chọn lọc cá thể bc1f1, bc2f2 mang qtl gen tăng số hạt trên bông của tổ hợp lai kd18 x kc25 bằng chỉ thị phân tử

Mục đích và yêu cầu của đề tài + Mục đích của đề tài Sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại trong quy tụ QTL/gen tăng số hạt trên bông vào giống lúa KD1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM -

NGUYỄN THỊ LOAN

SỐ HẠT TRÊN BÔNG CỦA TỔ HỢP LAI KD18 X KC25

Luận văn được thực hiện tại Bộ môn Sinh học Phân tử, Bộ môn Kỹ thuật Di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp Tại đây, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của Ban lãnh đạo và các cán bộ trong Bộ môn, Viện Di truyền trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới khoa Công nghệ Sinh học, Ban Đào tạo sau Đại học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi về kiến thức và chuyên môn trong suốt hai năm học tập và làm luận văn

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới gia đình, người thân và toàn thể bạn bè đã cổ vũ, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.`

Trong quá trình thực hiện, không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được sự góp ý chân thành

Một lần nữa tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, tháng năm 2015

Tác giả

Nguyễn Thị Loan

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Trần Đăng Khánh, TS Nguyễn Văn Giang

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được sử dụng công bố ở bất cứ công trình khoa học nào

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn này

đã được ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

Nguyễn Thị Loan

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Lời cam đoan ii

Mục lục iii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục đích và yêu cầu của đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của của đề tài 2

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về giống lúa bố mẹ 3

1.1.1 Giống nhận QTL/gen KD18 3

1.1.2.Giống cho QTL/gen KC25 3

1.2 Cơ sở khoa học trong việc ứng dụng chọn giống nhờ chỉ thị phân tử 3

1.2.1 Chỉ thị phân tử 3

1.2.2 Tính ưu việt và những ứng dụng của chỉ thị phân tử 9

1.3 Những nghiên cứu chọn tạo giống lúa năng suất 16

1.3.1 Trên thế giới 16

1.3.2 Tại Việt Nam 21

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Vật liệu nghiên cứu 24

2.1.1 Các giống lúa nghiên cứu 24

2.1.2.Các chỉ thị phân tử và hóa chất thí nghiệm 24

2.2 Nội dung nghiên cứu 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Phương pháp lai hữu tính - lai trở lại giữa giống cho và nhận QTL/gen 27

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu phòng thí nghiệm 29

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 33

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Kết quả lai tạo thế hệ F1, BC1F1, BC1F2 của tổ hợp KD18 x KC25 34

3.2 Tách chiết và tinh sạch ADN tổng số 34

3.3 Khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ 35

3.4 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn lọc cá thể lai mang QTL/gen 36

3.4.1 Xác định con lai F1 36

3.4.2 Chọn lọc các cá thể mang QTL/gen ở thế hệ BC1F1 37

3.4.3 Chọn lọc các cá thể mang QTL/gen ở thế hệ BC2F1 45

3.4.4 Chọn lọc các cá thể mang QTL/gen đồng hợp tử với KC25 ở thế hệ BC2F2 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

Kết luận 58

Kiến nghị 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

PHỤ LỤC 65

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dài các

đoạn được nhân bản chọn lọc RAPD : Random Amplification of Polymorphic DNA - Đa hình ADN được

nhân bản ngẫu nhiên RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài

mảnh phân cắt giới hạn STS : Sequence Tagged Site – Xác định vị trí trình tự đã được đánh dấu RGA : Resistance Gene Analog – Vùng tương đồng gen kháng

SNP : Single Nucleotide Polymorphisms – Đa hình nucleotide đơn

SSR : Simple Sequence Repeat - Sự lặp lại của trình tự đơn giản

cDNA : Complementary DNA – Thư viện ADN bổ trợ

PCR : Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp

QTL/ QTLs : Quantity Trait Loci(s) - Locus kiểm soát tính trạng số lượng

DANH MỤC BẢNG

2.1 Các chỉ thị cho đa hình giữa giống KD18 x KC25 tại vị trí QTL/gen 24 2.2 Các chỉ thị cho đa hình trên 12NST giữa giống KD18 x KC25 24 2.3 Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR 29

3.1 Tỉ lệ phần trăm alen giống nhận gen của 32 cá thể BC1F1 mang QTL/gen 42 3.2 Tỉ lệ phần trăm alen giống nhận gen của 15 cá thể BC2F1 mang QTL/gen 51 3.3 Sự tương quan giữa số thế hệ với tỷ lệ kiểu gen của giống nhận gen được

DANH MỤC HÌNH

2.1 Các bước thí nghiệm trong chọn tạo giống lúa tăng số hạt trên bông

bằng phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử và lai trở lại 28

3.16 Tỷ lệ các cá thể mang nền di truyền giống mẹ ở thế hệ BC1F1 43 3.17 Biểu đồ 32 cá thể thế hệ BC1F1 (KD18/KC25) trên NST số 1, 2, 3, 4 44 3.18 Biểu đồ 32 cá thể thế hệ BC1F1 (KD18/KC25) trên NST số 5, 6, 7, 8 44 3.19 Biểu đồ 32 cá thể thế hệ BC1F1 (KD18/KC25) trên NST số 9, 10, 11, 12 44 3.20 Biểu đồ của cá thể số 74 thế hệ BC1F1 quần thể KD18/KC25 45 3.21 Biểu đồ của cá thể số 109 thế hệ BC1F1 quần thể KD18/KC25 45

3.25 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 49

3.34 Tỷ lệ các cá thể mang nền di truyền giống mẹ (BC2F1) 52 3.35 Biểu đồ 15 cá thể thế hệ BC2F1 (KD18/KC25) trên NST số 1, 2, 3 52 3.36 Biểu đồ 15 cá thể thế hệ BC2F1 (KD18/KC25) trên NST số 4, 5, 6 53 3.37 Biểu đồ 15 cá thể thế hệ BC2F1 (KD18 x KC25) trên NST số 7, 8, 9 53 3.38 Biểu đồ 15 cá thể thế hệ BC2F1 (KD18 x KC25) trên NST số 10, 11, 12 53 3.39 Biểu đồ của cá thể số 61 thế hệ BC2F1 quần thể KD18 x KC25 54 3.40 Biểu đồ của cá thể số 59 thế hệ BC2F1 quần thể KD18 x KC25 54

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực chính đảm bảo an

ninh lương thực, ổn định xã hội ở nhiều quốc gia trên thế giới và được trồng tập trung chủ yếu ở các nước châu Á, châu Phi và Mỹ La tinh Ở nước ta, lúa gạo không chỉ là nguồn lương thực tiêu dùng trong nước mà còn là mặt hàng xuất khẩu quan trọng Sản lượng lúa gạo toàn cầu năm 2013 đạt 496,3 triệu tấn, tăng 1% so với năm

2012 Trong đó, sản lượng lúa tại châu Á ước tính đạt 450,6 triệu tấn, tăng khoảng

1,1% so với năm 2012 (FAO, 2013)

Ngày nay, dân số ngày càng tăng nhanh đang gây áp lực lớn đến nền nông nghiệp toàn cầu và đặc biệt ở các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam (Bùi Thị Kim Vi và cs, 2011) Diện tích đất nông nghiệp đặc biệt là đất canh tác lúa giảm nhanh do sự chuyển dịch cơ cấu sản xuất nông nghiệp, bên cạnh quá trình đô thị hóa

và công nghiệp hóa diễn ra nhanh chóng Một vấn đề đáng quan tâm là ảnh hưởng tiêu cực của biến đổi khí hậu như lũ lụt, hạn hán, xâm nhập mặn làm sản lượng lúa bị sụt giảm đáng kể Để đáp ứng nhu cầu lương thực, nghiên cứu, cải tiến các giống lúa có năng suất cao, chất lượng tốt là yếu tố quan trọng nhằm đảm bảo an sinh xã hội, tăng thu nhập cho người dân

Phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC) đã được ứng dụng thành công tại Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) trong việc quy tụ QTL/gen chịu ngập và chịu mặn vào một số giống lúa trồng phổ biến ở các nước Đông nam châu Á như: Ấn Độ, Indonesia, Bangladet Phương pháp MABC thiết thực, hiệu quả trong việc quy tụ locus gen quy định tính trạng di truyền số lượng (QTL) hay gen vào giống mới cho phép rút ngắn quá trình chọn lọc, chọn lọc được những tính trạng khó hay nhiều gen cùng một lúc Chọn giống bằng phương pháp MABC sẽ giảm được giá thành, thời gian và cho hiệu quả cao hơn so với phương pháp chọn giống truyền thống Phương pháp này cho phép chọn lọc trực tiếp hệ gen của từng cá thể trong quần thể Việc ứng dụng chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại từ 2 đến 3 thế hệ có thể thu được cá thể với nền di truyền của giống mẹ và mang gen chuyển Các dòng này có thể cho tự thụ, thu hạt để thử nghiệm trên đồng ruộng

