xác định một số điều kiện thích hợp để nuôi cấy tế bào thận và gan phôi vịt trong điều kiện in vitro và thử nghiệm gây nhiễm virus viêm gan vịt type 1

Nội dung: - Xác định một số điều kiện thích hợp để tạo môi trường tế bào gan phôi vịt và thận phôi vịt một lớp qua các nồng độ nuôi cấy ban đầu và nồng độ huyết thanh bổ sung vào môi tr

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

  

VÕ QUỐC HOÀNG DÂN

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP

ĐỂ NUÔI CẤY TẾ BÀO THẬN VÀ GAN PHÔI VỊT TRONG

ĐIỀU KIỆN IN VITRO VÀ THỬ NGHIỆM GÂY NHIỄM VIRUS

VIÊM GAN VỊT TYPE 1

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH THÚ Y

Cần Thơ, 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

  

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP

ĐỂ NUÔI CẤY TẾ BÀO THẬN VÀ GAN PHÔI VỊT TRONG

ĐIỀU KIỆN IN VITRO VÀ THỬ NGHIỆM GÂY NHIỄM VIRUS

VIÊM GAN VỊT TYPE 1

GVHD:

PGS.TS HỒ THỊ VIỆT THU

Sinh viện thực hiện:

VÕ QUỐC HOÀNG DÂN MSSV: 3092656

LỚP: THÚ Y – K 35

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y



Đề tài: “Xác định một số điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế bào thận

và gan phôi vịt trong điều kiện in vitro và nuôi cấy thử nghiệm virus viêm gan vịt type 1” do sinh viên: Võ Quốc Hoàng Dân thực hiện tại phòng Chẩn

đoán và xét nghiệm, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ, từ 08/2013 đến 12/2013

Cần Thơ, Ngày tháng năm 2013 Cần Thơ, Ngày tháng năm 2013

Duyệt Bộ Môn Duyệt Giáo viên hướng dẫn

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

Duyệt Khoa Nông Nghiệp & SHƯD

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây

Võ Quốc Hoàng Dân

LỜI CẢM TẠ

Với tất cả sự kính trọng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đối Bố

mẹ là người đã sinh thành, nuôi dạy tôi khôn lớn và luôn ở bên cạnh ủng hộ, động viên khi tôi gặp khó khăn, vấp ngã trong cuộc sống

Tôi xin chân thành cảm ơn:

Cô Hồ Thị Việt Thu đã dành thời gian quý báu tận tình hướng dẫn, giúp

đỡ tôi trong suốt thời gian l àm luận văn tốt nghiệp

Cảm ơn anh Lê Trần Hoài Khanh đã tận tình hướng dẫn các thao tác trong phòng thí nghiệm

Cảm ơn tất cả các anh chị phòng Chẩn đoán và xét nghiệm, các bạn cùng lớp Thú Y Khóa 35 đã chia sẽ cùng tôi những buồn vui trong quá trình học tập cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề t ài Xin kính gởi đến quý thầy, cô, người than, anh, chị, bạn bè tôi lời chúc sức khỏe thành công và xin nhận nơi tôi lòng biết ơn sâu sắc

Cuối cùng tôi xin cảm ơn đến Hội Đồng Giám Khảo đã dành thời gian đọc, xem xét và đóng góp ý kiến quí báu cho đề tài tốt nghiệp của tôi

Võ Quốc Hoàng Dân

TÓM LƯỢC

Mục tiêu: Tạo môi trường tế bào thận phôi và gan phôi vịt lớp đơn phục

vụ các nghiên cứu về tế bào học và virus học

Để đáp ứng mục tiêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Xác định một số

điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế bào thận và gan phôi vịt trong điều kiện

in vitro và nuôi cấy thử nghiệm virus viêm gan vịt type 1” Từ tháng 08/2013

đến tháng 12/2013, thực hiện tại phòng chẩn đoán và xét nghiệm, Bộ môn Thú

Y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Đại học Cần Thơ

Nội dung:

- Xác định một số điều kiện thích hợp để tạo môi trường tế bào gan phôi vịt và thận phôi vịt một lớp qua các nồng độ nuôi cấy ban đầu và nồng độ huyết thanh bổ sung vào môi trường nuôi cấy

- Thử nghiệm gây nhiễm virus viêm gan vịt type 1 trên 2 loại môi trường

tế bào thận phôi vịt và gan phôi vịt lớp đơn

Các kết quả thu được:

- Về nồng độ nuôi cấy ban đầu 2 loại tế bào: ở cùng một nồng độ nuôi cấy ban đầu tế bào thận phôi vịt tạo lớp nhanh hơn tế bào gan phôi vịt; Nồng

độ thích hợp để tạo môi trường tế bào là 5x105 tb/ml Về nồng độ huyết thanh thích hợp bổ sung vào môi trường nuôi cấy: ở tế bào thận phôi vịt là 5-10%,

và tế bào gan phôi vịt là 10%

- Virus viêm gan vịt type 1 đều gây bệnh lý tế bào đặc trưng trên 2 loại tế bào (co tròn, hoại tử) Virus viêm gan vịt type 1 tăng sinh ở môi trường tế bào gan phôi vịt nhanh hơn môi trường tế bào thận phôi vịt

MỤC LỤC

Trang phụ bìa i

Trang duyệt ii

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM TẠ iv

TÓM LƯỢC v

MỤC LỤC vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC HÌNH x

DANH MỤC BẢNG xi

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Lịch sử nghiên cứu và phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào 3

2.2 Đặc điểm của tế bào động vật nuôi cấy 5

2.3 Tổng quan về nuôi cấy tế bào động vật 7

2.4 Các loại tế bào trong nuôi cấy tế bào động vật 10

2.5 Những đặc điểm và chức năng của tế bào nuôi cấy 10

2.6 Một số điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế b ào động vật 10

2.7 Một số môi trường nuôi cấy tế bào 14

2.8 Đánh giá tình trạng tế bào nuôi cấy 14

2.9 Sự tạp nhiễm khi nuôi cấy tế b ào động vật 15

2.10 Các pha trong nuôi cấy tế bào 15

2.11 Bảo quản lạnh tế bào nuôi cấy 15

2.12 Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào 17

2.13 Duck hepatitis virus type 1 (DHV -1) 18

CHƯƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 thời gian và địa điểm 20

3.2 Vật liệu và hóa chất 20

3.3 Nội dung nghiên cứu 22

3.4 Phương pháp nghiên cứu 22

3.4.1 Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ tế bào nuôi cấy thích hợp với điều kiện thí nghiệm 24

3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ huyết thanh FBS bổ sung vào môi trường tăng trưởng MEM lên hiệu quả tạo lớp đơn tế bào 25

3.4.3 Thí nghiệm 3: Nuôi cấy thử nghiệm Duck Hepatitis Viru s type 1 trên 2 loại môi trường DEK, DEL 27

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ tế bào nuôi cấy thích hợp với điều kiện thí nghiệm 29

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ huyết thanh FBS bổ sung vào môi trường tăng trưởng MEM lên hiệu quả tạo lớp đơn tế bào 35

4.3 Thí nghiệm 3: Nuôi cấy thử nghiệm Duck Hepatitis Virus type 1 trên 2 loại môi trường DEK và DEL 41

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Đề nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ CHƯƠNG 49

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CAM Chorioallantoic membrane Màng nhung niệu

DHV-1 Duck Hepatitis Virus type 1 Virus viêm gan vịt type 1 D’MEM Dulbecco`s modification of Eagle`s

medium

Môi trường MEM cải tiến bởi Dulbecco

DNA Deoxyribonucleic acid

DPBS Dulbecco’s Phosphate Buffered

Saline Solution

Đệm sinh lý Dulbecco

EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid

E’ MEM Eagle's minimal essential medium Môi trường tối thiểu do

Eagle thiết lập

HAT Hypoxanthine Aminopterin

Thymidine medium

Môi trường nuôi cấy tế bào động vật có vú HEPES Hydroxy – Ethyl – Piperazine –

Ethane – Sulphonic acid

Đệm hữu cơ

In Vitro In an artificial environment outside

the living organism

Trong điều kiện ngoài cơ thể sống

MEM Minimum Essential Medium Môi trường tối thiểu

kinh

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Mô hình cấu tạo của một tế bào động vật 5

Hình 2.2 Các loại dụng cụ nuôi cấy tế bào lớp đơn 9

Hình 2.3 Các loại dụng cụ nuôi cấy tế bào huyền phù 9

Hình 2.4 Duck hepatitis virus type 1 18

Hình 3.1 Buồng đếm Neubauer 54

Hình 3.2 Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ ban đầu thích hợp cho nuôi cấy 25

Hình 3.3 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ huyết thanh lên hiệu quả tạo lớp đơn tế bào 26

Hình 3.4 Hình bố trí thí nghiệm nuôi gây nhiễm DHV-1 trên 2 loại tế bào 27

Hình 4.1 Biểu đồ thời gian trung bình tạo lớp 2 loại tế bào với các nồng độ nuôi cấy ban đầu ax105 tb/ml 29

Hình 4.2 thời gian tạo lớp của 2 loại tế bào DEK (A) và DEL (B) từ nồng độ nuôi cấy ban đầu là 3x105 tb/ml 30

Hình 4.3 Thời gian tạo lớp của 2 loại tế bào DEK (A) và DEL (B) từ nồng độ nuôi cấy ban đầu là 5x105 tb/ml 31

