khảo sát hàm lượng một số loại cao điều chế từ nấm đông cô (lentinula edodes) loại tươi, khô loại lớn, khô loại nhỏ và phân lập hợp chất từ cao petroleum ether

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BỘ MÔN HÓA HỌC ------ NGUYỄN THỊ THU NGÂN KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG MỘT SỐ LOẠI CAO ĐIỀU CHẾ TỪ NẤM ĐÔNG CÔ LENTINULA EDODES LOẠI TƯƠI, KHÔ LOẠI LỚN, KHÔ LOẠI NHỎ

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA HỌC

- -

NGUYỄN THỊ THU NGÂN

KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG MỘT SỐ LOẠI CAO

ĐIỀU CHẾ TỪ NẤM ĐÔNG CÔ (LENTINULA EDODES)

LOẠI TƯƠI, KHÔ LOẠI LỚN, KHÔ LOẠI NHỎ VÀ

PHÂN LẬP HỢP CHẤT TỪ CAO PETROLEUM ETHER

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH HÓA HỌC

BỘ MÔN HÓA HỌC

- -

NGUYỄN THỊ THU NGÂN

KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG MỘT SỐ LOẠI CAO

ĐIỀU CHẾ TỪ NẤM ĐÔNG CÔ (LENTINULA EDODES)

LOẠI TƯƠI, KHÔ LOẠI LỚN, KHÔ LOẠI NHỎ VÀ

PHÂN LẬP HỢP CHẤT TỪ CAO PETROLEUM ETHER

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH HÓA HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TS LÊ THANH PHƯỚC

2013

Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc lập − Tự do − Hạnh phúc

Bộ Môn Hóa Học

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

1 Cán bộ hướng dẫn: TS Lê Thanh Phước

2 Đề tài: Khảo sát hàm lượng một số loại cao điều chế từ nấm Đông

cô (Lentinula edodes) loại tươi, khô loại lớn, khô loại nhỏ và phân

lập hợp chất từ cao petroleum ether

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thu Ngân MSSV: 2102273

Lớp: Hóa học – Khóa 36

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức của LVTN:

………

b Nhận xét về nội dung của LVTN (Đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

TS Lê Thanh Phước

Bộ Môn Hóa Học

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ CHẤM PHẢN BIỆN

1 Cán bộ chấm phản biện:

2 Đề tài: Khảo sát hàm lượng một số loại cao điều chế từ nấm Đông

cô (Lentinula edodes) loại tươi, khô loại lớn, khô loại nhỏ và phân

lập hợp chất từ cao petroleum ether

3 Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thu Ngân MSSV: 2102273

Lớp: Hóa học – Khóa 36

4 Nội dung nhận xét:

a Nhận xét về hình thức của LVTN:

b Nhận xét về nội dung của LVTN (Đề nghị ghi chi tiết đầy đủ):

 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

LỜI CẢM ƠN - -

Để đạt được những kết quả như hôm nay phải trải qua quá trình tìm tòi nghiên cứu không mệt mỏi Do kiến thức và kỹ năng chuyên môn còn hạn chế nên tôi đã gặp rất nhiều khó khăn Tuy nhiên, dưới sự dìu dắt tận tình của quý thầy cô trong bộ môn, sự động viên giúp đỡ của người thân, bạn bè, tôi đã hoàn thành công việc nghiên cứu của mình, trao dồi và tích lũy thêm nhiều kiến thức rất bổ ích cho bản thân, chuẩn bị hành trang khi ra trường

Lời đầu tiên em xin được gửi lời cám ơn chân thành, sâu sắc đến thầy Lê Thanh Phước, thầy đã luôn bên cạnh hướng dẫn và chỉ dạy em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến tất cả quý thầy cô trong khoa Khoa Học Tự Nhiên, các thầy cô trong Bộ môn Hóa, cô cố vấn học tập Nguyễn Thị Ánh Hồng Quý thầy cô đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt cho em những kiến thức rất bổ ích trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Con xin cám ơn cha mẹ đã luôn ở bên con động viên tinh thần, chăm lo

và dành cho con những gì tốt nhất, giúp con yên tâm thực hiện tốt công việc nghiên cứu của mình mặc dù gia đình còn rất nhiều khó khăn

Lời cuối tôi xin được gửi lời chân thành, thân mến đến tất cả các bạn Hóa Học K36, các bạn lớp Hóa Dược K36 đã luôn ở bên cạnh tôi, cùng tôi vượt qua những ngày tháng đáng nhớ trong cuộc đời

Xin chân thành cám ơn!