Kết hợp phương pháp MABC và chọn giống truyền thống để tạo ra

dòng/giống lúa có khả năng năng suất cao, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài

“Chọn lọc cá thể BC 1 F 1 , BC 2 F 2 mang QTL/ gen tăng số hạt trên bông của tổ hợp lai KD18 x KC25 bằng chỉ thị phân tử”

2 Mục đích và yêu cầu của đề tài

+ Mục đích của đề tài

Sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại trong quy tụ QTL/gen tăng số hạt trên bông vào giống lúa KD18 đang được trồng phổ biến ở Việt Nam, để chọn ra 1-2 cá thể KD18 x KC25 mang QTL/gen tăng số hạt

trên bông có nền di truyền cao nhất giống giống nhận gen

+ Yêu cầu của đề tài

- Tạo được quần thể F1, BC1F1, BC2F1 của tổ hợp lai KD18 x KC25 - Xác định được cá thể trong quần thể F1, BC1F1, BC2F1 mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông

- Xác định cá thể trong quần thể BC1F1, BC2F1 mang QTL/gen tăng số hạt trên bông và có nền di truyền cao nhất giống KD18

- Xác định cá thể trong quần thể BC2F2 mang QTL/gen tăng số hạt trên bông đồng hợp tử với KC25

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của của đề tài

+ Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Ứng dụng chỉ thị phân tử kết hợp phương pháp lai trở lại để chọn lọc nhanh và chính xác các cá thể mang QTL/gen tăng số hạt trên bông, nhờ vậy rút ngắn thời gian, công sức chọn lọc trên đồng ruộng, giảm số lượng lớn cá thể gieo trồng hàng vụ và giúp khắc phục được những hạn chế của phương pháp chọn giống truyền thống

+ Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Những thành công bước đầu trong quy tụ QTL/gen tăng số hạt trên bông nhờ

sử dụng chỉ thị phân tử ở lúa sẽ mở ra khả năng ứng dụng rộng rãi trong công tác chọn tạo giống nói chung, không chỉ đối với tính trạng năng suất mà còn đối với nhiều đặc tính nông học đáp ứng nhu cầu lương thực con người

- Những cá thể trong quần thể BC1F1, BC2F1, BC2F2, triển vọng được chọn lọc trong đề tài này sẽ trồng thử nghiệm, đánh giá, chọn ra các dòng lúa có năng suất phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về giống lúa bố mẹ

1.1.1 Giống nhận QTL/gen KD18

KD18 gọi tắt của giống lúa Khang dân 18 là giống lúa thuần được trồng khá phổ biến ở các tỉnh đồng bằng sông Hồng và được nhập nội từ Trung Quốc vào nước ta từ những năm 90 của thế kỷ trước Là giống lúa có tiềm năng năng suất cao,

đẻ nhánh khá, chịu rét khá Có bộ lá đứng, gọn, kháng sâu bệnh khá Chịu thâm

canh trung bình

- Thời gian sinh trưởng:

+ Vụ xuân muộn: 120 – 130 ngày

+ Vụ mùa: 100 – 105 ngày

- Năng suất trung bình: 220 – 280 Kg/ sào (360m2)

- Mật độ trung bình: 40 – 45 khóm/m2

1.1.2.Giống cho QTL/gen KC25

KC25 là giống nhập nội từ Hàn Quốc mang QTL/gen tăng số hạt trên bông được sử dụng làm giống cho QTL/gen

1.2 Cơ sở khoa học trong việc ứng dụng chọn giống nhờ chỉ thị phân tử

Năm 1998 Bert Collard và David Mackill đã trình bày về chọn lọc dựa trên chỉ thị phân tử, cơ sở khoa học là tất cả cơ quan sống được hình thành từ các tế bào, các tế bào sống được điều khiển bằng vật liệu di truyền gọi là ADN Phân tử ADN được tạo thành chuỗi dài chứa các N (Adenin [A]; Cytosin [C]; Guanine [G] và Thymine [T], chỉ mỗi phần nhỏ của chuỗi ADN tạo thành các gen mang mã

di truyền cho các protein, phần còn lại chủ yếu của ADN không mã hóa Các vật

liệu di truyền tổ chức bên trong các NST (ví dụ cây Arabidopsis thaliana có 5

NST), tập hợp bộ nhiễm sắc thể gọi là genome Trong 1 cá thể lưỡng bội (NST theo các cặp) có 2 allen của một gen, mỗi allen có nguồn từ một bố, mẹ Chỉ thị phân tử không xem xét như các gen bình thường khi chúng không có ảnh hưởng sinh học

mà xem xét như các mốc điểm trong genome Chúng ta có thể nhận biết trình tự ADN truyền đạt di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác dựa vào kiểm tra ADN phản ánh được chỉ thị hình thái ADN là cơ sở nhận biết các tính trạng bằng chỉ thị hóa sinh là cơ sở gen tạo ra protein, số chỉ thị này có thể dò tìm toàn bộ genome và thông tin cung cấp cho nhà tạo giống phụ thuộc vào chỉ thị sử dụng, mỗi chỉ thị có

ưu và nhược điểm khác nhau Trong thực tế, số lượng các chỉ thị ADN là rất lớn, nếu chỉ tính một sai khác rất nhỏ giữa hai cá thể đã dẫn đến một số lượng lớn sai khác các chỉ thị ADN giữa 2 cá thể đó

Chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị có bản chất là đa hình, về mặt nguyên tắc một chỉ thị ADN lý tưởng phải đạt các yêu cầu sau: Bản chất cho đa hình cao, di truyền đồng trội, xuất hiện nhiều trong genome, dễ tiếp cận, phân tích nhanh và dễ dàng Tuy nhiên, gần như không thể tìm thấy một nào có thể thỏa mãn tất cả những điều kiện trên Tùy thuộc vào những nghiên cứu mà người ta sử dụng một hệ thống chỉ thị thỏa mãn được một số điều kiện (Nguyễn Duy Bảy và cs, 2001) Bên cạnh

đó chỉ thị phân tử ADN có những ưu điểm vượt trội so với chỉ thị hình thái và chỉ thị isozyme ở một số đặc tính:

1/Đo lường trực tiếp các vật liệu di truyền;

2/Có nhiều chỉ thị trong quần thể;

3/Đo lường không chi phối ảnh hưởng của môi trường và ảnh hưởng có tính chất phát triển

Vì những ưu thế trên nên ngày nay trong công tác nghiên cứu chọn giống cây trồng thường hay sử dụng chỉ thị phân tử ADN hơn

Chỉ thị phân tử được chia làm ba loại chính:

1.2.1.1 Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN

* Chỉ thị RFLP (Restriction fragment length polymorphism - Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn)

Chỉ thị này được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên

cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở người Năm 1980 Bostein đã chỉ ra rằng trong chỉ thị RFLP, enzym giới hạn được sử dụng để cắt ADN genome thành nhiều mảnh ADN có độ dài khác nhau Các đa hình RFLP sinh ra bởi những đột biến tự nhiên ở những điểm cắt enzym giới hạn trong ADN bộ gen như đảo đoạn, thêm hoặc mất đoạn ADN tùy thuộc vào mỗi giống, mỗi loài thậm chí mỗi cá thể Mỗi loài sinh vật có một bộ gen đặc hiệu trong cấu trúc Vì vậy khi sử dụng những enzym giới hạn để cắt phân tử ADN của hệ gen, các đoạn cắt ra của ADN với kích thước hay chiều dài khác nhau có thể được dùng như các dấu hiệu di truyền để xem xét các mẫu nhiễm sắc thể Sự nhận biết các đoạn cắt được thực hiện nhờ kỹ thuật lai với các ADN mẫu dò

Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các alen của cùng một locus gen Do vậy có thể phân biệt được các thể đồng hợp tử (AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp tử (Aa) Đây là đặc điểm ưu việt của chỉ thị RFLP Hạn chế của phương pháp này là tốn nhiều thời gian và công sức, đòi hỏi có phòng thí nghiệm với nhiều trang thiết bị kỹ thuật cao, đặc biệt là tiêu hao một lượng lớn ADN mà số lượng đa hình thu được khá ít, thậm chí ở một số loài khó nhận được đa hình (Lưu Thị Ngọc Huyền, 2003)

1.2.1.2 Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN

Phản ứng chuỗi trùng hợp hay kĩ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

do Kary Mullis đưa ra, giúp phát hiện sự đa hình ADN dựa trên cơ sở nhân bản các đoạn ADN với số lượng lớn dựa trên nguyên lí tái bản của ADN trong tự nhiên

* Chỉ thị RAPD (RADNomly Amplified Polymorphic ADNs – Đa hình các đoạn ADN khuyếch đại ngẫu nhiên)

