nghiên cứu quy trình công nghệ chế biến sản phẩm đồ uống lên men từ củ khoai lang tím nhật bản

Kết hợp những thực trạng trên ở nước ta nên đề tài luận văn “Nghiên cứu quy tr nh công nghệ chế biến sản phẩm đồ uống lên men t củ khoai lang tím Nhật Bản” đã được tiến hành ở quy mô phò

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

- -

LÊ THỊ TỐ QUYÊN MSSV: 2102004

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN SẢN PHẨM ĐỒ UỐNG LÊN MEN TỪ CỦ KHOAI

LANG TÍM NHẬT BẢN

Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

CẦN THƠ, 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

- -

LÊ THỊ TỐ QUYÊN MSSV: 2102004

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN SẢN PHẨM ĐỒ UỐNG LÊN MEN TỪ CỦ KHOAI

LANG TÍM NHẬT BẢN

Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Giáo viên hướng dẫn PGs.Ts Lý Nguyễn Bình

CẦN THƠ, 2013

Luận văn đính kèm sau đây, với đề tài: “Nghiên cứu quy trình công nghệ chế biến

sản phẩm đồ uống lên men từ củ khoai lang tím Nhật Bản” do Lê Thị Tố Quyên

thực hiện và báo cáo, đã được hội đồng chấm luận văn thông qua

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

PGs.Ts Lý Nguyễn Bình Lê Thị Tố Quyên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công tr nh nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả

tr nh bày trong luận văn là trung thực và chưa t ng được ai công bố trong bất k công tr nh luận văn nào trước đây

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2013

Sinh viên thực hiện

Lê Thị Tố Quyên

để tôi có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến cô Phan Thị Anh Đào, thầy Nguyễn Công Hà - thầy, cô cố vấn học tập của tôi, đã luôn đồng hành, giúp đỡ, cung cấp những thông tin, bài học hữu ích cho tôi trong suốt những năm dưới mái trường đại học

Nhân đây, tôi xin cảm ơn quý thầy cô và cán bộ trong Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, cũng như cán bộ Khoa Nông nghiệp & SHƯD, Trường Đại học Cần Thơ đã giảng dạy, truyền đạt kiến thức và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, rèn luyện

và nghiên cứu tại trường

Cảm ơn những người bạn cấp 3, những bạn đồng học khóa 36, các anh chị trong phòng thí nghiệm và các anh chị cán bộ địa phương đã nhiệt t nh giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá tr nh nghiên cứu

Và trong sâu thẳm tận đáy lòng, tôi muốn cảm ơn nhất là gia đ nh tôi, những người luôn ở bên cạnh động viên tôi, luôn tạo những điều kiện thuận lợi, cho tôi môi trường học tập tốt nhất

Xin chân thành cảm ơn mọi người

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2013

Sinh viên thực hiện

Lê Thị Tố Quyên

TÓM LƯỢC

Khoai lang (Ipomoea batatas) là cây lương thực chứa hàm lượng tinh bột cao, gần

30% trọng lượng tươi, và đặc biệt giống khoai lang tím Nhật có giá trị cảm quan tốt

về mùi vị và màu sắc anthocyanin Đồ uống lên men là thức uống có cồn không thể thiếu trong nét văn hóa đặc sắc của các dân tộc trên thế giới và Việt Nam Nguyên liệu sản xuất rất đa dạng nhưng chủ yếu là gạo, tấm Kết hợp những thực trạng trên

ở nước ta nên đề tài luận văn “Nghiên cứu quy tr nh công nghệ chế biến sản phẩm

đồ uống lên men t củ khoai lang tím Nhật Bản” đã được tiến hành ở quy mô phòng thí nghiệm với các mục tiêu cụ thể như sau: (i) Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme α-amylase và thời gian đến khả năng dịch hóa tinh bột khoai lang,(ii) Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian đến khả năng đường hóa tinh bột khoai lang, (iii) Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian dịch hóa đến hàm lượng anthocyanin trong dịch khoai lang tím

Kết quả thí nghiệm cho thấy, nồng độ và thời gian tối ưu của enzyme α-amylase là 0,02% trong 180 phút ở 95oC, pH 5,2 và của enzyme glucoamylase là 0,055% trong

70 giờ ở 61oC, pH 4,2 cho kết quả tốt nhất Đồng thời, thí nghiệm cho thấy thời gian

và nhiệt độ cũng có ảnh hưởng đến hàm lượng anthocyanin trong dịch khoai lang tím

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ii

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM LƯỢC iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH HÌNH viii

DANH SÁCH BẢNG viiix

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC TIÊU 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 GIỚI THIỆU VỀ KHOAI LANG TÍM NHẬT BẢN 3

2.1.1 Nguồn gốc và phân bố 3

2.1.2 Giá trị dinh dưỡng của khoai lang 5

2.1.3 Hợp chất màu anthocyanin của khoai lang tím Nhật 5

2.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME 6

2.2.1 Thành phần cấu tạo 7

2.2.2 Tính đặc hiệu của enzyme 8

2.2.3 Cơ chế tác động 9

2.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME 10

2.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất [S] 10

2.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme 10

2.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 10

2.3.4 Ảnh hưởng của pH 11

2.3.5 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa (activator) 12

2.3.6 Sự ức chế enzyme (enzyme inhibition) 12

2.3.7 Các yếu tố khác 12

2.4 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME AMYLASE 13

2.4.1 Đặc tính và cơ chế tác dụng của α-amylase (EC.3.2.1.1) 15

2.4.2 Đặc tính và cơ chế tác dụng của glucoamylase (EC.3.2.1.3) 17

2.4.3 Ứng dụng của enzyme amylase trong công nghệ thực phẩm 18

2.5 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ANTHOCYANIN 19

2.5.1 Cấu trúc của anthocyanin 19

2.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến anthocyanin 20

2.5.2.1 Cấu trúc 20

2.5.2.2 pH và nhiệt độ 21

2.5.2.3 Ánh sáng và oxy 22

2.5.2.4 Enzyme 22

2.5.2.5 Các chất kết hợp màu (copigment) 22

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 23

3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 23

3.1.1 Địa điểm 23

3.1.2 Thời gian 23

3.1.3 Nguyên liệu và hóa chất sử dụng 23

3.1.4 Thiết bị, dụng cụ 23

3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 25

3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme α-amylase và thời gian đến khả năng dịch hóa tinh bột khoai lang 25