TÓM TẮT - -

Bằng phương pháp tách chiết thông thường như kỹ thuật chiết rắn – lỏng

và kỹ thuật chiết lỏng – lỏng, tiến hành điều chế cao tổng etanol từ 3 loại nấm

Đông cô (Lentinula edodes) tươi, khô loại lớn và khô loại nhỏ bán trên thị

trường Định tính các nhóm chức có trong dịch chiết ban đầu nhận thấy trong thành phần nấm có chứa: alkaloid, flavonoid, terpenoid – sterol, glucoside, không có saponin và tanin

Từ cao tổng etanol tiếp tục điều chế 3 loại cao thành phần: petroleum

ether, etyl acetate, n−butanol Sau đó so sánh khối lượng các cao thu được từ 3

loại nấm nêu trên

Dựa vào phương pháp cô lập các hợp chất thiên nhiên, sắc ký cột kết hợp sắc ký lớp mỏng, cô lập được 2 hợp chất có trong cao petroleum ether từ nấm Đông cô tươi Phân tích phổ từ viện Hóa Học – phòng NMR xác định được chất thứ nhất là ergosterol – một sterol có trong tế bào nấm, dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời hợp chất ergosterol sẽ được chuyển hóa thành vitamine D2 Hợp chất thứ 2 là ergosterol peroxide dạng chuyển hóa của chất thứ nhất Cả 2 hợp chất tìm được đều có hoạt tính sinh học cao và được quan tâm nghiên cứu

ABSTRACT - -

By conventional extraction techniques such as solid − liquid and liquid −

liquid extraction Modulation total ethanol from 3 kinds of shiitake (Lentinula edodes) fresh, large dried and small dried on the market Quantitative analysis

of the functional groups present in the initial organic extracts Containing the alkaloids, flavonoids, terpenoids − sterols, glucosides in ingredients of shiitake There aren’t present of tanins and saponins

From the total ethanol extract, continue to product 3 component categories extract: petroleum ether, ethyl acetate, n−buthanol Then compare the volume obtained from 3 kinds of above fungi

Based on the method isolation of natural compounds, column chromatography combined with thin layer chromatography Two compounds are isolated in extract petroleum ether from fresh shiitake NMR spectral analysis, the first substance is identified as ergosterol − a sterol present in fungal cells, under the influence of sunlight ergosterol compound will be converted to vitamine D2 The second sudstance is ergosterol peroxide − This sterol is trans − formed from ergosterol by photo − oxidation with singlet oxygen Both of all have bioactivity needs to research

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên: Nguyễn Thị Thu Ngân, MSSV 2102273, lớp KH1069A1

Đề tài thực hiện: “Khảo sát hàm lượng một số loại cao điều chế từ nấm

Đông cô (Lentinula edodes) loại tươi, khô loại lớn, khô loại nhỏ và phân lập

hợp chất từ cao petroleum ether”

Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của bản thân, theo sự gợi ý của cán bộ hướng dẫn Các thông tin về số liệu, hình ảnh, kết quả

đã được trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa từng được công bố ở bất kỳ luận văn nào trước đây

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

Nguyễn Thị Thu Ngân

MỤC LỤC

- -

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT ix

Chương 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu chung về chi Lentinula 3

2.2 Giới thiệu về nấm Đông cô (Lentinula edodes) 4

2.2.1 Tên gọi, xuất xứ và phân loại 4

2.2.2 Đặc điểm thực vật 4

2.2.3 Thành phần hóa học 5

2.2.4 Công dụng 6

2.2.5 Nghiên cứu trong và ngoài nước 8

Chương 3: PHƯƠNG TIỆN − PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

3.1 Địa điểm, thời gian, phương tiện nghiên cứu 10

3.1.1 Địa điểm 10

3.1.2 Thời gian 10

3.1.3 Phương tiện nghiên cứu 10

3.2 Phương pháp nghiên cứu 10

3.2.1 Phương pháp chiết tách 10

3.2.2 Phân lập hợp chất hữu cơ 11

3.3 Phương pháp chiết tách 11

3.3.1 Kĩ thuật chiết ngâm dầm (rắn − lỏng) 11

3.3.2 Kĩ thuật chiết lỏng – lỏng 12

3.4 Sắc ký lớp mỏng (SKLM) 13

3.4.1 Giới thiệu chung 13

3.4.2 Chất hấp phụ silica gel 14

3.4.3 Dung môi giải ly 15

3.4.4 Các kỹ thuật SKLM 16

3.4.5 Ứng dụng của SKLM 17

3.5 Sắc ký cột 17

3.5.1 Nguyên tắc 18

3.5.2 Kỹ thuật triển khai 18

3.5.3 Quá trình giải ly cột 20

Chương 4: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Xử lý nguyên liệu và định tính các nhóm chức 22

