hiệu quả kháng thể kháng virus viêm gan vịt type 1 được tạo từ lòng đỏ trứng gà trong điều kiện in vitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y Đề tài: “Thử nghiệm hiệu quả bảo nguyên bào sợi vịt của kháng thể kháng virus viêm gan vịt type 1 tạo từ lòng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

TRẦN NGUYỄN TUẤN PHƯƠNG

HIỆU QUẢ KHÁNG THỂ KHÁNG VIRUS VIÊM GAN VỊT TYPE 1 ĐƯỢC TẠO TỪ

LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ TRONG

ĐIỀU KIỆN IN VITRO

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH THÚ Y

Cần Thơ, 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

HIỆU QUẢ KHÁNG THỂ KHÁNG VIRUS VIÊM GAN VỊT TYPE 1 ĐƯỢC TẠO TỪ

LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ TRONG

ĐIỀU KIỆN IN VITRO

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

PGS.TS HỒ THỊ VIỆT THU TRẦN NGUYỄN TUẤN PHƯƠNG

Cần Thơ, 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

Đề tài: “Thử nghiệm hiệu quả bảo nguyên bào sợi vịt của kháng thể

kháng virus viêm gan vịt type 1 tạo từ lòng đỏ trứng gà trong điều kiện In

vitro’’ do sinh viên Trần Nguyễn Tuấn Phương thực hiện tại phòng thí

nghiệm virus học, Bộ môn Thú y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ, từ tháng 08 năm 2014 đến tháng 12 năm 2014

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2014 Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2014

Duyệt của bộ môn Duyệt của giáo viên hướng dẫn

PGS.TS HỒ THỊ VIỆT THU

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2014

Duyệt của Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

Tác giả luận văn

Trần Nguyễn Tuấn Phương

LỜI CẢM TẠ

Con xin kính gửi lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng nhất đến Cha Mẹ - đấng sinh thành đã nuôi dưỡng, dạy dỗ, động viên khuyến khích con trong suốt quá trình học tập và làm người

Qua thời gian học tập và rèn luyện tại trường Đại Học Cần Thơ, cũng như trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp đại học, tôi đã được quý Thầy Cô tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kiến thức kinh nghiệm quý báo về chuyên ngành Thú Y mà tôi đang theo học

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến

- Cô Hồ Thị Việt Thu đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận

TÓM LƯỢC

Đề tài “Hiệu quả kháng thể kháng virus viêm gan vịt type 1 được tạo từ

lòng đỏ trứng gà trong điều kiện in vitro” Được tiến hành tại phòng thí

nghiệm virus học, Bộ Môn Thú Y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ trong thời gian từ tháng 8/2014 đến tháng 12/2014 Nghiên cứu được thực hiện nhằm khảo sát độc tính tế bào và khả năng bảo vệ lớp nguyên bào sợi vịt (Duck Embryo Fibroblast (DEF)) của dich kháng thể được tạo từ lòng đỏ trứng gà (IgY) đối với virus viêm gan vịt type 1 (Duck hepatitis virus type 1 (DHV-1)) Hiệu quả bảo vệ nguyên bào sợi vịt của IgY được xác định qua các thời điểm khác nhau Qua đó, các độ pha loãng của IgY theo bậc 10 đưa vào tế bào trước 12 giờ, 24 giờ và sau 12 giờ, 24 giờ gây nhiễm tế bào với DHV-1 liều 500 TCID50 Các số liệu và hình ảnh được ghi nhận và phân tích qua hai phương pháp là khảo sát sự thay đổi hình thái lớp nguyên bào sợi vịt dưới kính hiển vi soi ngược và so sánh các giá trị từ phương pháp đo mật độ quang

Kết quả thử nghiệm cho thấy dịch IgY không gây độc cho tế bào DEF ở liều thấp hơn 1,688 mg/ml Hiệu quả bảo vệ tế bào DEF của IgY biến thiên theo phương thức phụ thuộc liều thử nghiệm nằm trong khoảng hàm lượng IgY từ 1,688 mg/ml đến 1,688.10-1 mg/ml Ngoài ra, dịch IgY cho hiệu quả

bảo vệ tế bào DEF in vitro tốt nhất nếu đưa IgY vào môi trường tế bào trước

12 giờ gây nhiễm với DHV-1

Kết quả đề tài cung cấp các số liệu thử nghiệm để làm cơ sở cho các

nghiên cứu tiếp theo về kháng thể IgY trong điều kiện in vitro.

MỤC LỤC

Trang

TRANG DUYỆT LUẬN VĂN i

LỜI CAM ĐOAN ii

LỜI CẢM TẠ iii

TÓM LƯỢC iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH HÌNH viii

DANH SÁCH SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ ix

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT x

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 2

2.1 Virus viêm gan vịt 2

2.1.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại virus 2

2.1.2 Sức đề kháng của virus viêm gan vịt 2

2.1.3 Cơ chế sinh bệnh của virus viêm gan vịt type 1 3

2.1.4 Đặc tính nuôi cấy virus viêm gan vịt type 1 3

2.1.5 Nuôi cấy tế bào xơ phôi vịt 3

2.2 Kháng thể IgY của gà 3

2.2.1 Sơ lược về IgY 3

2.2.2 Cấu trúc và chức năng 4

2.2.3 Đặc tính của IgY 4

2.3 Vai trò của kháng thể 5

2.3.1 Liên kết với kháng nguyên 5

2.3.2 Hoạt hóa tế bào miễn dịch 5

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 6

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 6

3.1.1 Thời gian 6

3.1.2 Địa điểm 6

3.2 Vật liệu và hóa chất 6

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm 6

3.2.2 Các dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 6

3.2.3 Các hóa chất và môi trường 7

3.3 Nội dung nghiên cứu 7

3.4 Phương pháp nghiên cứu 8

3.4.1 Chuẩn bị lớp đơn tế bào DEF 9

3.4.2 Chuẩn độ và xác định liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy 10

3.4.3 Xác định liều an toàn của dịch IgY đối với tế bào DEF 12

3.4.4 Khảo sát hoạt tính bảo vệ nguyên bào sợi vịt của IgY qua các thời điểm bổ sung sinh phẩm khác nhau 14

3.5 Phương pháp xử lý số liệu 15

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16

4.1 Chuẩn độ virus, xác định liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy của virus gây bệnh viêm gan vịt type 1 16

