nghiên cứu trích ly lipase từ nội tạng cá lóc

Các chế phẩm enzyme phổ biến như amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, glucoseoxydase,… Chế phẩm enzyme không chỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứng dụng trong nhiều lĩn

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU TRÍCH LY LIPASE

TỪ NỘI TẠNG CÁ LÓC

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

MSSV: 2101960

Lớp Công nghệ thực phẩm khóa 36

Cần Thơ, 2013



Đề tài luận văn tốt nghiệp “Nghiên cứu trích ly lipase từ nội tạng cá lóc” là công

trình nghiên cứu của sinh viên Dương Ý Thơ với sự hướng dẫn của Ts Trần Thanh Trúc Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và do chính tác giả thực hiện

Cần Thơ, ngày 08 tháng 12 năm 2013 Giáo viên hướng dẫn Người cam đoan

Dương Ý Thơ

LỜI CẢM TẠ



Nhờ sự tận tình giúp đỡ của thầy cô và các bạn, đề tài tốt nghiệp của em đã hoàn thành Có được kết quả này, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến:

Cô Trần Thanh Trúc và Thầy Nguyễn Văn Mười, những người đã trực tiếp hướng dẫn

và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài Mặc dù bận rộn với công việc giảng dạy nhưng thầy cô vẫn thường xuyên theo dõi, hướng dẫn và giúp đỡ em rất tận tình

Thầy cô Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ đã cho em những kiến thức quý báu trong thời gian học tập tại trường Những kiến thức tích lũy được từ sự giảng dạy tận tình của quý thầy cô đã giúp em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài này

Cán bộ phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ, đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài của mình

Anh Trần Thế Hiển – học viên Cao học ngành Công nghệ thực phẩm khóa 20, anh đã truyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm quý báu, giúp đỡ em tận tình về kiến thức cũng như phương pháp học tập, nghiên cứu

Các anh chị Cao học Công nghệ thực phẩm khóa 18, khóa 19, các bạn sinh viên lớp Công nghệ thực phẩm khoá 36 đã nhiệt tình đóng góp ý kiến và động viên giúp đỡ trong suốt thời gian thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm

Cuối lời em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể quý thầy cô trường Đại học Cần Thơ đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt những năm học tập tại trường

Kính chúc quý thầy cô và các bạn luôn dồi dào sức khỏe và thành công

Em xin chân thành cảm ơn

Cần Thơ, ngày 08 tháng 12 năm 2013

Sinh viên thực hiện

Dương Ý Thơ

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện nhằm mục đích xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá lóc Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài đã khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và dung môi trích ly, giá trị pH, thời gian và nhiệt

độ trích ly đến quá trình thu nhận enzyme lipase Hoạt tính enzyme được xác định theo phương pháp chuẩn độ bằng NaOH 0,05 N với phenolphtalein là chất chỉ thị Kết quả thí nghiệm cho thấy hiệu quả trích ly lipase đạt tốt nhất với hoạt tính lipase thu được là 5,94 ± 0,16 U/g CKNL khi sử dụng đệm phosphate với pH = 6 để trích ly

ở tỷ lệ nguyên liệu và dung môi trích ly là 1: 4, thời gian trích ly là 3 giờ ở nhiệt độ trích ly 50C

Từ khoá: đệm phosphate, lipase, nhiệt độ trích ly, nội tạng cá lóc, thời gian trích ly

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ii

LỜI CẢM TẠ i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH HÌNH v

DANH SÁCH BẢNG vi

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 TỔNG QUAN 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU 3

2.1.1 Cá lóc 3

2.1.2 Tình hình nuôi trồng cá lóc 4

2.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME LIPASE 5

2.1.1 Giới thiệu 5

2.1.2 Đặc điểm cấu trúc của lipase 6

2.2.3 Cơ chế phản ứng 9

2.2.4 Tính đặc hiệu của enzyme lipase 11

2.2.5 Phân loại enzyme lipase 11

2.2.6 Một số tính chất của lipase 12

2.2.7 Các nguồn thu nhận 14

2.2.8 Cơ chế sinh tổng hợp lipase từ vi sinh vật 15

2.2.9 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp lipase 17

2.2.10 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme lipase 18

2.2.11 Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase 20

2.2.12 Ứng dụng 21

2.3 QUÁ TRÌNH TRÍCH LY LIPASE TỪ NỘI TẠNG 23

2.3.1 Định nghĩa 23

2.3.2 Cơ sở lý thuyết của quá trình trích ly enzyme 24

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly của enzyme 24

2.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN 25

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 27

3.1.1 Địa điểm, thời gian 27

3.1.2 Dụng cụ, thiết bị 27

3.1.3 Hóa chất dùng trong thí nghiệm 27

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 28

3.2.2 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả 28

3.2.3 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả 29

3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 29

3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 29

3.3.2 Phân tích thành phần cơ bản của nguyên liệu 30

3.3.3 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và nước cất đến hoạt tính enzyme lipase được trích ly từ nội tạng cá lóc 31

3.3.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi trích ly và pH đến hoạt tính enzyme lipase được trích ly từ nội tạng cá lóc 32

3.3.5 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt tính enzyme lipase được trích ly từ nội tạng cá lóc 33

3.3.6 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hoạt tính enzyme lipase được trích ly từ nội tạng cá lóc 35

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 36

4.1 Thành phần hoá lý cơ bản của nội tạng cá lóc 36

4.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và nước cất đến hoạt tính enzyme lipase trích ly từ nội tạng cá lóc 36

4.3 Ảnh hưởng của việc điều chỉnh pH ban đầu của dung môi trích ly đến hoạt tính enzyme lipase trích ly từ nội tạng cá lóc 38

4.4 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt tính enzyme lipase từ nội tạng cá lóc 39

4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hiệu quả thu nhận lipase từ nội tạng cá lóc 40

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

5.1 KẾT LUẬN 43

5.2 KIẾN NGHỊ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 1 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH vii

PHỤ LỤC 2 KẾT QUẢ THỐNG KÊ xiv

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Cá lóc (Channa argus) 3

Hình 2.2: Cấu trúc tinh thể lipase Thermomyces lanuginose 7

Hình 2.3: Hoạt tính bề mặt của lipase 8

Hình 2.4: Trung tâm hoạt động lipase Thermomyces lanuginose 9

Hình 2.5: Phản ứng thủy phân triacylglycerol của enzyme lipase 9

Hình 2.6: Phản ứng thủy phân triacylglycerol theo từng bậc của enzyme lipase 10

Hình 2.7: Cơ chế phản ứng thuỷ phân của lipase 10

Hình 3.1: Nguyên liệu trước và sau xử lý 28

Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 29

Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 32

Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 33

Hình 3.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 34

Hình 3.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 4 35

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Ba nhóm phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase 20

Bảng 2.2: Ứng dụng của lipase trong công nghiệp 21

Bảng 3.1: Phương pháp phân tích các chỉ tiêu 28

Bảng 4.1: Thành phần hoá lý cơ bản của nội tạng cá lóc 36

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và nước cất đến hoạt tính enzyme lipase thu nhận từ nội tạng cá lóc 37

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme lipase thu nhận từ nội tạng cá lóc 39

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt tính lipase thu nhận từ nội tạng cá lóc 40 Bảng 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hoạt tính enzyme lipase từ nội tạng cá lóc 41

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 TỔNG QUAN

Trong những năm gần đây, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát

triển mạnh mẽ trên quy mô công nghiệp Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme

bán trên thị trường thế giới, các chế phẩm này được khai thác và tinh chế có mức độ

tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng Các chế phẩm enzyme phổ biến

như amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, glucoseoxydase,… Chế phẩm

enzyme không chỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứng dụng trong nhiều

lĩnh vực công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, trong hóa học,… Có thể nói ý

nghĩa của việc sử dụng enzyme trong các lĩnh vực thực tế không kém so với ý nghĩa

của việc sử dụng năng lượng nguyên tử (Ngô Tiến Hiển, 2010)

Trong 20 năm cuối thế kỷ XX và các năm đầu của thế kỷ XXI có rất nhiều enzyme

khác nhau đã được thương mại hóa và ứng dụng trong thực tiễn ở hầu hết các lĩnh

vực của đời sống, Ở Việt Nam bước đầu đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng các

enzyme trong chế biến nông sản, thực phẩm, nhất là trong lĩnh vực sản xuất bia,

rượu, chế biến tinh bột (Ngô Tiến Hiển, 2010)

Lipase (glycerol ester hydrolase, EC 3.1.1.3) là enzyme được ứng dụng trong nhiều

ngành như công nghiệp thực phẩm, công nghiệp hóa học, mỹ phẩm, da, trong y dược

và trong các ngành công nghiệp khác do có khả năng xúc tác thủy phân triglyceride

thành di, mono glyceride hoặc glycerol và các acid béo nhờ hoạt động trên bề mặt

phân pha dầu nước Trong công nghiệp dầu và chất béo, việc sử dụng lipase rất phổ

biến Có khoảng hơn 100 lipase khác nhau được dùng để chuyển đổi lipid thành các

chất khác (Marae và Hammond, 1985)

Hiện nay, Việt Nam sử dụng một lượng lớn lipase trong công nghiệp thực phẩm,

công nghiệp tẩy rửa, hóa học và y học… song các chế phẩm enzyme được sử dụng

phần lớn là do nhập khẩu với giá thành cao Vì thế, việc nghiên cứu, sản xuất ra các

chế phẩm enzyme có nguồn gốc tự nhiên đang là một đòi hỏi cấp thiết đối với nhiều

quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam Do vậy, mục đích của đề tài tập trung

nghiên cứu thu nhận enzyme lipase từ nột tạng cá lóc bằng phương pháp trích ly

nhằm thu được enzyme có hoạt tính cao nhất

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Xác định các thông số cơ bản của quá trình trích ly lipase có hiệu suất cao từ nội tạng

cá lóc

Trên cơ sở mục tiêu nghiên cứu đã được đặt ra, đề tài tiến hành các nội dung nghiên

cứu chủ yếu sau:

 Xác định tỷ lệ nguyên liệu và dung môi (nước cất) sử dụng thích hợp cho quá

trình trích ly đến hiệu quả thu nhận lipase

 Ảnh hưởng của loại dung dịch đệm và pH sử dụng đến độ ổn định của lipase

thu nhận

 Sự thay đổi hoạt tính lipase thu nhận do tác động tương tác của nhiệt độ và

thời gian trích ly

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Cá lóc

Cá lóc hay còn gọi là cá quả, cá chuối, cá sộp, cá xộp, cá tràu, cá đô tùy theo từng

vùng, là loài cá thuộc họ Channidae Họ này có hai chi là Channa có 26 loài ở châu

Á, và Parachanna (Teugels và Daget, 1984) có 3 loài ở châu Phi Ở Việt Nam chủ

yếu là Channa maculata (có tài liệu gọi là Ophiocephalus maculatus/ Bostrychus

maculatus) và Channa argus (hay còn gọi là Ophiocephalus argus, tức cá quả Trung

Quốc) (Walter et al., 2004)

Theo truyển thống, cá lóc được xếp trong bộ Perciformes (Nelson, 1994), tuy nhiên

gần đây người ta đã xem xét lại phát sinh chủng loài của cá và đề xuất tách họ này

sang bộ Anabantiformes (Ricardo Betancur-R, 2013)

Hình 2.1: Cá lóc (Channa argus)

(Walter et al., 2004)

Cá lóc có thể sống trong các môi trường nước thiếu oxy, là loài cá nước ngọt Chúng

phân bố ở khu vực nhiệt đới như châu Á và châu Phi, đặc biệt là Trung Quốc, Triều

Tiên, Sri Lanka, Việt Nam,… Ở những nơi này, cá lóc được coi là loài cá đặc sản

Cá sống chủ yếu ở độ sâu từ 0 đến 30 m trong các sông, suối, ao, hồ và trong các ao

nuôi nhân tạo Chúng sinh sống ở tầng nước giữa và thấp, hay tìm thấy trong các ao

hồ có nhiều rong cỏ và nước đục Cá lóc thường sinh sống ở những khu vực có nhiệt

độ 7 ÷ 35C

Cá lóc có 40 ÷ 46 tia vây lưng, 28 ÷ 30 tia vây hậu môn, 41 ÷ 55 vảy đường bên Đầu

cá lóc Channa maculata có đường vân giống như chữ “nhất” và hai chữ “bát”, còn

đầu cá Channa argus tương đối nhọn và dài giống như đầu rắn Đầu của chúng bẹt so

với thân, vảy tạo vân màu nâu xám xen lẫn với những chỗ màu xám nhạt Lưng có

màu đen ánh nâu

Cá lóc lớn tương đối nhanh Con lớn nhất có thể dài đến 1 m, nặng đến 20 kg Cá một

tuổi thân dài khoảng 19 ÷ 39 cm, nặng 95 ÷ 760 g; cá hai tuổi thân dài 38,5 ÷ 40 cm,

nặng 625 ÷ 1.395 g; cá ba tuổi thân dài 45 ÷ 59 cm, nặng 1,5 ÷ 2,0 kg (con đực và cái

có sự chênh lệch lớn) Khi nhiệt độ trên 20C, cá lóc sinh trưởng khá nhanh, tuy

nhiên, khi nhiệt độ xuống dưới 15C, chúng bắt đầu sinh trưởng chậm lại Cá từ một

năm tuổi trở lên đã có khả năng sinh sản Mùa sinh sản thường là tháng 4 ÷ 7 hàng

năm

Cá mới nở sử dụng dinh dưỡng từ noãn hoàng, khi noãn hoàng hết cá ăn các loài thức

ăn bên ngoài như: luân trùng, trứng nước, động vật phù du… Khi trọng lượng nặng

0,5 kg chúng có thể ăn tới 20% trọng lượng cơ thể mỗi ngày Trong điều kiện nuôi

nhân tạo, chúng cũng ăn thức ăn chế biến (Trần Đắc Định và cộng sự, 2013)

2.1.2 Tình hình nuôi trồng cá lóc

Chuyển đổi cơ cấu cây trồng vật nuôi là một trong những vấn đề trọng tâm đã và

đang được chính quyền các cấp quan tâm Trong những năm qua, với các trở ngại về

việc xuất nhập khẩu cá tra ở Đồng bằng sông Cửu Long cùng với việc không kiểm

soát được cung cầu đối với nguồn nguyên liệu này, giải pháp thay thế cá tra bằng cá

lóc đã được áp dụng Mặc dù vậy, với việc thả nuôi và mở rộng ào ạt cá lóc ở các tỉnh

đã dẫn đến sự ứ đọng nguồn nguyên liệu này, cũng là nguyên nhân làm tăng nguy cơ

tồn ứ đầu ra của cá lóc Chuyên mục phóng sự của Đài truyền hình Trà Vinh ngày

26/11/2013 cũng đã cho thấy thực trạng của việc sụt giảm giá cá và sự ô nhiễm

nguồn nước sinh hoạt từ việc mở rộng không kểm soát việc nuôi cá lóc Nếu như năm

2012, toàn tỉnh Trà Vinh có 660 hộ thả nuôi cá lóc, thì hiện tại, theo thống kê sơ bộ,

toàn tỉnh hiện có hơn 1.000 hộ thả nuôi, tăng gần gấp đôi so với cùng kỳ năm

ngoái Số hộ nuôi cá lóc tăng một cách nhanh chóng như vậy là do người dân thấy chỉ

sau 5 tháng nuôi trên diện tích 1.000 m2, người nuôi đã thu lợi nhuận hơn 100 triệu

đồng với giá liên tục giữ ở mức 35.000 – 36.000 đồng/kg, trong khi trồng mía cả năm

chỉ thu được khoảng 2 triệu đồng Vì thế, nhiều hộ dân rủ nhau bỏ cây mía, lấy đất

đào ao nuôi cá lóc Điều này đang xảy ra rộng khắp ở các tỉnh trong khu vực đồng

bằng sông Cửu Long, đặc biệt là Vĩnh Long, Đồng Tháp Tuy nhiên, vì loại thuỷ sản

này hiện chỉ tiêu thụ nội địa, nếu mở rộng diện tích tự phát như hiện nay thì cung sẽ

vượt cầu; hơn nữa, hệ thống thuỷ lợi ở vùng nuôi cá lóc hiện chưa đáp ứng nổi diện

tích nuôi ngày càng lớn, môi trường nước đang có dấu hiệu bị ô nhiễm nặng, khả

năng bị nhiễm bệnh là rất lớn

(Hoàng Xuân, 2013;

http://tepbac.com/news/full/7011/Nong-dan-do-xo-dao-ao-tha-ca-loc-tren-dat-lua.htm)

Chính vì thế, nghiên cứu giải pháp sử dụng hiệu quả nguồn nguyên liệu này là vấn đề

có tính cấp thiết, giúp giải quyết chủ động đầu ra cho cá lóc, đảm bảo giá cả và bình

ổn đời sống cho người dân Việc sử dụng nguyên liệu này trong chế biến khô cá lóc

là một giải pháp phổ biến nhất được thực hiện

(http://www.vasep.com.vn/Tin-Tuc/51_28448/Dong-Thap-Che-bien-kho-ca-loc-bang-he-thong-say.htm)

Điều này kéo theo tỷ lệ phụ phẩm từ cá lóc gia tăng Chính vì vậy, việc nghiên cứu

tận dụng nguồn phụ phẩm này trong chế biến các chế phẩm sinh học, thực phẩm chức

năng có ý nghĩa rất quan trọng

Nội tạng cá lóc cũng như các loài cá là nguồn nguyên liệu thuận tiện cho vi sinh vật

phát triển, nhưng cũng là nguồn cung cấp nhiều enzyme quan trọng, điển hình là

protease, lipase và cellulase (Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Mẫn, 2006) Việc sử

dụng nội tạng cá lóc trong ly trích enzyme là hướng tích cực giúp tăng giá trị kinh tế

của nguồn nguyên liệu này và giúp hạn chế chất thải vào môi trường

2.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME LIPASE

2.1.1 Giới thiệu

Lipase (glycerol ester hydrolase hay triacylglycerol acylhydrolase – EC 3.1.1.3),

thuộc nhóm phụ enzyme thủy phân có Serine của họ enzyme thủy phân α/β, xúc tác

thủy phân các nối ester của triacylglycerol tạo thành acylglycerol và acid béo tương

ứng (Litthauer et al., 2002) Lipase hiện diện rộng rãi và tham gia vào sự chuyển hóa

sinh học của lipid trong tự nhiên Nét đặc trưng chuyên biệt giúp phân biệt lipase với

các enzyme esterase khác là khả năng hoạt động tại bề mặt phân cách giữa pha nước

với các pha không hòa tan chứa cơ chất Bên cạnh hoạt tính thủy phân lipid, enzyme

lipase còn có hoạt tính thủy phân và tổng hợp ester

Lipase được tổng hợp bởi nhiều vi sinh vật và các sinh vật nhân chuẩn Vi sinh vật

sinh tổng hợp lipase bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc và xạ khuẩn được tìm

thấy rộng rãi trong các môi trường như: nước thải công nghiệp, nhà máy chế biến dầu

thực vật, sữa, đất lẫn dầu, hạt có dầu, thực phẩm thối rữa, than đá, suối nước nóng,

Hầu hết lipase thương mại có nguồn gốc từ vi khuẩn, được ứng dụng trong nhiều

ngành công nghiệp quan trọng (Kamini et al., 2000) Trong thị phần enzyme thế giới,

lipase chiếm 5% và chỉ xếp sau protease và carbohydrase (Ghosh et al., 1996)