4.1.2 Định tính các nhóm chức 22

4.2 Điều chế các loại cao 26

4.2.1 Điều chế cao etanol tổng (EtOH) 26

4.2.2 Điều chế cao thành phần 26

4.2.3 So sánh khối lượng cao 28

4.3 Phân lập hợp chất có trong cao PE 28

4.3.1 Quá trình phân lập chất trên cao PE 28

4.3.2 Quá trình phân lập chất trên phân đoạn I cao PE 29

4.3.3 Biện luận cấu trúc hợp chất vừa phân lập 31

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34

5.1 Kết luận 34

5.1.1 Khối lượng các loại cao 34

5.1.2 Hợp chất phân lập 34

5.2 Kiến nghị 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

PHỤ LỤC 38

DANH MỤC HÌNH

- -

Hình 2.1: Lentinula aciculospora 3

Hình 2.2: Lentinula boryana 3

Hình 2.3: Lentinula cubensis 3

Hình 2.4: Lentinula edodes 3

Hình 2.5: Lentinula raphanica 3

Hình 3.1: Kỹ thuật chiết ngâm dầm 12

Hình 3.2: Cách tính giá trị Rf 14

Hình 3.3: Cấu trúc mạng silica gel 15

Hình 3.4: Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng 2 chiều 16

Hình 3.5: Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng điều chế 17

Hình 4.1: Nấm Đông cô tươi, khô loại lớn và khô loại nhỏ 22

Hình 4.2: Định tính alkaloid với thuốc thử Dragendrorff 23

Hình 4.3: Định tính alkaloid với thuốc thử Mayer 23

Hình 4.4: Định tính flavonoid 24

Hình 4.5: Định tính steroid 24

Hình 4.6: Định tính đường khử 25

Hình 4.7: Sơ đồ tổng quát quá trình điều chế các loại cao 27

Hình 4.8: SKLM phân đoạn I, I4 và I5 30

Hình 4.9: SKLM hợp chất PHUOC_NS1 với 3 hệ dung môi khác nhau 30

Hình 4.10: SKLM hợp chất PHUOC_NS2 với 3 hệ dung môi khác nhau 31

Hình 4.11: Hợp chất ergosterol 31

Hình 4.12: Sự chuyển hóa ergosterol 32

Hình 4.13: Hợp chất ergosterol peroxide 33

Hình 4.14: Sự chuyển đổi ergosterol thành ergosterol peroxide 33

DANH MỤC BẢNG

- -Bảng 2.1: Giá trị dinh dưỡng trên 100 g nấm Đông cô khô 6

Bảng 4.1: Bảng xác định độ ẩm 22

Bảng 4.2: Kết quả định tính một số nhóm chức 25

Bảng 4.3: Khối lượng cao tổng và hiệu suất thu cao tổng 26

Bảng 4.4: Khối lượng cao PE và hiệu suất thu cao 26

Bảng 4.5: Khối lượng cao Ea và hiệu suất thu cao 26

Bảng 4.6: Khối lượng cao n−butanol và hiệu suất thu cao 27

Bảng 4.7: Bảng tổng kết khối lượng các cao thu được 28

Bảng 4.8: Kết quả sắc ký cột cao PE nấm tươi 29

Bảng 4.9: Kết quả sắc ký cột phân đoạn I 29

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

C−NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance

DEPT Detortionless Enhancement Polarization Transfer

Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Giới thiệu

Hơn 3000 năm trước con người đã biết đến nhiều hiệu quả từ nấm Đông

cô như một vị thuốc quý có tác dụng tăng cường khí lực, kích thích ăn uống, điều hòa khí huyết,… Cho đến nay lợi ích của nấm Đông cô ngày càng được khai thác với những giá trị cao về dược phẩm cũng như thực phẩm Nấm Đông

cô chứa nhiều protein, carbohydrate, giàu khoáng chất, amino acid thiết yếu, vitamine và các nguyên tố vi lượng,… Đặc biệt các thành phần có hoạt tính sinh học: lentinan, lentinula mycelium edodes, ergosterol, ergosterol peroxide,

L–ergothionine, eritadenine, các chất kháng oxy hóa như vitamine C, selen,…

có trong nấm Đông cô là tiềm năng lớn trong y học

Ngày nay khi xã hội ngày càng phát triển, sức khỏe là vấn đề được quan tâm hàng đầu Bên cạnh rất nhiều loại thuốc được tạo ra từ quá trình tổng hợp, con người ngày càng có xu hướng tìm về với cội nguồn thảo dược thiên nhiên Chính vì vậy việc nghiên cứu về thảo dược góp phần quan trọng được rất nhiều nhà khoa học quan tâm Công việc tìm hiểu, nghiên cứu không những giúp ta hiểu rõ về thành phần hóa học của thảo dược mà còn giúp ta hiểu hơn

về tác dụng và tính chất của dược liệu

Trên thị trường hiện nay nấm Đông cô được bán dưới dạng nấm Đông cô tươi, nấm Đông cô được sấy khô có loại lớn và loại nhỏ Vậy thành phần dinh dưỡng trong 3 loại nấm trên có gì khác biệt? Trong phạm vi giới hạn của đề tài, nghiên cứu này sẽ góp phần giúp tìm hiểu rõ hơn về hàm lượng chất dinh dưỡng dưới dạng cao được điều chế có trong từng loại nấm Đông cô tươi và khô nêu trên Đây sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu sâu và rộng hơn về loại nấm

có nhiều giá trị về dinh dưỡng cũng như giá trị dược phẩm này Đồng thời, phân lập chất trên cao petroleum ether từ nấm Đông cô tươi dựa vào kỹ thuật sắc ký và xác định cấu trúc chất phân lập được, đó là lý do tiến hành nghiên cứu và thực hiện đề tài: “Khảo sát hàm lượng một số loại cao điều chế từ nấm

Đông cô (Lentinula edodes) loại tươi, khô loại lớn, khô loại nhỏ và phân lập

hợp chất từ cao petroleum ether”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Ngâm dầm và thu dịch chiết etanol từ 3 loại nấm Đông cô (Lentinula edodes) tươi, khô lớn và khô nhỏ có bán trên thị trường