4.2 Kết quả xác định liều an toàn của dịch kháng thể IgY đối với tế bào DEF 17

4.3 Hoạt tính bảo vệ tế bào DEF của kháng thể IgY kháng DHV-1 trong điều kiện in vitro 20

4.3.1 Kết quả xác định hoạt tính bảo vệ tế bào DEF của dịch kháng thể IgY khi đưa sinh phẩm vào lúc 12 giờ sau khi gây nhiễm DHV-1 21

4.3.2 Kết quả xác định hoạt tính bảo vệ tế bào DEF của dịch kháng thể IgY khi đưa sinh phẩm vào lúc 24 giờ sau khi gây nhiễm DHV-1 23

4.3.3 Kết quả xác định hoạt tính bảo vệ tế bào DEF của dịch kháng thể

IgY khi đưa sinh phẩm vào lúc 12 giờ trước khi gây nhiễm DHV-1 25

4.3.4 Kết quả xác định hoạt tính bảo vệ tế bào DEF của dịch kháng thể IgY khi đưa sinh phẩm vào lúc 24 giờ trước khi gây nhiễm DHV-1 27

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 29

5.1 Kết luận 29

5.2 Đề nghị 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO 30

PHỤ LỤC 1 CHUẨN BỊ HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG 33

PHỤ LỤC 2 CÁC KỸ THUẬT PHÒNG THÍ NGHIỆM 34

PHỤ LỤC 3 SỐ LIỆU VÀ XỬ LÝ THỐNG KÊ 35

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 4.1 Tỷ lệ xuất hiện CPE do DHC-1 gây ra theo nồng

độ virus trên lớp đơn tế bào DEF

16

Bảng 4.2 Giá trị OD620 và tỷ lệ tế bào sống trung bình

trong thí nghiệm xác định liều an toàn của dịch IgY

19

Bảng 4.3 Giá trị OD620 và tỷ lệ tế bào sống trung bình khi

đưa kháng thể IgY vào tế bào DEF sau 12 giờ gây nhiễm với DHV-1

21

Bảng 4.4 Giá trị OD620 và tỷ lệ tế bào sống trung bình khi

đưa kháng thể IgY vào tế bào DEF sau 24 giờ gây nhiễm với DHV-1

23

Bảng 4.5 Giá trị OD620 và tỷ lệ tế bào sống trung bình khi

đưa kháng thể IgY vào tế bào DEF trước 12 giờ gây nhiễm với DHV-1

25

Bảng 4.6 Giá trị OD620 và tỷ lệ tế bào sống trung bình khi

đưa kháng thể IgY vào tế bào DEF trước 24 giờ gây nhiễm với DHV-1

27

DANH SÁCH HÌNH

Hình 3.1 Bố trí thí nghiệm xác định liều TCID50/ 0,1 ml 10

Hình 4.1 Hình ảnh tế bào DEF dưới tác động gây độc của

IgY ở những nồng độ khác nhau

18

Hình 4.2 Hình ảnh tế bào DEF dưới tác dụng bảo vệ bởi

IgY ở những nồng độ khác nhau đối với virus DHV-1 khi gây nhiễm ở 12 giờ trước khi sử dụng IgY (100X)

22

Hình 4.3 Hình ảnh tế bào DEF dưới tác dụng bảo vệ bởi

IgY ở những nồng độ khác nhau đối với virus DHV-1 khi gây nhiễm ở 24 giờ trước khi sử dụng IgY (100X)

24

Hình 4.4 Hình ảnh tế bào DEF dưới tác dụng bảo vệ bởi

IgY ở những nồng độ khác nhau bổ sung thời điểm 12 giờ trước khi gây nhiễm virus DHV-1 (100X)

26

Hình 4.5 Mật độ quang trên đĩa nuôi cấy sau khi nhuộm

MTT, kháng thể IgY được đưa vào môi tường tế bào DEF trước 24 giờ gây nhiễm DHV-1

28

DANH SÁCH SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ

Sơ đồ 3.1 Quá trình khảo sát xác định hoạt tính kháng

DHV-1 in vitro của dịch kháng thể IgY

8

Sơ đồ 3.3 Qui trình chuẩn độ virus gây bệnh viêm gan vịt

type 1 trên môi trường tế bào DEF

11

Sơ đồ 3.4 Qui trình xác định liều an toàn của dịch IgY đối

với tế bào DEF

13

Sơ đồ 3.5 Qui trình khảo sát hoạt tính bảo vệ tế bào DEF

của IgY qua các thời điểm khác nhau

15

Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ tế bào sống trung bình của tế bào DEF với

các nồng độ kháng thể IgY khác nhau

19

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

CC50 50% Cytotoxic concentration Nồng độ gây độc 50% tế bào CPE Cytopathic effect Bệnh tích tế bào

