nghiên cứu chọn tạo giống cà chua chín chậm, kháng virus xoăn vàng lá và mốc sương bằng chỉ thị phân tử dna

1.1 Tổng quan về bệnh mốc sương và chọn tạo giống cà chua kháng bệnh mốc sương 4 1.1.2 Nguyên lý di truyền và chọn tạo giống cà chua kháng bệnh mốc sương 9 1.2 Tổng quan về các đột biến

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

HOÀNG THỊ LAN ANH

NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG CÀ CHUA CHÍN CHẬM, KHÁNG VIRUS XOĂN VÀNG LÁ VÀ MỐC SƯƠNG

BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

HOÀNG THỊ LAN ANH

NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG CÀ CHUA CHÍN CHẬM, KHÁNG VIRUS XOĂN VÀNG LÁ VÀ MỐC SƯƠNG

BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS PHAN HỮU TÔN

HÀ NỘI, NĂM 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan tất cả số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận này là khách quan, trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong khóa luận đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 11 tháng 6 năm 2015

Tác giả

Hoàng Thị Lan Anh

& Công nghệ sinh học ứng dụng, Khoa công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã rất nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, anh

em, bạn bè đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 11 tháng 6 năm 2015

Tác giả

Hoàng Thị Lan Anh

1.1 Tổng quan về bệnh mốc sương và chọn tạo giống cà chua kháng bệnh mốc sương 4

1.1.2 Nguyên lý di truyền và chọn tạo giống cà chua kháng bệnh mốc sương 9 1.2 Tổng quan về các đột biến chín chậm và ứng trong dụng chọn giống chín chậm 13

1.2.2 Các đặc tính của cây đồng và dị hợp tử tại locus rin, nor và alc 16 1.2.3 Các thành tựu tạo giống cà chua chín chậm sử dụng các đột biến rin, nor và alc 25 1.3 Nghiên cứu về bệnh xoăn vàng lá và chọn tạo giống cà chua kháng TYLCV 26

1.3.2 Nghiên cứu về gen kháng chọn tạo giống cà chua kháng virus xoăn vàng lá 26

2.3.1 Phương pháp đánh giá các đặc điểm nông sinh học, năng suất, chất lượng quả 31

2.3.3 Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các THL 35

2.3.5 PCR xác định gen chín chậm rin và các gen kháng Ty1, Ty2, Ty3 và Ph-3 35

3.1 Đánh giá đặc điểm nông sinh học, năng suất, chất lượng của các THL 388

3.1.4 Kết quả đánh giá về cấu trúc chùm hoa, đặc điểm nở hoa và tỷ lệ đậu quả 41 3.1.5 Kết quả đánh giá về năng suất và các yêu tố cấu thành năng suất 44

3.1.7 Đánh giá tính chín chậm và thời gian bảo quản quả của các THL 50

3.2 Chọn lọc cá thể cà chua mang gen Ty1, Ty2, Ty3, Ph3 và rin từ quần thể

3.2.4 PCR xác định các cá thể có gen kháng xoăn vàng lá Ty-2 và Ty-1 60

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

TYLCV Tomato yellow leaf curl virus

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả đánh giá kiểu hình sinh trưởng, các giai đoạn sinh trưởng và một số

đặc điểm hình thái cấu trúc cây của các tổ hợp lai F1 vụ đông 2015 40 Bảng 3.2 Đặc điểm nở hoa, cấu trúc chùm hoa và tỷ lệ đậu quả của các THL 43 Bảng 3.3 Kết quả đánh giá về năng suất và các yêu tố cấu thành năng suất của

Bảng 3.4 Kết quả đánh giá một số đặc điểm hình thái quả của các THL 47 Bảng 3.5 Kết quả đánh giá một số đặc điểm chất lượng quả của các THL 49

Bảng 3.7 Khả năng kháng virus ToLCHnV của các THL cà chua nghiên cứu 53 Bảng 3.8 Kết quả lây nhiễm nhân tạo đánh giá khả năng kháng bệnh mốc sương

Bảng 3.12 Các cá thể mang gen Ty-2 chọn được bằng cặp mồi T0302 F/Ty2R1 61

Bảng 3.14 Kết quả xác định kiểu gen Ph-3, Ty-3, Ty-2, Ty-1 và rin của các cá thể 63 Bảng 3.15 Một số đặc điểm hình thái và thời gian sinh trưởng của cá cá thể 64 Bảng 3.16 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các cá thể 65 Bảng 3.17 Một số đặc điểm hình thái và chất lượng quả của các cá thể 66

Hình 3.4 Kết quả PCR phát hiện các cá thể có gen Ty-3 bằng cặp mồi P6-25F2/R5 58 Hình 3.5 Ảnh điện di phát hiện gen rin ở một số cá thể bằng cặp mồi rinF/R 59 Hình 3.6 Ảnh điện di một số cá thể bằng chỉ thị T0302 phát hiện gen Ty-2 61 Hình 3.7 Ảnh điện di một số cá thể bảng chỉ thị TG97 phát hiện gen Ty1 62