Định tính các nhóm chức có trong dịch chiết etanol ban đầu

Điều chế cao tổng etanol Từ cao etanol tổng tiếp tục điều chế 3 loại cao

thành phần: cao petroleum ether, cao etyl acetate, cao n−butanol So sánh hàm

lượng các cao thu được từ 3 loại nấm nêu trên

Sử dụng các kỹ thuật cô lập hợp chất thiên nhiên, tiến hành phân lập chất trên cao petroleum ether và xác định cấu trúc hợp chất phân lập được

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về chi Lentinula

Lentinula là một chi nấm tán mọc trên gỗ, phân bố rộng ở vùng nhiệt đới

bao gồm 8 loài:

Lentinula aciculospora, Lentinula boryana, Lentinula cubensis, Lentinula raphanica, Lentinula edodes, Lentinula guarapiensis, Lentinula lateritia, Lentinula novae − zelandiae

Chi Lentinula được lập bởi Franklin Sumner Earle năm 1909, trong đó phổ biến nhất là loài Lentinula edodes

2.2 Giới thiệu về nấm Đông cô (Lentinula edodes)

2.2.1 Tên gọi, xuất xứ và phân loại

Tên thường: Shiitake, nấm Đông cô, nấm Hương, nấm đen Trung Quốc

Tên khoa học: Lentinula edodes

Xuất xứ: Nấm Đông cô là loại nấm ăn có nguồc gốc bản địa ở vùng Đông Á

Phân loại như sau:

Giới: Nấm Ngành: Basidiomycota

Lớp: Homobasidiomycetes Bộ: Agaricales

Nấm Đông cô có một chân hình trụ, dài khoảng 3–10 cm, đường kính 0,5–1 cm đính vào giữa tai nấm

Mặt trên tai nấm màu nâu, mặt dưới có nhiều nếp mỏng xếp lại Trên mặt nấm có những vảy nhỏ màu trắng Thịt nấm màu trắng

2.2.2.2 Phân bố

Nấm Đông cô phân bố rộng ở Châu Á, thường mọc hoang ở Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái Lan,…

Ở nước ta nấm Đông cô phân bố tự nhiên ở vùng rừng núi Lào Cai (Sa

Pa), Yên Bái, Tuyên Quang, Hoà Bình, Bắc Thái, Cao Bằng, Lạng Sơn

Thường mọc trên thân cây gỗ mục như: Côm tầng (Elaeocarpus dubius), cây

Dẻ đỏ (Quercus), Sồi bộp (Pasania), Re đỏ (Cinnamomum) vào mùa lạnh nơi

có điều kiện thoáng gió, có ánh sáng và ẩm ướt

2.2.2.3 Gây trồng nhân tạo

Hiện nay người ta đã biết đến việc gây trồng nhân tạo nhằm khai thác tiềm năng cũng như thu lại hiệu quả kinh tế từ loại nấm này Mô hình trồng nhân tạo được nhân rộng với quy mô trang trại và có tính thương mại cao

Người dân đốn các cây cỡ lớn, dài khoảng 5 m, để nằm ở nơi thoáng có ánh sáng mặt trời chiếu vào Giữ cẩn thận cho vỏ cây khỏi bong ra Sau khi loại bỏ tất cả cành lá rườm rà, chặt sâu xuống thân cây những rạch ngang sâu

từ 6−10 cm, mỗi rạch cách nhau 50−100 cm; mục đích của việc chia cây gỗ thành nhiều đoạn như thế là để lấy nơi cho nhựa cây thoát ra, cây sẽ mau mục Sau đó người ta thường lấy nấm Đông cô đã già đem ngâm vào nước vo gạo trong một ngày đêm rồi tưới lên khúc gỗ Hoặc lấy bào tử nấm xát ở mặt trên cây gỗ, vì chỉ ở nơi nào có ánh sáng mặt trời chiếu tới thì nấm mới mọc

Sau một năm, nấm đã bắt đầu nẩy lên và đã có thể thu hoạch nhưng nấm còn nhỏ, phải đợi khoảng 2 năm thì tốt hơn Một cây gỗ chặt như trên sẽ cho

được từ 5−10 kg nấm tươi, có thể cho thu hoạch đến năm thứ 6

2.2.3 Thành phần hóa học

Nấm Đông cô có hàm lượng protein cao, từ 23−24% trong sợi nấm và có thể so sánh với lượng protein có trong thịt Trong thành phần có đầy đủ các acid amin thiết yếu cơ thể người không tổng hợp được như: isoleucin, leucin, lysine, methionin, phenylalanine, threonin, histidin, tryptophan, valin [1-3], Chất béo với hàm lượng 8−9% trọng lượng khô, bao gồm: các acid béo

tự do, monoglyceride, diglyceride, triglyceride, phospholipids chủ yếu là phosphatidylcholine, sterol,… Các chất béo thiết yếu chiếm từ 54−76% tổng lượng chất béo [1-3]

Tổng lượng carbohydrate gồm: đường pentose, hexose, disaccharide, trehalose, Nguồn chất xơ không hòa tan như: cenlulose, ligin, chitin và hòa tan như: β–glucan, chitosan Trong đó chitin là thành phần chính cấu tạo nên vách tế bào sợi nấm Hàm lượng chất xơ nấm Đông cô khoảng 7−14% [3-5] Nấm Đông cô chứa nhiều loại vitamine cần thiết cho cơ thể như: B1, B2,