Lipase có nhiều ứng dụng triển vọng trong các quy trình hóa hữu cơ, sản xuất chất

tẩy, tổng hợp chất hoạt động bề mặt, công nghiệp hóa dầu ăn, công nghiệp sữa, công

nghiệp nông hóa, sản xuất giấy, chất dinh dưỡng, mỹ phẩm, dược phẩm, (Kamini et

al., 2000) Tuy nhiên, hiện nay vẫn còn thiếu những enzyme lipase có tính chất đặc

hiệu cần thiết

2.1.2 Đặc điểm cấu trúc của lipase

2.2.2.1 Cấu trúc phân tử

Lipase thu nhận từ vi sinh vật là nguồn enzyme đầy tiềm năng và được nghiên cứu

một cách sâu rộng Nhìn chung, lipase có cấu trúc / với vị trí trung tâm là lưới hỗn

hợp  chứa bộ ba xúc tác và có cấu trúc xoắn ngăn cản cơ chất tiếp xúc trung tâm

hoạt động

Cấu trúc không gian (3D) của lipase từ nấm Rhizomucor miehei và lipase từ tuyến

tụy của người đã được xác định vào năm 1990 (Zygmunt và Urszula, 1992; Winkler

et al., 1990), từ đó đến nay có hơn 11 cấu trúc lipase nữa được xác định Ngoại trừ

lipase từ tuyến tụy của người, tất cả các lipase còn lại đều từ vi sinh vật (Zygmunt và

Urszula, 1992)

Rhizomucor miehei (Mucor miehei) sản xuất lipase ngoại bào có khả năng thuỷ phân

rất nhiều cơ chất khác nhau Trong quá trình sinh tổng hợp, cấu trúc phân tử của

enzyme được gắn thêm một đoạn peptide tín hiệu (signal peptide) và một đoạn

propeptide bên cạnh mạch enzyme chính bao gồm 269 amino acid có phân tử lượng

là 29.472 Dalton Có hai dạng đồng phân của enzyme là dạng A (pI = 3,9) và dạng B

(pI = 4,3) phụ thuộc mức độ deglycosylation trong quá trình sau dịch mã Cấu trúc

của lipase Rhizomucor miehei là cấu trúc dạng / gồm vùng lưới  trung tâm có tám

dải  liên kết song song cuộn lên trên vùng xoắn lưỡng cực (N-terminal) Tất cả các

cấu trúc xoắn đều nằm một bên lưới  Ba liên kết disulfide trong phân tử lipase,

Cys29-Cys268; Cys40-Cys43 và Cys235-Cys244 có tác dụng làm cho toàn bộ cấu

trúc của enzyme được ổn định Vùng trung tâm hoạt động của enzyme có chứa bộ ba

xúc tác Ser144, His257 và Asp203 nhưng lại bị che phủ bởi phần không phân cực của

cấu trúc xoắn lưỡng cực “lid” “Lid” là một đoạn oligopeptide kỵ nước mà enzyme

esterase không có Chính vì điều này đã giúp lipase hấp phụ được trên bề mặt phân

chia pha dầu-nước và sau đó diễn ra sự tái sắp xếp cấu trúc enzyme, đoạn phân tử

“lid” sẽ cuộn vào trong để lộ vùng trung tâm hoạt động xúc tác thuỷ phân cơ chất Vì

thế, ta có thể nhận thấy rằng hoạt tính bề mặt của lipase chính là việc tạo thành cấu

trúc bền vững trên bề mặt phân chia giữa hai pha dầu và nước (Zygmunt và Urszula,

1992)

Lipase từ Geotrichum candidum cũng tồn tại dưới hai dạng đồng phân: dạng I (pI =

4,56) và dạng II (pI = 4,46) có cùng chiều dài mạch là 544 amino acid, phân tử lượng

59.085 Dalton và có từ hai đến ba vị trí N-glycosylation tương ứng với từng dạng

đồng phân Tuy nhiên, lipase I và II được mã hoá bởi hai đoạn gen khác nhau Cấu

trúc của enzyme cũng có dạng / với lưới hỗn hợp  hình thành bởi 11 dải trong đó

có 7 dải song song với nhau Những cấu trúc cuộn xoắn liên kết với các dải đều nằm

ở hai bên vùng lưới  Hai liên kết disulfide được tìm thấy là Cys61-Cys105 và

Cys276-Cys288 Bộ ba xúc tác là Ser217, His463 và Glu354 nằm trong vùng trung

tâm hoạt động bị che khuất bởi hai cấu trúc xoắn  gần như song song với nhau

Một số cấu trúc phân tử của lipase thu nhận từ Candida rugosa, C antarctica,

Rhizopus delmar, Pseudomonas glumae và Ps aeruginosa cũng được nghiên cứu

Song, sự khác biệt quan trọng về cấu trúc giữa lipase tuyến tuỵ và vi sinh vật chính là

phần enzyme chứa đầu Carbon (C-terminal domain) được dùng để liên kết với

colipase không có trong cấu trúc enzyme của vi sinh vật Một điều cần phải lưu ý là

không phải tất cả lipase đều có hoạt tính bề mặt Ví dụ như lipase từ Pseudomonas

aeruginosa thiếu cấu trúc xoắn “lid” bao phủ trung tâm hoạt động, do đó enzyme này

không có hoạt tính bề mặt (Wong, 1995)

Hình 2.2: Cấu trúc tinh thể lipase Thermomyces lanuginose

Lưới , cấu trúc xoắn , trung tâm hoạt động và đoạn phân tử “lid” được thể hiện tương ứng trong màu xanh,

vàng, đỏ (sticks) và đỏ

(Wong, 1995)

2.2.2.2 Hoạt tính bề mặt

Nhờ vào kỹ thuật X quang mà cấu trúc tinh thể của một số lipase đã được xác định

Trong cấu trúc đó có một phân đoạn xoắn , được gọi là “lid”, đã che lấp trung tâm

hoạt động làm cho enzyme không thể có hoạt tính xúc tác trong dung dịch nước hoặc

trong dung môi hữu cơ Nhưng nếu trong dung dịch xuất hiện bề mặt phân chia pha

giữa dầu và nước thì sự hấp phụ enzyme này lên bề mặt đó sẽ làm thay đổi hình dạng

enzyme dẫn đến việc mở rộng cửa rào “lid” tạo điều kiện cho sự tiếp xúc cơ chất với

trung tâm hoạt động (Wong, 1995)

Hình 2.3: Hoạt tính bề mặt của lipase

E, enzyme trong pha nước; E a , enzyme hấp phụ trên bề mặt; E a , enzyme được hoạt hoá; S, cơ chất; E a S, phức

enzyme cơ chất; E a Ac, acylenzyme; P 1 , P 2 , sản phẩm thuỷ phân

(Wong, 1995)

2.2.2.3 Trung tâm hoạt động

Trung tâm hoạt động của lipase là những phân tử acid amin có vị trí xác định trên

toàn bộ cấu trúc phân tử enzyme, bao gồm bộ ba xúc tác Serine, Histidine và

Aspartate (có thể thay thế bằng Glutamate) (Wong, 1995) Phía trên trung tâm hoạt

động có vùng kỵ nước được hình thành sau khi lipase được hoạt hóa Ngoại trừ các

điểm chung về khả năng xúc tác thông dụng thì lipase từ những nguồn khác nhau có

rất ít điểm chung ở cấp độ amino acid Do đó, sự hiện diện của Serine ở tâm hoạt

động được xem là có tính bảo tồn cao và thường xuất hiện trong chuỗi pentapeptide

Gly – Xaa – Ser – Xaa – Gly (Lohse et al., 1997)

Hình 2.4: Trung tâm hoạt động lipase Thermomyces lanuginose

Nguyên tử C màu xanh lá, O màu đỏ, N màu xanh dương, H màu trắng

(Wong, 1995)

2.2.3 Cơ chế phản ứng

Lipase xúc tác cho nhiều phản ứng khác nhau bao gồm: phản ứng thủy phân, phản

ứng tổng hợp ester, phản ứng chuyển ester (gồm có phản ứng rượu hóa (alcoholysis)

và thủy phân glicogen (glycolysis)), phản ứng trao đổi ester (gồm có phản ứng acid

hóa (acidolysis) và trao đổi ester) và phản ứng amin hóa (aminolysis)

Các phản ứng do lipase xúc tác đều là các phản ứng thuận nghịch và chiều hướng của

phản ứng phụ thuộc vào lượng nước tham gia vào phản ứng

Hình 2.5: Phản ứng thủy phân triacylglycerol của enzyme lipase

(http://www.1cro.com/campbell/hottopics/hibernation/hibernation.html)

Khi cung cấp đầy đủ nước, phản ứng thủy phân xảy ra (theo chiều thuận) Ngược lại,

trong điều kiện thiếu nước, phản ứng ester hóa xảy ra và tổng hợp lại glyceride từ

acid béo tự do và glycerol (theo chiều nghịch) Các phản ứng này xảy ra tại bề mặt

phân cách giữa cơ chất và pha nước nên gây khó khăn cho việc phân tích động học và

khảo sát hoạt tính của lipase Lipase thủy phân triacylglycerols (TAG) theo từng bậc,

tạo ra diacylglycerols (DAG), monoacylglycerols (MAG) và acid béo (FA), rồi cuối

cùng thủy phân hoàn toàn tạo ra glycerol và acid béo tự do (Girousse, 2012)

Hình 2.6: Phản ứng thủy phân triacylglycerol theo từng bậc của enzyme lipase

(Girousse, 2012)

Phản ứng thuỷ phân được thực hiện nhờ bộ ba xúc tác Serine, Histidine và Aspartate

trải qua năm giai đoạn sau:

 Enzyme kết hợp với cơ chất hình thành phức chất hoạt động

 Nhóm chức hoạt động –OH của Serine tấn công vào gốc acyl của cơ chất tạo

liên kết đồng hoá trị hình thành hợp chất trung gian Giai đoạn này được hỗ trợ

bởi hoạt tính xúc tác base của Histidine trong bộ ba xúc tác

 Tạo thành acyl enzyme và tách khỏi phản ứng oxy của liên kết ester (R1OH)