3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian đến khả năng đường hóa tinh bột khoai lang 27

3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian dịch hóa đến hàm lượng anthocyanin trong dịch khoai lang tím 29

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ENZYME α-AMYLASE VÀ THỜI GIAN ĐẾN KHẢ NĂNG DỊCH HÓA TINH BỘT KHOAI LANG 31

4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ENZYME GLUCOAMYLASE VÀ THỜI GIAN ĐẾN KHẢ NĂNG ĐƯỜNG HÓA TINH BỘT KHOAI LANG 32

4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN DỊCH HÓA ĐẾN HÀM LƯỢNG ANTHOCYANIN TRONG DỊCH KHOAI LANG TÍM 33

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35

5.1 KẾT LUẬN 35

5.2 ĐỀ NGHỊ 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

PHỤ LỤC 39

DANH SÁCH HÌNH

H nh 2.1 Khoai lang tím Nhật Bản 3

H nh 2.2 Cánh đồng khoai lang tím tại huyện B nh Tân, tỉnh Vĩnh Long 4

H nh 2.3 Các loại enzyme Endoamylase và Exoamylase 14

H nh 2.4 Công thức cấu tạo của α-amylase 15

H nh 2.5 Cấu trúc cơ bản của anthocyanin 19

Hình 3.1 Một số dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm……… 24

H nh 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng dịch hóa tinh bột khoai lang 255 H nh 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng đường hóa tinh bột khoai lang 27

H nh 3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo độ bền anthocyanin trong quá tr nh thủy phân 29

Hình 4.1 Sự biến động hàm lượng anthocyanin theo nhiệt độ và thời gian 33

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần hóa học trung b nh của khoai lang (theo % trọng lượng) 5

Bảng 2.2 Sự thay đổi màu sắc của anthocyanin theo pH 6

Bảng 2.3 Bậc phản ứng so với nồng độ cơ chất 10

Bảng 2.4 Sáu loại anthocyanidin phổ biến nhất trong thực phẩm 20

Bảng 4.1 Kết quả đo độ nhớt (cP) 31

Bảng 4.2 Kết quả phân tích hàm lượng đường khử khi đường hóa ở các mức nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian khác nhau (%) 32

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Trước đây, khi đất nước còn nghèo th nhu cầu của con người chỉ d ng lại ở mức

“ăn no, mặc ấm” là đủ, dần dần về sau khi vấn đề đó đã được giải quyết, xã hội đã

có bước tiến hơn th nhu cầu con người được nâng lên “ăn ngon, mặc đẹp” Ngày nay, xã hội ngày càng phát triển, con người càng trở nên quan tâm, chú trọng đến sức khỏe Trước thực trạng vấn đề thực phẩm đang hết sức báo động, con người đã

ý thức hơn nhiều trong việc ăn uống, họ đã bắt đầu “ăn có chọn lọc” Nắm bắt được điều này các nhà sản xuất thực phẩm luôn nghiên cứu để t m ra những sản phẩm mới có lợi cho sức khỏe dựa trên những nguồn nguyên liệu giàu giá trị dinh dưỡng,

an toàn và dễ t m kiếm

Khoai lang tím là loại cây nông nghiệp với các rễ củ lớn, chứa nhiều tinh bột được trồng nhiều ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long, đặc biệt là ở tỉnh Vĩnh Long với diện tích trồng khoai lang tím lớn nhất miền Tây, đạt hơn 5.000 ha, tập trung ở các huyện Tam B nh, B nh Tân, B nh Minh Hằng năm, lượng khoai cung cấp ra thị trường là rất lớn nhưng chúng còn ở dạng sản phẩm thô chưa qua chế biến nên giá trị không cao

Ngoài ra, trong khoai lang tím chứa hàm lượng cao chất anthocyanin so với các loại khoai có màu trắng, vàng, cam có cùng nguồn gốc, một chất sắc tố tự nhiên thường được t m thấy trong các loại rau củ, hoa quả màu tím như: bắp cải tím, nho, trái việt quất … Anthocyanin không những có tác dụng giảm nguy cơ ung thư, k m hãm sự phát triển của các tế bào gây ung thư mà còn có khả năng chống oxy hóa cao, chống viêm, chống lão hóa và tăng cường hệ miễn dịch cho cơ thể

T những thực tế đó, khoai lang tím trở thành đề tài nghiên cứu hấp dẫn trong những năm gần đây Trong thành phần khoai lang tím có chứa hàm lượng tinh bột cao, cho nên quá tr nh thủy phân của khoai lang tím được coi là giai đoạn quan trọng, tạo tiền đề sản xuất các loại đường ứng dụng trong sản xuất bánh kẹo, thức uống, rượu, mứt, sữa … Ngoài ra, việc biến động hàm lượng anthocyanin trong quá trình thủy phân cũng được quan tâm bởi vì sắc tố này giúp thực phẩm bắt mắt hơn

và có giá trị dinh dưỡng cao hơn

1.2 MỤC TIÊU

Nhằm nâng cao giá trị cho khoai lang tím Nhật, bảo quản củ khoai lang tím Nhật bằng phương pháp lên men truyền thống, bên cạnh đó góp phần giải quyết nguồn nguyên liệu khoai lang và đa dạng hóa phát triển sản phẩm mới đầy t m năng, đề tài:

“Nghiên cứu quy trình công nghệ chế biến sản phẩm đồ uống lên men từ củ

khoai lang tím Nhật Bản” được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công

nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng – Trường Đại học Cần Thơ với ba nội dung cụ thể là:

 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme α-amylase và thời gian đến khả năng dịch hóa tinh bột khoai lang

 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian đến khả năng đường hóa tinh bột khoai lang

 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian dịch hóa đến hàm lượng anthocyanin trong dịch khoai lang tím

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU VỀ KHOAI LANG TÍM NHẬT BẢN