B3, B5, B6, vitamine C, tiền vitamine D Các khoáng chất vi lượng cần thiết như: natri, canxi, phospho, sắt, đồng, magie, selen,… Hơn nữa trong thành phần nấm Đông cô có khoảng 30 enzyme trong đó có những enzyme quan trọng như: amylase, aromatase, cenlulase, 5–α–reductase [3],

Hoạt chất lentinan và lentinula edodes mycelium (LEM) từ nấm Đông

cô Đây là 2 chất chính tạo nên tác dụng dược lý của loại nấm này Ngoài ra nấm Đông cô còn chứa: 5΄−GMP, lethionine và alcol tạo nên hương thơm rất đặc trưng, eritadenine, L–erothioneine, ergosterol peroxide đều có hoạt tính sinh học được quan tâm [6-9]

Bảng 2.1: Giá trị dinh dưỡng trên 100 g nấm Đông cô khô

ưa thích và là những bài thuốc Đông y có giá trị chữa bệnh hiệu quả

Canh nấm Đông cô: Tác dụng giảm mỡ máu, điều hòa lipid trong máu

Rau cần xào nấm: Rất tốt cho người mỡ máu cao, người bệnh mạch vành, đồng thời có tác dụng thanh nhiệt bình can

Gà hầm nấm: Công dụng kiện tỳ, bổ thận, ích khí, dưỡng huyết, dùng để chữa các chứng bệnh có biểu hiện khí huyết suy nhược, mệt mỏi nhiều, mắt

mờ, đầu choáng, mất ngủ, hay quên

Nấm nấu đậu: Rất tốt cho trẻ em bị còi xương, người già bị loãng xương

và chứng phù thũng

Bầu dục xào nấm: Bổ thận, tráng dương, kích thích tiêu hóa, thích hợp cho những người yếu sinh lý, đau lưng, mỏi gối, ăn uống không ngon miệng Hải sâm xào nấm: Ích khí, bổ âm, cầm máu, tiêu viêm và phòng chống ung thư, đặc biệt là ung thư dạ dày

Chân giò hầm nấm: Bồi bổ âm dương, dưỡng huyết, kích thích sự thèm

ăn, tăng số lượng và chất lượng sữa ở phụ nữ nuôi con bú

2.2.4.2 Giá trị dược phẩm

Tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể: Các polysaccharide, đặc biệt

là β–glucan trong nấm Đông cô có khả năng hoạt hoá miễn dịch tế bào, thúc đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào lympho, kích hoạt tế bào lympho T và lympho B − những tế bào đóng vai trò chính trong bảo vệ cơ thể Nấm Đông cô được coi là thực phẩm cho những người bị thiếu máu do thiếu sắt, cao huyết áp, tiểu đường, trẻ em suy dinh dưỡng Là nguồn cung cấp khoáng chất vi lượng cần thiết cho cơ thể

Kháng khuẩn và virus: Chất lentinan trong nấm Đông cô có khả năng kháng khuẩn, virus, kháng nấm bệnh và ký sinh trùng, chống bội nhiễm khuẩn

ở các bệnh nhân AIDS Nghiên cứu cho thấy hiệu quả điều trị từ việc sử dụng thuốc có chứa hoạt chất chiết xuất từ nấm Đông cô đạt 80,5% [10-12]

Chống ung thư: Các công ty của Nhật như Công ty Ajinomoto, Yamanouchi đã từ sợi nấm Đông cô bào chế ra lentinan như là một dược phẩm chống ung thư, đặc biệt trong điều trị ung thư dạ dày cho hiệu quả cao, không

có tác dụng phụ, do đó được áp dụng như một phương pháp trị liệu có hiệu quả cao cho các bệnh nhân Ngay cả trong những trường hợp ung thư đường

dạ dày − ruột đến giai đoạn 3, kết quả vẫn rất khả quan

Giảm cholesterol: Thành phần eritadenine làm giảm mức cholesterol và các lipid trung tính trong máu Chính vì vậy, nấm Đông cô được sử dụng để điều trị các bệnh về tim mạch Ngoài ra còn có tác dụng điều chỉnh rối loạn

lipid máu, làm hạ lượng cholesterol, triglyceride và β−lipoprotein trong huyết thanh, vì vậy có tác dụng điều tiết công năng tim mạch, tăng lưu lượng máu động mạch vành, hạ thấp oxy tiêu thụ và cải thiện tình trạng thiếu máu cơ tim Giải độc và bảo vệ tế bào gan: Giảm thiểu tác hại của các chất như carbon tetrachloride, thioacetamide và prednisone đối với tế bào gan, làm tăng hàm lượng glycogen trong gan và hạ thấp men gan