Hình 4.4 Thời gian tạo lớp của 2 loại tế bào DEK (A) và DEL (B) từ nồng độ nuôi cấy ban đầu là 7x105 tb/ml 32

Hình 4.5 Thời gian tạo lớp của 2 loại tế bào DEK (A) và DEL (B) từ nồng độ nuôi cấy ban đầu là 10x105 tb/ml 33

Hình 4.6 Hiệu quả tạo lớp của 2 loại tế bào DEK (A) và DEL (B) trong môi trường MEM không bổ sung huyết thanh 36

Hình 4.7 Hiệu quả tạo lớp của 2 loại tế bào DEK (A) và DEL (B) trong môi trường MEM bổ sung 2% huyết thanh 37

Hình 4.8 Hiệu quả tạo lớp của 2 loại tế bào DEK (A) và DEL (B) trong môi trường MEM bổ sung 5% huyết thanh 38

Hình 4.9 Hiệu quả tạo lớp của 2 loại tế bào DEK (A) và DEL (B) trong môi trường MEM bổ sung 10% huyết thanh 39

Hình 5.0 Thời gian biểu hiện CPE của 2 loại tế bào DEK (A) và DEL (B) sau gây nhiễm DHV-1 42

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1: Thời gian trung bình tạo lớp tế bào với các nồng độ nuôi cấy ban

đầu của 2 loại tế bào DEK và DEL 33 Bảng 4.2 Giá trị OD620 trung bình theo nồng độ tế bào nuôi cấy ban đầu của

2 loại tế bào DEK và DEL 34 Bảng 4.3 Hiệu quả thời gian tạo lớp tế b ào tương ứng với 4 nồng độ huyết

thanh qua 3 thời điểm quan sát trên 2 loại tế bào 40 Bảng 4.4 Giá trị OD620 sau đo được sau 120 giờ nuôi cấy 2 loại tế bào theo 4

nồng độ huyết thanh 40 Bảng 4.5 Giá trị OD620 và tỷ lệ tế bào sống trung bình của 2 loại môi trường

tế bào 42

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Trước kia nếu muốn nuôi cấy virus thì người ta phải nuôi cấy trên cơ thể động vật Như vậy rất khó quan sát được các hiệu ứng đặc thù của virus ở mức độ tế bào Vào những năm 30 của thế kỷ 20 các nhà virus học đã phát hiện thấy phôi gà có thể được dùng để nuôi cấy virus herpes, virus đậu mùa và virus cúm Mặc dù phôi gà có kết cấu giản đơn hơn nhiều so với cơ thể thỏ hay chuột thí nghiệm nhưng phôi gà vẫn

là một cơ thể phức tạp Việc sử dụng phôi gà không thể hiện hết những bệnh lý do virus gây nên Mặt khác, vi khuẩn cũng phát triển tốt trên phôi gà, trên các phôi nhiễm

vi khuẩn rất khó đánh giá chính xác được các hiệu ứng do virus Vì vậy ngành virus học đã phát triển chậm chạp khi chưa cải tiến được phương pháp nuôi cấy virus

Có hai phát hiện mới đã làm triển khai được phương pháp nuôi cấy tế bào giúp cho các nhà virus học và các nhà khoa học khác Một là, việc phát hiện và sử dụng chất kháng sinh để ngăn ngừa sự cảm nhiễm vi khuẩn Hai là, các nhà sinh học phát hiện thấy các enzyme thủy phân protein, nhất là trypsine, có thể làm tách riêng các tế bào ra khỏi các mô xung quanh mà không làm tổn hại đến các tế bào này Rửa các tế bào và đếm số lượng chúng, pha loãng rồi chuyển vào các bình, các ống nghiệm hay hộp Petri bằng nhựa Các tế bào trong dịch huyền phù sẽ hấp phụ trên bề mặt lớp thành nhựa, chúng sinh sôi nẩy nở và lan ra thành một tầng tế bào gọi là tầng tế bào đơn Tầng tế bào đơn này có thể nuôi cấy truyền qua thế hệ bằng phương pháp đem các tế bào nuôi cấy được đi nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy mới (nuôi cấy thứ cấp) Một lượng lớn các tế bào truyền thế hệ được tạo thành từ một mẫu tổ chức đơn sẽ là mẫu tế bào nuôi cấy đồng nhất cần thiết cho các nghiên cứu hiệu ứng của virus

Thuật ngữ nuôi cấy mô đã được sử dụng rộng rãi nhưng nuôi cấy tế bào cần sử dụng chính xác hơn Hiện nay, phần lớn các tế bào nuôi cấy đều là tầng tế bào đơn sinh trưởng ra từ các tế bào phân tán đã được xử lý nhờ enzyme Nhờ sử dụng nhiều loại hình nuôi cấy tế bào vận dụng chất kháng sinh để ức chế nhiễm trùng mà ngành Virus học đã bước vào thời đại vàng Từ thập kỷ 50 đến thập kỷ 60 của thế kỷ 20 đã có trên 400 virus được phân lập và giám định Mặc dù các virus mới đã được phát hiện nhưng trọng tâm hiện nay là cần giám định kỹ hơn các đặc tính của virus, xác định các bước cảm nhiễm và nhân lên của virus

Ngoài ra, nuôi cấy tế bào giúp giảm số lượng các cơ thể sống dùng làm thí nghiệm Thay vì thí nghiệm ta thực hiện trên một cơ thể sống thì ta thực hiện nó trên tế bào Điều này giúp cho các thí nghiệm được thực hiện trên nhiều đối tượng thử nghiệm hơn, thời gian ngắn hơn Trong sản xuất vaccine từ tế bào nuôi cấy có ưu điểm

là độ tinh khiết và đơn vị kháng nguyên cao vì thế cho đáp ứng miễn dịch sớm và hiệu giá kháng thể đạt được cao Còn nhiều các ứng dụng khác của công nghệ nuôi cấy tế bào như nghiên cứu ung thư, thử nghiệm thuốc…

Xuất phát từ nhu cầu thực tế và nhu cầu nghiên cứu về virus học và một số nghiên cứu khác, cùng với điều kiện phòng thí nghiệm virus học, bộ mô Thú y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, chúng tôi tiến h ành thực hiện đề tài:

“Xác định một số điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế bào thận và gan phôi vịt

trong điều kiện in vitro và nuôi cấy thử nghiệm virus viêm gan vịt type 1”

Mục tiêu đề tài

Xác định một số điều kiện thích hợp để tạo môi trường tế bào thận phôi và gan phôi tách từ phôi vịt như nồng độ tế bào nuôi cấy, nồng độ huyết thanh bổ sung trong môi trường nuôi cấy

Thử nghiệm gây nhiễm virus viêm gan vịt type 1 trên môi trường 2 loại tế bào Xem hiệu quả tăng sinh của virus trên 2 loại môi trường nhằm phục vụ cho các thí nghiệm về virus học

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Lịch sử nghiên cứu và phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào

Thuyết tế bào của Schleiden và Schwan (1838) là nền tảng cho các nghiên cứu sâu về khả năng phát triển tế bào từ một tế bào gốc Thực tế, trong sự phát triển của khoa học và y học có nhu cầu nuôi cấy tế bào rất lớn Chẳng hạn, nuôi cấy tế bào phục

vụ cho sản xuất vaccine cho người và gia súc, nghiên cứu sự phát triển của tế bào ung thư, nghiên cứu virus học Chính vì nhu cầu đó từ thế 19 nhiều nhà khoa học đã tiến

hành nghiên cứu tế bào cũng như nuôi cấy nó trong điều kiện in vitro

Một số mốc thời gian ghi nhận sự phát triển của công nghệ nuôi cấy tế b ào và mô:

- Năm 1838, Schleiden và Schwann công bố thuyết tế bào, đặt nền tảng cho nhiều nhà khoa học nghiên cứu sau về khả năng phát triển tế bào từ một tế bào gốc ban đầu

- Năm 1885, Roux nhận xét rằng tế bào phôi gà có thể giữ ở trạng thái sống trong dung dịch mối sinh lý bên ngoài cơ thể, Đây là ghi nhận đầu tiên về khả năng nuôi tế bào động vật

- Năm 1907, Harrison lần đầu tiên tách thành công tế bào thần kinh ếch để làm thí nghiệm nuôi chúng ngoài cơ thể Ông đã quan sát được dưới kính hiển vi sợi thần kinh hình thành từ tế bào chất của tế bào thần kinh

- Năm 1913, một nghiên cứu có tính chất làm nền tảng cho công nghệ nuôi cấy tế bào động vật do Carrel thực hiện, nghiên cứu đã chứng minh tế bào có thể sống lâu

ngày trong điều kiện in vitro nếu được thường xuyên bổ sung chất dinh dưỡng trong

điều kiện vô trùng

- Năm 1948, Earle đã thành công khi phân lập được các tế bào đơn từ dòng tế bào và nuôi chúng trong những điều kiện môi trường đặc biệt và thu nhận được những dòng tế bào biệt lập

- Năm 1952, Gey phân lập được dòng tế bào liên tục (được gọi là dòng tế bào HeLa) có nguồn gốc tế bào ung thư cổ tử cung ở người