Cây khoai lang có tên khoa học là Ipomoea batatas (L) Lam, là cây hoa màu lương thực ăn củ và lấy dây lá, trồng hàng năm, họ B m B m (Convolvulaceae) Khoai

lang trồng ở vùng nhiệt đới thường có thân bò, trồng ở vùng ôn đới, thường có dạng bụi Lá h nh tim, nguyên hay có khía Hoa trắng, vàng hay tím, h nh phễu Củ h nh thoi do rễ phồng lên, chứa tinh bột và đường, vỏ củ màu trắng, vàng hay đỏ tím, thịt

củ trắng, vàng hay tím nhạt tùy theo giống

Khoai lang có hai nhóm giống chính gồm: nhóm giống củ thịt mềm, nhiều nước, màu trắng, vàng, da cam, hồng, tím và nhóm giống củ thịt chắc, nhiều bột, thích hợp với công nghệ thái lát, phơi khô, lấy bột (Nguồn: www.nong nghiep.vn)

1000 mm, chịu hạn, chịu đất xấu Là cây giao phấn, ngày ngắn, không ra hoa khi ngày dài quá 13 giờ 30 phút, do đó ít khi ra hoa ở những vùng có vĩ độ ôn đới trên

30o Bắc hay Nam Ở vùng nhiệt đới, dễ ra hoa, có hạt, có sức sống, nhưng thường chỉ trồng bằng các đoạn dây gọi là hom, trong trường hợp gây giống có thể trồng bằng mầm lấy t củ (Nguồn: www.nong nghiep.vn)

Hình 2.2 Cánh đồng khoai lang tím tại huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long

Khoai lang là loại cây lương thực đứng hàng thứ năm trên thế giới sau cây lúa, lúa

m , bắp và khoai m (sắn) Khoai lang được canh tác ở trên 100 nước trên thế giới, châu Á (31 nước), châu Phi (39 nước), châu Mĩ Latin (31 nước), tập trung ở những nước có thu nhập thấp, bản thân các nước này được canh tác ở vùng đói nghèo như tỉnh Sichuan Trung Quốc hay tây Kenya, trên đất đồi, dốc manh mún, phân tán nên năng suất và thu nhập không đáng kể

Theo số liệu thống kê của FAO năm 2004 sản lượng toàn thế giới là 127 triệu tấn, trong đó phần lớn tại Trung Quốc với sản lượng khoảng 105 triệu tấn chiếm hơn 80% sản lượng khoai trên toàn thế giới và diện tích trồng là 49.000 km2 Khoảng một nửa sản lượng của Trung Quốc được dùng làm thức ăn cho gia súc và gia cầm Sản lượng trên đầu người là lớn nhất tại các quốc gia mà khoai lang là mặt hàng lương thực chính trong khẩu phần ăn, đứng đầu là quần đảo Solomon với 160 kg/người/năm và Burundi với 130 kg

Khoai lang là nguyên liệu đặc trưng trong nhiều món ăn ở Nhật Bản, Đài Loan, Philippines và các quốc gia khác Indonesia, Việt Nam, Ấn Độ cùng một số quốc gia Châu Á khác cũng là các quốc gia trồng nhiều khoai lang Uganda (quốc gia đứng thứ ba sau Indonesia), Rwanda và một số quốc gia Châu Phi khác cũng trồng nhiều khoai lang v đó là một thành phần quan trọng trong khẩu phần ăn tại các quốc gia này, Bắc và Nam Mỹ là quê hương của khoai lang nhưng ngày nay chỉ chiếm không quá 3% sản lượng toàn thế giới Châu Âu cũng có trồng khoai lang, nhưng sản lượng không đáng kể, chủ yếu tại Bồ Đào Nha

Lợi thế của các cây có củ là cung cấp nguồn năng lượng dưới dạng tinh bột và đường với giá rẻ nhất Mặc dù trên cùng đơn vị trọng lượng, khoai lang chỉ cung cấp số năng lượng chỉ bằng 1/3 so lúa gạo và lúa m do có chứa hàm lượng nước cao hơn Tuy nhiên, về mặt năng suất khoai lang lại cho năng suất cao hơn lúa, trong thí nghiệm khoai lang có thể đạt năng suất kỷ lục lên đến 85 tấn/ha, nhiều

nước đạt năng suất trên 20 tấn/ha Do năng suất cao nên tính trên đơn vị diện tích và thời gian, khoai lang cho năng suất chất bột đường cao gấp 1,5 lần và cho giá trị thu nhập gấp 1,7 lần so với lúa

Trên thế giới có trên 7.000 giống khoai, trong đó có 1.944 giống cao sản Trong 637 giống khoai được canh tác nhiều trên thế giới, có 25 giống cho củ màu trắng, 185 giống cho củ màu kem, 220 giống cho củ màu vàng, 143 giống cho củ màu cam và

64 giống cho củ mà tím.(http://vi.wikipedia.org/wiki/Khoai_lang)

2.1.2 Giá trị dinh dưỡng của khoai lang

Bảng 2.1 Thành phần hóa học trung bình của khoai lang (theo % trọng lượng)

Loại khoai lang

Thành phần, % Nước Protein Lipid Glucid Cenllulose Tro Khoai lang tươi 68,1 1,60 0,50 27,9 0,90 1,00

(Nguồn: Bùi Ái, 2003)

T xa xưa, nông dân ta vẫn sử dụng khoai lang làm lương thực cho người, nhất là khi thiếu gạo ăn hoặc vào lúc giáp hạt thường vẫn ăn khoai luộc thay cơm, hoặc ăn cơm độn khoai, là bữa ăn đã có t lâu của dân nghèo Nhưng t nhiều năm nay, kinh tế phát triển, mức sống nhân dân ta được nâng cao, dân có đủ gạo ăn, ít ăn cơm độn khoai

Nghiên cứu thực hiện tại Mỹ do ông Joe Vinson đứng đầu cho thấy, khoai lang tím

có tác dụng trong việc phòng ng a bệnh cao huyết áp (Nguồn: Theo Nông nghiệp VN)