D’MEM Dulbeco - Modified Eagle

Medium

Môi trường cải tiến của Dulbeco

DEF Duck embryo fibroblast Nguyên bào sợi vịt

DHV Duck hepatitis virus Virus gây bệnh viêm gan vịt DHV-1 Duck hepatitis virus type 1 Virus gây bệnh viêm gan vit

type 1 DMSO Dimethyl sulfoxide

DNA Deoxyribonucleic Axit

DPBS Dulbecco phosphate

buffered saline

Dung dịch muối đệm phosphate Dulbecco E’MEM Eagle Minimum Essential

Medium

Môi trường nuôi cấy tế bào

EDTA Ethylendiamin Tetra Acetic

Acid Fab Fragment antigen binding Tiểu phần liên kết kháng

nguyên FBS Fetal bovine serum Huyết thanh bào thai

Fc Fragment crystal Tiểu phần có khả năng kết

tinh IgA Immunoglobulin A Globulin miễn dịch lớp A IgG Immunoglobulin G Globulin miễn dịch lớp G IgM Immunoglobulin M Globulin miễn dịch lớp M IgY Egg yolk immunoglobulin Kháng thể lòng đỏ

IU International unit Đơn vị quốc tế

MEM Minimum Essential Medium Môi trường cần thiết tối thiểu MTT 3-(4,5-dimethyldiazol-2-yl)-

2,5-diphenyl tetrazolium bromide

Thuốc nhuộm MTT

NK Natural killer cell Tế bào diệt tự nhiên

OD620 Optical density 620nm Mật độ quang đo được ở

bước sóng 620nm

PD Proportional distance Khoảng cách tỷ lệ

RNA Ribonucleic acid

SE Standard error Sai số chuẩn

SPF Specific-pathogen-free Đàn không có mầm bệnh TCID50 Tissue culture infective dose

ĐC (+) Đối chứng dương Môi trường tế bào DEF cho

DHV-1 với liều 500 TCID50

MTDT Môi trường duy trì

MTPL Môi trường pha loãng

MTTT Môi trường tăng trưởng

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh viêm gan vịt do virus là bệnh truyền nhiễm cấp tính lây lan nhanh gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi vịt (Nguyễn Xuân Bình, 2002) Bệnh chủ yếu xảy ra ở vịt con 1-3 tuần tuổi với tỷ lệ chết cao từ 50-90%, có khi tới 100% Bệnh cũng có thể gặp ở vịt mới nở hoặc vịt 5-6 tuần tuổi (Hồ Thị Việt Thu và ctv, 2012) Virus viêm gan vịt hiện có 3 type: 1, 2 và 3 Trong đó, virus viêm gan vịt type 1 (DHV-1) có độc lực cao, gây bệnh nặng và tỷ lệ tử vong rất lớn Cho đến nay bệnh vẫn gia tăng, lưu hành ở nhiều địa phương trên khắp cả nước, gây thiệt hại nặng nề về kinh tế cho người chăn nuôi Bệnh không thể điều trị bằng kháng sinh

Kháng thể lòng đỏ (IgY) là một globulin miễn dịch được sản xuất từ các tế bào plasmocyte Kháng thể IgY có trọng lượng phân tử là 180 kilo-dalton Hiện nay trên thế giới bên cạnh các nghiên cứu tạo kháng thể gà chống các tác nhân nhiễm trùng và ứng dụng thành công trong điều trị bệnh thú y ở các loài như heo, bò, chó, gà đã có một số nơi nghiên cứu chế tạo kháng thể gà

kháng các tác nhân gây tiêu chảy ở người trong đó có Rotavirus và E.coli tiêu

chảy

Ưu điểm của kháng thể đặc hiệu là liên kết với đúng kháng nguyên đó, không gây tồn dư như kháng sinh gây ảnh hưởng đến sức khỏe của con người khi sử dụng các sản phầm của con vật đó Kháng thể sản xuất từ lòng đỏ sẽ thu được nhiều kháng thể hơn so với sản xuất kháng thể từ huyết thanh, vì gà có thể khai thác trong thời gian dài Động vật có vú không thể khai thác huyết thanh thường xuyên được Sản lượng trứng gà lại cao 300 trứng/ năm mà mỗi trứng cho hàm lượng IgY ít nhất là 100 mg/ trứng

Xuất phát từ nhu cầu tìm một phương thức trị bệnh viêm gan vịt type 1

đem lại hiệu quả cao Chúng tôi tiến hành đề tài “Hiệu quả kháng thể kháng

virus viêm gan vịt type 1 được tạo từ lòng đỏ trứng gà trong điều kiện in

vitro”

Mục tiêu đề tài

Xác định được hiệu quả bảo vệ tế bào nguyên bào sợi vịt (DEF) của kháng thể IgY kháng virus viêm gan vịt type 1 tại các thời điểm bổ sung sinh phẩm khác nhau Thử nghiệm xác định hiệu quả bảo vệ tế bào DEF của kháng thể IgY làm cơ sở cho thử nghiệm xác định hiệu quả bảo vệ vịt con thí nghiệm của sinh phẩm này đối với bệnh viêm gan vịt do virus

Chương 2

CƠ SỞ LÝ LUẬN

2.1 VIRUS VIÊM GAN VỊT

2.1.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại virus

Bệnh viêm gan vịt do virus (Duck Virus Hepatitis - DHV) là bệnh truyền nhiễm cấp tính do một RNA virus rất nhỏ, xuyên qua được màng lọc Beckfeld và Seitz (Levine and Fabricant, 1950) Theo Reuss (1959) dưới kính hiển vi điện tử virus viêm gan vịt là những hạt tròn bề mặt xù xì, không có vỏ bọc, kích thước 20-40 nm, có 32 capxomer

Virus viêm gan vịt có 3 type khác nhau: type 1 (DHV-1), 2, 3 Các type

2 và 3 được công nhận tồn tại riêng biệt và nó gây bệnh cho vịt con đã miễn dịch với type 1 (Nguyễn Đức Lưu, 2002)

Virus viêm gan vịt type 1: là một RNA virus không có vỏ bao được xếp

loại là một Piconavirus, có kích thước khoảng 20-40nm, Richer et al quan sát

virus dưới kính hiển vi điện tử kích thước DHV-1 khoảng 30nm (Woolcook and Fabricant, 1997) Virus không gây ngưng kết hồng cầu gà, vịt, ngựa, chuột, rắn, heo (Nguyễn Đức Hiền, 2012)