Thanh trừ các gốc tự do và chống lão hoá: Gốc tự do là các sản phẩm có hại của quá trình chuyển hoá tế bào Nấm Đông cô có chứa L–erothioneine, vitamine C, vitamine E, ergosterol peroxide, polyphenolic và selen, tác dụng thanh trừ các sản phẩm từ quá trình chuyển hóa này, làm giảm lượng mỡ trong

cơ thể, từ đó có khả năng làm chậm quá trình lão hóa và kéo dài tuổi thọ

Hàm lượng vitamine B cao cần thiết trong bảo vệ cơ thể, chống lại nhiều chứng bệnh như Parkinson và Alzheimer Ergosterol chuyển hóa thành vitamine D giúp cơ thể hấp thu tốt canxi và phospho, tăng cường quá trình cốt hóa, hạn chế loãng xương Ngoài ra sự biến đổi hợp chất ergosterol thành ergosterol peroxide là một hợp chất có tính kháng viêm, kháng khuẩn và hạn chế sự phát triển của khối u [12-14]

Aromatase biến androgen được coi là kích thích tố dương trở thành estrogen kích thích tố âm Làm hạ kích thích tố âm sẽ làm giảm nguy cơ gây

ra ung thư tuyến tiền liệt và một vài loại ung thư vú Enzyme 5–α−reductase ngăn chặn sự biến thể của testosterone thành dihydrotestosterone (DHT) một loại kích thích tố khởi xướng ra bệnh ung thư tuyến tiền liệt [1-3, 8]

2.2.5 Nghiên cứu trong và ngoài nước

Đã có rất nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần dược tính

có giá trị của loại nấm này, trong đó phải nhắc tới nghiên cứu gần đây của các nhà khoa học trong phát hiện hợp chất lentinan từ sợi nấm Đông cô có đặc tính chống ung thư hiệu quả cao

Trường Công nghệ Sinh Học, Đại học Quốc gia, thành phố Hồ Chí Minh nghiên cứu hàm lượng protein, lipid, carbohydrate,… trong một số loại nấm

ăn thông thường ở miền Nam, Việt Nam trong đó có Lentinula edodes [4]

Nghiên cứu đa dạng của các loài nấm Đông cô (Lentinula edodes) ở Sa

Pa, Letinula CF Lateritia ở Langbiang, Đà Lạt và Letinula SP mới tìm thấy ở

Cát Tiên, Việt Nam do Sở Khoa học và Công nghệ Lâm Đồng, trường Đại học

Đà Lạt, Vườn Quốc gia Cát Tiên, Đồng Nai hợp tác thực hiện [16]

Y Choy và cộng sự thuộc trường Đại học Chungbuk, Hàn Quốc nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính chống oxy hóa các hợp chất có trong nấm Đông cô [9]

Nghiên cứu của Julita Reguła và Marek Siwulski, Đại học Nông nghiệp Poznan năm 2007 về hàm lượng các nguyên tố vi lượng có trong nấm Đông cô loại khô [5]

Nghiên cứu của khoa Vi sinh vật, Đaị học Nihon, Masudo Nhật Bản Chiết xuất chloroform, etyl acetate và nước các chất kháng khuẩn có nguồn

gốc từ răng miệng Streptococcus spp., Actinomyces spp., Lactobacillus spp., Prevotella spp và Porphyromonas spp [10]

Định lượng các hoạt chất có hoạt tính sinh học eritadenine trong nấm Đông cô Đại học Công nghệ, Thụy Điển [17]

Nghiên cứu của Michael và cộng sự, phân tích thị trường nấm Đông cô

và khảo sát chất lượng nấm được trồng trong những điều kiện khác nhau [15]

Chương 3: PHƯƠNG TIỆN − PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm, thời gian, phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm

Đề tài luận văn: “Khảo sát hàm lượng một số loại cao điều chế từ nấm

Đông cô (Lentinula edodes) loại tươi, khô loại lớn, khô loại nhỏ và phân lập

hợp chất từ cao petroleum ether” được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa Hữu Cơ – khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại học Cần Thơ

3.1.2 Thời gian

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 8/2013 đến tháng 11/2013

3.1.3 Phương tiện nghiên cứu

Máy cô quay: Điều chế các cao, cô quay các phân đoạn

Các thiết bị: Cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, bình cầu, ống mao quản,

3.1.3.2 Hóa chất

Các dung môi: Etanol 96o, petroleum ether 60−90, chloroform, etyl

acetate, n−butanol, aceton để rửa dụng cụ

Các thuốc thử định tính các nhóm chức: Dragendrorff, Mayer, Stiasny, HCl, NaOH, (CH3COO)2Pb,

Silica gel 60 (0,04–0,06 mm), bảng mỏng tráng sẵn

Dung dich H2SO4 đậm đặc dùng để pha thuốc thử hiện hình

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp chiết tách

Nấm Đông cô sau khi mua ngoài thị trường được sắc nhỏ, phơi khô và xay thành bột Sau đó sử dụng phương pháp chiết rắn – lỏng, ngâm trong etanol 96o, thu dịch chiết etanol

Định tính nhóm chức: Alkaloid, flavonoid, terpenoid − steroid,

Điều chế cao: cao etanol tổng, cao petroleum ether, cao etyl acetate, cao

n−butanol Sử dụng phương pháp chiết lỏng – lỏng, cô quay thu dung môi

So sánh các cao điều chế được từ nấm Đông cô tươi, nấm Đông cô khô loại lớn và loại nhỏ