Những nghiên cứu gần đây cho biết, giống khoai tím có polyphenol chứa anthocyanin có tác dụng kháng oxy hóa rất mạnh, có khả năng kiềm chế đột biến của tế bào ung thư, có tác dụng ngăn ng a ung thư, hạ huyết áp, phòng ng a bệnh tim mạch, có công năng làm đẹp và thông tiện Cây khoai lang có sắc tố có thể bào chế chất nhuộm màu thực phẩm thiên nhiên thay sắc tố tổng hợp nhân tạo Khoai lang chứa nhiều loại vitamin A, B, C, E và các chất khoáng K, Ca, Mg, Fe, Se,…, giàu chất xơ thực phẩm Tổ chức FAO của Liên Hợp Quốc đã đánh giá khoai lang

là thực phẩm bổ dưỡng tốt nhất thế kỷ XXI, đang được thị trường thế giới rất ưa chuộng (Nguồn: www.nong nghiep.vn)

2.1.3 Hợp chất màu anthocyanin của khoai lang tím Nhật

Khoai lang tím Nhật có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao nên được trồng nhiều ở Việt Nam Ngoài ra, khoai lang tím Nhật chứa hợp chất anthocyanin thuộc nhóm

flavonoid hiện diện trong một số loại rau, hoa, quả, hạt có màu t đỏ đến tím như nho, gạo nếp than, bắp cải tím,… và được ứng dụng làm chất tạo màu trong nhiều loại thực phẩm như bánh kẹo, mứt, rượu và nước giải khát Anthocyanin là chất màu tự nhiên, hấp dẫn bởi giá trị cảm quan cao, có chức năng chống oxy hóa, hạn chế lão hóa tế bào và ngăn ng a một số bệnh góp phần kéo dài tuổi thọ con người Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định h nh là hợp chất mang tính phân cực nên tan tốt trong các dung môi phân cực Màu sắc của anthocyanin thay đổi phụ thuộc vào sự thay đổi của pH, nhiệt độ, sự cạnh tranh của các chất màu khác như carotene và còn nhiều yếu tố khác Tuy nhiên, màu sắc của anthocyanin thay đổi mạnh nhất phụ thuộc vào pH môi trường

Bảng 2.2 Sự thay đổi màu sắc của anthocyanin theo pH

Màu Đỏ Đỏ Đỏ Đỏ nhạt Đỏ nhạt Tím nhạt Tím Xanh Xanh

(Nguồn: http://www.hua.edu.vn:85/tc_khktnn/Upload%5C16112012-06.pdf)

2.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ENZYME

Enzyme là những chất xúc tác sinh học và là các phân tử protein trong tự nhiên Chúng được sản xuất bởi các tế bào sống (động vật, thực vật và vi sinh vật) và là hoàn toàn cần thiết như chất xúc tác trong các phản ứng sinh hóa Hầu hết các phản ứng trong tế bào đòi hỏi sự hiện diện của một enzyme cụ thể Chức năng chính của các enzyme trong một hệ thống sống là xúc tác cho việc tạo ra và phá vỡ các liên kết hóa học Do đó, giống như bất k chất xúc tác khác, chúng làm gia tăng tốc độ phản ứng mà không tự làm thay đổi về mặt hóa học của bản thân nó

Khả năng xúc tác của enzyme là do cấu trúc protein đặc biệt của nó Một phản ứng hóa học cụ thể được xúc tác tại một phần nhỏ trên bề mặt của một loại enzyme, được biết đến như là trung tâm hoạt động Một số các tương tác vật lý và hóa học xảy ra tại trung tâm hoạt động này xúc tác cho phản ứng hóa học nhất định nào đó của enzyme

Những ưu điểm của enzyme là: chúng có thể tham gia phản ứng đến cùng để đạt hiệu quả 100% và không tạo ra phụ phẩm th a Chúng có thể tham gia phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển hóa rất cao của t ng enzyme Chúng có thể tham gia các phản ứng theo dây chuyền Khi đó, sản phẩm của phản ứng đầu là nguyên liệu cho phản ứng sau Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu tốn năng lượng là ít nhất (năng lượng hoạt hóa) Trong tế bào sinh vật, enzyme luôn được tổng hợp Số lượng chúng là rất lớn và ứng với số lượng các phản ứng cơ thể cần thiết phải thực hiện Enzyme không bị mất đi sau phản ứng Khi kết thúc một phản ứng, enzyme hoàn

toàn được tự do và lại tham gia xúc tác phản ứng mới (tất nhiên là trong điều kiện không bị tác động bởi các yếu tố có hại đến cấu trúc của chúng như nhiệt độ, pH) Enzyme xúc tác phản ứng khác với các phản ứng hóa học như sau:

 Chất xúc tác enzyme mang tính đặc hiệu cao và xúc tác chỉ có một hoặc một

số nhỏ các phản ứng hóa học Một loạt các enzyme tồn tại cùng lúc có thể xúc tác cho một phạm vi rất rộng các phản ứng

 Tốc độ của phản ứng enzyme xúc tác thường nhanh hơn nhiều so với các phản ứng tương tự khi được xúc tác bởi chất xúc tác không phải sinh học Chỉ một lượng nhỏ enzyme là cần thiết để tạo ra một hiệu quả mong muốn

 Các điều kiện phản ứng như nhiệt độ, áp suất và pH cho các phản ứng enzyme là rất nhạy cảm

 Enzyme là các phân tử tương đối nhạy cảm và thường là không ổn định do vậy cần phải cẩn thận khi sử dụng

2.2.1 Thành phần cấu tạo

Enzyme về cơ bản là protein, có trung tâm hoạt động (active site), có phân tử lượng rất lớn t 20 đến 1000 kDa, chiếm khoảng 5% của tổng cộng protein tạo ra Các acid amin thường được t m thấy ở trung tâm hoạt động serine, histidine, cysteine, lysine, arginine, glutamic acid, aspartic acid, tryptophan

Enzyme được cấu tạo t các L-α-acid amin, kết hợp với nhau qua liên kết peptide Nếu bị tác động bởi enzyme peptidehydrolase, acid hoặc kiềm th các enzyme sẽ bị thủy phân hoàn toàn và kết quả sẽ tạo ra các L-α-acid amin Trong một số trường hợp, ngoài acid amin ra ta còn thu nhận các hợp chất khác