Virus viêm gan vịt type 2: là một Astrovirus và có đường kính khoảng

28-30nm khi quan sát với kính hiển vi điện tử Virus viêm gan vịt type 2 cũng

được so sánh với Astrovirus phân lập từ gà và gà tây bởi những nghiên cứu về

sự gây nhiễm và bảo vệ chéo cho thấy sự khác biệt kháng nguyên rõ ràng (Nguyễn Đức Hiền, 2012)

Virus viêm gan vịt type 3: là RNA virus, có đường kính 30nm, virus

được phân loại là Piconavirus nhưng không liên quan đến type 1 vì không có

kháng nguyên chung qua kiểm tra bằng kỹ thuật trung hòa virus và kháng thể quỳnh quang (Nguyễn Đức Hiền, 2012)

2.1.2 Sức đề kháng của virus viêm gan vịt

Virus viêm gan vịt có sức đề kháng cao, không bị bất hoạt khi xử lý bằng ether hoặc fluorocarbon, chloroform, trypsin và methanol 30% hoặc ammonium sulfate (Woolcock and Fabricant, 1997)

Virus có thể tồn tại ở pH= 3 đến 9 giờ DHV tương đối ổn định ở nhiệt

độ dưới 40-450C nhưng dễ bất hoạt ở nhiệt độ cao hơn (Davis, 1987) Với nhiệt độ 500C virus chết sau 1 giờ, ở 600C virus chịu đựng được 30 phút Ở

370C virus tồn tại 48 giờ, 40C trong 2 năm, -200C có thể tồn tại tới 9 năm

Trong chuồng trại ẩm ướt, trong phân vịt thì virus có thể tồn tại tới 10 tuần Các chất sát trùng phải pha ở nồng độ cao và xử lý trong thời gian dài mới tiêu diệt được virus (Nguyễn Bá Hiên và Nguyễn Minh Tâm, 2007)

2.1.3 Cơ chế sinh bệnh của virus viêm gan vịt type 1

Virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc đường tiêu hóa, đường hô hấp hoặc qua vết thương rồi vào máu Virus theo máu đến các phủ tạng và tập trung nhiều ở gan Dưới tác động của virus quá trình trao đổi chất bị rối loạn, lượng glycogen ở gan giảm thấp, lượng lipit tăng do quá trình chuyển hóa mở

bị đình trệ Do đó, vịt con bị bệnh thiếu năng lượng và sức đề kháng bị giảm sút

Virus phát triển trong gan và trực tiếp phá hoại tế bào gan và các tế bào nội mô huyết quản gây nên xuất huyết đặc hiệu Virus nhân lên trong gan, tại các tế bào thuộc hệ võng mạc nội mô như tế bào Kupffer Tổ chức gan bị phá hoại, gan không giải độc được và con vịt chết do ngộ độc (Phạm Sỹ Lăng và ctv, 2005)

2.1.4 Đặc tính nuôi cấy virus viêm gan vịt type 1

Nuôi cấy trên môi trường trứng

Tiêm virus viêm gan vịt vào xoang niệu mô của phôi vịt 10-14 ngày tuổi, 24-72 giờ sau khi gây nhiễm, phôi chết với bệnh tích: phôi còi cọc, xuất huyết dưới da đặc biệt ở vùng đầu, bụng, chân, phôi phù, gan sưng có màu đỏ hoặc hơi vàng, có thể có điểm hoại tử Ở những phôi chết muộn nước xoang

niệu mô có màu xanh nhạt, bệnh tích rõ hơn

2.1.5 Nuôi cấy tế bào xơ phôi vịt

Có thể nuôi cấy DHV trong môi trường tế bào xơ phôi gà, xơ phôi vịt

và thận phôi vịt Virus gây bệnh tích tế bào, thể hiện ở một số đặc điểm: nhân

tế bào co tròn, nguyên sinh chất đông đặc, tế bào tan vỡ hoàn toàn (Nguyễn Bá Hiên và Nguyễn Minh Tâm, 2007)

Theo Maiboroda (1972), sự xuất hiện CPE đầu tiên là các tế bào co tròn sau 8 giờ gây nhiễm DHV

Trên tế bào xơ phôi vịt và thận phôi vịt khi gây nhiễm DHV sự thay đổi bệnh lý cũng được quan sát bởi Hwang (1965) Bệnh tích đặc trưng bởi sự thoái hóa và hoại tử của lớp tế bào đơn Các bệnh lý thường thấy rõ từ 24-36

giờ sau khi gây nhiễm (Fitzgerald et al, 1963)

Theo Hwang (1966), tế bào gan lấy từ phôi vịt 20 ngày tuổi và mật dộ nuôi cấy là 5.105 tế bào/ml là phù hợp Sự nhân giống DHV trên nuôi cấy tế bào thận phôi vịt đã được kiểm tra trong một nghiên cứu cho phù hợp trong hệ

thống in vitro, trong đó DHV cho hiệu giá cao kèm với sự thay đổi bệnh lý tế

bào quan sát được trong chuẩn độ virus và kháng huyết thanh

2.2 KHÁNG THỂ IgY CỦA GÀ

2.2.1 Sơ lược về IgY

Ở loài chim đã tìm thấy 3 loại kháng thể: IgA, IgM và IgY IgA và IgM thì tương tự như IgA và IgM của loài hữu nhũ, riêng IgY là globulin miễn dịch chính có trong huyết thanh và lòng đỏ trứng IgY hình thành khoảng 75% tổng

số globulin miễn dịch Hàm lượng huyết thanh IgY, IgA, IgM lần lượt là 5,0 ; 1,25 và 0,61 mg/ml (Leslie et al., 1973)