Chỉ thị RAPD hay còn gọi là PCR – RAPD được hình thành dựa trên nguyên lý của kỹ thuật PCR được William phát triển vào năm 1990 Trong chỉ thị RAPD không cần dùng cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn ADN nhất định mà dùng các mồi đơn ngẫu nhiên để nhân các đoạn ADN một cách ngẫu nhiên Mồi ngẫu nhiên

là đoạn oligonucleotide dài khoảng từ 6 – 12 nucleotide, nhiệt độ kết cặp thấp Do tính ngẫu nhiên nên các đoạn mồi này vừa là mồi xuôi, vừa là mồi ngược Các đoạn này sẽ bắt cặp với trình tự bổ sung trong hệ gen của sinh vật để nhân bản Sự đa

hình phát hiện được khi sử dụng kỹ thuật RAPD có thể là do sự thay đổi bazơ nucleotit ở vị trí gắn mồi, hoặc sự thêm hay mất nucleotit nằm trong vùng khuếch đại (Williams J.G et al, 1990)

* Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài các đoạn ADN nhân bản chọn lọc)

Chỉ thị AFLP dựa trên nguyên tắc sử dụng enzym giới hạn và PCR Để thiết

kế được các mồi đặc trưng trước hết cắt các mẫu nghiên cứu bằng enzym giới hạn Khi xử lý enzym giới hạn ADN sẽ bị cắt thành vô số mảnh có kích thước khác nhau Mỗi mảnh cắt, đều biết trước trình tự nucleotide của chúng ở hai đầu cắt Dựa vào trình tự ở hai đầu cắt thiết kế các đoạn gắn (adaptor) Sau đó dùng enzym ligase

để nối các đoạn ADN thích ứng vào hai đầu ADN đã cắt Dựa vào trình tự adaptor

ta thiết kế mồi PCR Mồi PCR gồm hai phần: Một phần có trình tự bổ sung với adaptor và phần kia là những nucleotide được thêm vào tùy ý, thường từ 1 – 3 nucleotide Với mồi thiết kế như vậy thì chỉ có những đoạn ADN có trình tự ở hai đầu bổ sung với trình tự mồi mới được nhân bản

Ưu điểm của phương pháp này là lượng ADN sử dụng cho nghiên cứu ít, băng ADN ổn định, khả năng ứng dụng rộng rãi và do có thể bổ sung các nucleotide khác nhau khi thiết kế mồi nên số lượng mồi có thể thiết kế được và tiềm năng ứng dụng rất lớn AFLP còn cung cấp một lượng đa hình ADN lý tưởng từ ADN của bất

kỳ nguồn gốc nào từ đơn giản đến phức tạp AFLP cũng được coi là công cụ hiệu quả nghiên cứu tính đa hình di truyền, tìm chỉ thị liên kết, xây dựng bản đồ di truyền mật độ cao Đặc biệt được dùng trong phân tích ADN từ nhiều nguồn gốc với mức độ phức tạp khác nhau

* Chỉ thị STS (Sequence Tagged Site – Xác định vị trí trình tự đã được đánh dấu)

STS là một đoạn ADN ngắn gồm khoảng 60- 1000bp có thể được phát hiện bằng kỹ thuật PCR Nó cho phép xác định những vị trí được đánh dấu bằng cách sử dụng các trình tự nucleotide đã biết trước của ADN trong genome

STS là chỉ thị nhân bản trực tiếp những locus đã biết bằng việc sử dụng cặp mồi PCR được thiết kế, theo trình tự đoạn đầu và đoạn cuối của những locus đặc

trưng này Các đoạn mồi STS chứa khoảng 20 nucleotide nên có tính đặc hiệu cao với PCR Mỗi một STS được xác định tại một điểm trên bản đồ như là một mốc trong genom (Trịnh Đình Đạt, 2006) Ở cây lúa, các STS được coi như là mốc chuẩn và người ta đã xác lập được các STS liên kết với một số gen kháng sâu bệnh,

sử dụng để phát hiện tính đa hình xây dựng bản đồ di truyền liên kết như STS liên kết với gen kháng stress, chịu lạnh ở lúa (Lê Duy Thành, 2000) Nhờ đó việc tìm kiếm các gen kiểm soát hoặc liên quan chặt chẽ đến một tính trạng di truyền nào đó

có thể được tiến hành dễ dàng Sử dụng trong lĩnh vực chọn giống dựa vào các dấu phân tử STS để tìm kiếm các gen quan tâm trong quần thể và phân tích nguồn gen, nghiên cứu mối quan hệ họ hàng giữa các loài

* Chỉ thị RGA (Resistance Gene Analog – Vùng tương đồng gen kháng)

Khi so sánh trình tự ADN của những gen kháng đã phân lập từ nhiều loài thực vật khác nhau, các nhà khoa học đã thấy rằng những gen này có chung những vùng lặp lại, như vùng lặp lại giàu leucin (Leucine Rich Repeat: LRR), vùng vị trí liên kết nucleotit (Nucleotit Binding Site: NBS) và vùng protein Kinaza (PK) (Grant et al., 1995) Bản chất của kỹ thuật RGA là những cặp mồi ADN được xây dựng dựa vào những vùng bảo tồn nằm trong gen kháng Bởi vậy, sản phẩm “nhận dạng” ADN có thể là một vùng hoặc toàn bộ gen kháng Kỹ thuật RGA đã được dùng để tách, lập bản đồ gen kháng và phân tích đa dạng di truyền (Chen et al., 1999) Những mồi

RGA đã sử dụng cũng tách biệt những giống lúa có hệ gen di truyền Indica từ hệ gen di truyền japonica Ngoài ra, mối liên kết giữa chỉ thị RGA với gen kháng bệnh

rỉ sắt cũng được phát hiện (Chen X M et al., 1998)

* Chỉ thị SNPs (Single nucleotide polymorphism - Đa hình của các nucleotit đơn)

SNP là những biến dạng của chuỗi trình tự ADN được tìm thấy với tần suất cao nhất trong genome người Theo phân tích chi tiết chuỗi trình tự của những phần nào đó trong genome, ADN từ hai cá thể khác nhau phần lớn đều giống nhau với số cặp base khác biệt nhau nằm ở trong khoảng cho phép 500-1000bp Một cặp base ở một vị trí nào đó sẽ biểu thị sự khác nhau của cá thể có tính chất phổ biến, và một cặp base khác là biến dị, ít phổ biến hơn ở cùng một vị trí Nếu cặp base ít phổ biến hơn xuất hiện nhỏ hơn 1% trong quần thể, người ta gọi vị trí cặp base đó là một

SNP Hiện nay, người ta đã công bố 3 triệu SNP trong genome người, nhiều hơn bất

cứ chỉ thị phân tử nào đã được công bố trước đó Chỉ thị SNP được áp dụng vào đầu những năm 2000, từ genome người cho đến genome các sinh vật khác như cây

Arabidopsis , cây lúa (Oryza sativa L.)

1.2.1.3 Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại

Chuỗi lặp lại có trật tự (TADNemly Repeated Sequence) là những trình tự lặp lại một cách có trật tự từ đầu đến cuối trong một hệ gen, thường được gọi là ADN vệ tinh, tiểu vệ tinh hay vi vệ tinh tuỳ thuộc vào số lượng bản sao của chúng trong hệ gen và tính chất của chuỗi Thực ra, một số chuỗi lặp lại cũng thuộc loại chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bội ADN như chỉ thị vi vệ tinh Tuy nhiên, do chúng có bản chất là chuỗi lặp lại nên có thể xếp chung vào một nhóm riêng

* Tiểu vệ tinh (Minisatellite)

Tiểu vệ tinh là loại chuỗi lặp lại nhiều lần, có đơn vị lặp lại gồm từ 6 nucleotid trở lên (thường vào khoảng 15bp), bao phủ một vùng từ 0,5-3kb Không giống như ADN vệ tinh, tiểu vệ tinh được tìm thấy ở những vùng dị nhiễm sắc và thường thay đổi rất nhiều về kích thước Có 2 loại ADN tiểu vệ tinh Đó là ADN đầu mút NST và ADN tiểu vệ tinh siêu biến ADN đầu mút NST nằm ở vai NST, gồm một vài kilobase ADN tiểu vệ tinh siêu biến nằm ở vùng phụ đầu mút NST

* Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats - Sự lặp lại của trình tự đơn giản)

SSR là chỉ thị khuyếch đại các đoạn lặp lại đơn giản hay còn gọi là vi vệ tinh (Microsatellites)

Chỉ thị này được phát triển bởi Litt và Luty năm 1989 Là những đoạn ADN lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị lặp lại từ 2- 6 nucleotide, theo kiểu lặp lại ngắn và vài chục lần Hiện tượng tồn tại các SSR trong cơ thể sinh vật Eukaryote

là khá phổ biến, tuỳ từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ 2 đến hàng trăm ngàn lần hoặc nhiều hơn (Lê Thị Ánh Hồng, 2002)