- Năm 1954, Levi-Montalcini đã dùng các yếu tố tăng trưởng thần kinh (NGF - Nerve Growth Factor) kích thích lên sự phát triển các tế bào thần kinh trong điều kiện

in vitro

- Năm 1955, Earle lần đầu tiên nghiên cứu có hệ thống nhu cầu dinh dưỡng thiết

yếu của tế bào nuôi cấy trong điều kiện in vitro và phát hiện rằng tế bào động vật có

thể phân chia được trong một hỗn hợp chứa các dinh dưỡng có phân tử lượng nhỏ và

có hiện diện của một lượng huyết thanh nhất định

- Năm 1956, Puck nhận thấy yếu tố đột biến cũng kích thích lên sự phát triển của

các tế bào Hela trong điều kiện nuôi cấy in vitro

- Năm 1958, Temin và Tubin phát triển phương pháp xét nghiệm định lượng virus Rous sarcoma qua gây nhiễm vào tế bào gà nuôi cấy

- Năm1961, Hayflick và Moorhead thấy rằng tế bào nguyên sợi người (human fibroblast) bị chết sau khi phân chia đến một số lượng giới hạn trong điều kiện nuôi cấy

- Năm 1964, Littlefied đã đưa ra môi trường nuôi cấy HAT dùng để phát triển tế bào sinh dưỡng lai Bao gồm kỹ thuật dung hợp tế bào, để cho các tế bào sinh dưỡng tiếp nhận gen mới

- Năm 1965, Ham xác định môi trường nuôi cấy tế bào không có huyết thanh cũng có khả năng kích thích sự phát triển của tế bào động vật có vú Cùng thời gian này, Harris và Watkins lần đầu tiên gây được hiện tương dung hợp tế bào người và tế

bào chuột bởi tác động của virus trong điều kiện in vitro

- Năm 1975, Kohler và Milstein sản xuất được kháng thể đơn dòng từ tế bào Lympho B với một tế bào ung thư hybridoma

- Năm 1976, Sato đã chứng minh các dòng tế bào dùng để nuôi cấy đòi hỏi những hỗn hợp hormone khác nhau và các yếu tố tăng trưởng trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh

- Năm 1977, Wigler đã cải tiến phương pháp ghi chép cấu trúc gen của động vật

có vú qua nuôi cấy tế bào từ phương pháp của Graham và Van Der Eb

Từ các nghiên cứu trên góp phần: tìm ra được nhiều môi trường thích hợp cho sự

phát triển nhiều loại mô khác nhau của người và động vật trong điều kiện in vitro,

hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô động vật, tạo ra một số đột biến có ích và có ý nghĩa rất lớn trong kỹ thuật sản xuấ t vaccine cho người và động vật

Trong tương lai không xa, hướng nghiên cứu này sẽ đem lại những thành tựu khoa học cũng như lợi ích kinh tế rất lớn Trước mắt, kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật

sẽ phục vụ cho hai ngành: ngành y và ngành chăn nuôi – thú y Hai ngành này đang cần những kỹ thuật hiện đại để phát triển

2.2 Đặc điểm của tế bào động vật nuôi cấy

Hình 2.1 Mô hình cấu tạo của một tế bào động vật (http://www.biologyjunction.com/cell_model_instructions.htm)

Sự điều hòa trao đổi chất

Quá trình trảo đổi chất của cơ thể được tập trung chủ yếu trong từng tế bào Sự chuyển hóa vật chất chủ yếu xảy ra trong tế bào và có tính quyết định đến sự tồn tại của có thể sống

Ở tế bào động vật, ngoài tác động của enzyme và hệ dịch quanh tế bào, chúng còn bị tác động rất mạnh của hệ thần kinh Hệ thần kinh thu nhận những phản xạ phong phú từ bên ngoài và bên trong tế bào, điều khiển một cách hài hòa toàn bộ quá trình trao đổi chất ở tế bào Sự rối loạn quá trình trao đổi chất ở tế bào có liên quan rất chặt chẽ với sự điều khiển từ hệ thần kinh Do đó, việc điều khiể n trao đổi chất của tế bào động vật trong cơ thể sống hết sức phức tạp

Tuy nhiên, việc điều khiển dinh dưỡng tế bào trong nuôi cấy in vitro khác quá trình dinh dưỡng tế bào trong cơ thể Khi nuôi cấy tế bào in vitro, các quá trình trao

đổi chất của tế bào hoàn toàn tuân theo các đặc điểm của một tế bào độc lập, không tuân theo quy luật của mô và của cơ thể đa bào Việc nuôi cấy tế bào động vật được thực hiện trên cơ sở điều khiển quá trình tổng hợp enzyme và các hoạt động của

enzyme, đây cũng là hai yếu tố quyết định khả năng phát triển của tế bào, khả năng tạo

ra những sản phẩm trao đổi chất của tế b ào, cũng như khả năng phân chia tế bào Trong quá trình phát triển của tế bào, có hai vấn đề ảnh hưởng quyết định đến kết quả:

- Bản chất tự nhiên của tế bào, hay nói cách khác là nguồn gốc của tế bào

- Những yếu tố môi trường quyết định đặc trưng riêng biệt của tế bào

Những hiểu biết nguồn gốc của tế bào giúp ta định hướng sản phẩm cuối, còn sự hiểu biết về đặc trưng riêng biệt giúp ta điều chỉnh để tính trạng đó được biểu hiện ra trong quá trình nuôi cấy

Trong nuôi cấy tế bào in vitro có những yếu tố hoàn toàn khác với sự phát triển

của chính tế bào đó trong cơ thể Còn khi phát triển trong cơ thể, các tế bào này không chỉ chịu tác động trực tiếp mà còng chịu những tác động gián tiếp Do đó, mọi tác

động của môi trường đến tế bào nuôi in vitro xảy ra rất nhanh và mãnh liệt, cần tạo ra

sự hài hòa trong mọi tác động đến sự trao đổi chất của tế b ào được nuôi cấy

Tính chất cơ học

Tế bào động vật không có thành tế bào, chúng chỉ được bao bọc rởi một màng tế bào – thành phần duy nhất ngăn cách giữa tế bào với các tế bào khác trong mô Mặt khác, kích thước tế bào động vật thường rất lớn, trung bình khoảng 10 μm, lại không

có vách nên tế bào động vật có tính chất cơ học yếu Do đó, trong quá trình nuôi cấy cần nhẹ nhàng, tránh sự phá vỡ tế bào, trong trường hợp việc nuôi cấy tế bào cần khuấy hay quay thì tốc độ không được quá 100 rpm (vòng/phút) (Phạm Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2007)

Khả năng phân chia và tốc độ tăng trưởng chậm

Do đặc điểm di truyền ở tế bào động vật và thực vật, một chu kỳ tế bào thường kéo dài 20 – 70 giờ (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Nếu trong một điều kiện nào đó, một loại tế bào trong có thể đa bào lại tăng số lượng một cách bất thường thì cơ thể đó sẽ chuyển sang trạng thái bệnh lý

Cần giá đỡ trong quá trình phát triển, nhân đôi

Trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mô và tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia Tế bào sẽ ngừng phân chia khi đã hình thành một lớp đơn liên tục trên bề mặt của dụng cụ nuôi Tuy vây, một số dòng tế bào như tế bào ung thư hoặc dòng tế bào liên tục từ mô bình thường (sau khi được thuần hóa) có thế sinh trưởng và phân chi trong trạng thái lơ lửng, không cần bám vào giá đỡ (Phạm Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2007)

Chịu ảnh hưởng rất mạnh bởi sản phẩm trao đổi chất của chúng

Đây là cơ chế kìm hãm ngược (Negative feed – back), là cơ chế ức chế sự tổng hợp và tiết ra ngoài môi trường của một chất nào đó, được thực hiện bởi chính sự gia tăng của nồng độ chất này trong môi trường Do đó, việc thay mới môi trường sau một thời gian nuôi cấy là cần thiết Trong phòng thí nghiệm, cơ chế kìm hãm ngược còn có thể gây tổn thương tế bào, thậm chí chết hàng loạt (Phạm Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2007)

Khả năng tiếp nhận gen lạ

Xét về cấu trúc tế bào, tế bào động vật được xem như một loại tế bào trần tự nhiên Chúng được bao bọc chỉ bởi một lớp màng Do đó, trong trường hợp chúng tồn tại ở trạng thái tự do, chúng có khả năng tiếp nhận dòng thông tin di truyền lạ từ virus hoặc khi những tế bào động vật có thông tin di truyền khác nhau ở gần nhau, sẽ xãy ra hiện tượng trao đổi vật chất di truyền tạo ra các tế bào lai (như tế bào hybridoma, được lai giữa tế bào bình thường có khả năng sản xuất kháng thể và tế bào ung thư tủy)

Khả năng bảo quản trong điều kiện nhân tạo

Khác với tế bào vi sinh vật và tế bào thực vật, tế bào động vật cần phải được bảo quản trong điều kiện hết sức đặt biệt mới có thế giữ đ ược những đặc tính riêng của nó Bằng cách sử dụng nitơ lỏng (-1960C) để trữ, tế bào động vật vẫn duy trì được đặc tính của chúng trong thời gian rất dài Phương pháp này được áp dụng nhiều ở các ngân hàng giống động vật trên thế giới Khi sử dụng, tế bào động vật được tiến hành giải đông và được hoạt hóa để phục hồi khả năng tăng trưởng và phân chia như trước khi đem bảo quản

Ngoài ra, tế bào động vật rất kém thích nghi với điều kiện môi tr ường, nhạy cảm với kim loại Trong quá trình phát triển ở môi trường nhân tạo, chúng rất cần huyết thanh, hormone

2.3 Tổng quan về nuôi cấy tế bào động vật

Các hình thức nuôi cấy tế bào động vật

- Nuôi cấy tế bào sơ cấp (Primary culture)