Nếu sau khi thủy phân ta thu được sản phẩm chỉ có các chất khác th enzyme đó thuộc loại enzyme một cấu tử, còn gọi là enzyme đơn giản

Nếu sau khi thủy phân ngoài acid amin ta còn thấy các chất khác th enzyme đó thuộc loại enzyme hai cấu tử, còn gọi là enzyme phức tạp Như vậy, enzyme được chia làm hai loại: enzyme đơn giản và enzyme phức tạp

Enzyme đơn giản là loại enzyme trong cấu trúc của nó có chứa protein và các thành phần khác (ion kim loại, vitamin, glutation dạng khử, nucleotid, dẫn xuất ester phosphat của monosaccharide,…)

Đa số enzyme có trong cơ thể thuộc loại đa cấu tử Trong enzyme đa cấu tử người

ta phân biệt rõ các thành phần như sau:

 Phần protein được gọi là „feron‟ và „apoenzyme‟

 Phần không phải là protein gọi là nhóm ngoại „agon‟

Nếu nhóm ngoại tách ra khỏi phần „apoenzyme‟ chúng có thể tồn tại độc lập Trong trường hợp này các agon này sẽ được gọi là coenzyme

Các enzyme trong tế bào này thường là các protein có cấu trúc bậc bốn V thế, nếu chúng bị tác động bởi một số yếu tố nhất định sẽ phân ly để tạo thành những tiểu đơn vị Trong trường hợp này hoạt tính của các enzyme sẽ bị mất hoàn toàn Trong trường hợp thuận lợi các tiểu đơn vị này lại có khả năng kết hợp lại với nhau Khi

đó hoạt tính của enzyme lại được phục hồi

2.2.2 Tính đặc hiệu của enzyme

Khác với sự xúc tác hóa học đơn thuần, các enzyme bản chất là protein và có cường lực xúc tác rất mạnh Khả năng xúc tác của enzyme thường vượt xa xúc tác hóa học thông thường Đặc tính quan trọng nhất của enzyme đó là tính đặc hiệu Tính đặc hiệu của enzyme là khả năng xúc tác có chọn lọc, xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định Tính chất đặc hiệu của enzyme có liên quan đến cấu trúc không gian ba chiều của enzyme Lúc đầu, nhiều người cho rằng enzyme tham gia phản ứng giống như một quá tr nh hoạt động bề mặt Nhưng v enzyme là một protein có cấu trúc ba chiều nên việc tương tác giữa enzyme và cơ chất xảy ra chỉ khi một enzyme nào đó tương tác với một enzyme tương ứng về cấu trúc không gian (như h nh dạng hay vị trí của nhóm tích điện) và

nó có khả năng lấp đầy bề mặt của enzyme đó Tính đặc hiệu của enzyme được biểu hiện như sau:

 Đặc hiệu phản ứng: kiểu đặc hiệu này biểu hiện đối với cơ chất có mang một loại liên kết hóa học nhất định hay các enzyme chỉ có thể xúc tác cho một trong những kiểu phản ứng chuyển hóa cơ chất nhất định Ví dụ như: phản ứng oxy hóa khử, chuyển vị hoặc thủy phân

 Đặc tính cơ chất: mỗi cơ chất có một loại enzyme tương tác tương ứng Trong enzyme có thể phân biệt được những cơ chất mà nó sẽ tác dụng Khả năng này còn thấy rõ khi trong quá tr nh phản ứng tồn tại các dạng đồng phân Ví dụ: enzyme sucrase chỉ phân hủy sucrose thành glucose và fructose Chúng không tác dụng lên hai đồng phân của chúng là maltose và lactose

Tuy nhiên, mức độ đặc hiệu của các enzyme rất khác nhau V thế, người ta chia ra mức độ đặc hiệu khác nhau như sau:

 Đặc hiệu tuyệt đối: là khả năng tác động của enzyme lên một cơ chất nhất định Ngoài ra, chúng hoàn toàn không có khả năng tác dụng lên một loại cơ chất nào khác

 Đặc hiệu tương đối: là khả năng của enzyme tác động lên kiểu liên kết hóa học nhất định của phân tử cơ chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo của các phần tham gia tạo thành các mối liên kết đó

 Đặc hiệu nhóm: là khả năng của enzyme tác động lên một kiểu liên kết hóa học với điều kiện một trong hai phần tham gia tạo thành liên kết phải có cấu tạo xác định

 Đặc hiệu quang học: nếu có hai dạng đồng phân quang học th enzyme chỉ tác dụng lên một trong hai dạng đồng phân quang học đó

2.2.3 Cơ chế tác động

Bản chất của cơ chế tác dụng bởi enzyme trong các phản ứng hóa học là khả năng hoạt hóa cơ chất để các cơ chất tham gia phản ứng mạnh hơn Theo đó, cơ chất tương tác với enzyme do sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron và sự biến dạng các liên kết T đó làm thay đổi động năng, thế năng dẫn tới cơ chất trở nên dễ dàng tham gia vào các phản ứng hơn

Điểm đặc biệt là khi có enzyme tham gia xúc tác th năng lượng cần cho phản ứng nhỏ hơn khi không có enzyme (năng lượng hoạt hóa) Quá tr nh xúc tác trải qua ba giai đoạn:

 Giai đoạn 1: enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu Kết quả tạo thành một phức hợp enzyme – cơ chất ES, phức hợp này không bền Phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi một ít năng lượng

 Giai đoạn 2: khi cơ chất tạo phức với enzyme sẽ bị thay đổi cả cấu h nh không gian, cả về mức độ bền vững của các liên kết Kết quả là làm căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị

 Giai đoạn 3: sản phẩm được tạo thành, enzyme được giải phóng và trở lại trạng thái tự do

Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là: tương tác tĩnh điện, liên kết hydro, tương tác Vandervaals Mỗi loại liên kết đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước

E + S ES →P + E Trong đó:

E: enzyme ES: phức hợp enzyme – cơ chất S: cơ chất (Subtrate) P: sản phẩm (Product)

2.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME

2.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất [S]

Khi nồng độ cơ chất tăng th cơ hội cơ chất tiếp xúc với enzyme nhiều do đó tốc độ phản ứng tăng theo Tuy nhiên, sự liên hệ này chỉ giới hạn ở một nồng độ nhất định, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất sẽ ức chế ngược lại hoạt động xúc tác của enzyme

Để t m được Vmax và Km, ta giữ số lượng enzyme là hằng số và cho giá trị nồng độ

cơ chất tăng dần Tốc độ phản ứng sẽ gia tăng cực đại đến Vmax, sau điểm này nếu gia tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng hầu như không đổi

Bảng 2.3 Bậc phản ứng so với nồng độ cơ chất

0 V = k Tốc độ phản ứng độc lập với nồng độ cơ chất

1 V = k[S] Tốc độ phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ cơ chất

2 V = k[S] [S] = k[S]2 Tốc độ phản ứng tỉ lệ với b nh phương nồng độ cơ chất

2 V = k[S1][S2] Tốc độ phản ứng tỉ lệ thuận bậc 1 với nồng độ của 2 cơ chất

phản ứng

(Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy,2010)

2.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Trong trường hợp th a cơ chất, nồng độ enzyme tăng sẽ làm tăng tốc độ phản ứng

Sự tăng tốc độ phản ứng trong tế bào sinh vật lại phụ thuộc rất nhiều vào khả năng điều hòa của gen Nh n chung, tốc độ phản ứng thuộc tuyến phụ thuộc tuyến tính với lượng enzyme

V = K[E] có dạng y = ax

Có nhiều trường hợp trong môi trường có chứa chất k m hãm hay hoạt hóa th vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác không phụ thuộc tuyến tính với [E] đó

2.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Tốc độ của phản ứng hóa học phụ thuộc vào nhiệt độ theo phương tr nh Arrheninus

là k=Ae-E/RT Do đó, khi vẽ đồ thị giữa lnk với l/T, một đường thẳng có hệ số góc là –E/R sẽ nhận được Sự phụ thuộc nhiệt độ của nhiều phản ứng xúc tác bởi enzyme

có thể được mô tả bởi phương tr nh Arrhenius Sự gia tăng năng lượng cao hơn và

xu hướng lớn hơn để di chuyển Tuy nhiên, nhiệt độ bị giới hạn trong phạm vi sinh học b nh thường Khi nhiệt độ tăng, sự biến tính nhiệt phá hủy các hoạt động của

các phân tử enzyme Điều này là do sự mở ra của chuỗi protein sau khi bị mất các liên kết hydro, v thế vận tốc phản ứng bị giảm Đối với nhiều protein, biến tính bắt đầu xảy ra tại nhiệt độ 45 đến 50oC Một số enzyme có thể chịu nhiệt rất tốt do chỉ

bị biến tính bởi nhiệt độ cao, đặc biệt là các enzyme được phân lập t vi sinh vật ưa nhiệt được t m thấy trong môi trường nóng nào đó

Như vậy, về cơ bản giống như những phản ứng hóa học khác, tốc độ của phản ứng xúc tác do enzyme tăng khi nhiệt độ tăng

Khi gia tăng 10oC đối với một phản ứng sẽ làm tăng độ hoạt động của enzyme lên

t 50 đến 100%

Chỉ cần thay đổi nhiệt độ phản ứng enzyme t một đến hai độ thôi sẽ làm thay đổi

t 10 đến 20% kết quả về hiệu quả phản ứng Trong phản ứng do enzyme, điều này tương đối phức tạp do nhiều enzyme có ảnh hưởng ngược với nhiệt độ cao

Tốc độ phản ứng gia tăng đến cực đại khi nhiệt độ tăng, sau đó chúng bị giảm nếu tiếp tục gia tăng nhiệt độ

Nên tồn trữ enzyme dưới 5oC Một số enzyme bị mất hoạt tính ở chế độ cấp đông

2.3.4 Ảnh hưởng của pH

Enzyme bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi pH Giá trị pH thấp hay cao hơn pH tối ưu đều làm giảm hoạt tính xúc tác của hầu hết enzyme một phần hay hoàn toàn Tại điểm đẳng điện, enzyme bị biến tính dẫn đến không còn hoạt tính sinh học Nếu có biện pháp làm cho enzyme hòa tan trở lại th khả năng hồi phục một phần hoạt tính tối đa của enzyme là có thể

Một số lý do mà tốc độ phản ứng enzyme bị ảnh hưởng của độ pH có thể được giải thích như sau:

 Enzyme là một protein trong đó bao gồm các phần tử là acid amin

 Acid amin có nhóm chức bazơ, trung tính hoặc acid có thể được tích điện dương hay âm ở bất k độ pH nhất định

 Enzyme được hoạt hóa khi mỗi acid amin ở trung tâm hoạt động sở hữu một điện tích nhất định Do đó, trung tâm hoạt động của enzyme được hoạt hóa phụ thuộc vào độ pH

Cùng một loại enzyme nhưng có nguồn gốc khác nhau sẽ có giá trị pH tối ưu khác nhau

2.3.5 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa (activator)

Chất hoạt hóa là những chất có tác dụng làm cho enzyme chuyển t trạng thái không hoạt động thành hoạt động, hoặc t hoạt động yếu thành hoạt động mạnh hơn

Các chất hoạt hóa có thể là các anion, các ion kim loại ở ô thứ 11 đến 55 trong bảng tuần hoàn Mendeleev, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp có nhiệm vụ chuyển hydro, các chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme hay các chất có khả năng phục hồi nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme Đối với các ion kim loại, trong quá tr nh hoạt hóa, chúng tham gia tạo thành các trung tâm hoạt động, làm cầu nối giữa enzyme với cơ chất hoặc nó làm nhiệm vụ ổn định cấu trúc không gian cần cho sự xúc tác của enzyme

2.3.6 Sự ức chế enzyme (enzyme inhibition)

Chất k m hãm (modulator) là chất có khả năng kết hợp với enzyme để làm giảm hoạt tính xúc tác của chúng