SSR là chỉ thị đồng trội có ưu điểm là dễ thực hiện, khả năng phát hiện đa hình rất cao, nhưng quá trình thiết kế mồi rất tốn kém mà mỗi loại mồi lại chỉ đặc trưng cho một loài Tuy nhiên, SSR là một loại chỉ thị chính xác và hữu hiệu trong

nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại các giống vật nuôi, cây trồng khác nhau trong cùng một loài động vật hay thực vật Người ta sử dụng chỉ thị SSR trong phân tích hệ gen để chọn giống, xây dựng bản đồ liên kết gen, chọn lọc tính kháng bệnh, nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất cây trồng, các bệnh hại và sử dụng trong việc phân định sự sai khác giữa các giống trong cùng một loài phụ do khả năng cho phép đánh giá mức độ alen thuộc một locus

Chỉ thị SSR được nghiên cứu lần đầu tiên trên người (Hamada et al, 1982) Sau đó chỉ thị này đựơc dùng trong nghiên cứu di truyền ở lúa (Caldo et al, 1998)

và nhiều loài sinh vật khác Bộ gen Eukaryote có nhiều đoạn ADN lặp lại, các đoạn lặp ADN có kích thước dài ngắn khác nhau tuỳ từng loài

1.2.2 Tính ưu việt và những ứng dụng của chỉ thị phân tử

1.2.2.1 Tính ưu việt của chỉ thị phân tử

Trong những năm gần đây việc nghiên cứu hệ gen sinh vật sử dụng các chỉ thị phân tử được phát triển nhanh chóng Chỉ thị phân tử cho phép xác định được các chỉ tiêu trực tiếp của kiểu gen thông qua việc xác định các trình tự nhất định của các gen hay các trình tự đặc hiệu liên kết chặt với các gen mang các tính trạng mong muốn Bằng việc sử dụng các chỉ tiêu phân tích trực tiếp kiểu gen, khắc phục ảnh hưởng của các yếu tố môi trường, theo dõi và phát hiện được các gen mong muốn,

sự biến đổi của chúng qua các thế hệ khi chưa có sự biểu hiện ra kiểu hình Điều này giúp công tác chọn tạo giống tiến hành một cách chính xác, rút ngắn thời gian

và chi phí

Trên rất nhiều loại cây trồng hiện nay người ta đã thiết lập bản đồ chi tiết về các chỉ thị ADN liên kết với nhiều gen quy định các tính trạng nông sinh học khác nhau, trên cơ sở đó đã tiến hành chọn lọc gián tiếp dựa trên các chỉ thị phân tử này Nhờ vào những ưu điểm của chỉ thị phân tử đó là:

- Tìm và phát hiện những cá thể có chứa một gen nhất định nào đó trong quần thể đang phân ly, trên cơ sở tìm sự có mặt của một mẫu ADN đánh dấu liên kết chặt với gen đó chứ không phải dựa vào kiểu hình của nó

- Đánh giá từng cá thể trong quần thể ở bất kì giai đoạn sinh trưởng nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể, trong bất kì điều kiện môi trường đánh giá nào, cùng

một lúc đánh giá được nhiều tính trạng khác nhau trên một cá thể sinh vật

- Loại trừ được ảnh hưởng của mối tương tác giữa các alen khác nhau của

một locus hoặc giữa các locus khác nhau lên sự biểu hiện tính trạng

- Tăng hiệu quả và độ chính xác của chọn lọc đặc biệt đối với những tính trạng khó biểu hiện ra kiểu hình

- Số lượng các chỉ thị phân tử là cực kỳ lớn, giúp cho nhà chọn giống phân

biệt được sự sai khác rất nhỏ giữa hai cá thể sinh vật có họ hàng gần nhau, thậm chí khác nhau chỉ do đột biến nhỏ hoặc do tái tổ hợp, phân biệt được giữa các alen, các chủng sinh lý gây bệnh

- Là công cụ hữu hiệu để khẳng định quyền tác giả đối với các loại giống cây trồng, vật nuôi, phát hiện các loại bệnh di truyền trong y tế, phát hiện tội phạm

1.2.2.2 Những ứng dụng của chỉ thị phân tử

* Phân tích đa dạng di truyền

Nhờ sự ra đời của các loại chỉ thị phân tử đã cung cấp cho các nhà khoa học một công cụ hữu ích trong việc nghiên cứu di truyền thực vật nói chung cũng như

nghiên cứu đa dạng di truyền, chọn tạo giống thực vật nói riêng Ưu điểm của trong

phân tích đa dạng di truyền là rút ngắn thời gian chọn lọc đối với các tính trạng không hoặc khó đánh giá thông qua kiểu hình Các chỉ thị phân tử thường được sử dụng để nghiên cứu, xác định mối quan hệ di truyền các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài là cơ sở cho việc phân loại dưới loài, phát hiện loài mới và mối quan

hệ tiến hoá giữa loài Đặc biệt, nghiên cứu đa dạng di truyền có thể giúp tiên đoán khả năng cho ưu thế lai giữa các cặp bố mẹ (Cặp bố mẹ nào có khoảng cách di

truyền xa hơn thường sẽ cho ưu thế lai lớn hơn)

RFLP là một trong những chỉ thị hình thành sớm nhất được sử dụng trong nghiên cứu đa hình di truyền Năm 1992 Wangz đã sử dụng chỉ thị RFLP để thiết kế

sơ đồ cây chủng loại phát sinh ở lúa (Wangz et al 1992) Chỉ thị RAPD đã được dùng để xác định đa dạng cấu trúc ADN cây họ đậu (Jena et al 2004) Lưu Minh Cúc và cộng sự đã sử dụng SSR để khảo sát đa dạng di truyền một số giống lúa nếp phục vụ cho xây dựng quy trình tính khác biệt của giống lúa hỗ trợ cho khảo nghiệm DUS (Lưu Minh Cúc, 2010) Chỉ thị phân tử ADN còn được ứng dụng

trong nghiên cứu sự sai khác ADN giữa các giống đột biến so với các giống gốc ở thực vật

* Tìm chỉ thị phân tử liên kết gen và lập bản đồ gen

Một trong những ứng dụng quan trọng của chỉ thị phân tử ADN là tìm chỉ thị liên kết gen (Gene tagging) và lập bản đồ gen Chỉ thị ADN cũng cho phép các nhà chọn giống thực vật đặt chính xác các QTL vào bản đồ phân tử Bản đồ đối với tính trạng số lượng (QTL) thường có rất ít thông tin về sự kiểm soát của gen Nhưng nó

vô cùng quan trọng, vì hầu như các tính trạng chống chịu với điều kiện bất lợi đều yêu cầu bản đồ QTL Người ta cần phải quét từ đầu đến cuối bộ genome với những chỉ thị bao phủ toàn bộ các NST, với mật độ trung bình 10cM giữa 2 chỉ thị Thông qua đó, người ta xác định những khu vực giả định có chứa các gen điều khiển tính trạng số lượng mà ta đang nghiên cứu

Những chỉ thị được ứng dụng trong chọn giống cây trồng phải liên kết chặt với gen mục tiêu, trên cơ sở bản đồ di truyền phân tử

Bản đồ di truyền lúa đầu tiên được thiết lập bởi Nagao và Takashuki năm

1963, gồm 12 nhóm liên kết Vào những năm 70 của thế kỷ 20, nhiều nhà di truyền chọn giống đã đề xuất bản đồ di truyền của lúa thiết lập nhờ các thể ba (Trisomic) Sau

đó bản đồ di truyền liên kết ở lúa được thiết lập trên cơ sở các chỉ thị đột biến hình thái

và các chỉ thị izozym (Ishikawa et al, 1991; Wu et al, 1993)

Hiện nay, các nhà khoa học đã xác định có khoảng trên 30 gen chính kháng bệnh bạc lá, 30 gen kháng đạo ôn, trên 20 gen kháng rầy nâu và một số QTL kháng đạo ôn và rầy nâu đã được phát hiện Ngoài ra, nhiều gen và QTL có liên quan đến các tính trạng khác của cây lúa như chịu ngập, hạn, mặn, chịu độc nhôm, chịu thiếu phốt-pho, bất dục đực nhân nhậy cảm quang chu kỳ, bất dục đực nhân nhậy cảm nhiệt độ, gen tương hợp rộng cũng được lập bản đồ phân tử để đưa vào sử dụng trong chọn giống Lưu Thị Ngọc Huyền bằng kỹ thuật AFLP để xác định chỉ thị phân tử liên kết gen kháng rầy nâu ở lúa CR203 Michael J Thomson đã lập bản đồ QTL và bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại tạo giống lúa chống chịu mặn (Thomson 2010) Nguyễn Thị Lan Hoa đã sử dụng các chỉ thị SSR cho đa hình lập bản đồ các

nhóm liên kết genome và xác định vị trí gen kháng bệnh xanh lùn ở cây bông cỏ (Nguyễn Thị Lan Hoa, 2009)

* Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử

Từ lâu, các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết với một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng như một phương tiện hữu ích trong quy trình tạo giống mới Với chỉ thị hình thái các nhà chọn giống phải đánh giá kiểu hình của cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong muốn

Mặt khác chỉ thị hình thái vốn có số lượng không nhiều, những chỉ thị liên kết với gen quan tâm lại càng hiếm gặp vì thế giá trị thực tiễn của chỉ thị hình thái trong chọn giống gặp nhiều hạn chế Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm đến vấn đề chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại -MABC) với ý đồ sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong muốn trong chọn tạo giống mới

Thông thường, trong quy trình chọn tạo giống truyền thống, người ta đưa nguồn gen mới có tính trạng mong muốn vào 1 giống khác bằng phương pháp lai trở lại liên tục qua 5-6 thế hệ, hoặc chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly từ thế hệ

F2 đến các thế hệ tiếp theo Bằng phương pháp này việc đưa gen lặn vào tổ hợp lai, hoặc du nhập cùng một lúc vài gen mong muốn vào một dòng ưu việt thường gặp rất nhiều khó khăn hoặc đôi khi không thể thực hiện được (Mohan et al., 1997) Còn đối với quy trình chọn giống nhờ chỉ thị phân tử, nguồn gen mới nhập được phát hiện gián tiếp thông qua các chỉ thị phân tử liên kết chặt với những gen đó

Nguyên lý của phương pháp MABC là (Marker Assisted Backcross) chuyển một QTL/gen từ dòng cho gen vào dòng nhận gen trong khi chọn lọc sự hội nhập của dòng cho thông qua phần còn lại của hệ gen (Thomson et al 2009; Septiningsih

et al 2009; Singh et al 2009) Việc sử dụng các chỉ thị phân tử cho phép khảo sát di truyền của con lai ở mỗi thế hệ, đẩy nhanh tốc độ của quá trình chọn lọc, vì thế tăng cường nền di truyền qua mỗi thế hệ Theo mô hình của (Jung et al 2010) và (Collard BCY 2008) chỉ cần chọn lọc đến thế hệ BC3 thì tỷ lệ gen của cá thể nhận

có thể đạt 98% hệ gen của các cá thể lai trong quần thể Từ đó có thể thấy rằng đây

là phương pháp thiết thực, hiệu quả trong việc chuyển locus gen quy định tính trạng di truyền số lượng (QTL) hay gen vào giống mới đồng thời rút ngắn quá trình chọn lọc Ưu điểm chính của phương pháp MABC là: (1) Chọn lọc bằng chỉ thị phân tử đối với locus gen đích; (2) Chọn lọc nền di truyền đối với hệ gen cây bố

mẹ tái tổ hợp, (3) Tiến gần đến locus quan tâm trên bản đồ liên kết, và (4) Chọn giống ngẫu nhiên kiểu gen mới với một số tính trạng quan tâm Hiệu quả của các sản phẩm MABC sẽ được thể hiện trên đồng ruộng (Singh et al 2009; Sarkar et al 2009) Chọn lọc MABC có ba bước khi áp dụng:

* Bước thứ nhất: Sử dụng để chọn lọc trực tiếp locus tính trạng mục tiêu, những tính trạng rất khó chọn lọc dựa trên kiểu hình hoặc những tính trạng quy định bởi gen lặn

* Bước thứ hai: Chọn lọc các chỉ thị nằm về hai phía của gen mục tiêu để giảm tối thiểu các gen không mong muốn kéo theo, bước này còn gọi là chọn lọc tái tổ hợp (recombinant selection)

* Bước thứ ba: Chọn lọc bằng chỉ thị phân tử trên các nhiễm sắc thể khác trên các thế hệ con cái lai trở lại đã chọn lọc tính trạng mục tiêu Như vậy chọn lọc lai trở lại nhờ sử dụng chỉ thị phân tử có thể giảm ít nhất là 2 nhưng có thể 3 thậm chí là 4 thế hệ lai trở lại so với chọn lọc lai trở lại truyền thống

Trên thế giới có nhiều nước ứng dụng phương pháp MABC trong chọn giống cây trồng Từ những năm 90 của thế kỷ trước, Australia đã đưa được các QTL điều kiển tính trạng hàm lượng lignin thấp vào giống Bạch đàn phát triển nhanh, tạo ra giống bạch đàn ưu tú cho ngành công nghiệp sản xuất giấy (Brondani, et al, 1998) Tại Thái Lan, một số dự án lớn đã và đang được thực hiện để đưa những gen kháng bệnh vào giống lúa Jasmine là một giống lúa thơm có thương hiệu, nhằm tạo ra giống mới Super Jasmine (Theerayut 2013) IRRI đã thành công trong việc đưa một số gen chống chịu ở các giống lúa hoang dại vào giống lúa trồng, đã lập bản đồ

chính xác QTL liên kết với tính trạng chịu ngập (Sub1) nằm trên nhiễm sắc thể số 9,

và đã thành công đưa vào 6 giống lúa cho vùng ngập bằng phương pháp chọn

giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại Sáu giống lúa được chuyển gen Sub1 là

những giống phổ biến được nông dân trồng ở Nam và Đông Nam châu Á; Swarna, Sambha Mahsuri, IR64, BR11, TDK1 và CR1009, những giống này đã được trồng với diện tích hàng triệu ha, đạt năng suất từ 1-3,5 tấn/ha trong điều kiện ngập hoàn toàn trong giai đoạn lúa con gái Phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC) cũng đã thành công trong việc chọn tạo giống lúa chịu mặn bằng việc chuyển QTL Saltol có khả năng chịu mặn nằm trên nhiễm sắc thể số 1, và đã thành công trên ba giống lúa trồng đại trà BR11, BRRI dhan28 và IR64

Chọn giống bằng chỉ thị phân tử MAS (Marker Assisted Selection): thay vì phải đánh giá kiểu hình của cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong muốn, người ta chỉ cần đi tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thị hình thái liên kết với các gen đó Tuy nhiên các chỉ thị hình thái vốn có số lượng không nhiều, còn những chỉ thị (liên kết với gen quan tâm) lại càng hiếm gặp, vì thế giá trị thực tiễn của chỉ thị hình thái trong chọn giống còn gặp nhiều hạn chế (Lưu Minh

Cúc, 2009) Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, đặc biệt là chỉ thị phân tử, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm nhiều hơn tới vấn đề chọn giống nhờ chỉ thị phân tử MAS (Marker Assisted Selection) với ý đồ sử dụng các chỉ thị phân

tử liên kết với các gen mong muốn trong chọn tạo giống mới Khi lập bản đồ đa gen

đã nêu ra những ưu thế của chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái như sau (Tanksley 1993):

+ Kiểu gen của các locus chỉ thị phân tử có thể được xác định tại bất kỳ giai đoạn nào và ở bất cứ mức độ nào: Tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể, trong khi kiểu hình của phần lớn các chỉ thị hình thái chỉ có thể phân biệt được trong những giai đoạn nhất định và thường ở mức độ toàn bộ cơ thể

+ Số lượng các chỉ thị phân tử là cực kỳ lớn, trong khi số lượng các chỉ thị hình thái rất hạn chế (Tạ Hồng Lĩnh, 2013)

+ Các alen khác nhau của chỉ thị phân tử thường không liên kết với các hiệu ứng có hại, trong khi việc đánh giá các chỉ thị hình thái thường hay đi kèm với những hiệu ứng kiểu hình không mong muốn

+ Các alen của các chỉ thị phân tử phần lớn là đồng trội, vì thế cho phép phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào, còn các alen của các chỉ thị hình thái thường tương tác theo kiểu trội-lặn, do đó bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ hợp lai

+ Đối với chỉ thị hình thái, các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc đánh giá các cá thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly, còn đối với chỉ thị phân

tử, hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp (Tạ Hồng Lĩnh, 2013)

Ngày nay, phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là một phương tiện hữu hiệu, trợ giúp đắc lực cho chọn giống truyền thống nhằm khắc phục những trở ngại mà công tác chọn giống truyền thống rất khó giải quyết Sự phát triển của công nghệ chỉ thị phân tử đã giải phóng các nhà chọn giống khỏi một lượng lớn công việc khi phải chọn lọc, phát hiện một lượng ít ỏi những cá thể quan tâm trong số vô vàn các cá thể khác nhờ việc xác định sự có mặt hay vắng mặt của chỉ thị phân tử liên kết với những alen đặc hiệu mà không cần đánh giá kiểu hình Phương pháp này còn có thể giúp chọn lọc những cá thể mang nhiều tổ hợp gen cần thiết và loại bỏ các nhiễu do các tương tác trong cùng alen hay giữa các alen gây ra - những tương tác này thường không thể phát hiện được bằng các phân tích kiểu hình Phương pháp này đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần đưa gen lặn hoặc thậm chí đưa cùng lúc nhiều gen khác nhau vào một nền gen ưu việt