 Tách gốc acyl còn lại ra khỏi trung tâm hoạt động bởi nhóm chức hoạt động

của Histidine, có sự tham gia của phân tử nước và hình thành hợp chất trung

gian có cấu trúc tứ diện

 Giải phóng acid carboxylic (R2COOH)

Hình 2.7: Cơ chế phản ứng thuỷ phân của lipase

(Wong, 1995)

Trong số các phản ứng trên, được quan tâm nhiều nhất là phản ứng chuyển ester hóa,

acid hóa (acidolysis) và rượu hóa (alcoholysis) Sự chuyển ester hóa là sự chuyển

nhóm acyl giữa 2 ester, có thể là giữa hai triglyceride hoặc giữa một triglyceride và

một acid béo Acid hóa là sự chuyển nhóm acyl giữa một acid và một ester Rượu hóa

là phản ứng giữa rượu và ester

Do lipase chỉ hoạt động ở bề mặt phân cách giữa hai pha dầu – nước, nên lượng dầu

tồn tại ở mặt phân cách sẽ quyết định hoạt tính của lipase (Sharma, 2001) Điều này

có thể khắc phục theo hướng tăng diện tích ở bề mặt tiếp xúc giữa hai pha bằng cách

tạo thể nhũ tương dầu bởi sự khuấy động mạnh với tác nhân nhũ hóa Do đó, cần áp

dụng phương pháp nhũ hóa thích hợp để làm tăng diện tích tiếp xúc của các tế bào

nhũ hóa

Lipase có ứng dụng thương mại thường là enzyme ngoại bào, được thu từ nhiều vi

sinh vật khác nhau Nhiều lipase hoạt động trong dung môi hữu cơ, xúc tác một số

phản ứng có lợi gồm tạo ester, chuyển ester, gắn acyl chọn lọc vị trí của glycol và

menthol, tổng hợp peptide và các hóa chất khác Triển vọng là lipase sẽ trở thành một

enzyme công nghiệp quan trọng như protease và carbohydrase hiện nay

2.2.4 Tính đặc hiệu của enzyme lipase

Trong tự nhiên, lipase có từ nhiều nguồn gốc khác nhau Chính sự đa dạng này đã

ảnh hưởng đến tính đặc hiệu trong các phản ứng chúng xúc tác Dựa vào tính đặc

hiệu đối với các acid béo trong phân tử triglyceride, lipase vi sinh vật có thể được

phân thành ba nhóm (John, 2000)

Nhóm đầu tiên bao gồm những enzyme không đặc hiệu với vị trí hoặc cấu trúc gốc

acyl trên mạch triglyceride, ví dụ như lipase từ Candida cylindracea và

Staphylococcus aureus

Nhóm thứ hai được xem là quan trọng nhất bao gồm những enzyme xúc tác đặc hiệu

vị trí 1, 3 trên phân tử triacylglycerol, trong đó thông dụng là lipase từ Aspergillus

niger, Rhizopus delemar, Mucor miehei và Pseudomonas fragi

Nhóm thứ ba gồm những enzyme chỉ xúc tác đặc hiệu một số acid béo nhất định, ví

dụ lipase từ Geotrichum candidum chỉ thuỷ phân acid béo mạch dài hoặc acid béo

không no dạng cis-9

2.2.5 Phân loại enzyme lipase

Theo Arpigny và Jaeger (1999), enzyme thủy phân lipid có nguồn gốc từ vi sinh vật

được xếp làm 8 họ:

 Họ I, được chia làm 6 họ phụ, gọi là lipase “thật”: lipase từ Pseudomonas, từ các

vi khuẩn Gram dương như Bacillus, Staphylococcus và lipase khác như lipase từ

Propionibacterium và Streptomyces

 Họ II, gồm các enzyme lipase thiếu chuỗi pentapeptide kinh điển Gly – Xaa –

Ser – Xaa – Gly nhưng lại có chuỗi Gly – Asp – Ser – Leu thay thế Trong họ

này có các enzyme esterasre của Streptomyces scabies, Pseudomonas

aeruginosa, Salmonella typhimurium, Photorhabdus luminescens và Aeromonas

hydrophila

 Họ III, gồm các lipase ngoại bào của Streptomyces và Moraxella

 Họ IV, gồm các enzyme tương tự như các lipase nhạy cảm hormone ở động vật

có vú

 Họ V, gồm các enzyme có nguồn gốc từ các vi khuẩn chịu nhiệt trung bình (như

Pseudomonas oleovorans, Haemophilus influenza, Acetobacter pasteurianus), từ

vi sinh vật chịu lạnh (như Moraxella sp., Psychrobacter immobilis) và những vi

sinh vật chịu nóng (Sulfolobus acidocaldarius)

 Họ VI, gồm những esterase nhỏ nhất có khối lượng phân tử 23 ÷ 26 kDa

 Họ VII, gồm những esterase vi khuẩn lớn có khối lượng phân tử khoảng 55 kDa

 Họ VIII, gồm những enzyme tương tự như các β-lactamase nhóm C

Các enzyme thủy phân lipid hiện nay đang thu hút được nhiều sự quan tâm vì chúng

có tiềm năng trong nhiều ứng dụng Phần lớn lipase sử dụng trong công nghiệp là

enzyme từ vi khuẩn hoặc từ nấm

2.2.6 Một số tính chất của lipase

2.2.6.1 Các tính chất động học

Trong nhiều trường hợp, lipase tuân theo động học Michaelis – Menten (Guit et al.,

1991; Malcata et al., 1992) Động học Michaelis – Menten được xác định qua hai

thông số Km và Vmax với Vmax là tốc độ tối đa của phản ứng và Km là chỉ số đo ái lực

của enzyme đối với cơ chất đặc hiệu Giá trị Km thấp thể hiện ái lực cao, nghĩa là vận

tốc của phản ứng càng lớn Giá trị Km trải rộng nhưng đối với hầu hết các enzyme

công nghiệp liên quan Km trải từ 10-1 đến 10-5 M (Fullbrook, 1996) Các thông số Km

và Vmax của lipase tinh sạch từ chủng P cepacia là 12 mM và 30 µmol/phút, đối với

cơ chất pNPP (Pencreac’h và Baratti, 1996) Bên cạnh đó, Pabai et al (1995) cũng đề

xuất các thông số Km và Vmax của P fragi CRDA 323 lipase là 0,7 mg/mL và 0,97.10

-3 U/min

2.2.6.2 Độ bền nhiệt

Tốc độ phản ứng tăng gấp đôi khi nhiệt độ tăng lên 10C, nếu enzyme bền ở nhiệt độ

cao thì hiệu suất phản ứng có thể tăng lên rất nhiều khi thực hiện ở một nhiệt độ

tương đối cao Do đó, độ bền với nhiệt là một tính chất mong muốn của lipase

(Janssen et al., 1994)

Lipase bền nhiệt được tách chiết từ nhiều nguồn như: Bacillus sp (Wang et al., 1995;

Sidhu et al., 1998), B coagulans và B cereus (El-Shafei và Rezkallah, 1997), B

stearothermophilus (Kim et al., 1998), Geotrichum sp và Aeromonas sobria

(Lotrakul và Dharmsthiti, 1997; Macedo et al.,1997), P flourescens (Kojima et al.,

1994) và P aeruginosa (Sharon et al., 1998) Một trong những enzyme bền với nhiệt

đáng chú ý là được tách từ chủng Bacillus, enzyme này có hoạt tính tối đa ở 60C và

giữ 100% hoạt tính ban đầu khi ủ 30 phút ở 75C Thời gian bán hoạt động của

enzyme là 8 giờ ở 75C, enzyme giữ ít nhất 90% hoạt tính ban đầu sau khi ủ 15 giờ ở

60C (Wang et al., 1995) Ngoài ra còn nhiều lipase bền nhiệt khác cũng được công

bố (Izumi et al., 1990; Janssen et al., 1994; Gao và Breuil, 1995; Kim et al., 1998;

Lee et al., 1999)

Độ bền nhiệt của lipase có liên quan tới cấu trúc của nó Độ bền nhiệt bị ảnh hưởng

bởi các yếu tố môi trường như pH, sự có mặt của ion kim loại, do đó đã có nhiều thí

nghiệm được thực hiện gây đột biến lipase để cải thiện độ bền nhiệt So với enzyme

tự nhiên, độ bền nhiệt và hoạt động của nhiều lipase tái tổ hợp có thể được nâng cao

đáng kể (Zhu et al., 2001)

Giá trị pH tối ưu của lipase tái tổ hợp LipA chủng Ralstonia sp M1 là 10,75 và

enzyme có độ bền ở dải pH kiềm (8,0 ÷ 10,5) Lipase tự nhiên chủng Ralstonia sp

M1 có pH tối ưu tương tự pH 10 và bền ở dải pH rộng hơn (7,5 ÷ 11) (Quyền Đình

Thi và cộng sự, 2004) Lipase được sinh tổng hợp chủng Acinetobacter sp RAG-1

bền ở dải pH (5,8 ÷ 9,0) với hoạt tính tối đa ở pH 9,0 (Snellman et al., 2002)

Acinetobacter sp SY-01 lipase có hoạt tính tối đa ở pH 10 và bền ở dải pH (9 ÷ 11)

(Han et al., 2003) B thermocatenulatus lipase BTL2 cho thấy hoạt tính tối đa ở pH

(7,5 ÷ 9,0) và độ bền ở dải pH (7 ÷ 11), có được hoạt tính tối đa và độ bền ở dải pH

kiềm là điều kiện quan trọng cho lipase để làm phụ gia bột giặt và chất xúc tác

(Abramic et al., 1999)