Chất ức chế (inhibitor) là chất k m hãm làm giảm hoạt tính của enzyme Có 4 kiểu

ức chế: cạnh tranh, không cạnh tranh, cạnh tranh một phần và cạnh tranh hỗn hợp

 Chất ức chế cạnh tranh (competitive inhibition): là chất ức chế chỉ kết hợp ngay tại trung tâm hoạt động của enzyme làm cơ chất không thể gắn vào, sự kết hợp đó làm cho Km tăng lên trong khi Vmax cực đại giống so với phản ứng thông thường

 Chất ức chế không cạnh tranh (uncompetitive inhibition): là chất ức chế chỉ kết hợp với phức hợp enzyme – cơ chất nhưng không phải tại vị trí đặc hiệu

mà cơ chất kết hợp với enzyme Điều này dẫn đến hiện tượng Vmax và Kmđều giảm theo cùng một nhân tố a‟ nào đó

 Chất ức chế cạnh tranh một phần (non-competitive inhibition): là chất ức chế kết hợp với cả enzyme và hỗn hợp enzyme – cơ chất làm ngăn chặn sự h nh thành sản phẩm, dẫn tới Vmax giảm trong khi Km không đổi so với phản ứng thông thường

 Chất ức chế hỗn hợp (mixed inhibition): tương tự như chất ức chế cạnh tranh một phần, nó kết hợp với E và ES với ái lực khác nhau, ngăn chặn h nh thành sản phẩm dẫn tới làm giảm giá trị Vmax và Km

2.3.7 Các yếu tố khác

Ánh sáng: có ảnh hưởng khác nhau đến t ng loại enzyme, các bước sóng khác nhau

có ảnh hưởng khác nhau, thường ánh sáng trắng có tác động mạnh nhất, ánh sáng đỏ

có tác động yếu nhất Ánh sáng vùng tử ngoại cũng có thể gây nên những bất lợi, enzyme ở trạng thái dung dịch bền hơn khi được kết tinh ở dạng tinh thể, nồng độ enzyme trong dung dịch càng thấp th càng kém bền, tác động của tia tử ngoại sẽ tăng lên khi nhiệt độ Độ bền phụ thuộc vào trạng thái của tồn tại enzyme, càng tinh khiết th enzyme càng kém bền, dịch càng loãng th độ bền càng kém

Sự chiếu điện: điện chiếu với cường độ càng cao th tác động phá hủy càng mạnh Tác động sẽ mạnh hơn đối với dịch enzyme có nồng độ thấp Có thể do tạo thành những gốc tự do, t đó tấn công vào phản ứng enzyme

Sóng siêu âm: tác động rất khác nhau đối với t ng loại enzyme, có enzyme bị mất hoạt tính, có enzyme lại không chịu ảnh hưởng

2.4 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME AMYLASE

Amylase là hệ enzyme phổ biến trong thế giới sinh vật, các enzyme này thuộc nhóm hydrolase, enzyme thủy phân, xúc tác sự phân giải các liên kết nội phân tử trong polysacharide với sự tham gia của nước

R.R‟ + H – OH → RH + R‟OH Dựa vào vị trí liên kết glucoside bị phân cắt, người ta phân chia amylase ra 2 nhóm:

 Endoamylase (enzyme cắt liên kết glucoside nội mạch):

Endoamylase thủy phân các liên kết glucoside nằm bên trong của chuỗi polysaccharide Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh Nhóm enzyme khử nhánh được chia thành 2 loại: Khử trực tiếp là Pullulanase (hay α-dextrin 6-glucosidase), khử gián tiếp là Transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) và maylo-1,6-glucosidase

 Exoamylase (enzyme cắt liên kết glucoside ở đầu mạch):

Exoamylase gồm có β-amylase và γ-amylase Đây là những enzyme thủy phân liên kết glucoside tinh bột t đầu không khử của chuỗi polysaccharide

Hình 2.3 Các loại enzyme Endoamylase và Exoamylase

(Nguồn: oryzae-2697)

http://luanvan.co/luan-van/tim-hieu-va-thu-nhan-enzyme-amylase-tu-chung-nam-moc-aspergillus-Các enzyme amylase t các nguồn khác nhau th thường khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân

Amylase là một trong số những enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp; trong đó hai enzyme được sử dụng nhiều nhất là glucoamylase (GA) chiếm 26% và α-amylase bền nhiệt chiếm 24% Cho đến nay việc nghiên cứu cấu trúc gen

mã hóa, tính chất và cấu trúc của enzyme amylase, cũng như các loại amylase khác nhau, sản xuất và tinh sạch amylase cũng đã được tiến hành nhiều, đây là enzyme

có vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm

Enzyme amylase có thể t m thấy ở nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như t thực vật, động vật và vi sinh vật Ngày nay, enzyme amylase dần dần thay thế acid xúc tác trong các quá tr nh thủy phân tinh bột ở quy mô công nghiệp Hiện nay, các nhà

sản xuất thường sử dụng α-amylase bền nhiệt của Bac licheniformis và Bac

stearothermophilus có khả năng chịu nhiệt cao 105oC để tăng hiệu suất thủy phân trong quá tr nh dịch hóa Ngoài ra, sử dụng amylase còn có nhiều ưu điểm hơn so với việc sử dụng acid trong quá tr nh thủy phân tinh bột như năng lượng xúc tác thấp, chi phí tinh sạch giảm và hạn chế độc hại cho công nhân và môi trường

2.4.1 Đặc tính và cơ chế tác dụng của α-amylase (EC.3.2.1.1)

Hình 2.4 Công thức cấu tạo của α-amylase

(Nguồn: 2680/)

http://luanvan.co/luan-van/nghien-cuu-ung-dung-enzyme-amylase-trong-san-xuat-ruou-nep-trang-α-amylase (endo-1,4-α-D-glucan glucohydrolase, EC 3.2.1.1) là enzyme ngoại bào thủy phân liên kết 1,4-α-D-glucoside của phân tử cơ chất (tinh bột và các polysaccharide đồng loại) một cách ngẫu nhiên Đây là những endo-enzyme phân cắt bên trong mạch tinh bột nên người ta gọi nó là enzyme nội phân (andoamylase) α-amylase không chỉ có khả năng thủy phân hồ tinh bột mà còn có khả năng phân hủy cả hạt tinh bột nguyên vẹn