Nuôi cấy tế bào sơ cấp là giai đoạn nuôi cấy đầu tiên những tế bào vừa được tách

ra từ mô hay cơ quan (Phan Kim Ngọc, 2002) Việc nuôi cấy bắt đầu khi các tế bào được tác ra từ mô bằng phương pháp cơ học hay bằng phương pháp xử lý enzyme và

có thể tăng trưởng trong môi trường thích hợp

Có nhiều loại enzyme để tách tế bào như collagenase, elastase, hyaluronidase, pronase… nhưng trypsin đươc dùng nhiều nhất vì hiệu quả tách tế bào cao và giá

thành rẻ Trypsin (và pronase) có thể tách hoàn toàn tế bào từ mô bằng cách thủy phân các protein liên kết các tế bào với nhau (Phan Kim Ngọc, 2002)

Dù tế bào được tách ra bằng bất kỳ phương pháp nào thì đây vẫn là giai đoạn chọn lọc đầu tiên của quá trình nuôi cấy để cuối cùng có thể thu các dòng tế bào tương đối đồng dạng

Trong giai đoạn nuôi cấy sơ cấp, sự chọn lọc dựa vào đặc tính của tế bào như dễ tách rời nhau, sống và bám vào cơ chất thành một lớp mỏng hoặc tồn tại đươc trong dịch huyền phù Những tế bào đó là đối tượng cơ bản của quá trình nuôi cấy sơ cấp Các tế bào nuôi cấy sơ cấp không đồng nhất với nhau do chúng là thế hệ con của nhiều loại tế bào ban đầu khác nhau Ở giai đoạn nhày, tế bào có hình thái gần mô cha mẹ nhất

- Nuôi cấy thứ cấp (Secondary culture)

Đây là hình thức cấy chuyền tế bào sơ cấp, để có bề mặt cho sự phát triển Qua mỗi lần cấy chuyền, nhằm lựa chọn những tế bào có khả năng tăng sinh cao nhất sẽ dần dần chiếm ưu thế và loại bỏ các tế bào chết hoặc tăng sinh kém Qua nhiều lần cấy truyền, tế bào trở nên ổn định hơn, có khả năng tăng sinh nhanh chóng và mạnh mẽ Tiến hành cấy chuyền bằng cách tách rời các tế bào từ bình nuôi cấy bằng enzyme (tương tự enzyme đã dùng khi tách tế bào để nuôi cấy sơ cấp), enzyme này phá hủy cấu trúc protein gắn kết tế bào với bề mặt cơ chất Ngay sau khi tế bào được tách rời, enzyme được bất hoạt nhờ môi trường nuôi cấy (có chứa huyết thanh), huyền phù tế bào được chia nhỏ ra và cho vào bình nuôi cấy mới

Các dòng tế bào nuôi cấy

- Dòng tế bào liên tục: là dòng tế bào nuôi cấy qua nhiều thế hệ trong điều kiện in

vitro và có thể duy trì khả năng phân bào trong một thời gian dài mà không thay đổi

đặc tính Ví dụ: tế bào Hela (tế bào ung thư cổ tử cung người), tế bào Vero (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi)…

- Dòng tế bào giới hạn: là dòng tế bào chỉ có khả năng sống trong điều kiện nuôi

cấy ở một thời gian giới hạn Đây là các dòng tế bào bình thường (không phải tế bào ung thư)

Dụng cụ nuôi cấy tế bào

- Nuôi cấy lớp đơn (Monolayer culture): thường sử dụng các đĩa microplate, đĩa

petri, bình Roux (T-flask) Các dụng cụ được chọn tùy vào số lượng tế bào, bản chất môi trường nuôi cấy, giá thành và thói quen người sử dụng

Đĩa Bình T-flask

Hình 2.2 Các loại dụng cụ nuôi cấy tế bào lớp đơn

- Nuôi cấy huyền phù (Suspension culture): Nuôi trong bình có cánh quát xoay từ

(Spinner flask) hoặc bình lắc Erlenmeyer Trong đó tế bào được giữ trạng thái huyền phù trong môi trường

Bình Erlenmeyer Bình có cánh quạt xoay (Spinner flask) Hình 2.3 Các loại dụng cụ nuôi cấy tế bào huyền phù

2.4 Các loại tế bào trong nuôi cấy tế bào động vật

Những tế bào nuôi cấy thường được mô tả dựa trên hình thái (hình dạng và biểu hiện) hoặc đặc điểm chức năng của chúng Có 5 dạng h ình thái cơ bản:

- Dạng biểu mô (Epithelial – like): những tế bào này bám trên bề mặt có dạng đa giác và dát mỏng

- Lympho bào (Lymphoblast – like): là những dòng tế bào thường không bám lên bề mặt nhưng tồn tại trong dịch huyền phù dưới dạng hình cầu

- Nguyên sợi bào (Fibroblast – like): những tế bào bám trên bề mặt và có biểu hiện thon dài, có hai đầu, thường có dạng xoáy khi nuôi cấy với mật độ d ày đặc

- Tế bào thần kinh (Neuron): cấu tạo có mấu lồi và sợi trục đặc trưng, ít quan sát được sự phân chia trong môi trường

- Tế bào cơ (Muscle – like): dạng ống nhỏ có nhiều nhân, biệt hóa thành dạng ống trong quá trình nuôi cấy

2.5 Những đặc điểm và chức năng của tế bào nuôi cấy

Đặc điểm của những tế bào nuôi cấy phụ thuộc vào nguồn gốc và khả năng thích nghi của chúng với điều kiện môi trường Những chất đánh dấu hóa sinh được sử dụng

để kiểm tra xem tế bào có mang những đặc điểm chức năng mà chúng có trong cơ thể sống hay không (ví dụ: tế bào gan tiết albumin) Những dấu hiệu hình thái học hay siêu cấu trúc cũng có thể được xác định (chẳng hạn sự đập của tế bào tim) Thông thường, những đặc điểm này có thể thay đổi hoặc mất đi khi đặt tế bào trong điều kiện nhân tạo

2.6 Một số điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế bào động vật

Một điều kiện thích hợp là điều kiện tốt hơn so với điều kiện cho phép tế bào tồn tại trong nuôi cấy Nó cho phép các tế bào ở số lượng ít tăng số lượng thông qua sự phân chia cũng như mang các chức năng sinh lý, sinh hóa quan trọng như trong cơ thể

Để có điều kiện sống này, cần cung cấp cho tế bào nhiệt độ thích hợp, vật bám tốt và điều kiện nuôi cấy chuẩn xác

Nhiệt độ ủ ấm: nhiệt độ thích hợp là nhiệt độ gần với nhiệt độ cơ thể động vật

chủ mà tế bào được tách ra Với động vật máu lanh, nhiệt độ thay đổi từ 18-250C, hầu hết động vật hữu nhũ đòi hỏi nhiệt độ từ 36-370C Phạm vi nhiệt độ này được đảm bảo bằng nhiệt kế và tủ ấm phải được kiểm tra thường xuyên

Chổ bám (giá đỡ): những tế bào phụ thuộc chổ bám cũng đòi hỏi một chất nền

tốt để bám và phát triển Thủy tình và plastic (được xử lý đặc biệt) thường được sử dụng nhất Những yếu tố bám khác như collagen, gelatin, fibronectin có th ể sủ dụng phủ bề mặt cho tác dụng bám tốt hơn Những tế bào sẽ có chức năng tốt nếu chúng

được phát triển trên một chất nền xốp hay có dạng tổ ong Tế bào cũng có thể phát triển trên các hạt trong huyền phù (hạt thủy tinh, plastic, polyacrylamide và hệ thống các phân tử dextrin) Bằng cách này, các tế bào phụ thuộc chỗ bám có thể phát triển trong hệ thống nuôi cấy huyền phù và làm tăng khả năng sản xuất tế bào bằng phương pháp sinh học

Môi trường nuôi cấy: môi trường nuôi cấy chia làm hai loại:

- Môi trường tự nhiên: gồm huyết thanh động vật, nước ép bào thai và dung dịch muối đệm (như dung dịch Hanks)

- Môi trường tổng hợp: tổng hợp nhiều thành phần, tương đối đầy đủ dưỡng chất cho sự sống và phát triển của tế bào (như các môi trường MEM, E’MEM, D’MEM) Môi trường nuôi cấy là yếu tố phức tạp và quan trọng nhất để kiểm soát khả năng làm tế bào phát triển tốt Bên cạnh những đòi hỏi dinh dưỡng cơ bản của tế bào, môi trường nuôi cấy phải có nhiều yếu tố phát triển cần thiết, điều chỉnh pH v à áp suất, cung cấp các khí thiết yếu (O2 và CO2) Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy gồm amino acid, vitamine, khoáng và carbohydrate Chúng cho phép tế bào tạo ra những protein mới và các thành phần thiết yếu khác cho sự phát triển và các hoạt động

chức năng – tương tự như sự cung cấp năng lượng cho trao đổi chất

Amino acid: các amino acid cần thiết là các amino acid không được tổng hợp

trong cơ thể nên cần phải được bổ sung vào môi trường nuôi cấy Nhu cầu về cysteine

và tyrosine thay đổi khác nhau tùy theo dòng tế bào Các amino acid không cần thiết khác cũng được bổ sung vào môi trường để bù đắp cho những dòng tế bào không có khả năng tổng hợp