2.2.6.4 Ảnh hưởng của ion kim loại

Lipase ngoại bào chủng P aeruginisa MB5001 bị ức chế mạnh bởi 1 mM ZnSO4 (ức

chế 94%) nhưng được tăng hoạt bởi 10 mM CaCl2 (tăng 1,24 lần) và 200 mM acid

taurocholic (tăng 1,6 lần) (Chartrain et al., 1993) hay lipase từ chủng P aeruginosa

KKA-5 giữ nguyên hoạt tính với sự có mặt của Ca2+ và Mg2+ nhưng bị ức chế nhẹ

bởi Mn2+, Cd2+ và Cu2+ (Sharma, 2001) Muối ion kim loại nặng (Fe2+, Zn2+, Hg2+,

Fe3+) ức chế mạnh lipase, gợi ra rằng chúng có thể thay đổi cấu hình enzyme

(Kanchana, 2007)

Trong một nghiên cứu tương tự khác với ion kim loại (1 mM) và chất tạo gọng kìm,

hoạt tính lipase từ chủng P pseudoalcaligenes F-111 bị ức chế 60% bởi Fe3+ nhưng

không bị ức chế bởi Ca2+, Hg2+, Zn2+, Mn2+, Cu2+, Mg2+, Co2+, Cd2+ và Pb2+, chất tạo

gọng kìm kim loại (EDTA, o-phenanthrolin) không ảnh hưởng quan trọng tới hoạt

tính lipase kiềm hay lipase tinh sạch từ chủng Pe roqueforti IAM7268 không bị ảnh

hưởng bởi Ca2+, Mg2+, Mn2+, Na+, K+, Cu2+, EDTA, acid p- chloro mercuribenzoic và

iodoacetate, ngược lại, enzyme bị ức chế bởi Ag+, Fe2+, Hg2+ và isopropyl

fluorophosphates (Sharma, 2001)

2.2.6.5 Ảnh hưởng của bề mặt tiếp xúc giữa hai pha

Các phản ứng do lipase xúc tác xảy ra tại bề mặt tiếp xúc giữa hai pha hay tại giao

diện, do đó sức căng bề mặt có ảnh hưởng quan trọng lên tốc độ phản ứng có thể

quan sát được Lắc cơ học mạnh và đánh huyền phù trong cốc phản ứng sẽ tạo đủ bề

mặt tiếp xúc cần thiết (Sharma et al., 2001)

2.2.7 Các nguồn thu nhận

Lipase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau, điển hình như lipase từ thực

vật, lipase từ động vật và lipase từ vi sinh vật, đặc biệt là từ vi khuẩn và nấm Đã có

một vài lipase thu nhận từ vi sinh vật có giá trị thương mại

2.2.7.1 Lipase từ vi sinh vật

Đây là nguồn enzyme được quan tâm và sản xuất nhiều nhất theo quy mô công

nghiệp Khác với động vật và thực vật, vi sinh vật được cấu tạo từ một tế bào, chính

vì vậy mà nó có những ưu điểm hơn hẳn động vật và thực vật Vi sinh vật có khả

năng tổng hợp một lượng enzyme rất lớn trong một khoảng thời gian ngắn; hoạt tính

của enzyme cao hơn hẳn hoạt tính của enzyme được tổng hợp từ động vật và thực

vật; đồng thời có thể điều khiển tốc độ sinh tổng hợp enzyme trong khi sản xuất

(Sharma et al., 2001)

Lipase được thu nhận từ vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm men và nấm mốc là

những enzyme ngoại bào có tính chất gần giống lipase tuyến tuỵ Các loài nấm mốc

có khả năng sinh tổng hợp lipase như: Aspergillus sp., Mucor sp., Rhizopus sp.,

Penicillium sp., Geotrichum sp… Đối với nấm men gồm những loài: Torulopsis sp.,

Candida sp… Và vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp lipase bao gồm: Pseudomonas

sp., Achromobacter sp., Staphylococcus sp… (Sharma et al., 2001)

2.2.7.2 Lipase từ thực vật

Lipase từ thực vật không được chú ý nhiều so với những nguồn thu nhận khác Tuy

nhiên, gần đây loại enzyme này đã bắt đầu được quan tâm và nghiên cứu khá phổ

biến Trong đó, lipase từ những hạt có dầu là được quan tâm nhất Những enzyme có

nguồn gốc khác nhau thì tính đặc hiệu về cơ chất, pH tối ưu, khả năng phản ứng với

sulfuhydryl, tính kỵ nước cũng khác nhau Những enzyme này có quan hệ mật thiết

với triacylglycerol có trong bản thân hạt dầu đó và chỉ được tổng hợp trong quá trình

nảy mầm của hạt (Mukherjee và Mills, 1994)

2.2.7.3 Lipase từ động vật

Lipase thu nhận từ những cơ quan, mô của một số loài động vật hữu nhũ đã được

nghiên cứu rất nhiều, nhưng toàn diện hơn cả là lipase có nguồn gốc từ con người và

một số lipase từ tuyến tuỵ (Hjorth et al., 1993) Những enzyme tuyến tuỵ này được

tiết ra ở tá tràng xúc tác cho sự thuỷ phân triacylglycerol Lipase tuyến tuỵ có thể

thuỷ phân hoàn toàn triacylglycerol thành glycerol và acid béo Bản chất của chúng là

những glycoprotein, phân tử lượng 50 kDa, không có hoặc ít hoạt tính đối với

phospholipid và được hoạt hoá ở bề mặt phân chia pha dầu nước, nhưng lại bị ức chế

ở muối mật (Dugi et al., 1992)

Lipase của động vật hữu nhũ bền ở pH thấp, được hoạt hoá bởi muối mật và đặc hiệu

tại vị trí sn-3 của cơ chất Lipoprotein lipase người có chức năng thuỷ phân

triacylglycerol trong chylomicron Để có hoạt tính thì enzyme này kết hợp với

apolipoprotein C-II để tạo thành dimer và được hoạt hoá bởi heparin (Clark et al.,

1991) Tuy nhiên, lipase trong gan thực hiện chức năng chuyển hoá lipoprotein

nhưng không liên kết với apoC-II Lipase có trong sữa mẹ được hoạt hoá bởi muối

mật để giúp trẻ sơ sinh tiêu hoá chất béo có trong sữa (Baba et al., 1991)

Nguồn lipase từ động vật quan trọng nhất là từ tụy tạng của bò, cừu và lợn Lipase từ

tụy tạng lợn là một trong những lipase được biết đến sớm nhất và khá thông dụng

Hạn chế của lipase từ tụy tạng là chúng chứa những hợp chất có mùi và vị khó chịu

như trypsine, tạo vị đắng nên không được ưa chuộng Bên cạnh đó, nguồn lipase này

còn có khả năng lây truyền virus từ động vật sang người nên hiện nay xu hướng sử

dụng lipase từ vi sinh vật đang được ưa chuộng do đặc tính đa dạng, dễ tách chiết và

nguyên liệu vô hạn

2.2.8 Cơ chế sinh tổng hợp lipase từ vi sinh vật

Giống như sự tổng hợp protein, lipase sẽ được hình thành khi trải qua các quá trình

phiên mã, dịch mã và sau dịch mã Tất cả các quá trình được thực hiện bên trong tế

bào chất của vi sinh vật

Đầu tiên là sự phiên mã Quá trình chỉ xảy ra khi đoạn gen tổng hợp nên lipase phải

được hoạt hoá trước bằng chất cảm ứng Chất này sẽ giúp giải phóng enzyme RNA

polymerase thoát khỏi sự kiềm hãm của chất ức chế bằng cách kết hợp với chính chất

ức chế đó Bản chất của chất cảm ứng chính là cơ chất chịu sự xúc tác của lipase

(Wickner et al., 1999)

Kết thúc quá trình phiên mã diễn ra trong nhân tế bào sản phẩm sẽ là phân tử mRNA,

nhưng phân tử này rất dễ bị thuỷ phân trong môi trường tế bào chất Bên cạnh đó,

những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy phân tử siRNA (short interference RNA)

được hình thành trong quá trình phiên mã có tác động kiềm hãm sự dịch mã hoặc

thúc đẩy sự phân huỷ những phân tử mRNA Vì vậy số lượng enzyme được tổng hợp

sẽ giảm đi đáng kể

Tiếp theo, quá trình dịch mã sẽ sử dụng tài liệu mã chứa trong phân tử mRNA để tạo

thành mạch protein có thứ tự acid amin chính xác Tuy nhiên, chuỗi polypeptide này

rất dễ bị thuỷ phân bởi enzyme peptidase Quá trình này cần một loại protein “chuyển

giao” để tái sử dụng các acid amin của protein có cấu trúc gấp khúc (folded protein)

mà không còn sử dụng được nữa

Khi những chuỗi polypeptide enzyme đã được tổng hợp khá nhiều thì những

polypeptide ở gần nhau sẽ tương tác với nhau tạo thành cấu trúc gấp khúc làm cho

khối enzyme trở nên không tan Điều này đã làm cho enzyme mất đi hoạt tính sinh

học Quá trình này được điều khiển bởi chaperone, là một đoạn polypeptide có chức

năng làm gấp khúc các enzyme trong nội bào trước khi những enzyme này được vận

chuyển qua màng membrane Đối với pre-pro-enzyme ngoại bào, là enzyme tổng hợp

trong tế bào chất nhưng chưa có cấu trúc hoàn thiện, cấu trúc phân tử không được

gấp khúc trong suốt quá trình vận chuyển qua màng membrane Do đó, một số

protein khác đã hỗ trợ enzyme ngoại bào này chống lại sự gấp khúc trong tế bào chất