2.2.2 Cấu trúc và chức năng

Cấu trúc của IgY nói chung cũng giống như cấu trúc của IgG ở động vật có vú, bao gồm hai chuỗi nặng H (heavy chain) và hai chuỗi nhẹ L (light chain) liên kết với nhau bằng cầu nối disulfit (-S-S-) Trọng lượng phân tử của IgY là 180 kilo-dalton (KDa), lớn hơn so với IgG của động vật có vú (159 kDa)

Tương tự như các kháng thể khác, IgY có khả năng trung hoà các vi sinh vật và độc tố của vi sinh vật Trong máu và trong dịch gian bào của gà, IgY đóng vai trò tương tự như IgG của động vật có vú IgY tham gia hoạt động opsonin hoá kháng nguyên, IgY gây ngưng tập kháng nguyên hữu hình, kết tủa kháng nguyên hoà tan

2.2.3 Đặc tính của IgY

Đặc tính sinh hóa

Điểm đẳng điện của IgY thấp hơn IgG (Polson et al., 1980) trong dãy 5,7-7,6 còn IgG nằm giữa 6,1–8,5 trong khi đó chuỗi Fc (phần kỵ nước nhất của phân tử kháng thể) cũa IgY thì lớn hơn của IgG, phân tử IgY kỵ nước hơn IgG

Tính bền của IgY

Bền với pH: hoạt tính IgY giảm ở pH= 3,5 hoặc thấp hơn và hầu như hoàn toàn mất ở pH= 3 (Shimizu et al., 1988) Hoạt tính IgY nhanh chóng giảm ở pH thấp đòi hỏi những thay đổi thích ứng và sự tồn tại trên phần Fab bao gồm vị trí gắn kháng nguyên Ở điều kiện kiềm tính, hoạt tính của IgY không thay đổi ngay cả khi pH tăng đến 11 Dù vậy nó vẫn bị giảm ở pH= 12 hay cao hơn (Shimizu et al., 1988)

Bền với sự phân giải protein: IgY có tính đề kháng với trypsine hay chymotrysine tiêu hóa nhưng hơi nhạy cảm với pepsine tiêu hóa Hatta (1993) chỉ định rằng hầu hết hoạt tính IgY bị mất theo đường tiêu hóa với pepsine, nhưng hoạt tính được duy trì mức 39% và 41% khi ủ với trysine và chymotrypsine sau 8h

Bền với nhiệt và áp suất: IgY được dùng ấm ở các mức nhiệt khác nhau cho các giai đoạn khác nhau về thời gian Hoạt tính gắn kết của IgY với kháng nguyên giảm với sự tăng nhiệt và thời gian làm nóng Theo Shimizu (1988) và Hatta (1993) IgY bền với nhiệt độ 60-700C Hoạt tính IgY giảm do sự làm nóng trong 15 phút ở 700C hay cao hơn; IgY biến tính nhiều khi làm nóng ở nhiệt độ trên 750C (Chang et al., 1999) IgY có tính bền với áp suất được ghi

nhận qua sự không phát hiện ra sự bất hoạt của IgY bởi áp suất 4000kg/cm2

(Shimizu et al., 1988)

Bền với lạnh và khí khô: lạnh và đông khô là quá trình nhiệt thấp thường được xem như ít bị hủy hoại

Hiện nay trên thế giới bên cạnh các nghiên cứu tạo kháng thể gà chống các tác nhân nhiễm trùng và ứng dụng thành công trong điều trị bệnh thú y ở các loài như lợn, bò, chó, gà đã có một số nơi nghiên cứu chế tạo kháng thể gà

kháng các tác nhân gây tiêu chảy ở người trong đó có rotavirus và E.coli tiêu

chảy

2.3 Vai trò của kháng thể

Trong đáp ứng miễn dịch, kháng thể có 3 chức năng chính: liên kết với kháng nguyên, kích hoạt bổ thể và huy động các tế bào miễn dịch

2.3.1 Liên kết với kháng nguyên

Các kháng thể có khả năng nhận diện và gắn một cách đặc hiệu với một kháng nguyên tương ứng nhờ các vùng biến thiên

Một thí dụ để miêu tả lợi ích của kháng thể là trong phản ứng chống độc tố vi khuẩn Kháng thể liên kết và trung hòa các độc tố, ngăn ngừa sự tương tác của chúng với các thụ thể tế bào Như vậy, các tế bào có thể tránh được các rối loạn do các độc tố gây ra

Tương tự như vậy, nhiều virus và vi khuẩn chỉ gây bệnh khi bám vào các tế bào Vi khuẩn sử dụng các phân tử protein bám dính là protein adhesin, còn virus sở hữu các protein bám dính trên lớp vỏ của chúng Các kháng thể kháng adhesin và kháng protein vỏ virus sẽ ngăn chặn các vi sinh vật này gắn vào các tế bào đích

2.3.2 Hoạt hóa tế bào miễn dịch

Sau khi tương tác với kháng nguyên ở đầu biến thiên (Fab), kháng thể

có thể cố định trên các tế bào miễn dịch ở đầu hằng định (Fc) Những tương tác này có tầm quan trọng đặc biệt trong đáp ứng miễn dịch Các kháng thể gắn với một virus hoặc một vi khuẩn có thể liên kết với đại thực bào và khởi động hiện tượng thực bào Các tế bào diệt tự nhiên (Natural Killer) có thể thực hiện chức năng giải độc tế bào và ly giải các vi khuẩn bị gắn kết với các kháng thể

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm

Nguyên bào sợi vịt được tạo từ phôi vịt 9-11 ngày tuổi (trứng được mua

từ đàn vịt không tiêm vaccine viêm gan vịt và được xác định không chứa kháng thể kháng virus viêm gan vịt qua phản ứng trung hòa huyết thanh)

Virus viêm gan vịt type 1 được phân lập tại Vĩnh Long (chủng virus này được giám định là type 1, subtype 3 –DHAV-3 tại Viện Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ)