Vitamine: môi trường MEM của Eagle (hoặc E’MEM) chỉ có các vitamine thuộc

nhóm B, các vitamine từ nhóm khác sẽ được bổ sung từ huyết thanh Khi tăng thành phần môi trường lên (mục đích để giảm lượng huyết thanh xuống) thì danh sách các vitamine trong môi trường cũng phải tăng theo Khi giảm lượng huyết thanh trong môi trường thì việc bổ sung các vitamine khác ngoài những vitamine đã có sẳn trong môi trường là rất cần thiết Khi mật độ tế bào trong môi trường nuôi cấy thấp (trong giai đoạn nhân dòng tế bào) thì cần phải tăng lượng vitamine cho dù trong môi trường đã

có sự hiện diện của huyết thanh Sự hạn chế về vitamine có ảnh hưởng rõ rệt trên sức sống và tốc độ tăng trưởng của tế bào hơn là trên mật độ tế bào

Muối: các loại muối chủ yếu như Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO32-, PO43-và HCO3-

là thành phần chính tạo ra áp suất thẩm thấu của môi trường Trong huyền phù tế bào, lượng Ca2+ thường được giảm xuống để hạn chế sự kết cụm của tế bào Nồng độ của HCO3- được xác định bởi nồng độ CO2 ở dạng khí

Glucose: glucose được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để cung cấp năng

lượng Glucose được chuyển hóa chủ yếu bởi quá trình đường phân (glycolyse) tạo ra acid lactic để đi qua chu trình Krebs giải phóng CO2 Nghiên cứu lượng acid lactic tích

tụ trong môi trường, đặc biệt là khi nuôi các tế bào phôi và các tế bào biến đổi, người

ta thấy rằng chu trình Krebs ở đây hoạt động không trọn vẹn như in vivo, và carbon

trong acid lactic chủ yếu là chuyển hóa từ glutamine, chỉ một phần nhỏ là từ glucose Điều này giải thích cho nhu cầu về glutamine v à glutamate của tế bào nuôi cấy

Khoáng chất: việc bổ sung các chất vào môi trường nói chung không cần thiết

lắm, trừ khi có sự giảm lượng huyết thanh trong môi trường Trong môi trường có hàm lượng huyết thanh thấp hoặc hoàn toàn không có huyết thanh thì lúc đó cần phải bổ sung sắt, đồng, kẽm, selenium các và các nguyên tố khác vào môi trường nuôi cấy

Các chất hữu cơ khác: hợp chất khác nhau như nucleoside, các chất trung gian

của chu trình Krebs, pyruvate và lipid c ũng có mặt trong các môi trường nuôi cấy phức tạp Những hợp chất này cần thiết khi giảm lượng huyết thanh trong môi trường nuôi cấy Các chất này có vai trò trong nhân dòng và duy trì các dòng t ế bào chuyên biêt

L-Glutamine: cần thiết cho hầu hết các dòng tế bào Glutamine được sử dụng

trong môi trường nuôi cấy tế bào như nguồn cung cấp năng lượng và carbon (Reitzer

et al, 1979)

Huyết thanh: hầu hết các loại môi trường nuôi nuôi cấy tế bào đều cần đến huyết

thanh vì nó có vai trò quan trọng như sau: cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như các amino acid thiết yếu, tiền chất của nucleic acid, các nguyên tố vi lương…, cung cấp nhân tố tăng trưởng kích thích tế bào tăng trưởng và phân chia, kích thích sự phục hồi do các tổn thương tế bào khi cấy truyền và các protein trong huyết thanh làm bất hoạt trypsine tránh các enzyme gây tổn thương tế bào, cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng, cải thiện tính dính của tế bào lên bề mặt nuôi nhờ các yếu tố làm tăng

độ dính của tế bào lên giá đỡ, chống oxy hóa mạnh và ức chế độc tính của oxy (Phan Kim Ngọc, 2002)

Huyết thanh được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là huyết thanh bê (sử dụng nhiều nhất), huyết thanh phôi bò, huyết thanh ngựa và huyết thanh người (sử dụng trong nuôi cấy một số dòng tế bào của người) Tuy nhiên, huyết thanh làm tăng giá thành nuôi lên rất nhiều Ngoài ra, huyết thanh còn dễ bị nhiễm virus, mycoplasma và khó ổn định chất lượng của những lô môi trường khác nhau cũng như chứa những thành phần gây ức chế sự phân bào của một tế bào đặc biệt Do đó, cần chọn loại huyết thanh phù hợp

Hormone: hormone có những ảnh hưởng khác nhau trên tế bào và thường khó

có thể nhận ra được tác động chính của chúng Insulin kích thích sự hấp thu glucose v à amino acid và có lẽ khả năng kích thích sự phân chia tế bào của nó đã ảnh hưởng đến

thuộc tính này Một vài yếu tố tăng trưởng kết hợp với chất nhận của insulin trên bề mặt của tế bào và có những hoạt động tương tự Các hormone tăng trưởng có thể có mặt trong huyết thanh, đặc biệt là trong huyết thanh bò và cùng với somatomedine ảnh hưởng trên sự phân bào Hydrocortisone cũng có trong huyết thanh với hàm lượng thay đổi Chất này có thể kích thích sự bám dính của tế bào và sự tăng sinh của tế bào Nhưng trong những điều kiện nhất định (như khi mật độ tế bào cao) thì cản sự phân bào và có thể cảm ứng sự biệt hóa tế bào Trong các thí nghiệm giảm hoặc bỏ hẳn huyết thanh trong môi trường nuôi cấy cho thấy các hormone cần thiết cho sự nuôi cấy nên việc bổ sung huyết thanh vào môi trường nuôi cấy là cần thiết

Các chất biến dưỡng và các dưỡng chất: trong huyết thanh cũng có các amino

acid, glucose, ketoacid và một số các dưỡng chất, các chất biến dưỡng trung gian Những chất này quan trọng trong các môi trường đơn giản, nhưng ít quan trọng hơn trong các môi trường phức tạp, đặc biệt là những môi trường có ít các chất bổ sung khác và các amino acid với nồng độ cao

Các yếu tố kiềm hãm: huyết thanh có thể có chứa những cơ chất có tác dụng

kiềm hãm sự tăng sinh của tế bào Một số chất có thể được tạo ra trong quá trình chuẩn

bị môi trường như độc tố của các loại vi khuẩn nhiễm vào môi trường trước khi qua lọc vô trùng, các phân đoạn của γ – globulin có thể chứa các loại kháng sinh gây trở ngại cho việc nuôi cấy Hơi nóng có thể làm phân hủy một vài phức chất trong huyết thanh và làm giảm tính độc của immunoglobulin mà không gây hại đến các yếu tố tăng trưởng là polypeptide, hơi nóng có thể làm phân hủy một số chất dễ bị biến tính bởi nhiệt và thành phần của huyết thanh sẽ không còn giống như trước khi xử lý

Các chất đệm: góp phần kiểm soát và tránh sự thay đổi pH đột ngột Tùy vào

từng loại tế bào, khi chúng phát triển càng nhanh thì càng sinh nhiều lactic acid làm

pH môi trường giảm, do đó cần bổ sung chất đệm Có hai hệ đệm thường dùng: hệ đệm CO32-/HCO3- (NaHCO3) và hệ đệm hữu cơ như HEPES (Hydroxy – Ethyl – Piperazine – Ethane – Sulphonic acid) Đệm NaHCO3 điều chỉnh lượng CO2 hòa tan trong môi trường, thường được sử dụng khi dùng tủ ấm kiểm soát CO2 cung cấp từ 2-10% CO2

Đệm HEPES là loại đệm lưỡng cực, có khả năng điều chình pH môi trường nuôi cấy theo cả 2 hướng acid và base, do đó giữ pH môi trường trong khoảng 7,0 - 7,4 Đệm không nhạy cảm với CO2, chúng cung cấp một hệ thống tốt để các tế bào có thể chuyển hóa mạnh (sản xuất nhiều CO2) giữ ỗn định pH

Áp suất thẩm thấu: rất quan trọng với việc điều chỉnh dòng chất trong và ngoài

tế bào Nó được kiểm soát bởi sự thêm hay bớt một lượng muối trong môi trường nuôi cấy Sự bay hơi của môi trường ở hệ thống nuôi cấy hở (đĩa…) sẽ làm tăng nhanh áp

suất, làm cho tế bào bị stress, biến dạng hoặc chết Với hệ thống nuôi cấy hở, cần có tủ

ấm với ẩm độ cao để hạn chế sự bay h ơi của môi trường

2.7 Một số môi trường nuôi cấy tế bào

Môi trường MEM (Minimum Essential Medium): Là môi trường cơ bản được

bổ sung muối Earle, các thành phần khác như amino acid không thiết yếu, Glutamine, vitamine đảm bảo cho sự phát triển của tế bào, cần bỏ sung 5-10% huyết thanh vào môi trường

L-Môi trường E’MEM (Eagle Minimum Essential Medium): còn gọi là môi

trường tối thiểu do Eagle thiết lập, l à môi trương chứa nồng độ cao các amino acid (không có L-Glutamine) và vitamine, chứa kháng sinh kanamycin, cần bổ sung thêm 5

- 10% huyết thanh khi nuôi cấy tế bào

Môi trường D’MEM (Dulbecco – Modified Eagle Medium): là môi trường

E’MEM do Dulbecco cải tiến với thành phần một số amino acid cao gấp hai lần và một sô vitamine cao gấp 4 lần, bổ sung thêm glucose để nuôi được nhiều lại tế bào hơn