3.2.2 Phân lập hợp chất hữu cơ

Để có thể phân lập hợp chất thiên nhiên thường sử dụng phương pháp sắc ký cột và sử dụng sắc ký lớp mỏng song song sắc ký cột để theo dõi quá trình giải ly Sắc ký lớp mỏng góp phần nhận định chất tách được đã tinh khiết hay chưa

Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất phân lập được, ghi phổ 1H−NMR, phổ 13C−NMR, phổ DEPT−NMR đo tại phòng phân tích cấu trúc Viện Hóa học, Trung tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc gia, địa chỉ số 18 Hoàng Quốc Việt − Cầu Giấy − Hà Nội

3.3 Phương pháp chiết tách

3.3.1 Kĩ thuật chiết ngâm dầm (rắn − lỏng)

Ngâm mẫu bột trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không

gỉ, bình có nắp đậy Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đều xấp xĩ bề mặt Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào và hòa tan các hợp chất tự nhiên Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc, cô quay thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa và tiếp tục quá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu

Có thể gia tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xóc đều lớp bột hoặc có thể gắn vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dịch chiết bị trào ra ngoài) Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủ

vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến khi đạt mức bão hòa Dung môi sau khi thu hồi được làm khan nước bằng các chất làm khan và được tiếp tục sử dụng để chiết các lần sau

Trong thực nghiệm, việc chiết rắn − lỏng được áp dụng nhiều, gồm sự ngấm kiệt, ngâm dầm, trích với máy chiết soxhlet,… Ngoài ra, còn có chiết với phương pháp lôi cuốn hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêu tới hạn, kỹ thuật chiết pha rắn SPE [18-21]

Hình 3.1: Kỹ thuật chiết ngâm dầm

3.3.2 Kĩ thuật chiết lỏng – lỏng

Kỹ thuật chiết lỏng − lỏng thường được áp dụng để:

- Chiết hợp chất cần quan tâm ra khỏi dung dịch ban đầu

- Phân chia cao alcol thô ban đầu có chứa quá nhiều loại hợp chất từ không phân cực đến rất phân cực thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau

Nguyên tắc: Dung môi không phân cực như: Petroleum ether, hexane,

sẽ hoà tan tốt các hợp chất không phân cực: Các alcol béo, ester béo,… Dung môi phân cực trung bình như: Diethyl ether, chloroform,… sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình chứa nhóm chức ether −O−, aldehyde

−CHO, ketone −CO−, ester −COO−,… Dung môi phân cực mạnh như: Metanol, butanol, nuớc,… hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh chứa các nhóm chức −OH, −COOH,…

Việc chiết lỏng − lỏng được thực hiện bằng bình lóng, trong đó cao alcol thô ban đầu được hoà tan vào pha nước Sử dụng lần lượt các dung môi hữu

cơ, loại không hòa tan với nước hoặc có thể hỗn hợp được với nước để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tùy vào độ phân cực của dung môi) Tùy vào tỷ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu

cơ nằm ở lớp trên hoặc ở dưới so với pha nước Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực thí dụ như: petroleum ether hoặc hexane, chloroform, dichloromethane, ethyl acetate,

n−butanol,… Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều

lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, chiết đến khi không còn chất

Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan như Na2SO4, MgSO4, CaSO4,… cô quay đuổi dung môi thu được cao chiết Để kiểm tra xem các hợp chất nào đã được chiết vào pha hữu

cơ cũng như các hợp chất nào còn lại ở trong pha nước và chiết bao nhiêu lần thì hoàn tất, có thể sử dụng sắc ký lớp mỏng, trên bản mỏng cần so sánh đồng thời vết của pha nước và của pha hữu cơ Sự chiết bởi một dung môi cụ thể nào đó được coi là hoàn tất khi lần chiết thứ n, trên bảng mỏng không còn nhìn thấy vết của chất đó trong pha nước cũng như trong pha hữu cơ Cũng có thể kiểm tra bằng cách nhỏ một giọt dung dịch chiết lần thứ n lên trên một tấm kính sạch, sau khi bay hết dung môi, không còn để lại vết gì trên mặt kính

Chiết lỏng − lỏng được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nếu gia tăng nhiệt độ cho dung môi thì khả năng hòa tan của dung môi sẽ tăng lên và nguyên tắc nêu trên sẽ có nhiều thay đổi

Lưu ý: Khi thực hiện kỹ thuật chiết lỏng − lỏng do phải lắc bình lóng nhiều lần, nên ở những lần chiết sau dung môi trong bình lóng tạo nhủ tương

Để khắc phục nhược điểm này dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ dung dịch hoặc

cọ xát vào thành bình, chổ mặt thoáng của dung dịch nhằm xóa bỏ bọt khí, nhanh chóng phân thành 2 lớp, ngoài ra cũng có thể dùng kỹ thuật chiết pha rắn SPE [18-21]

3.4 Sắc ký lớp mỏng (SKLM)

3.4.1 Giới thiệu chung

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography (TLC)) còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), là kỹ thuật phân bố rắn – lỏng, trong đó pha động là một dung môi hay một hỗn hợp dung môi, di chuyển qua một pha tĩnh

là một chất hấp phụ trơ như silica gel hay oxit alumin Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic Do chất hấp phụ được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này gọi là sắc ký lớp mỏng