Như vậy, chỉ thị phân tử làm tăng thêm hiệu quả sàng lọc trong các chương trình chọn giống nhờ cung cấp thêm:

+ Khả năng chọn lọc ngay từ giai đoạn cây con đang nẩy mầm trong khi nhiều dấu hiệu biểu hiện chỉ có thể sàng lọc khi chúng được biểu hiện ở những giai đoạn muộn hơn trong quá trình sống nếu chỉ sử dụng phương pháp chọn giống truyền thống (ví dụ: Chất lượng quả và hạt, tính bất dục đực, khả năng phản ứng chu kỳ quang)

+ Khả năng sàng lọc những dấu hiệu mà việc đánh giá các đặc tính này khó khăn, đắt tiền, tốn thời gian (ví dụ như hình thái rễ, tính kháng hay nhiễm đối với

các dịch hại hoặc đối với những nòi, những bệnh đặc hiệu, hay tính chống chịu những điều kiện gây sốc sinh học như hạn, mặn, các chất độc)

+ Khả năng phân biệt trạng thái đồng hợp hay dị hợp của nhiều locus trong cùng một thế hệ mà không cần kiểm tra thế hệ sau

+ Khả năng chọn lọc đồng thời vài đặc tính trong cùng một thời gian, do vậy

mà có thể đưa vào cùng lúc vài gen có giá trị về mặt nông học, ví dụ đưa vào cùng một lúc nhiều gen kháng dịch hại khác nhau

Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã đưa ra các phương pháp luận và phân tích cặn kẽ một vài mô hình MAS Theo một số mô hình thì chỉ cần tiến hành lai trở lại qua 4 thế hệ, chứ không cần đến 6 thế hệ, ngay cả khi quần thể chọn giống có kích thước nhỏ và các dữ liệu về chỉ thị phân tử bị hạn chế (Frisch etal 1999; Hospital etal 1992) Trong một số trường hợp thuận lợi, đôi khi các nhà chọn giống chỉ cần lai trở lại 3 thế hệ là có thể đạt được mục tiêu của mình

Để đánh giá các giống lúa có mùi thơm Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu đã nghiên cứu di truyền mùi thơm trên lúa và nhận thấy rằng gen mùi thơm được kiểm soát bởi một gen lặn và chỉ thị ADN liên kết với gen mùi thơm từ đó có thể phát hiện thể đồng hợp tử và dị hợp tử ngay từ thế hệ ban đầu (Nguyễn thị Lang và cs, 2004)

Lưu Thị Ngọc Huyền đã dùng chỉ thị SSR để tạo giống lúa thuần kháng rầy nâu cho ĐBSH và ĐBSCL (Lưu Thị Ngọc Huyền, 2010) Lã tuấn Nghĩa cũng sử dụng chỉ thị SSR để tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn có năng suất chất lượng cao (Lã Tuấn Nghĩa, 2011)

1.3 Những nghiên cứu chọn tạo giống lúa năng suất

truyền số lượng, nó là tổ hợp tính trạng như: số hạt chắc trên bông, số bông trên khóm, khối lượng nghìn hạt Những năm gần đây, nhiều QTL/gen quy định tính trạng cấu thành năng suất đã được xác định trên rất nhiều các quần thể từ các tổ hợp lai giữa giống hay các loài phụ QTL/gen năng suất và yếu tố cấu thành năng suất được xác định trên tất cả các nhiễm sắc thể của lúa Ở đây chúng tôi tập hợp lại những kết quả xác định QTL/gen liên kết năng suất và yếu tố cấu thành năng suất trên cây lúa

Trên nhiễm sắc thể số 1: Các nhà khoa học trên thế giới đã xác định được nhiều

tính trạng liên quan đến năng suất trên nhiễm sắc thể số 1 như: Ba QTLs quy định tính trạng khối lượng nghìn hạt tại vị trí gần chỉ thị phân tử RM283-RM259 (Thomson et al 2010), RG690-RM212 (Hittalmani et al 2003), và RG810-RG331 () Một QTL liên kết tính trạng số hạt trên bông tại vị trí chỉ thị phân tử RM1-RM490 (Brondani et al 2002) và một QTL liên kết tính trạng số hạt chắc trên bông

đã được xác định từ các tác giả (Zhuang et al 2002) Một QTL liên kết tính trạng tỷ

lệ đậu hạt tại vị trí RM265-RM315 (Thomson et al 2010)

Nhiễm sắc thể số 2: QTL quy định khối lượng nghìn hạt được xác định tại vị trí chỉ

thị phân tử RM240-RM266 (Ishimaru et al 2003) Ba QTL liên kết tính trạng tổng

số hạt trên khóm, tại các vị trí gần tâm động (Cui et al 2003), vị trí chỉ thị RM263 (Zhuang et al 2002) và vị trí chỉ thị RZ123-RZ446 (Xing et al 2003) Một QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt được xác định tại vị trí chỉ thị phân tử RZ123-RZ446 trên vai dài của nhiễm sắc thể số 2 (Xiao et al 1996) Hai QTLs quy định tính trạng số bông trên khóm được xác định tại vị trí gần tâm động (Kobayashi et al 2003) Hai QTLs liên kết tính trạng năng suất được xác định gần tâm động (Zhuang

et al 1997) và nằm trên vai dài của nhiễm sắc thể 2 (L)

Nhiễm sắc thể số 3: Một số tác giả đã xác định QTL liên kết tính trạng khối lượng

nghìn hạt trên nhiễm sắc thể số 3 Một trong số đó là QTL được xác định tại vị trí tâm động (Yu et al 1997), tác giả Li năm 2004 đã lập bản đồ QTL liên kết tính trạng khối lượng nghìn hạt với khoảng cách 98kb QTL thứ hai được xác định trên nhiễm sắc thể số 3 tại vị trí chỉ thị phân tử RM16-RM168 (Hua et al 2002) QTL thứ ba được xác định trên vai ngắn (Moncada et al 2001) Hai QTLs liên kết tổng

số hạt trên bông trên vai dài của nhiễm sắc thể 3 (Mei et al 2003) Một QTL liên kết số hạt trên bông (Ishimaru et al 2000) Gần chỉ thị phân tử RM282, một QTL cho số hạt chắc trên bông cũng được xác định (Xing et al 2003) Một QTL tỷ lệ đậu hạt được xác định (Xiao et al 1998), Xing et al (2001) đã xác định QTL cho tỷ lệ đậu hạt khác tại vị trí G144-C1087 Bốn QTLs liên kết số bông trên khóm được xác định tại vai dài (Kobayashi et al 2003), CDO337-OSR31 (Xu et al 2004), RZ598-RM16(Thomson et al 2010) và CDO87-RG910 (Hittalmani et al 2003) QTL quy định năng suất cũng được xác định trên vai dài (Thomson et al 2010), RG393-G144 (Hua et al 2003), và RZ329-RZ892 (Venuprasad et al 2002)

Nhiễm sắc thể số 4: Ba QTLs/gen liên kết với tính trạng khối lượng nghìn hạt được

các nhà khoa học xác định hai QTLs tại vị trí gần chỉ thị phântử CDO244-RG864 (Zhuang et al 2002) và một tại vị trí RG143 (Brondani et al 2002) Hai QTLs quy định tổng số hạt trên cây được xác định tại vi trí RM303-RM317 (Hittalmani et al 2002) và RG214-RG620 (Lu et al 1997) Ba QTLs quy định tính trạng số bông trên khóm được xác định bởi các tác giả (Liao et al 2001) Hai QTL quy định tính trạng năng suất tại vị trí gần tâm động (Zhuang et al 2001)

Nhiễm sắc thể số 5: Ba QTLs quy định tính trạng năng suất được xác định trên

nhiễm sắc thể số 5 tại vị trí R1674-RG360 (Hua et al 2003), và gần tâm động liên kết chỉ thị RZ296 (Zhuang et al 1997) Hai QTL quy định tính trạng khối lượng nghìn hạt liên kết chỉ thị phân tử RG360-R3166 trên vai ngắn (Ishimaru 2001) và tại RG13-RG470 (Li et al 1997) Hai QTL quy định tính trạng số hạt trên cây tại

vị trí chỉ thị phân tử RZ556-RG360 (Mei et al 2003) và gần RG13 (Nagata et al 2002) Hai QTL liên kết tính trạng số hạt chắc trên bông tại vị trí RG360-RG182 trên vai ngắn (Li et al 2000) và tại vị trí RM164-C624 trên vai dài (Li et al 2000) Bốn QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt được xác định liên kết chỉ thị phân tử RZ390-RM153 (Thomson et al 2010), RZ296 (Xiao et al 1996) và G366-C624 (Lu et al 1997), tại vị trí chỉ thị phân tử RG435 trên vai dài (Xiao et al 1998) Ba QTLs quy định số bông trên khóm liên kết chỉ thị phân tử RG360-RG9 (Lin et al 1996) và C734B (Kobayashi et al 2003), nằm trên vai dài tại vị trí CDO1083 (Xiao et al 1996)