để không hình thành khối protein không tan và chống lại sự thuỷ phân nội bào

Hoạt tính của enzyme còn phụ thuộc vào cofactor là những ion kim loại Sự cung cấp

không đủ những ion này trong tế bào chất sẽ làm giảm đi hoạt tính của enzyme Vì

vậy phải đảm bảo nồng độ bão hoà các ion đối với enzyme phải thấp hơn nồng độ các

ion đó trong tế bào chất

Đối với dạng tiền enzyme (pre-pro-enzyme), khi không đủ cofactor để đảm bảo hoạt

tính cũng như sự vận chuyển qua màng thì một lượng enzyme này bị giữ lại trong tế

bào chất làm ảnh hưởng hiệu suất sinh tổng hợp enzyme

Sau khi được vận chuyển qua màng, enzyme ngoại bào vẫn có thể bị phân huỷ bởi

enzyme peptidase trong không gian chu chất Trong giai đoạn này pro-enzyme, là

enzyme ngoại bào trong không gian chu chất chưa có cấu trúc hoàn thiện, vẫn tiếp

tục hoàn thiện cấu trúc của nó nhờ những phản ứng thuỷ phân (Wickner et al., 1999)

2.2.9 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp lipase

Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để xác định sự ảnh hưởng tới năng suất sinh

tổng hợp lipase bởi các yếu tố như: nồng độ nguồn carbon và nitơ, pH dịch nuôi cấy,

nhiệt độ phát triển, nồng độ oxy hòa tan,… (Cordenons et al., 1996; Bùi Hồng Quân

và Nguyễn Đức Lượng, 2009)

i Nguồn carbon và chất cảm ứng

Nguồn carbon dạng lipid nói chung có tác dụng gia tăng sự sinh tổng hợp lipase ở vi

sinh vật, tuy nhiên có một vài tác giả đã cho sinh tổng hợp lipase với năng suất cao

nhưng không có dầu mỡ Triglyceride là chất quan trọng cho sự sinh tổng hợp lipase

do nó vừa đóng vai trò là chất cảm ứng cũng như là chất ức chế sự sinh tổng hợp

enzyme lipase Trong số các triglyceride, dầu olive được nhận thấy là một chất cảm

ứng tốt cho sự sinh tổng hợp lipase của đa số các vi sinh vật Tuy nhiên, khi bổ sung

lipid ở dạng tự nhiên vào môi trường nuôi sẽ làm giảm sự sinh trưởng và tổng hợp

lipase của vi sinh vật Trong khi đó, dạng nhũ tương hóa của dầu bởi gum arabic hoặc

polyvinyl alcohol (PVA) lại kích thích quá trình sinh trưởng và tổng hợp lipase của vi

sinh vật (Sharma et al., 2001)

ii Nguồn nitrogen

Cũng giống như nguồn carbon, nguồn nitrogen ảnh hưởng rất mạnh lên năng suất

sinh tổng hợp lipase của các chủng vi sinh vật Cordenons et al (1996), đã khảo sát

nhiều nguồn nitơ khác nhau để sinh tổng hợp lipase ngoại bào từ A calcoacetius

Amino acid và trypton cho năng suất tổng hợp lipase cao gấp 2 ÷ 3 lần so với

ammoni, cao nấm men và protease pepton Tuy nhiên, năng suất lipase và độ bền có

thể được cải thiện khi bổ sung nguồn nitơ hữu cơ

iii Nhiệt độ

Nhiệt độ của môi trường nuôi là một thông số quan trọng cho sự sinh trưởng, phát

triển và sinh tổng hợp lipase của vi sinh vật Nếu như nhiệt độ dưới mức tối ưu thì vi

sinh vật phát triển chậm và lượng lipase tạo ra bị hạn chế Ngược lại, nếu nhiệt độ

quá cao, có thể làm chết tế bào hoặc ảnh hưởng tới hoạt tính lipase, kết quả là giảm

năng suất tạo thành sản phẩm

iv pH

pH của môi trường là yếu tố quan trọng cho sự tổng hợp lipase Nếu như đối với

Pseudomonas aeruginosa hoạt tính lipase tạo ra cao nhất ở pH môi trường là 9,0 thì

pH tối ưu cho sự phát triển của Pseudomonas aeruginosa lại hơi acid (4,0 – 7,0) Do

đó, trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp lipase cần điều chỉnh pH cho

thích hợp ở từng giai đoạn (Sharon, 1998) Tương tự, đối với nấm men Pichia

anomala VTCC Y7087 hoạt tính lipase tạo ra cao nhất cũng ở pH tối ưu 9,0 (Bùi

Hồng Quân và Nguyễn Đức Lượng, 2009)

2.2.10 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme lipase

Giống như những cấu trúc xúc tác sinh học khác, lipase cũng chịu ảnh hưởng bởi các

yếu tố như: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại,

hàm lượng oxygen, các chất kìm hãm…

2.2.10.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Trong điều kiện thừa cơ chất, nghĩa là [S] >>[E] thì vận tốc phản ứng phụ thuộc

tuyến tính vào nồng độ enzyme

Đường biểu diễn có dạng: tốc độ phản ứng v = K[E] có dạng y = ax

Khi thừa cơ chất thì khi nồng độ enzyme tăng vận tốc tăng Khi nồng độ enzyme bão

hòa với nồng độ cơ chất thì nồng độ enzyme tăng vận tốc không thay đổi

2.2.10.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất [S]

Khi enzyme (E) kết hợp với cơ chất (S) sẽ hình thành phức hợp enzyme – cơ chất

Phức hợp sau đó tạo ra sản phẩm (P) và giải phóng enzyme Mischaelis và Menten đã

giải thích tính chất động học của phản ứng enzyme và lập được phương trình biểu

diễn sự liên quan giữa vận tốc phản ứng và nồng độ cơ chất: Tính chất phổ biến của

phương trình Mischaelis – Menten thể hiện ở chỗ nó không chỉ dùng trong trường

hợp đơn giản như đã nói ở trên (một cơ chất S tạo thành một sản phẩm P) mà nó cũng

đúng trong những trường hợp phức tạp hơn, phản ứng gồm hai hay nhiều cơ chất tạo

thành nhiều sản phẩm

2.2.10.3 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa

Các chất có tác dụng làm tăng hoạt tính của enzyme được gọi là các chất hoạt hóa

enzyme Các chất hoạt hóa enzyme có bản chất hóa học rất khác nhau Chúng có thể

là các anion, các ion kim loại, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp Các chất hoạt

hóa có tác dụng hoạt hóa ở nồng độ nhất định Vượt qua nồng độ này chúng sẽ gây

ức chế hoạt động của enzyme Ở nồng độ hoạt hóa, các chất hoạt hóa thường làm

nhiệm vụ chuyển nhóm hydrogen hoặc phục hồi các nhóm chức năng trong trung tâm

hoạt động của enzyme Tác dụng của anion clo, brom, iot đến hoạt độ của α –

amylase động vật, tác dụng của một số ion kim loại như Mn2+, Zn2+,… đối với hoạt

độ của các protease Tuy nhiên tác dụng hoạt hóa chỉ giới hạn ở những nồng độ xác

định, vượt quá giới hạn này có thể làm giảm hoạt tính enzyme

2.2.10.4 Ảnh hưởng của chất ức chế

Chất ức chế (hay chất kìm hãm) là chất có khả năng làm yếu hoặc làm mất hoàn toàn

tác dụng của enzyme Khi có mặt cơ chất, hoạt tính xúc tác của enzyme bị ảnh hưởng

bởi loại chất ức chế và nồng độ chất ức chế Các chất ức chế có thể tác động thuận

nghịch hoặc không thuận nghịch với enzyme Chất ức chế thuận nghịch tương tác với

enzyme thông qua các liên kết không đồng hóa trị hay các phản ứng phân ly Ngược

lại chất ức chế không thuận nghịch gây ra sự thay đổi liên kết đồng hóa trị trong

enzyme (Đỗ Quý Hai, 2004)

2.2.10.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Theo quy luật của các phản ứng hóa học thông thường, vận tốc phản ứng càng tăng

khi nhiệt độ tăng, nhưng vì enzyme có bản chất là protein do đó khi tăng nhiệt độ tới

một giới hạn nào đó thì vận tốc phản ứng enzyme sẽ bị giảm do sự biến tính của

protein Sự gia tăng nhiệt độ làm tăng tốc độ phản ứng, vì các nguyên tử trong phân

tử enzyme có năng lượng cao hơn và xu hướng lớn hơn để di chuyển Tuy nhiên,

nhiệt độ bị giới hạn trong phạm vi sinh học bình thường Khi nhiệt độ tăng, sự biến

tính nhiệt phá hủy các hoạt động của các phân tử enzyme Điều này là do sự mở ra

của chuỗi protein sau khi bị mất các liên kết yếu như liên kết hydro, vì thế vận tốc

phản ứng bị giảm (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011)

Nhiệt độ ứng với vận tốc cực đại gọi là nhiệt độ tối thích, thường ở trong khoảng từ

40 ÷ 60C Tuy nhiên, mỗi enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau, nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nguồn enzyme, cơ chất, pH môi trường, thời gian phản

ứng… Nhiệt độ mà enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính xúc tác gọi là nhiệt độ tới hạn,

thường vào khoảng 70C Ở nhiệt độ tới hạn enzyme bị biến tính, ít khi có khả năng

phục hồi Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 0C hoạt tính của enzyme tuy bị giảm nhưng lại

có thể tăng lên khi đưa về nhiệt độ bình thường Một số enzyme có thể chịu nhiệt rất

tốt do chỉ bị biến tính bởi nhiệt độ cao, đặc biệt là các enzyme được phân lập từ sinh

vật ưa nhiệt được tìm thấy trong môi trường nóng nào đó (Nguyễn Công Hà và Lê

Nguyễn Đoan Duy, 2011)

2.2.10.6 Ảnh hưởng của pH

Giá trị pH có ảnh hưởng lớn tới vận tốc phản ứng enzyme, mỗi enzyme chỉ hoạt động

thích hợp nhất ở một pH xác định gọi là pH tối thích của enzyme Ví dụ, pHopt của

tripsin là 5 ÷ 9, của pepsin là 1,8 ÷ 2,2 Cùng một loại enzyme nhưng thu từ các

nguồn khác nhau cũng có pH tối thích khác nhau

Sự thay đổi giá trị pH có ảnh hưởng rất lớn đến trạng thái ion hóa của các nhóm chức

trong trung tâm hoạt động của enzyme, trạng thái ion hóa của cơ chất và phức chất