2.8 Đánh giá tình trạng tế bào nuôi cấy

Để đánh giá tình trạng tế bào nuôi cấy dựa trên 4 đặc điểm: hình thái, tỷ lệ phát triển, năng suất che phủ và thực hiện chức năng đặc biệt

Dựa vào hình thái học (hình dạng tế bào): dễ xác định nhưng ít sử dụng do khó

đưa ra kết luận từ những quan sát trực tiếp (xem tươi), nó không thể hiện một số lượng hay đo lường chính xác nào Do đó, để xác định trạng thái tế bào, có thể nhuộm tế bào với một số hóa chất như: Neutral red, Crystal violet Chúng bắt màu các tế bào sống, Neutral red bắt màu lysosome (Finter, 1969), Crystal violet bắt màu DNA, protein và các mảng tế bào (Renault et al, 1991)

Đếm tế bào để ước lượng số lượng tế bào: cho phép xác định tỷ lệ phát triển, tỷ

lệ này nhạy cảm với những thay đổi cơ bản của điều kiện nuôi cấy Dựa vào đó có thể thiết lập các thí nghiệm xác định điều kiện (môi trường, chất nền, huyết thanh…) tốt hơn cho tế bào

Năng suất che phủ: là đặc điểm dựa trên phương pháp ước lượng phần trăm tạo

lớp tế bào từ các tế bào đã phát triển bám bào cơ chất che phủ diện tích nuôi cấy Số lượng các tế bào phát triển đặc trưng cho khả năng tồn tại và tỷ lệ phát triển, kích thước lớp tế bào đặc trưng cho năng suất che phủ

Sự biểu hiện chức năng đặc biệt: thường khó quan sát và đo lường nhất, được

xác định bằng các xét nghiệm hóa sinh v à miễn dịch

2.9 Sự tạp nhiễm khi nuôi cấy tế bào động vật

Sự tạp nhiễm khi nuôi cấy tế bào có hai loại chính là nhiễm hóa học và nhiễm sinh học

Nhiễm hóa học: khó phát hiện, nó gây ra bởi nhiều tác nhân như: ion kim loại

hoặc thuốc tẩy hóa học, những chất này không thể nhìn thấy được

Nhiễm sinh học: vi khuẩn phát triển nhanh, có thể thấy biểu hiện trong môi

trường tế bào, thay đổi pH hoặc làm đục mờ môi trường nuôi cấy Tuy nhiên hai dạng khác của nhiễm sinh học là mycoplasma và virus thì không dễ phát hiện và đòi hỏi những phương pháp xác định đặc biệt

Tạp mô và các tế bào khác: ngoài ra trong môi trường tế bào nuôi cấy còn lẫn

các loại tế bào khác, làm dòng tế bào không đồng nhất do qua trình tách và xử lý mô lẫn các mô khác trên cùng cơ thể

Hai yêu cầu chính để tránh tạp nhiễm: thứ nhất là đảm bảo vô trùng tốt trong khu vực làm việc, thứ hai là môi trường, dụng cụ phải được tiệt trùng, cất giữ và sắp xếp hợp lý Sử dụng kháng sinh cẩn thận và có giới hạn trong nuôi cấy mô có thể giúp tránh tổn thất do tạp nhiễm sinh học

2.10 Các pha trong nuôi cấy tế bào

Pha ức chế: đây là pha đầu tiên, nó phụ thuộc rất nhiều yếu tố như thành phần,

một độ, trạng thái ban đầu của tế bào… Pha này xảy ra sớm, không tăng về số lượng tế bào (sô lượng tế bào có thể giảm) Nếu mật độ và khả năng sống của tế bào nuôi cấy thấp thì pha này sẽ kéo dài hơn

Pha phát triển: sau thời gian nuôi cấy, số lượng tế bào sẽ bắt đầu tăng lên nhanh

chóng Trong chẩn đoán, thường sử dụng bình tế bào đã phủ 80% bề mặt bình (ở pha phát triển)

Pha ổn định: mật độ tế bào không tăng, số tế bào chết bằng tế bào sinh trưởng

Sự sinh trưởng của tế bào hạn chế do:

- Hết dưỡng chất trong môi trường nuôi cấy

- Các sản phẩm của quá trình trao đỗi chất có thể ức chế sự phát triển của tế b ào

- Tế bào đã phủ kín trên chất nền nên không còn chỗ bám và không thể sinh sản tiếp được

Pha suy giảm: số lượng tế bào chết tăng, mật độ tế bào sống giảm

2.11 Bảo quản lạnh tế bào nuôi cấy

Để bảo đảm sức khỏe nói chung hay sự phát triển của tế bào nuôi cấy nói riêng cần chú ý giảm thiểu khả năng rủi ro và sự tạp nhiễm Bên cạnh đó, khả năng phát

triển nhanh của tế bào sẽ thay đổi, như tất cả mọi sinh vật, những biến đổi do tuổi tác hay sự thay đổi môi trường có thể làm giảm khả năng và sự phát triển liên tục của tế bào

Có thể giải quyết những vấn đề này bằng cách bảo quản lạnh để dừng hoạt động sinh học tế bào, đặt chúng vào trong điều kiện ngừng hoạt động thật sự Trong một thời gian dài, ý tưởng này được xem là giả tưởng cho đến năm 1949, Polge, Smith và Parkes phát hiện rằng glycerol ngăn chặn được sự phá hủy tế bào khi đông lạnh (John

A Ryan, 2004) Và từ đó, người ta đưa ra nhiều quy trình đông lạnh tế bào, và đạt được kết quả rất tốt

Những ưu điểm của việc đông lạnh tế b ào nuôi cấy:

- Tiết kiệm thời gian và tiền của

- Có nguồn để đáp ứng ngay khi cần

- Cung cấp một loại tế bào thuần nhất và giảm thiểu sự phát triển và hóa già của

tế bào nuôi cấy

Tiến trình bảo quản lạnh tế bào:

- Lựa chọn tế bào: chọn bình tế bào nuôi cấy ở gần cuối giai đoạn pha phát triển

(đầy 90%) và thay môi trường phát triển mới trước thu hoạch 24 giờ Kiểm tra sự nhiễm (đặc biệt là Mycoplasma), kiểm tra sự đồng nhất của tế bào và cả một vài biểu hiện đặc biệt

- Thu hoạch tế bào: phải tiến hành đúng cách và thao tác thật nhẹ nhàng

- Đưa vào chất bảo quản lạnh: các chất có tác dụng bảo quản lạnh là methyl

acetamide, methyl alcohol, ethylene glycol và polyvinyl pyrrolidone… Tuy nhiên, DMSO (dimethylsulfoxide) và glycerol là thuận tiện và được sử dụng nhiều nhất Cần chú ý, DMSO là chất phân cực mạnh, dễ dàng thấm qua da và mang theo các chất có độc tính hay chất gây ung thư

- Đưa vào ống bảo quản

- Dán nhãn và ghi sổ

- Đưa vào bình bảo quản lạnh: Tốc độ làm lạnh thích hợp với hầu hết các dòng tế bào là giảm từ 1 đến 30C trong 1 phút Bảo quản dưới -1300C, giám sát lượng Nitơ lỏng thường xuyên, và cần phải ghi chép vào sổ đầy đủ

Một số vấn đề có thể ảnh hưởng đến kết quả bảo quản (John A Ryan,2004)

- Quá trình thu hoạch và thao tác trên tế bào: dư thừa tác nhân tách tế bào, sử

dụng chất bảo quản có chứa độc tính, đặt tế bào quá lâu ở nhiệt độ phòng hoặc pH không thích hợp…

- Tiến trình làm lạnh: tế bào bị hư hỏng nhiều và khả năng sống giảm thường do

tốc độ làm lạnh quá nhanh hoặc quá chậm, hoặc tiến trình làm lạnh bị gián đoạn Chất làm lạnh ở nồng độ không thích hợp cũng ảnh hưởng khả năng sống của tế bào

- Quá trình trữ lạnh: khả năng sống của tế bào giảm khi nhiệt độ ấm lên lúc vận

chuyển hoặc khi nhiệt độ bình chứa không ổn định

- Quá trình rã đông và hoạt hóa: rã đông quá lâu hoặc phương pháp tách chất bảo

quản không chính xác

2.12 Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào

Phục vụ cho nghiên cứu về tế bào động vật: sinh lý và sinh hóa tế bào, tương

tác giữa tác nhân gây bệnh và tế bào, tác dụng của thuốc đối với tế bào, tiến trình và sự hóa già và những nghiên cứu về dinh dưỡng

Nghiên cứu virus học: đây là ứng dụng cơ bản và sớm nhất của nuôi cấy tế bào

Nuôi cấy tế bào được sử dụng rộng rãi trong định danh và phân lập virus, cách thức virus xâm nhập và phát triển trong cơ thể

Điều chế vaccine: khả năng nhân lên của virus trong môi trường tế bào động vật

được sử dụng trong điều chế vaccine, bao gồm vaccine bại liệt, dại, vi êm gan siêu vi

B, sởi… đối với ngành chăn nuôi, sản xuất vaccine Gumboro, đậu gà, dịch tả vịt… Các chủng virus cường độc được nuôi cấy, nhân lên và cấy truyền nhiều lần trên môi trường lớp đơn tế bào phôi gà, các chủng virus trở nên nhược độc với cơ thể ký chủ, sử dụng môi trường tế bào chứa virus nhược độc này để điều chế vaccine Vaccine sản xuất từ tế bào có ưu điểm là độ tinh khiết và đơn vị kháng nguyên cao vì thế cho đáp ứng miễn dịch sớm và hiệu giá kháng thể đạt được cao