Kháng thể IgY kháng virus viêm gan vịt type 1 được tạo từ lòng đỏ trứng gà 27 mg/ml Kháng thể được ly trích và tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích qua màng bán thấm, tại Viện Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Cần Thơ

3.2.2 Các dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

Dụng cụ

Kéo, phểu lọc thủy tinh, vải gạc, đĩa petri đường kính 9-10 cm

Becher , ống đong các loại, ống ly tâm falcon loại 15 ml

Các tube nhỏ (eppendorf) Đầu lọc 0,22 µm; 0,45 µm (Milipore filter) Ống nghiệm, cá từ Pipette 1 ml, 2ml, 5 ml, pipetteman, micropipette, pipette-aid

Đầu cone 100 µm, 1ml Đĩa nuôi cấy microplate 96 giếng (Nunc A/S, Denmark)

Buồng đếm Neubauer (Marienfeld, Germany)

Thiết bị

Máy ảnh kỹ thuật số Samsung, máy ấp trứng, máy hấp autoclave

Tủ cấy vô trùng (Bio Clean Bench SANYO Electric Biomedical Co., Ltd)

Cân phân tích, tủ sấy (Memmert GmbH + Co.KG), tủ ấm CO2

(SANYO Electric Biomedical Co., Ltd)

Đầu đọc ELISA (Multiskan, ThermoLabsystems, Japan)

Tủ lạnh -200C, -800C, -40C, kính hiển vi soi ngược (Olympus, Tokyo, Japan)

Máy ly tâm lạnh (Hermle Labortechnik GmbH, Germany)

Máy khuấy từ (Corning, USA), máy lắc (Vortex, VELP Scientifica s.r.l, Italy)

3.2.3 Các hóa chất và môi trường

Nước cất hấp vô trùng, nước muối sinh lý

Huyết thanh bào thai bò (FBS-foetal bovine serum) đã bất hoạt ở 560C,

30 phút (Gibco BRL., Grand Land, NY, USA)

Isopropanol (Merk), Trypsin – EDTA 0,05% 1X (Gibco, Invitrogen, Canada)

Đệm DPBS (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd)

Thuốc nhuộm MTT (Invitrogen, USA)

Môi trường MEM (Gibco, Invitrogen, NY, USA)

Penicillin và streptomycin, kháng nấm amphotericin-B, glutamine, NaHCO3 7%

Môi trường tăng trưởng (MTTT): Môi trường EMEM +10% FBS + Glutamine 3% + NaHCO3 7% + 100 IU/ml Penicillin + 100 µg/ml Streptomycin + Amphotericin-B 2,5 µg/ml

Môi trường duy trì (MTDT): Môi trường EMEM + 5% FBS + Glutamine 3% + NaHCO3 7% + 100 IU/ml Penicillin + 100 µg/ml Streptomycin + Amphotericin-B 2,5 µg/ml

Môi trường pha loãng (MTPL): Môi trường EMEM + Glutamine 3% + NaHCO3 7% + 100 IU/ml Penicillin + 100 µg/ml Streptomycin + Amphotericin-B 2,5 µg/ml

3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nuôi cấy và tạo lớp đơn tế bào DEF từ phôi vịt 9-11 ngày tuổi

Chuẩn độ virus và xác định liều gây nhiễm 50% tế bào xơ phôi vịt của virus viêm gan vịt type 1 (Tissue culture infective dose 50 % (TCID50))

Xác định tính độc tế bào của kháng thể IgY gà biểu hiện trên môi trường

tế bào DEF

Khảo sát hoạt tính bảo vệ nguyên bào sợi vịt của kháng thể IgY kháng DHV-1 qua các thời điểm khác nhau

3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Quá trình khảo sát được tiến hành theo sơ đồ

Sơ đồ 3.1 Quá trình khảo sát xác định hoạt tính kháng DHV-1 in vitro của

Nuôi cấy và tạo lớp đơn tế bào DEF

Khảo sát hoạt tính bảo vệ tế bào DEF in

vitro của dịch kháng thể IgY qua các thời

điểm cấp khác nhau

3.4.1 Chuẩn bị lớp đơn tế bào DEF

Sơ đồ 3.2 Qui trình tạo lớp đơn tế bào DEF

Xử lý, tách mô từ phôi

vịt

Tách tế bào bằng phương pháp

trypsin hóa Rửa bằng đệm DPBS Trứng vịt có phôi 9-11 ngày tuổi

Khuấy từ cặn thêm 15 phút

Ly tâm huyễn dịch tế bào Khuấy từ 30 phút

Xem và đánh giá trạng thái tế bào dưới kính hiển vi soi ngược

Ly tâm với đệm DPBS

Tế bào sơ cấp

Pha loãng tế bào

Ly tâm với môi trường tăng

trưởng Lọc qua vải gạc

3.4.2 Chuẩn độ và xác định liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy

Mục tiêu: Tạo dịch DHV-1 có tính thích ứng và hoạt lực tốt trên môi

trường tế bào DEF, sau đó xác định chỉ số TCID50/0,1 ml của dịch virus để dùng cho các thử nghiệm sau

Nguyên tắc chuẩn độ virus: Dựa trên đặc tính gây bệnh tích tế bào của

virus Việc chuẩn độ virus được xác định qua chỉ số TCID50/0,1 ml, là sự pha loãng virus tới nồng độ thấp nhất tạo bệnh tích cho 50% giếng tế bào nuôi cấy

Bố trí thí nghiệm: Qui trình chuẩn độ virus được tiến hành theo phương

pháp của Hussain & Rasool (2005) trên môi trường DEF Pha loãng dịch virus theo bậc 10 từ độ pha loãng 10-1 đến 10-11 trên đĩa 96 giếng, 8 giếng cho mỗi

độ pha loãng Các giếng đối chứng chỉ chứa tế bào lớp đơn và môi trường duy trì (MTDT) Chỉ số TCID50/0,1 ml được tính theo công thức của Reed & Muench (1938)