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cà chua (Solanum lycopersicum) là loại rau ăn quả quan trọng ở nước ta Ở

miền Bắc, cà chua chủ yếu được trồng từ tháng 9 đến tháng 3 năm sau và thu hoạch

từ tháng 11 đến cuối tháng 5 Giá bán cà chua thời gian này thường rất thấp, người sản xuất thu được ít lợi nhuận Trong khi đó, từ tháng 6 - 10 nhu cầu sử dụng cà chua lại rất cao, giá bán có thể tăng gấp 2 - 3 lần so với thời điểm chính vụ Vì thế

đã có một số biện pháp kỹ thuật nhằm rải vụ như trồng sớm hoặc muộn, trồng trong nhà lưới hay dùng giống chịu nóng Tuy nhiên, các giống đang trồng hiện nay chưa

có giống nào có đặc tính chín chậm, vì thế vẫn phải thu đến đâu bán ngay đến đó, thời gian rải vụ không dài Hiện có nhiều nước trên thế giới đã chọn tạo được nhiều giống cà chua chín chậm nhờ sử dụng các dạng đột biến chín chậm hoặc không chín

như dạng đột biến chín chậm alc (alcobaca), ức chế sự chín rin (ripening inhibitor), đột biến không chín nor (non-ripening) và không bao giờ chín Nr (Never-ripening)

(Foolad, 2007; Garg et al., 2008) Những đột biến này có tác dụng làm chậm quá trình chín và sự mềm hóa của quả, giúp quả có thể bảo quản được lâu trong điều kiện bình thường, vận chuyển được xa và chống thối tốt (Foolad, 2007; Garg et al., 2008; McGlasson et al., 1983) Chọn tạo được giống chín chậm sẽ cho phép ta trồng chính vụ khi thời tiết thuận lợi, cho năng suất và chất lượng cao, sau đó thu hoạch

và bảo quản được lâu, khi nhu cầu tiêu thụ tăng thì xử lý ethylene làm quả chín rồi bán với giá cao Trồng giống chín chậm còn giúp người trồng chủ động trong thu hái, quả cứng và chống thối tốt cho phép vận chuyển thuận lợi và hạn chế thất thoát sau thu hoạch

Bên cạnh đó, cà chua bị rất nhiều loại bệnh gây hại, trong đó bệnh xoăn vàng lá

do một số loài virus thuộc chi Begomovirus và bệnh mốc sương do nấm Phytophthora

infestant gây ra đang là các bệnh gây hại nghiêm trọng nhất Hai bệnh này được cho là những tác nhân chính gây suy giảm năng suất cà chua trên khắp thế giới Sử dụng giống cà chua kháng là biện pháp hiệu quả nhất để phòng chống các bệnh này Đến nay, các nhà khoa học trên thế giới đã xác định được 5 gen kháng virus xoăn vàng lá và

3 gen kháng bệnh mốc sương khác nhau Các gen kháng bệnh xoăn vàng lá gồm gen

Ty1 (Zamir et al., 1994) và Ty3 (Ji and Scott, 2006) nằm trên nhiễm sắc thể 6, gen Ty2 nằm trên nhiễm sắc thể 11 (Hanson et al., 2006), gen Ty4 nằm trên nhiễm sắc thể 3 (Ji

et al., 2008) và gen Ty5 nằm trên nhiễm sắc thể 4 (Anbinder et al., 2009a) Các gen kháng mốc sương gồm gen Ph-1 nằm trên nhiễm sắc thể 7 (Cleyberg et al.,1965), gen Ph-2 nằm trên nhiễm sắc thể số 10 (Moreau và cộng sự, 1998) và gen Ph-3 trên

nhiễm sắc thể 9 (Chunwongse et al., 2002) Tuy nhiên, gen kháng Ph-1 chỉ kháng được chủng T0, gen Ph-2 chỉ kháng được chủng T1 Trong khi đó, gen Ph-3 có khả

năng kháng một loạt các chủng P.infestans khác nhau, vượt trội hơn so với gen

Ph-1 và Ph-2 (Kim and Mutschler, 2005)

Các chỉ thị phân tử liên kết chặt với các gen kháng xoăn vàng lá Ty1, Ty2, Ty3

(Castro et al., 2007; Garcia et al., 2007; Ji et al., 2007a; Zhang, 2010) và gen kháng

mốc sương Ph-3 (Hung et al., 2012) đã được phát triển và sử dụng trong chọn giống

giúp giúp cho việc chọn tạo giống kháng cũng như quy tụ nhiều gen kháng trở nên thuận lợi và dễ dàng hơn