Nhiễm sắc thể số 6: Ba QTL quy định tính trạng khối lượng nghìn hạt được xác định

một tại vị trí R2869-C226A (Hua et al 2003), một tại C751A-RZ667 (Hua et al 2003)

và một tại R2549-C962 (Hua et al 2003) Ba QTLs quy định tính trạng số hạt trên bông được xác định tại vị trí trên vai ngắn của nhiễm sắc thể số 6, liên kết với chỉ thị phân tử R2869 (Cui et al 2003), và RG138-RM253 (Cui et al 2003), và G122-R2549 (Nagata et al 2002) Tác giả Brondani et al 2002 đã xác định QTLs quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt được xác định liên kết chỉ thị phân tử OG32 Trong khi đó, Thomson

et al (2003) xác định QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt tại vị trí RM276 Ba QTLs

số bông trên khóm được xác định tại vi trí Wx-RG213 ), RM3-CDO78 (Moncada et al 20001), RG653 (Kobayashi et al 2003) Hai QTLs quy định tính trạng năng suất được xác định bởi một số tác giả tại vi trí chỉ thị phân tử RZ398-RM204 (Zhuang et al 2002)

và RG653-G342 (Hua et al 2002)

Nhiễm sắc thể số 7: Ba QTLS quy định tính trạng khối lượng 1000 hạt liên kết chỉ

thị phân tử RG128-C1023 trên vai ngắn (Hua et al 2002), RM125 gần tâm động, và -RZ626 (Brondani et al 2002) Bốn QTLs quy định tính trạng tổng số hạt trên cây được xác định liên kết chỉ thị phân tử RG128-RG528 (Cui et al 2002), C1023-R1440 gần tâm động (Xing et al 2003), RM336-R1245 (Xing et al 2003), và RM234-R1789 (Xing et al 2003) Ba QTL quy định tính trạng số hạt chắc trên bông được xác định liên kết chỉ thị RG128-C1023 trên vai ngắn (Xing et al 2003), C1023B-R1440 gần tâm động (Hua et al 2002), RZ471-RZ624 (Hua et al 2002)

Ba QTLs quy định tỷ lệ đậu hạt được xác định tại vị trí gần tâm động trên vai ngắn (Xiao et al 1996), RG650-C285 (Lu et al 1997), và gần chỉ thị STSG3 trên vai dài (Brondani et al 2002).Hai QTLs quy định tỷ lệ đậu hạt liên kết chỉ thị phân tử R2401 tại vị trí gần tâm động (Kobayashi et al 2003), RZ471-RM234 (Thomson et

al 2010) QTLs quy định tính trạng năng suất được xác định tại vị trí chỉ thị phân tử

RG128-C1023 trên vai ngắn (Yu et al 1997) Ghd7 là gen quy định tính trạng tăng

số hạt trên bông đã được phát hiện từ giống lúa Minghui 63 Ghd7 nằm gần tâm động, trên nhiễm sắc thể số 7 Ghd7 làm tăng (65.8%) số hoa trên bông trên giống Zhenshan97 Gpa7 được phát hiện từ giống lúa hoang O Rufipogon.Gpa7 làm tăng

số hạt trên bông trên giống lúa IndicaGuichao 2 Gw9.1 là QTL liên kết tính trạng

tăng khối lượng 1000 hạt, đã được phát hiện từ lúa hoang Oryza Rufipogon Gw9.1 được phát hiện nằm trên nhiễm sắc thể số 9 Gw11 liên kết tính trạng khối lượng

hạt, đã được các nhà chọn giống ở trường đại học tổng hợp quốc gia Chungnam

Hàn Quốc phát hiện từ giống lúa hoang O grADNiglumis

Nhiễm sắc thể số 8: QTLs quy định tính trạng khối lượng nghìn hạt liên kết chỉ thị

phân tử C1121-RZ562 gần tâm động (Redona et al 1996) Bốn QTLs quy định số hạt chắc trên bông được xác định liên kết chỉ thị phân tử RG333-C1121 (Hua et al 2003), RM25-RG978 (Xiao et al 1998), RM210-RZ66 (Zhuang et al 1997), và CDO99 (Xiao et al 1998) Hai QTLs quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt liên kết chỉ thị phân tử RM25 (Xiao et al 1998), RZ28 (Xiao et al 1996) Một QTLs quy định tính trạng số bông trên khóm liên kết chỉ thị phân tử RM210 (Brondani et al 2002) Hai QTLs quy định tính trạng năng suất được xác định tại vị trí gần tâm động (Li et

al 2000) và một tại vị trí liên kết chỉ thị phân tử RZ66-RG598 (Zhuang et al 1997)

Nhiễm sắc thể số 9: Một QTL quy định tính trạng khối lượng nghìn hạt liên kết chỉ

thị phân tử RM257-RG667 (Hua et al 2002) Một QTL quy định tính trạng tổng số hạt trên bông được xác định tại vị trí chỉ thị phân tử RM422-RM215 (Xiao et al 1998) Bốn QTLs quy định tính trạng hạt chắc trên bông được xác định tại vị trí RM215 (Thomson et al 2003) Một QTL quy định tính trạng số bông trên khóm tại

vị trí RG667-RM404 (Liao et al 2001) Ba QTLs quy định tính trạng năng suất liên kết chỉ thị phân tử C1232-R1164 và RM219-RZ698 (Hua et al 2003), và một tại vị trí RZ12-RM215 (Hua et al 2002)

Nhiễm sắc thể số 10: Bốn QTLs quy định tính trạng khối lượng nghìn hạt liên kết

chỉ thị phân tử C153A-RM222 trên vai ngắn nhiễm sắc thể 10 (Hua et al 2003), RG257-RM311 (Ishimaru 2001), RG241-RZ500 (Hittalmani et al 2003), và RM561-C371 (Hua et al 2002) Hai QTLs quy định tính trạng tổng số hạt trên cây liên kết chỉ thị phân tử RM239-RZ561 (Cui et al 2002), C405-C371 trên vai dài (Xiao et al 1996) Một QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt liên kết chỉ thị phân tử RM147 (Xiao et al 1996) Hai QTLS quy định tính trạng số hạt chắc trên bông liên kết chỉ thị phân tử RZ892-RZ561 (Xiao et al 1996), C677-RG134 (Liao et al 2001) Hai QTLs quy định tính trạng độ dài hạt hạt liên kết chỉ thị phân tử RG257-RG241 (Xiao et al 2003; Zhuang et al 2002) và RM228

Nhiễm sắc thể số 11: Ba QTLs quy định tính trạng khối lượng nghìn hạt liên kết chỉ

thị phân tử RM20B-RM167 trên vai ngắn nhiễm sắc thể số 11 (Brondani et al 2002), G44-G257 (Moncada et al 2001) và RG103-RZ536 (Moncada et al 2001) Một QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt liên kết chỉ thị phân tử RM224 (Xu et al 2004) Ba QTLs quy định tính trạng số hạt trên bông liên kết chỉ thị phân tử RM20-C104 (Hua

et al 2003), RZ537-RZ900 (Moncada et al 2001), và RM254-C950 (Thomson et al 2010) Một QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt liên kết chỉ thị phân tử RM286 (Xing et al 2003)

Nhiễm sắc thể số 12: Hai QTLs quy định tính trạng khối lượng nghìn hạt liên kết

chỉ thị phân tử R887-G1128a (Hua et al 2002), RM235 (Thomson et al 2010) Hai QTLs quy định tính trạng tổng số hạt trên cây liên kết chỉ thị phân tử RG574 (Xiao

et al 1996) và RG341 hay RG869 (Zhuang et al 1997) Ba QTLs quy định tính trạng số hạt trên bông được xác định liên kết chỉ thị phân tử RM20A-C732B (), RG869 (Thomson et al 2010), CDO459-RG235 (Xiao et al 1998)

1.3.2 Tại Việt Nam

Những nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống (như kỹ thuật chuyển gen, kỹ thụât sinh học phân tử ) thực tế đã được triển khai từ những năm cuối của thế kỷ trước tại một số viện nghiên cứu và trường đại học Tuy nhiên, các

kỹ thuật công nghệ này mới thực sự phát triển và được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu vào những năm gần đây Phần lớn các nghiên cứu xác định chỉ thị liên kết gen và lập bản đồ gen của các tác giả Việt Nam được tiến hành trên đối tượng cây lúa trong khuôn khổ các dự án nghiên cứu và dự án hợp tác quốc tế Nghiên cứu

về đa dạng di truyền và lập bản đồ gen, QTLs bằng việc sử dụng chỉ thị RAPD, RGA, SSR, AFLP, RFLP là những công cụ hữu hiệu trợ giúp đắc lực cho chọn giống truyền thống Việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong việc đánh giá nguồn gen và vật liệu phục vụ chọn tạo giống cũng được triển khai và thu được những kết quả tốt