Ngoài các yếu tố chính đã nêu trên, hoạt tính của enzyme còn phụ thuộc vào những

yếu tố khác như ánh sáng (đặc biệt là tia tử ngoại), sóng siêu âm, tia bức xạ,… Trong

hệ thống sống, hoạt tính enzyme còn phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng phát triển

của sinh vật (Đỗ Quý Hai và Trần Thanh Phong, 2005)

2.2.11 Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase

Trong enzyme học, người ta không định lượng enzyme một cách trực tiếp mà thường

xác định gián tiếp thông qua xác định mức độ hoạt động (hoạt độ) của enzyme Bởi

vì, khi có mặt enzyme thì sự hoạt động của nó được biểu hiện ra ở chỗ nó làm thay

đổi các tính chất vật lý, hoá lý cũng như tính chất hoá học của hỗn hợp phản ứng

Theo dõi những biến đổi đó có thể biết được chính xác mức độ hoạt động của

enzyme thông qua xác định lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo

thành trong phản ứng (Vương Bảo Thy và cộng sự, 2011)

Về nguyên tắc, có thể chia ra 3 nhóm phương pháp sau:

1) Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời

gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định

2) Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất

hay sản phẩm ứng với một nồng độ enzyme nhất định

3) Chọn nồng độ enzyme cần thiết như thế nào để trong một thời gian nhất định

thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm

Bảng 2.1: Ba nhóm phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase

Nhóm Các thông số cố định Các thông số thay đổi

1 Thời gian

Nồng độ enzyme

Biến thiên của S hay P

2 Lượng cơ chất mất đi (hay lượng sản phẩm

Có thể tìm thấy trên các bài báo, tạp chí khoa học nhiều phương pháp để đo hoạt tính

thuỷ phân của enzyme lipase Những phương pháp này có thể được phân loại như

sau:

 Phương pháp chuẩn độ (Titrimetry)

 Phương pháp quang phổ (Spectroscopy (photometry, fluorimetry))

 Phương pháp sắc ký (Chromatography)

 Phương pháp phóng xạ (Radioactivity)

 Phương pháp sức căng bề mặt (Interfacial tensionmetry)

 Phương pháp đục kế (Turbidimetry)

 Phương pháp đo độ dẫn điện (Conductimetry)

 Phương pháp hoá học miễn dịch (Immuno-chemistry)

 Phương pháp hiển vi (Microscopy)

(Arpigny và Jaeger, 1999)

2.2.12 Ứng dụng

Lipase được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp chế biến dầu béo, thực

phẩm, chất tẩy rửa, tổng hợp hoá chất và dược phẩm, sản xuất giấy và các loại mỹ

phẩm (Rubin và Dennis, 1997a,b; Kazlauskas và Bornscheuer, 1998) Ngoài ra,

lipase còn được sử dụng để thúc đẩy phản ứng phân huỷ chất thải dạng béo (fatty

waste) (Masse et al., 2001) và polyurethane (Takamoto et al., 2001) Một số những

ứng dụng quan trọng của lipase được tổng hợp trong bảng Phần lớn chế phẩm lipase

được thu nhận từ vi khuẩn, nấm men và nấm mốc

Bảng 2.2: Ứng dụng của lipase trong công nghiệp

Ngành công nghiệp Phản ứng Sản phẩm hoặc ứng dụng

Chất tẩy rửa Thuỷ phân chất béo Loại vết dầu mỡ trên vải

Sữa và thực phẩm từ sữa Thuỷ phân chất béo sữa,

làm chín phô mai, thay đổi thành phần bơ sữa

Tăng cường hợp chất tạo hương vị cho sữa, phô mai

và bơ Bánh kẹo Cải thiện mùi vị Kéo dài thời gian bảo quản

Thức uống Tăng cường hương vị Thức uống

Nước sốt (Food Dressings) Cải thiện chất lượng Mayonnaise, dressings,

whippings Thực phẩm dinh dưỡng Chuyển hoá ester Thực phẩm dinh dưỡng

Thịt cá Cải thiện mùi vị Sản phẩm thịt cá loại mỡ

Dầu béo Chuyển hoá ester, thuỷ

phân

Bơ ca cao, margarine, acid béo, glycerol, mono và diglyceride

Hoá chất Phản ứng tổng hợp đặc hiệu Hợp chất vòng chiral, hoá

chất Dược phẩm Chuyển hoá ester, thuỷ

phân

Chất hỗ trợ tiêu hoá, trao đổi chất

Mỹ phẩm Tổng hợp Chất nhũ hoá, chất làm ẩm

Thuộc da Thuỷ phân Sản phẩm thuộc da

Giấy Thuỷ phân Giấy chất lượng cao

(Nguồn: Vulfson, 1994)

i Công nghiệp chất tẩy rửa

Nhờ vào khả năng thuỷ phân chất béo, lipase được sử dụng như một loại phụ gia

trong công nghiệp chất tẩy rửa Tuy nhiên, lipase phải thoả mãn những yêu cầu sau:

(1) không đặc hiệu cơ chất, có khả năng thuỷ phân dầu mỡ với thành phần khác nhau;

(2) chịu đựng điều kiện khắc nghiệt (pH 10 ÷ 11, 30 ÷ 60C); (3) không bị tác động

bởi các chất hoạt động bề mặt và các enzyme khác có trong hỗn hợp chất tẩy rửa Để

đạt những tính chất như trên, kỹ thuật tái tổ hợp di truyền và phân tích protein đã

được áp dụng trong nghiên cứu nuôi cấy và thu nhận lipase từ vi sinh vật (Yeoh et

al., 1986; Wang et al., 1995; Cardenas et al., 2001; Kazlauskas và Bornscheuer,

1998)

Năm 1994, hãng Novo Nordisk đã giới thiệu sản phẩm lipase thương mại đầu tiên

“Lipolase” có nguồn gốc từ Thermomyces lanuginosus và Aspergillus oryzae Năm

1995, hai chế phẩm lipase “Lumafast” từ Pseudomonas mendocina và “Lipomax” từ

P alcaligenes đã được công bố bởi hãng Genencor International Hai loại chế phẩm

này được xem là có khả năng thích nghi cao trong điều kiện tẩy rửa (Jaeger và Reetz,

1998)

ii Công nghiệp thực phẩm

Chất béo là một trong những thành phần quan trọng của thực phẩm Không những

mang lại giá trị dinh dưỡng cao, chất béo còn đem đến giá trị cảm quan rất tốt đối với

thực phẩm Tính chất của chất béo phụ thuộc vào vị trí acid béo trên mạch glycerol,

độ dài mạch và mức độ không bão hoà của các acid béo Vì thế lipase có khả năng

thay đổi tính chất của chất béo bằng cách thay đổi vị trí acid béo và có thể thay thế

một hoặc nhiều hơn các acid béo trên mạch glycerol Với cách làm như vậy, các loại

chất béo có giá trị không cao sẽ được cải thiện và tăng giá trị sử dụng (Colman và

Macrae, 1980; Pabai et al., 1995a,b; Undurraga et al., 2001)

Bơ ca cao chứa thành phần acid béo palmitic và stearic, có điểm nóng chảy tại 37C,

là thành phần quan trọng trong sản xuất chocolate Với công nghệ sử dụng lipase

thực hiện phản ứng thuỷ phân và tổng hợp liên kết ester, chất béo thay thế bơ ca cao

đã được sản xuất từ những chất béo có giá trị không cao (Colman và Macrae, 1980;

Undurraga et al., 2001) Một ứng dụng khác là sử dụng lipase cố định Rhizomucor

miehei thực hiện phản ứng trao đổi ester để thay thế acid palmitic của dầu cọ bằng

acid stearic, hoặc có thể làm giảm hàm lượng acid béo mạch dài tại vị trí sn-2 bằng

cách trao đổi với những phân tử C18: 0 và C18: 1 (Pabai et al., 1995a)

Với những hiệu quả trong quá trình trao đổi chất, PUFA (polyunsaturated fatty acid)

được sử dụng trong dược phẩm và thực phẩm chức năng PUFA rất cần thiết cho quá

trình tổng hợp màng membrane và prostaglandin Những PUFA tự do hay dạng mono

hoặc diglyceride của nó được điều chế thành dược phẩm có tác dụng hạn chế hàm

lượng cholesterol trong máu, kháng viêm và chống tắc nghẽn mạch Lipase vi sinh

vật được ứng dụng để tách và thu nhận PUFA từ mỡ động vật và dầu thực vật (Gill

và Valivety, 1997a,b; Belarbi et al., 2000)

Trong công nghiệp sản xuất phô mai, lipase được ứng dụng trong quá trình làm chín

để tăng thêm hương vị cho sản phẩm Đối với công nghiệp thịt cá, lipase giúp loại bỏ

những chất béo không mong muốn ảnh hưởng đến mùi vị sản phẩm trong quá trình

bảo quản (Kazlauskas và Bornscheuer, 1998)

iii Công nghiệp sản xuất giấy

Thành phần không ưa nước trong gỗ, chủ yếu là triglyceride và sáp, sẽ gây cản trở

trong quá trình sản xuất giấy (Jaeger và Reetz, 1998) Lipase được sử dụng để loại bỏ

những thành phần này ra khỏi bột giấy trong quá trình làm giấy Ngành công nghiệp

Nippon Paper Industries của Nhật Bản đã ứng dụng thành công lipase Candida

rugosa có thể thuỷ phân đến 90% hàm lượng triglyceride có trong gỗ (Sharma et al.,