Xét nghiệm hiệu quả sử dụng của các loại thuốc: Các tế bào nuôi cấy được sử

dụng riêng hay kết hợp với các xét nghiệm trên cơ thể động vật để nghiên cứu hiệu quả của dược phẩm, hóa chất mới đối với sự tồn tại và phát triển của các loại tế bào khác nhau

Nghiên cứu ung thư: các tế bào ung thư có thể phát triển trong điều kiện nuôi

cấy Người ta sử dụng hóa chất, virus và phóng xạ làm biến đỗi các tế bào nuôi cấy bình thường thành các tế bào ung thư, từ đó nghiên cứu những nhân tố gây ra sụ biến đổi Nghiên cứu tế bào ung thư cung cấp các hệ thống xét nghiệm để xác định phương pháp và thuốc điều trị thích hợp cho từng bệnh ung th ư khác nhau

Sử dụng tế bào ở dạng mô và cơ quan thay thế

Sản xuất các chất thứ cấp từ tế b ào nuôi cấy:

- Sản xuất interferon (IFN) từ tế bào động vật Interferon do tế bào tiết ra khi bị virus tấn công có tính chất kháng virus v à kháng khối u

- Sản xuất các protein có giá trị trong y học và thương mại, bao gồm kháng thể đơn dòng, hormone, insulin…

Ngoài ra, công nghệ nuôi cấy tế bào còn ứng dụng cho lĩnh vực chẩn đoán di truyền, kỹ thuật di truyền và liệu pháp gen

2.13 Duck hepatitis virus type 1 (DHV-1)

Hình 2.4 Duck hepatitis virus type 1 (http://viralzone.expasy.org/all_by_species/758.html)

Đặc tính chung virus

- Virus có kích thước vô cùng nhỏ, kích thước trong khoảng 7,2 đến 9,0 kb (kilobases)

- Virus không có cấu tạo tế bào như các vi sinh vật khác

- Thành phần hóa học đơn giản, bao gồm protein và nucleic acid

- Không có khả năng sinh sản trong môi trường dinh dưỡng tổng hợp

- Sống ký sinh nội bào bắt buộc

- Một số virus ký sinh ở tế bào động vật và thực vật có khả năng tạo tinh thể (ví

dụ Tobacco mosai virus)

Virus viêm gan vịt type 1

Bệnh viêm gan do virus ở vịt là bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây lan nhanh Bệnh chủ yếu xảy ra ở vịt con từ mới nở đến 6 tuần tuổi với các bệnh tích đặc tr ưng gan sưng, nhạt màu, xuất huyết Trong đó, virus viêm gan type 1 (Duck Hepatitis type 1) là yếu tố gây bệnh chủ yếu

Virus viêm gan type 1 (DHV-1) là một RNA virus thuộc họ Picornaviridae,

không có vỏ, kích thước 20 – 40nm, đây là nhóm virus có tính đặc hiệu ký chủ (Phạm Hồng Sơn, 2006) (ví dụ: virus viêm gan vịt chỉ gây bệnh trên vịt không xảy ra trên gà), không gây ngưng kết hồng cầu virus có sức đề kháng cao, không bị bất hoạt khi xử lý

bằng ether hoặc fluorocarbon, chloroform, trypsin và 30% methanol hoặc ammonium sulfate (Woolcock và Faricant, 1997) Virus có thể tồn tại ở pH = 3 đến 9 giờ DHV-1 tương đối ổn định ở nhiệt độ dưới 40 – 450C nhưng dễ bị bất hoạt ở nhiệt độ cao hơn (Davis, 1987) Với nhiệt độ: Ở 500C virus chết sau 1 giờ, 600C chịu được 30 phút Ở

370C virus tồn tại 48 giờ, 40C trong 2 năm và -200C có thể tồn tại đến 9 năm

Trong chuồng trại ẩm ướt, trong phân vịt, virus có thể tồn tại 10 tuần Các chất sát trùng phải pha ở nồng độ cao và xử lý trong thời gian dài mới tiêu diệt được virus (Nguyễn Bá Hiên và Nguyễn Minh Tâm, 2007)

Khi gây nhiễm virus lên tế bào gan phôi vịt (DEL) (Woolcock, 1986) Ở cùng một nồng độ pha loãng, virus tác động gây bệnh lý tế bào (CPE), được đặc là tế bào nuôi cấy co tròn và hoại tử Khi che phủ với một phương tiện bảo dưỡng có chứa 1% agarose (trọng lượng/thể tích), CPE làm phát sinh mảng khoảng 1 mm

CHƯƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 thời gian và địa điểm

- Thời gian: từ tháng 8 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013

- Địa điểm: phòng thí nghiệm virus học, bộ môn Thú y, Khoa Nông nghiệp và

Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ

3.2 Vật liệu và hóa chất

Đối tượng thí nghiệm:

- Trứng vịt được mua từ các lò ấp thành phố Cần Thơ ấp 14 - 16 ngày để lấy tế bào thận và gan phôi vịt (DEK, DEL)

- Virus (DHV-1): nguồn virus DHV-1 được phân lập từ đàn vịt tỉnh Kiên Giang, qua 3 lần cấy truyền trên tế bào xơ phôi gà (Trung tâm công nghệ sinh học thành phố

Hồ Chí Minh)

Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

- Dụng cụ

Kéo lớn, kéo nhỏ, kẹp

Phiểu lọc thủy tinh, vải gạc

Đĩa Petri đường kính 9-10 cm

Beccher nhỏ 20-50 ml, 250 ml

Ống đong các loại

Hộp xốp

Ống ly tâm falcon loại 15 ml, 50 ml

Lame và lamelle, các type nhỏ (Eppendorf)

Đầu lọc tế bào 70 μm (milipore filter)

Ống nghiệm, cá từ

Pipette 1 ml, 2 ml, 5 ml, pipetteman, micropipette, pipettet -aid

Đầu cone 100 microliter, 1ml

Đĩa nuôi cấy microplate 96 giếng (Nunc A/S, Denmark)

Buồng đếm Neubauer (Haematocytometer, Marienfeld, Germany)

-Thiết bị sử dụng

Máy quay phim chụp ảnh Sony HD 720p

Máy ấp trứng (Dengenkiki Co., Ltd)

Tủ cấy vô trùng (Bio Clean Bench, SANYO Electric Biomedia Co., Ltd)

Tủ ấm CO2 (CO2 Incubator, SANYO Electric biomedical Co., Ltd)

Water bath (As One, Japan)

Cân phân tích (Sartotius AG, Germany)

Máy hấp autoclave (Sturdy Industrial Co., Ltd)

Máy lắc (Vortex, VELP Scientifica s.r.l, Italy)

Tủ sấy (Memmert GmbH + Co.KG)

Tủ lạnh -200C, -800C, 40C

Kính hiển vi soi ngược (Inverted microscope, OLYMPUS Tokyo, Japan)

Máy ly tâm thường, máy ly tâm lạnh (Hermle Labortechnik GmbH)

Máy ly tâm Haematocrit (Microhaematocrite Centrifuge, Kokusan Coporation Tokyo, Japan)

Máy ly tâm tube nhỏ (Ultra Centrifuge, Sigma, Japan)

Máy khuấy từ (Magnetic stirrer)

Máy đo OD (Powerware HT, Biotech)

Các loại hóa chất và môi trường

Nước cất vô trùng, nước muối sinh lý

Trypsine (Difco, USA)

EDTA (Dojindo Co., Ltd)

Đệm DPBS (-) (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd)

Thuốc nhuộm MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)

Formalin

Môi trường MEM (Gibco BRL., Grand Lan, NY, USA)

FBS đã bất hoạt ở 560C, 30 phút (huyết thanh bào thai bê – Foetal Bovine Serum-Gibco BRL., Grand Lan, NY, USA)

Peninicillin và Streptomycin (Invitrogen, UK)

Kháng nấm Amphotericin-B (Sigma)

Glutamine (Waka pure Chemical Industries, Ltd)

HEPES 1M

NaHCO3 7%

Isopropanol (Merck, Germany)

3.3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định một số điều kiện thích hợp để tạo môi tr ường thận phôi vịt (DEK) và gan phôi vịt (DEL) một lớp

+ Xác định nồng độ tế bào nuôi cấy ban đầu thích hợp với điều kiện thí nghiệm + Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ huyết thanh bổ sung vào môi trường tăng trưởng MEM lên sự tạo thành lớp tế bào đơn hai loại tế bào DEK và DEL

- Nuôi cấy thử nghiệm virus viêm gan vịt type 1 (DHV-1) trên môi trường DEK, DEL: So sánh khả năng sinh sản của DHV-1 trên từng loại môi trường tế bào dựa vào thời gian tạo CPE của từng loại môi trường, giá trị OD620 trung bìnhvà tỷ lệ tế bào sống trung bình

3.4 Phương pháp nghiên cứu

Chuẩn bị:

- Trước khi thực hiện, tủ nuôi cấy tế bào và dụng cụ được khử trùng bằng cách lau cồn 700 và chiếu tia UV trong khoảng 10-15 phút

- Dùng bông gòn thấm cồn 700 để lau trứng, đưa vào tủ nuôi cấy

Thực hiện nuôi cấy tế bào: DEK, DEL

- Dùng kéo lớn vô trùng làm rạn đỉnh của trứng và bóc dần vỏ đến rìa của buồng khí

- Dùng kẹp vô trùng bóc lớp màng lụa và chọc thủng màng đệm (CAM) trước khi kẹp nhẹ phần bên dưới đầu để nhấc phôi ra