Một số công trình nghiên cứu sử dụng chị thị phân tử để phát hiện gen kháng bệnh và lập bản đồ gen kháng đối với một số cây trồng chính, trong đó có nghiên cứu về gen kháng bệnh bạc lá đối với cây lúa đã được triển khai tại một số viện nghiên cứu và trường đại học trong nước (Học viện Nông nghiệp, Viện Di truyền

NN, Viện công nghệ sinh học, Viên lúa ĐBSCL ) Nghiên cứu đầu tiên của Viện nghiên cứu lúa ĐBSCL và Viện KHKTNN Miền nam về phân tích di truyền tính kháng rầy nâu của giống lúa hoang nhờ chỉ thị phân tử Các nhà nghiên cứu đã xác

định được hai gen mới kháng rầy nâu ở một loài lúa dại (O officinalis) định vị trên

NST số 3 và số 7 liên kết với 2 chỉ thị tương ứng là RM168 và RM18 Tiếp theo là nghiên cứu xác định gen kiểm soát tính trạng kháng đạo ôn và rầy nâu ở lúa bằng kỹ thuật AFLP, trong đó các tác giả đã tìm được một số chỉ thị AFLP liên kết với tính kháng rầy nâu và đạo ôn ở hai dòng lúa nghiên cứu Năm 2011, đề tài nghiên cứu tại trung tâm Tài nguyên Thực vật do Lã Tuấn Nghĩa và cộng sự đã quy tụ, chọn lọc

được dòng lúa mang cả hai gen kháng bệnh đạo ôn P1-1 và P1-5 qua sử dụng chỉ

thị phân tử liên kết với các gen để chọn lọc Để phục vụ cho chương trình nghiên cứu lúa lai tại Việt Nam, nghiên cứu lập bản đồ gen kiểm soát tính bất dục đực nhạy cảm nhiệt độ cũng đã được tiến hành Các tác giả thuộc Viện Di truyền NN đã tìm

được bốn chỉ thị phân tử AFLP liên kết gen tgms-vn1(gen bất dục đực nhân nhạy cảm với nhiệt độ) với khoảng cách gần nhất là 3,5cM trên vai ngắn của NST số 2

của hệ gen lúa Việc lập bản đồ các QTLs liên quan đến tính chịu mặn, chịu độc nhôm, chịu hạn ở lúa cũng đã được tiến hành nghiên cứu Một số nghiên cứu khác

về ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bạc lá, và đã có một số dòng kháng có triển vọng được tạo ra bằng kỹ thuật này Lưu Thị Ngọc Huyền và

cs năm 2003 đã lập bản đồ phân tử cho 3 gen kháng rầy nâu bphX, bph4, Bph6 và

phát hiện được một loạt chỉ thị phân tử SSR liên kết gần với các gen kháng đó Ngoài ra, Nguyễn Thị Lang với cộng tác của các tác giả thuộc IRRI đã thành công

trong việc lập bản đồ gen kháng Bph10 – 1 gen kháng tốt đối với quần thể rầy nâu

thuộc đồng bằng Sông Cửu Long Liên quan đến các công trình công bố về ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa chống chịu mặn, Vương Đình Tuấn và

cs năm 2000 đã báo cáo về lập bản đồ xác định vị trí của gen di truyền về số lượng ảnh hưởng tính chống chịu mặn của cây lúa Tác giả xác định 3 chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymophism) là R1928, R674 và G257 có liên kết với các QTL điều khiển tính chống chịu mặn trên các nhiễm sắc thể số 1, 6 và 11

theo thứ tự

Năm 2000 Bùi Chí Bửu và cs đã sử dụng 30 SSR chỉ thị để lập bản đồ gen cho tính chống chịu mặn của quần thể F3 gồm 257 cá thể phân ly, phát triển từ tổ hợp lai IR28 /Đốc Phụng Các tác giả xác định 10 SSR chỉ thị cho thể đa hình của các sản phẩm PCR giữa các cá thể phân ly và bố mẹ Tuy nhiên chỉ có chỉ thị RM223 liên kết với gen chống chịu mặn với khoảng cách 6,3 cM trên nhiễm sắc thể

số 8 RM223 nhân bản đoạn ADN kích thước 120 bp, liên kết với gen chống chịu mặn Từ giống Đốc Phụng và sản phẩm PCR có kích thước 160 bp từ giống nhiễm IR28 Nguyễn Thị Lang và cộng sự năm 2001 đã báo cáo chỉ thị OSR1 và RM315 liên kết với QTL cho tính chống chịu mặn ở lúa, định vị trên nhiễm sắc thể số 1 Chỉ thị RM223 liên kết với gen chống chịu mặn với khoảng cách di truyền là 6,3

cM trên nhiễm sắc thể số 8 ( Bùi Chí Bửu, 2001) Thực tế cho thấy số lượng của các nghiên cứu này chưa nhiều, đặc biệt là những nghiên cứu về năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất nhưng Việt Nam hoàn toàn có khả năng thực hiện những nghiên cứu về sinh học sử dụng các phương pháp công nghệ hiện đại nhằm đẩy mạnh công tác chọn tạo giống vật nuôi và cây trồng trong nước

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Các giống lúa nghiên cứu

- Hai giống lúa bố mẹ được sử dụng cho nghiên cứu do viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp là:

+ Giống lúa KD18 được sử dụng làm giống nhận QTL/gen

+ Giống KC25 là giống cho QTL/gen được nhập nội từ một số Viện nghiên cứu lúa quốc tế

2.1.2.Các chỉ thị phân tử và hóa chất thí nghiệm

61 chỉ thị phân tử SSR, hóa chất, vật tư chuyên dụng sử dụng trong nghiên cứu được bộ môn Sinh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp

Bảng 2.1 Các chỉ thị cho đa hình giữa giống KD18 x KC25 tại vị trí QTL/gen

Kích thước

Kích thước

2.2 Nội dung nghiên cứu

1 Lai tạo quần thể F1, BC1F1, BC2F1 của tổ hợp lai KD18 x KC25

2 Sử dụng chỉ thị phân tử đa hình tại vị trí QTL/gen quy định tính trạng tăng

số hạt/bông để xác định các cá thể trong quần thể BC1F1, BC2F1 mang QTL/gen nghiên cứu

3 Sử dụng các chỉ thị đa hình trên 12 NST xác định cá thể có nền di truyền cao nhất giống KD18 trong số các cá thể BC1F1, BC2F1 mang QTL/gen

4 Sử dụng chỉ thị phân tử đa hình tại vị trí QTL/gen xác định cá thể trong quần thể BC2F2 mang QTL/gen đồng hợp tử với KC25

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lai hữu tính - lai trở lại giữa giống cho và nhận QTL/gen

Phương pháp lai hữu tính đối với các giống lúa cho và nhận QTL/gen tăng số hạt trên bông Kết hợp với phương pháp lai trở lại để chọn lọc và làm thuần nhanh những dòng mang QTL/gen tăng số hạt trên bông và nền gen tối đa của giống nhận gen

KD18 được chọn làm cây mẹ và KC25 được chọn làm cây bố để lai tạo con lai F1, sử dụng phương pháp lai hữu tính (thụ phấn bằng tay) Hoa lúa chưa tung phấn của cây KD18 được khử đực bằng cách cắt bỏ 6 nhị trong mỗi hoa, sau đó lấy hạt phấn của cây KC25 thụ phấn cho cây KD18, sau 30 ngày thu hạt lai F1

Các hạt lai F1 được trồng đến khi được 20 ngày tuổi thì tiến hành tách chiết ADN, kiểm tra sự có mặt của gen tăng số hạt trên bông bằng chỉ thị phân tử Chọn lọc các cá thể dị hợp tử mang QTL/gen tăng số hạt trên bông để lai trở lại với giống KD18 (làm bố) tạo quần thể BC1F1 Các cá thể BC1F1 được trồng, tách chiết ADN, kiểm tra sự có mặt của gen tăng số hạt trên bông và chọn lọc nền gen của cây mẹ bằng chỉ thị phân tử Chọn những cá thể mang gen tăng số hạt trên bông và có nền

di truyền lớn nhất của giống KD18 để lai trở lại với dòng nhận gen tạo BC2F1 Tiếp tục các công việc như từ thế hệ BC1F1 đến thế hệ BC3F1 có thể lai thêm

1 thế hệ nữa hoặc cho tự thụ để chọn cá thể đồng hợp tử mang QTL/gen tăng số hạt trên bông, chọn được dòng mang QTL/gen tăng số hạt trên bông và mang phần trăm lớn nhất nền gen của cây mẹ

Quy trình chọn giống nhờ chỉ thị phân tử bằng phương pháp lai trở lại

Hình 2.1: Các bước thí nghiệm trong chọn tạo giống lúa tăng số hạt trên bông

bằng phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử và lai trở lại