2001)

iv Tổng hợp hữu cơ

Việc sử dụng lipase trong tổng hợp hoá học hữu cơ ngày càng trở nên đa dạng do tính

chất đặc hiệu về cơ chất, vị trí và cấu hình không gian của enzyme (Rubin và Dennis,

1997b; Kazlauskas và Bornscheuer, 1998; Berglund và Hutt, 2000) Phần lớn lipase

sử dụng có nguồn gốc từ vi sinh vật Những enzyme này hoạt động trên bề mặt phân

chia hai pha kỵ và ưa nước và có khả năng hoạt động tốt trong dung môi hữu cơ

(Berglund và Hutt, 2000)

Ứng dụng quan trọng của lipase là tổng hợp liên kết ester, tạo thành các hợp chất tạo

hương và nguồn nhiên liệu diesel quan trọng Tuỳ thuộc vào điều kiện phản ứng mà

enzyme này có thể thực hiện phản ứng thuỷ phân hoặc tổng hợp liên kết ester

(Klibanov, 1997)

2.3 QUÁ TRÌNH TRÍCH LY LIPASE TỪ NỘI TẠNG

2.3.1 Định nghĩa

Trích ly là quá trình tách một hoặc một số chất tan trong chất lỏng hay trong chất rắn

bằng một chất lỏng khác – gọi là dung môi Nếu quá trình tách chất hòa tan trong

chất lỏng bằng một chất lỏng khác thì gọi là trích ly lỏng – lỏng Nếu quá trình tách

chất hòa tan trong chất rắn bằng một chất lỏng thì gọi là trích ly rắn – lỏng (Nguyễn

Bin, 2008) Trong quá trình trích ly phải có sự tồn tại và tiếp xúc giữa hai pha

(Nguyễn Văn Mười, 2009)

2.3.2 Cơ sở lý thuyết của quá trình trích ly enzyme

Bất kỳ một quá trình trích ly rắn – lỏng nào cũng bao gồm các giai đoạn: dung môi

thâm nhập vào các mao quản của vật thể rắn, hòa tan các cấu tử cần tách (hoặc là tiến

hành các phản ứng hóa học), sau đó chất tan và dung môi khuếch tán vào dung dịch

từ vật thể rắn Đôi khi chất hòa tan chứa trong các mao quản của vật thể rắn ở dạng

dung dịch lỏng, trường hợp này chất hòa tan được chuyển trực tiếp vào dung môi

bằng khuếch tán (Nguyễn Bin, 2008)

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly của enzyme

2.3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và nguyên liệu

Sự chênh lệch nồng độ chất tan giữa dung môi và canh trường bề mặt sau lên men

càng lớn sẽ thúc đẩy quá trình khuếch tán chất tan ra ngoài dung môi càng tăng

(McCabe et al., 1993) Khi tỷ lệ dung môi và cơ chất thấp, không đủ xâm nhập vào

toàn bộ mẫu sử dụng để trích ly (Lonsane và Krishnaiah, 1992), không đủ cho sự

khuếch tán chất tan (enzyme) vào dung môi Hơn nữa, một lượng dung môi sẽ được

giữ lại trong nguyên liệu cũng là nguyên nhân làm giảm hiệu quả thu nhận chất tan

(Rao, 2010), hiệu quả thu nhận enzyme thấp Tuy nhiên, tỷ lệ dung môi và nguyên

liệu cao, không những hoạt tính enzyme bị pha loãng mà còn tạo điều kiện thuận lợi

cho vi sinh vật hoạt động làm ảnh hưởng đến chất lượng của protein hay enzyme

trích ly

2.3.3.2 Ảnh hưởng của pH môi trường

Sự thay đổi pH ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính enzyme do liên quan đến sự tương tác

giữa enzyme và cơ chất Phản ứng xúc tác phụ thuộc vào điện tích phân bố trên cả

enzyme lẫn cơ chất, cụ thể là trung tâm hoạt động của phân tử enzyme Mỗi enzyme

chỉ hoạt động mạnh nhất ở một pH xác định, gọi là pH tối ưu pH tối ưu cho hoạt

động của các enzyme có nguồn gốc động vật, điển hình như lipase từ nội tạng cá tra

(Phạm Thị Hồng Nga, 2008) vào khoảng 9 Giá trị pH tối ưu của mỗi enzyme có thể

thay đổi trong một khoảng nhất định tùy theo tính chất và nồng độ cơ chất, nhiệt độ

và bản chất của các loại dung dịch đệm (Phan Thị Bích Trâm, 2010)

2.3.3.3 Tác động của nhiệt độ và thời gian trích ly

Bản chất của enzyme là protein do đó nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến vận tốc phản

ứng Nhiệt độ tăng kéo theo tốc độ phản ứng tăng nhưng đến mức nào đó thì tốc độ

phản ứng giảm xuống do enzyme bị biến tính Đa số enzyme có nhiệt độ tối ưu

khoảng 40 ÷ 50°C Ở nhiệt độ trên 70°C, phần lớn enzyme đều mất hoạt tính Nhiệt

độ tối ưu của các enzyme khác nhau thì không giống nhau, chúng tùy thuộc vào

nguồn gốc sản sinh ra chúng Phần lớn nhiệt độ tối ưu của enzyme từ vi sinh vật, thực

vật cao hơn động vật Nhiệt độ tối ưu của những enzyme không cố định mà thay đổi

theo thời gian thủy phân, nồng độ enzyme, cơ chất phản ứng và dạng tồn tại của

enzyme (Rao, 2010)

Ngoài ra, thời gian trích ly cũng là một trong những yếu tố có ảnh hưởng đáng kể đến

hoạt tính enzyme Việc gia tăng nhiệt độ ly trích có tác động tích cực trong việc gia

tăng tính tan của dung môi, làm tăng vận tốc chuyển động và thúc đẩy quá trình thẩm

thấu dung môi vào cơ chất và gia tăng khả năng khuếch tán, hay ly trích lipase Tuy

nhiên, nhiệt độ ly trích cao có thể là nguyên nhân dẫn đến sự kém ổn định và ức chế

hoạt động của enzyme Điều này cũng xảy ra với trường hợp thời gian ly trích dài

Thời gian thủy phân nhanh hay chậm còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như kích thước

nguyên liệu cấu trúc loại protein, tác động đến sự khuếch tán enzyme vào dung môi,

khi enzyme phải xuyên qua khoảng trống bên trong với đường đi quanh co, kết quả là

khoảng cách khuếch tán dài (McCabe et al., 1993) Ở cùng tỷ lệ dung môi sử dụng,

thời gian ly trích ngắn sẽ không đủ cho quá trình ngấm dung môi vào nguyên liệu để

khuếch tán enzyme, giảm hiệu suất thu nhận enzyme (Rao, 2010)

2.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN

Lipase là enzyme được ứng dụng trong nhiều ngành như công nghiệp thực phẩm,

công nghiệp hóa học, mỹ phẩm, da,… Các nghiên cứu về tính chất và hoạt động của

lipase đã và đang được nhận được sự quan tâm của các nhà khoa học trong và ngoài

nước Trần Thị Bé Lan và cộng sự (2012) đã nghiên cứu những điều kiện tối ưu của

hai chế phẩm enzyme lipase từ Candida rugosa và Porcine pancreas Theo đó, đối

với lipase từ Candida rugosa, nhiệt độ và pH tối ưu tương ứng là 40C và độ pH là

7,0 (đệm phosphate) Sau 60 phút, độ bền pH thể hiện hoạt tính enzyme còn lại là

79,6%, độ bền nhiệt độ thể hiện hoạt tính enzyme còn lại là 84% Còn đối với lipase

từ Porcine pancreas, nhiệt độ và pH tối ưu tương ứng là 40C và độ pH là 8,5 (đệm

borate) Sau 60 phút, độ bền pH thể hiện hoạt tính enzyme còn lại là 100%, độ bền

nhiệt độ thể hiện hoạt tính enzyme còn lại là 71,4% Cũng trong nghiên cứu này,

Trần Thị Bé Lan và cộng sự (2012) đã kết luận rằng cả hai enzyme đều bị ảnh hưởng

bởi các ion Ca2+, Mg2+ và Al3+

Phạm Thị Hồng Nga (2008) đã nghiên cứu về trích ly lipase từ nội tạng cá tra Kết

quả nghiên cứu chỉ ra rằng quy trình trích ly tiến hành ở nhiệt độ 30C, thời gian trích

ly là 2,5 giờ, pH dung môi trích ly (dung dịch Na2CO3) là 9, tỷ lệ nội tạng và dung

môi trích ly là 1: 2,5 (theo khối lượng) thu được dịch trích có hoạt tính riêng của

lipase cao nhất là 1,4257 (mol/h.mg)

Lipase được trích từ nấm mốc Pseudomonas sp làm việc ở điều kiện tối ưu là nhiệt

độ 50C, pH = 8 và cơ chất được sử dụng là dầu olive 15% (Tembhurkar et al.,

2012)

Chartrain et al (1993) đã tinh chế được lipase từ P aeruginosa MB5001 Enzyme

tinh chế có khối lượng phân tử 29 kDa, hoạt tính enzyme thể hiện cao nhất ở nhiệt độ

55C và pH = 8,0

Từ các nghiên cứu thực tế trong và ngoài nước ở lĩnh vực trích ly và ứng dụng lipase

từ nguồn động vật, một số vấn đề cơ bản cần quan tâm là:

- Sự ổn định của nguồn nguyên liệu cung cấp lipase

- Các điều kiện trích ly enzyme phụ thuộc rất lớn vào đặc điểm từng loại

enzyme và nguồn nguyên liệu, trong đó tỷ lệ dung môi sử dụng để hòa tan

enzyme, tác động của pH, nhiệt độ và thời gian trích là các yếu tố có tầm quan

trọng cao nhất

Việc xác định các tính chất cơ bản của enzyme là cơ sở bước đầu trong việc dự đoán

đặc điểm, phương thức hoạt hóa và lĩnh vực ứng dụng của lipase khảo sát