- Kiểm tra phôi trước khi đưa vào đĩa petri có chứa sẵn dung dịch đệm DPBS Loại phôi nhợt nhạt, tim không đập (phôi chết), phôi nhiều lông (dễ gây tạp, dòng tế bào không đồng nhất)

- Rữa phôi trong đệm DPBS, Lấy phần tế bào cần nuôi cấy loại bỏ những phần không cần thiết Chú ý với thận phôi vịt thì ta nên lấy thận từ nhiều phôi trở lên vì thận phôi khá nhỏ

- Chuyển phần cần lấy nuôi cấy vào đĩa petri khác có sẵn đệm DPBS Dùng kéo nhỏ vô trùng cắt nhỏ Nghiêng đĩa cho các khối nhỏ lắng xuống và chắt bỏ phần dịch đệm bên trên

- Cho đệm DPBS vào đĩa và tiếp tục rửa để loại huyết cầu, tạp bẩn đến khi thấy phần dịch nước trong

- Chuyển các mẫu nhỏ phôi vào erlen 50 ml, bổ sung khoảng 10 ml dung dịch trypsine 0,25%-EDTA 0,2% lắc đều và để yên vài phút trước khi chắt bỏ dịch nước bên trên

- Thêm khoảng 10 ml dung dịch trypsine 0,25%-EDTA 0,2% vào erlen Cho cá

từ vào, đậy kín erlen và đặt lên máy khuấy từ

- Khuấy từ được 30 phút, đễ các mảnh mô ổn định lại rồi chắt lấy phần dịch n ước bên trên cho vào ống falcon và đặt trong cốc nước đá Phần cặn còn lại trong erlen thêm một ít dung dịch trypsine 0,25% -EDTA 0,2%, khuấy từ tiếp tục trong 15 phút

- Lọc huyền phù tế bào qua phểu sạch, vô trùng cho vào ống falcon Đem hai ống falcon ly tâm thường 1000 - 2000 vòng/phút trong 15 phút,

- Ly tâm xong rút bỏ phần nước trên bằng micropipette, hòa chung phần cặn hai ống lại và thêm một ít đệm DPBS, trộn đều đem ly tâm khoảng 1-2 lần với đệm DPBS

- Ly tâm xong rút bỏ phần đệm trong ống falcon ra, thêm môi trường tăng trưởng (MTTT) và ly tâm tiếp tục trong 15 phút, 1000 - 2000 vòng/phút Rút bỏ môi trường ra

và cho MTTT mới vào, trộn đều bằng micropipette

- Rút ra 0,1 ml huyền phù tế bào và 0,1 ml Trypan blue 0,3% (theo tỷ lệ 1:1), đếm tế bào dưới buồng đếm Neubauer để xác định mật độ tế b ào ban đầu

- Từ mật độ tế bào ban đầu tính ra thể tích và mật độ tế bào cần nuôi cấy, sau đó phân phối vào các đĩa microplate theo nồng độ và bố trí thích hợp theo yêu cầu thí nghiệm

- Đem đĩa nuôi cấy vào ủ trong tủ ấm 370C, 5% CO2, độ ẩm 80% Theo dõi sự phát triển của tế bào cho đến khi thu được môi trường tế bào một lớp

Cơ chế nhuộm MTT

Thuốc nhuộm MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) là loại thuốc nhuộm được dùng trong xác định tính độc tế bào của một tác nhân nghiên cứu hoặc đánh giá sự phát triển của tế bào nuôi cấy (Mosmann, 1983) Khi cho vào môi trường tế bào, MTT có màu vàng sẽ chuyển thành tinh thể formazan

đỏ tía dưới tác dụng của enzyme dehydrogenase của ty thể trong tế bào sống, do vậy lượng tinh thể sinh ra sẽ phụ thuộc mật độ tế bào sống có trong môi trường Tinh thể muối này không hòa tan được trong dung dịch có nước và được giữ lại trong tế bào

(Altman, 1976) Nhưng tinh thể có thể hòa tan được trong isopropanol có tính acid hoặc DMSO cho dung dịch đỏ tía, nồng độ của tinh thể có thể đánh giá bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) Giá trị OD thu được tỷ lệ với lượng tinh thể hình thành trong tế bào sống, qua đó đánh giá được mức tăng trưởng của tế bào cũng như tác động gây chết tế bào của tác nhân nghiên cứu

Trong các thí nghiệm 1 và thì nghiệm 2 sau khi các giếng tạo lớp trong khoảng 5 ngày thì tiến hành nhuộm MTT, xác định giá trị mật độ quang OD ở bước song 620

nm

Để đo mật độ quang OD620 tiến hành theo các bước sau:

- Rút bỏ MTTT ra khỏi giếng nuôi cấy, rữa 1 lần bằng DPBS

- Cho vào mỗi giếng 50 μl MTT, đem ủ 370C, 5% CO2, tránh ánh sáng, ủ trong 4 giờ Chú ý khi đưa thuốc nhuộm MTT vào giếng cần tránh thuốc nhuộm tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng

- Sau khi ủ, loại MTT ra khỏi giếng Cho 100μl isopropanol vào các giếng Lắc máy 30 phút, 600 vòng/phút

- Đem vào máy đọc giá trị OD620

3.4.1 Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ tế bào nuôi cấy thích hợp với điều kiện thí nghiệm

Nồng độ tế bào ban đầu được xác định bằng cách đếm tế bào dưới buồng đếm Neubauer Sử dụng công thức C1V1=C2V2 đễ pha loãng tế bào rồi đếm

Mục tiêu: Xác định mật độ nuôi cấy ban đầu cho hiệu quả tạo lớp đều, đồng

nhất Thời gian tạo lớp thích hợp với điều kiện thí nghiệm

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện trên 24 giếng cho mỗi loại tế bào theo 2 vị trí A và B (như hình 3.2) Trong đó vị trí A là dùng để nuôi cấy tế bào DEK từ các nồng độ nuôi cấy ban đầu, vị trí B là dùng để nuôi cấy tế bào DEL từ các nồng độ nuôi cấy ban đầu Loại MTTT được sử dụng là MEM có bổ sung 10% huyết thanh Hai loại tế bào DEK, DEL được pha loãng ra 4 nồng độ 3x105, 5x105, 7x105 và 10x105 tb/ml, sau đó phân phối các nồng độ này vào các giếng với lượng thể tích 100 μl/giếng, mỗi nồng độ

tế bào được lập lại 6 lần (6 giếng)

Hình 3.2 Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ thích hợp cho nuôi cấy

Sau khi phân phối xong, đưa vào tủ ấm CO2 để nuôi cấy Theo dõi sự phát triển của tế bào ở ba thời điểm cố đinh: 8 giờ sáng, 14 giờ chiều và 20 giờ tối Quan sát và ghi nhận hình ảnh dưới kính hiển vi soi ngược

Đến khoảng thời gian xác định khi nồng độ 5x105 tb/ml ở 2 loại tế bào đều tạo lớp thì tiến hành nhuộm MTT, sau đó đem đo mật độ quang OD620

Chỉ tiêu theo dõi:

-Thời gian trung bình tạo lớp đơn 2 loại tế bào (khoảng 80 - 90% diện tích đáy giếng)

-Hình thái tạo lớp đơn 2 tế bào

- Giá trị OD620 trung bình

Số liệu được xử lý bằng phép thử ANOVA-One Way, phần mềm Minitab 16.1

3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ huyết thanh FBS

bổ sung vào môi trường tăng trưởng MEM lên hiệu quả tạo lớp đơn tế bào

Nồng độ tế bào ban đầu được xác định bằng cách đếm tế bào dưới buồng đếm Neubauer Sử dụng công thức C1V1=C2V2 đễ pha loãng tế bào rồi đếm

Mục tiêu: Xác định nồng độ huyết thanh bổ sung vào môi trường ảnh hưởng đến

hiệu quả tạo lớp của 2 loại tế b ào (DEK, DEL) theo điều kiện thí nghiệm

Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện trên 24 giếng cho mỗi loại tế bào theo 2 vị trí C và D (như hình 3.3) Trong đó vị trí C là dùng để nuôi cấy tế bào DEK, vị trí D là dùng để nuôi cấy tế bào DEL Loại MTTT được sử dụng là MEM Huyết thanh FBS được bổ sung vào môi trường với 4 nồng độ 0%, 2%, 5%, 10% Mỗi nồng độ huyết thanh được

thử nghiệm với nồng độ pha loãng tế bào là 5x105 μl/giếng, trong đó mỗi nồng độ huyết thanh được lập lại 6 lần

Hình 3.3 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ huyết thanh lên

hiệu quả tạo lớp đơn tế bào

Sau khi phân phối xong, đưa vào tủ ấm CO2 để nuôi Theo dõi sự phát triển của

tế bào ba lần trong ngày: 8 giờ sáng, 14 giờ chiều và 20 giờ Quan sát và ghi nhận lại bằng hình ảnh

Các giếng được nhuộm với MTT cùng một lúc với thí nghiệm 1, đem đọc giá trị

OD620

Các chỉ tiêu theo dõi

- Thời gian trung bình tạo lớp tế bào đơn của 2 loại tế bào (khoảng 80 - 90% đáy giếng) (giờ)

- Hình thái tạo lớp 2 loại đơn tế bào

- Giá trị OD620 trung bình

Số liệu được xử lý bằng phép thử ANOVA-One Way, phần mềm Minitab 16.1