Muốn thực hiện sắc ký, người ta cho mẫu phân tích hòa tan vào trong một dung môi dễ bay hơi, dùng vi quản để chấm một ít dung dịch mẫu, chấm 1 vết nhỏ gọn lên lớp mỏng Sấy nhẹ để đuổi phần dung môi hòa tan mẫu, như vậy mẫu chỉ còn là dạng bột khô bám trên lớp mỏng Đặt lớp mỏng theo chiều thẳng đứng vào trong một bình có dung môi thích hợp, dung môi sẽ bị lực mao quản hút lên phía trên, mẫu chất sẽ được phân chia thành những vết riêng biệt Các vết sẽ được phát hiện bằng phương pháp vật lý như nhìn bằng mắt, soi dưới đèn tử ngoại hoặc bằng phương pháp hóa học [18-21]

Một chất tinh khiết chỉ cho một vết tròn, có giá trị Rf không đổi trong một hệ dung môi xác định Trị số Rf được tính như sau:

 Rf luôn có giá trị nhỏ hơn 1 và thay đổi tùy thuộc vào điều kiện tiến hành: Tính chất của chất hấp phụ

Thành phần của dung môi triển khai

Chiều dày của bảng mỏng

Lượng mẫu chất chấm

Nhiệt độ

Điều kiện bão hòa khí quyển

 Sắc ký lớp mỏng có một số ưu điểm sau:

Thời gian tiến hành nhanh

Lượng mẫu phân tích nhanh

Dụng cụ đơn giản

Hiệu ứng tách tốt hơn so với các phương pháp khác

Có thể phân tích đồng thời mẫu chất và chất chuẩn trong cùng điều kiện

3.4.2 Chất hấp phụ silica gel

Trong SKLM, thường dùng các chất hấp phụ: silica gel, Al2O3, cellulose, Kieselguhr,… Ngoài ra người ta còn trộn thêm chất kết dính hoặc chất chỉ thị phát huỳnh quang Chất kết dính giúp chất hấp phụ bám tốt vào tấm kính hoặc plastic, làm cho lớp mỏng bền, không bị trầy xước

Silica gel là chất hấp phụ được sử dụng thông dụng nhất Silica gel được

sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký, chế tạo bằng cách thủy giải natri silicate (cho tác dụng với acid sulfuric) để thành acid polysilisic, tiếp theo là sự ngưng

tụ và polymer hóa để đạt các chỉ tiêu vật lý cần thiết như có các hạt với kích

cỡ hạt, thể tích lỗ rỗng trên bề mặt, diện tích bề mặt, Ngoài ra người ta còn

mong muốn Silica gel thương phẩm nếu có tiếp vị ngữ “G” nghĩa là silica gel

đó có trộn thêm chất kết dính sulfat canxi ngậm nước CaSO4.0,5H2O Sự hiện diện của ion canxi hầu như không ảnh hưởng đến quá trình sắc ký

SiOH

O

SiOH

O

SiOH

O

OH

O

Hình 3.3: Cấu trúc mạng silica gel

Bản chất hóa học của bề mặt hạt silica gel là những nhóm –Si−OH, đây

là những tâm rất hoạt động có thể tạo nối hydrogen mạnh với hợp chất được sắc ký Vì thế, khi sắc ký cột với cột nhồi bằng silica gel, những hợp chất phân cực (có mang nhóm chức –OH, −NH2, −COOH, ) có khả năng tạo mối hydrogen mạnh, bị silica gel giữ chặt lại trong cột và giải ly muộn hơn so với những chất khác có tính kém phân cực như alkane, terpene (là những hợp chất không chứa những nhóm chức có thể tạo nên nối hydrogen) ít bị silica gel giữ lại, sẽ ra khỏi cột sớm [18]

3.4.3 Dung môi giải ly

Dung môi triển khai trong SKLM thường là một hỗn hợp có 2, 3 hoặc 4 loại dung môi khác nhau với tỉ lệ thích hợp Ứng với mỗi loại hợp chất khác nhau sẽ có hệ dung môi thích hợp

Nên chọn dung môi có độ tinh khiết cao, hòa tan được mẫu phân tích Tuy nhiên không khuyến khích dùng dung môi có thể hòa tan tuyệt đối mẫu Mẫu chất cần phân tích có thể chứa nhiều chất khác nhau, khả năng tách riêng các chất trong mẫu tùy thuộc vào tỷ lệ phân bố của các chất giữa chất hấp phụ

và dung môi triển khai Muốn thay đổi khả năng tách, người ta thay đổi thành phần dung môi hoặc thay đổi tỉ lệ giữa các dung môi trong hỗn hợp dung môi khai triển

Với mẫu chất chưa biết thành phần hợp chất, chưa có tài liệu tham khảo phải làm một loạt thí nghiệm với các hệ dung môi khác nhau, quan sát các vết, một hệ dung môi triển khai phù hợp khi các vết Rf rõ, cách xa và trong giới hạn từ 0,3 đến 0,7 Nếu Rf nhỏ hơn 0,3 thì hệ dung môi chưa đủ phân cực, Rf lớn hơn 0,7 thì hệ dung môi quá phân cực [18, 21]