α-amylase có thể thu nhận t vi khuẩn, nấm men và nấm mốc, α-amylase t vi khuẩn vẫn được sử dụng nhiều hơn so với α-amylase t nấm mốc do một số đặc điểm ưu việt của nó

α-amylase vi khuẩn – nhóm Bacillus là nhóm vi sinh vật quan trọng nhất được sử

dụng để sản xuất amylase trong công nghiệp bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy bề sâu, chịu nhiệt lên tới 105oC (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Đặc tính:

amylase t các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại amylase có một tổ hợp aminoacid đặc hiệu riêng α-amylase là một protein giàu tyrosine, trytophan, acid glutamine và aspartic Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme α-amylase

α-có ít methionine và α-có khoảng 7-10 gốc cysteine

Tâm hoạt động của α-amylase chứa các nhóm –COOH và –NH3, α-amylase dễ tan trong nước, dung dịch muối và rượu loãng Protein của α-amylase có tính chất acid yếu và tính chất của globuline Phân tử lượng của các α-amylase t các nguồn khác nhau tương đối gần nhau (của nấm mốc 45 đến 50 kDa, của malt 59 kDa) (Nguyễn Đức Lượng,2004)

α-amylase là một metaloenzyme, bền nhiệt hơn so với các amylase khác Người ta cho rằng đặc tính này liên quan tới hàm lượng calcium trong phân tử của nó Khi tách hoàn toàn Ca2+ ra khỏi enzyme th nó sẽ mất hết khả năng thủy phân cơ chất, v

Ca2+ tham gia vào sự h nh thành và ổn định cấu trúc của enzyme, đảm bảo độ bền cực lớn đối với tác động gây biến tính và sự phân hủy bởi các enzyme phân giải protein α-amylase bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+

, Hg2+ (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Điều kiện hoạt động của α-amylase t các nguồn khác nhau thường không giống nhau Vùng pH tối thích của α-amylase t nấm sợi là 4,5 – 4,8, của ,malt là 4,7 – 5,4 và của vi khuẩn là 5,8 - 6,0 (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

α-amylase của vi khuẩn có độ bền nhiệt cao hơn co với t các nguồn khác nhau Amylase của vi khuẩn chịu được nhiệt độ 92oC Trong khi đó amylase của nấm sợi

bị vô hoạt ở 70oC (Nguyễn Đức Lượng,2004)

Cơ chế tác dụng:

Sự thủy phân tinh bột của α-amylase trải qua nhiều giai đoạn:

Trước tiên, enzyme này phân cắt một số liên kết trong tinh bột tạo ra lượng lớn dextrin phân tử thấp, sau đó các dextrin này thủy phân tiếp tục để tạo ra maltose và glucose

Amylose bị phân cắt thành các oligosaccharide hay còn gọi là polyglucose (6–7 gốc glucose) dưới tác dụng của α-amylase , sau đó các polyglucose này tiếp tục bị phân cắt thành các chuỗi ngắn dần và tạo thành maltoterose, maltotriose, maltose Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm của quá tr nh thủy phân amylase là 13% glucose và 87% maltose

Tác dụng của α-amylase trên amylopectin cũng xảy ra tương tự và sản phẩm được tạo là 72% maltose, 19% glucose, ngoài ra còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose (8%) do α-amylase không thể cắt được liên kết 1,6-glucoside ở mạch nhánh của phân tử amylopectin

Khả năng dextrin hóa của α-amylase rất cao nên người ta còn gọi nó là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa

2.4.2 Đặc tính và cơ chế tác dụng của glucoamylase (EC.3.2.1.3)

Glucoamylase – GA (α-1,4-glucan glucohydrolase EC 3.2.1.3) là enzyme thủy phân liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside t đầu không khử của mạch tinh bột tạo ra đường glucose

GA có thể nhận được t nhiều nguồn như thực vật, động vật và vi sinh vật Trong

đó th enzyme vi sinh vật được sử dụng chủ yếu trong công nghiệp Nấm mốc

Aspergillus là chủng chính để thu nhận GA Kỹ thuật nuôi cấy gồm các phương

pháp nuôi cấy bề sâu, nuôi cấy bề mặt trên môi trường rắn hay bán rắn, nuôi cấy trong hệ hai pha Glucoamylase t nấm mốc là các protein có khối lượng dao động rất lớn t 27 đến 112 kDa, tùy thuộc vào nguồn gốc của enzyme

Đặc tính:

Glucoamylase tinh khiết tồn tại ở hai dạng glucoamylase I và glucoamylase II Acid glutamic chiếm hàm lượng lớn trong cấu trúc của GA, đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của GA GA bị vô hoạt mạnh bởi ion Hg2+

, trong khi Mn2+ và Fe2+ lại có khả năng hoạt hóa GA nói chung hoạt động trong vùng acid, pH tối ưu nằm trong khoảng 4,5-5,0, nhiệt độ tối ưu ở khoảng 40-60oC Khi so sánh vận tốc thủy phân cơ chất khác nhau bằng glucoamylase tinh thể, người ta nhận thấy các polysaccharide phân tử lớn thường được thủy phân nhanh hơn so với các polysaccharide phân tử nhỏ

So với α-amylase, glucoamylase bền đối với acid hơn nhưng lại kém bền đối với tác dụng của rượu etylic, aceton và không được bảo vệ bằng Ca2+

Hầu hết các glucoamylase bị mất hoạt tính khi đun nóng đến 70o

Cơ chế xúc tác thủy phân liên kết O-glucoside là do hoạt động chủ yếu của một cặp acid amin đóng vai trò như một cặp acid – base Khi tương tác với cơ chất, acid glutamic ở vị trí thứ 179 đóng vai trò như một chất xúc tác acid, nó sẽ proton hóa oxi-glycosidic (phân tử oxi ở vị trí liên kết O-glucoside)