Hình 3.1 Bố trí thí nghiệm xác định liều TCID 50 / 0,1 ml

Sơ đồ 3.3 Qui trình chuẩn độ virus gây bệnh viêm gan vịt type 1 trên môi trường tế bào DEF

Với 2 nồng độ pha loãng cho tỷ lệ trên 50% và dưới 50% giếng có CPE, ta tiến hành xác định chỉ số TCID50/0,1 ml theo phương pháp của Reed

& Muench (1938)

- Khoảng cách tỷ lệ (PD- proportional distance)

- Độ pha loãng cho CPE 50% = 10[lg (độ pha loãng cho CPE < 50%) +PD.logf]

- Liều gây nhiễm cho 50% tế bào nuôi cấy

- logf = 1

TCID50/0,1 ml =

Đĩa với các giếng đã có lớp tế bào DEF

Hút cạn môi trường, rửa 1 lần với đệm

DPBS

Pha loãng dịch virus với tỷ

lệ 1:10 MTPL, phân phối vào các tube nhỏ Đặt các tube này trên đá lạnh

Cho 100 µl mỗi nồng độ pha loãng virus vào các giếng, bắt

đầu từ độ pha loãng cao nhất Đối chứng là MTPL

Phủ dịch virus lên bề mặt tế bào và ủ trong 1 giờ ở 370C, 5%

CO2

Hút bỏ dịch virus, cho 100 µl MTDT vào tất cả các giếng

Xác định liều gây nhiễm 50% tế bào DEF của dịch virus

CPE ổn định

50% -(Tỷ lệ giếng có CPE < 50%) (Tỷ lệ giếng có CPE ≥ 50%) – (Tỷ lệ giếng có CPE <50%)

PD =

Độ pha loãng cho CPE 50%

1 1

3.4.3 Xác định liều an toàn của dịch IgY đối với tế bào DEF

Mục tiêu: Xác định tác động của dịch IgY lên khả năng sống của tế bào

DEF và qua đó chọn nồng thích hợp sử dụng cho các thí nghiệm sau

Cơ chế nhuộm MTT: MTT là loại thuốc nhuộm được dùng trong xác

định độc tố tế bào của một tác nhân nghiên cứu hoặc đánh giá sự phát triển của

tế bào nuôi cấy (Mosmann 1983) Khi cho vào môi trường tế bào, MTT có màu vàng sẽ chuyển thành tinh thể formazan đỏ tía dưới tác dụng của enzyme dehydrogenase của ty thể trong tế bào sống Do đó, lượng tinh thể sinh ra sẽ phụ thuộc mật độ tế bào sống có trong môi trường Tinh thể muối này không hòa tan được trong dung dịch có nước và được giữ lại trong tế bào Những tinh thể có thể hòa tan được trong isopropanol có tính acid hoặc Dimethyl sulfoxide (DMSO) cho dung dịch đỏ tía mà sau đó được đánh giá bằng phương pháp đo bước sóng Giá trị OD thu được tỷ lệ thuận với lượng tinh thể hình thành trong tế bào sống, qua đó đánh giá được mức tăng trưởng của tế bào cũng như tác động gây chết tế bào của tác nhân nghiên cứu

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành trên đĩa 96 giếng với 10

nồng độ dịch IgY được pha loãng theo bậc 2, nồng độ ban dầu tương ứng27/2 mg/ml Mỗi nồng độlặp lại 8 lần Đối chứng tế bào là môi trường tế bào DEF không cho dịch IgY chỉ cho MTDT Tính độc của dịch IgY tỷ lệ nghịch với khả năng sống của tế bào, được xác định qua phương pháp nhuộm MTT và đo

OD620 kết hợp việc quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi soi ngược

Chỉ tiêu theo dõi

- Hình thái thảm tế bào DEF khi quan sát dưới kính hiển vi soi ngược:

có hay không CPE và mức độ CPE nếu có

- Giá trị OD620 đo được ở mỗi giếng

- Tỷ lệ tế bào sống trung bình

Tiến hành: Việc xác định liều an toàn của dịch IgY đối với tế bào DEF

được tiến hành theo phương pháp của Meager (2002) như sơ đồ sau

Sơ đồ 3.4 Qui trình xác định liều an toàn của dịch IgY đối với tế bào DEF

Tác động gây độc của sinh phẩm thể hiện qua việc làm chết tế bào nuôi cấy, biểu hiện CPE, được đánh giá bằng phương pháp nhuộm MTT và mật độ quang OD620 Giá trị OD620 sẽ tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống Do vậy, sinh phẩm càng ít độc thì mật độ tế bào sống càng nhiều giá trị OD620 đo được càng cao và ngược lại

Tỷ lệ sống trung bình ở độ pha loãng X của IgY= (OD620X /OD620ĐC)x100 (a)

OD620X: Giá trị OD620 trung bình đo được ở các giếng thử nghiệm với

độ pha loãng X

OD620ĐC: Giá trị OD620 trung bình đo được ở các giếng đối chứng tế bào Tính độc tế bào của dịch IgY được đánh giá qua chỉ số CC50 (50% cytotoxic concentration) là nồng độ dịch IgY làm giảm 50% khả năng sống của tế bào Chỉ số này được xác định khi so sánh với giá trị OD620 đo được làm giảm 50% khả năng sống của tế bào DEF và được tính theo công thức (b)

Giá trị OD620 làm giảm 50% khả năng sống của tế bào = OD620ĐC/2 (b)

OD620ĐC: Giá trị OD620 trung bình đo được ở các giếng đối chứng

Liều an toàn cho tế bào của dịch IgY là hàm lượng IgY không gây độc cho tế bào DEF, thể hiện qua giá trị OD620 không khác biệt so với đối chứng

Pha loãng dịch IgY /MTDT đến nồng độ thích hợp, phân phối vào các tube nhỏ

Đĩa với các giếng đã có lớp đơn tế bào DEF

Hút bỏ MTTT, rửa 1 lần

với đệm DPBS

Cho 100 µl mỗi nồng độ dịch kháng thể IgY vào các giếng thí

nghiệm, 100 µl MTDT vào các giếng đối chứng

Hút cạn giếng, rửa 1 lần với đệm DPBS

Cho 50 µl MTT (5 mg/ml) vào từng giếng

Loại MTT, cho 100 µl isopropanol vào các giếng

Lắc máy 30 phút, 600 vòng/ phút rồi đọc OD620

72 giờ ủ 370C, 5% CO2

Xác định nồng độ gây độc 50% tế bào DEF

4 giờ ủ 370C, 5% CO2, tránh sáng

3.4.4 Khảo sát hoạt tính bảo vệ nguyên bào sợi vịt của IgY qua các thời điểm bổ sung sinh phẩm khác nhau

Thí nghiệm 1: Thí nghiệm được tiến hành trên đĩa 96 giếng với 4 nồng

độ pha loãng IgY được cho vào môi trường tế bào DEF tại 2 thời điểm 12 giờ

và 24 giờ sau khi gây nhiễm tế bào với 500 TCID50/0,1ml virus Nồng độ kháng thể IgY ban đầu không tác động gây độc cho tế bào, ở những nồng độ tiếp theo là nồng độ kháng thể IgY pha loãng theo log 10 Mỗi nồng độ lập lại

20 lần Đối chứng âm (ĐC (-)) là tế bào DEF không cho dịch IgY và không cho virus Đối chứng dương (ĐC (+)) là môi trường tế bào DEF không cho dịch IgY nhưng cho 500 TCID50/0,1ml virus

Thí nghiệm 2: Thí nghiệm được tiến hành trên đĩa 96 giếng với 4 nồng

độ pha loãng IgY được đưa vào môi trường tế bào DEF tại 2 thời điểm 12 giờ

và 24 giờ trước khi gây nhiễm tế bào với 500 TCID50/0,1ml virus Nồng độ kháng thể IgY ban đầu không tác động gây độc cho tế bào, ở những nồng độ tiếp theo là nồng độ kháng thể IgY pha loãng theo log 10 Mỗi nồng độ lập lại

20 lần Đối chứng âm (ĐC (-)) là tế bào DEF không cho dịch IgY và không cho virus Đối chứng dương (ĐC (+)) là môi trường tế bào DEF không cho dịch IgY nhưng cho 500 TCID50/0,1ml virus

Chỉ tiêu theo dõi

- Hình thái thảm tế bào DEF khi quan sát dưới kính hiển vi soi ngược

có hay không CPE và mức độ CPE nếu có

- Giá trị OD620 đo được ở mỗi giếng

- Tỷ lệ tế bào sống tương đối

3.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

Các số liệu thô được xử lý bằng phần mềm Excel 2003, so sánh hiệu quả bảo vệ nguyên bào sợi vịt giữa các độ pha loãng của dịch kháng thể IgY thông qua các giá trị OD620 bằng phép thử 2-sample T và One-way ANOVA của phần mềm Minitab 16.2

Sơ đồ 3.5 Qui trình khảo sát hoạt tính bảo vệ tế bào DEF của IgY qua các thời điểm khác nhau

Cho 100 µl mỗi nồng độ sinh phẩm và các

ĐC/MTDT vào các giếng theo bố trí thí

nghiệm Loại MTDT, rửa 1 lần với đệm DPBS

Cho 50 µl MTT (5 mg/ml) vào từng giếng

Xác định tác dụng ức chế CPE của dịch IgY

Loại MTT, cho 100 µl isopropanol vào các

bào DEF

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 CHUẨN ĐỘ VIRUS, XÁC ĐỊNH LIỀU GÂY NHIỄM 50% TẾ BÀO NUÔI CẤY CỦA VIRUS GÂY BỆNH VIÊM GAN VỊT TYPE 1

Huyễn dịch DHV-1 được pha loãng theo bậc 10, đưa vào môi trường DEF rồi ủ 48 giờ, lúc này CPE xuất hiện ổn định, tiến hành tính TCID50/0,1 ml kết quả được ghi nhận qua Bảng 4.1

Bảng 4.1 Tỷ lệ xuất hiện CPE do virus DHV-1 gây ra theo nồng độ virus trên lớp đơn tế bào DEF

Kết quả thu được với dịch DHV-1 cho thấy ở các độ pha loãng 100,10-1,

10-2 thì tất cả các giếng tế bào thí nghiệm (8 giếng) đều xuất hiện CPE, tỷ lệ xuất hiện CPE là 100% Khi quan sát dưới kính hiển vi, CPE biểu hiện là co tròn rồi kết cụm tế bào, vệt tan và bong khỏi đáy giếng nuôi cấy Trong khi đó,

ở các độ pha loãng 10-5 thì chỉ ghi nhận 1/8 giếng tế bào có biểu hiện CPE (12,5%) Tỷ lệ giếng có biểu hiện CPE trên và dưới 50% ở các độ pha loãng

10-3 và 10-4 lần lượt là 75% và 33,33% Ở các độ pha loãng DHV-1 còn lại (10-6 đến 10-11) các giếng tế bào DEF không xuất hiện CPE (Bảng 4.1)

Theo Reed và Muench (1938), chỉ số TCID50/0,1 ml được tính như sau: Khoảng cách tỷ lệ giữa 2 độ pha loãng cho tỷ lệ xuất hiện CPE >50%

và CPE <50% tương ứng là 10-3 và 10-4

Số tổng hợp Nồng độ pha

loãng virus

Có CPE Không có

CPE Có CPE

Không có CPE

Tỷ lệ giếng có CPE (%)