Mặc dù nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để chọn tạo các giống cà chua mang các tính trạng quý như tính chín chậm, tính kháng virus xoăn vàng lá cũng như tính kháng mốc sương Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào công bố về việc chọn tạo thành công giống cà chua mang đồng thời cả 3 tính trạng kể trên Việc chọn tạo được các dòng, giống cà chua vừa có khả năng chín chậm, vừa kháng cả hai bệnh mốc sương và xoăn vàng lá sẽ mang lại hiệu quả rất thiết thực cho người sản xuất cũng như người tiêu dùng

Thời gian vừa qua, trung tâm bảo tồn và phát triển nguồn gen cây trồng đã lai và chọn tạo ra được một loạt các dòng cà chua mang đồng thời khả năng kháng bệnh xoăn vàng lá và mốc sương Tuy nhiên, các dòng này chưa có khả năng chín chậm Với mong muốn tạo ra được các giống cà chua lai cũng như các dòng thuần vừa chín chậm, vừa kháng cả hai bệnh xoăn vàng lá và mốc sương, chúng tôi tiến

hành đề tài “Nghiên cứu chọn tạo giống cà chua chín chậm, kháng virus xoăn

vàng lá và mốc sương bằng chỉ thị phân tử DNA”

2 Mục đích và yêu cầu

Mục đích

- Đánh giá sơ bộ đặc điểm một số tổ hợp cà chua lai F1 có gen ức chế sự

chín rin, gen kháng bệnh xoăn vàng lá và gen kháng mốc sương nhằm chọn ra các

THL có năng suất và chất lượng cao để đưa vào sản xuất

- Sử dụng các chỉ thị phân tử DNA chọn ra các cá thể tốt mang đồng thời

gen rin, Ty1, Ty2, Ty3 và Ph-3 nhằm gây tạo dòng cà chua thuần mang đồng thời cả

3 tính trạng kể trên từ quần thể phân ly 331/1219 F2

Yêu cầu của đề tài

- Đánh giá được đặc điểm nông sinh học, năng suất, chất lượng, khả năng

chín chậm, kháng xoăn vàng lá và mốc sương của 40 THL F1

- Sử dụng các chỉ thị phân tử DNA để chọn lọc được các cá thể có năng suất

cao, có gen ức chế sự chín rin, các gen kháng virus xoăn vàng lá Ty1, Ty2, Ty3 và gen kháng mốc sương Ph-3 từ quần thể phân ly 331/1219 F2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về bệnh mốc sương và chọn tạo giống cà chua kháng bệnh mốc sương

1.1.1 Các nghiên cứu về bệnh mốc sương do nấm P infestans

1.1.1.1 Nguyên nhân và tầm quan trọng của bệnh

Phytophthora infestans thuộc lớp nấm trứng (Oomycetes), bộ nấm mốc sương (Peronosporales), lớp nấm này thuộc một giới khác với giới nấm thật (true fungi), thực vật, động vật và sinh vật tiền nhân Một số tác giả cho rằng lớp nấm trứng thuộc về giới Protoctista một số khác thì cho rằng nó thuộc giới Chromista

Nấm Phytophthora festans (Mont.) De Bary (Oomycota, Stramenopiles) lần

đầu tiên được biết đến gây ra bệnh mốc sương ở Philadelphia và thành phố New York trên cây khoai tây (Solanum tuberosum) vào năm 1843 Do thời tiết, gió mang các túi bào tử nấm sang các nước láng giềng (Reader, 2008) Đến năm 1845, bệnh mốc sương đã được tìm thấy từ llinois đến Nova Scotia và từ Virginia tới Ontario Các bệnh sau đó vượt qua Đại Tây Dương với một lô hàng hạt giống khoai tây bị nhiễm bệnh từ Hoa Kỳ đến châu Âu, gây hại chủ yếu cho nông dân Bỉ vào năm

người di cư đến New York (Vanhaute et al., 2006) Sự lây lan tiếp tục của P

infestans trong những năm tiếp theo dẫn đến làm cho bệnh mốc sương trở nên phổ biến trên toàn thế giới vào đầu thế kỷ XX với sự tàn phá toàn cầu trên cây khoai tây

và cà chua (Ingram and Williams, 1991)

Khi môi trường trồng khoai tây hoặc cà chua bị nhiễm P infestans, toàn bộ

cây trồng có thể bị tàn phá trong vòng 7-10 ngày (Fry, 2008) Thiệt hại kinh tế có thể ở dạng làm giảm năng suất, chất lượng (như khối lượng riêng thấp), khả năng bảo quản lưu trữ củ, quả giảm đi, và tăng chi phí tiêu diệt nấm gây bệnh Thiệt hại

năng suất khoai tây hiện nay gây ra bởi bệnh mốc sương đạt 6,7 tỉ đô la Mỹ/năm (4,28,60) tùy theo mức độ nghiêm trọng của bệnh, loại giống, và sử dụng các biện pháp quản lý bệnh Trong năm 2009, tại Hoa Kỳ, tổng thiệt hại trên khoai tây xấp xỉ 3,5 tỷ USD, trong khi tổng sản lượng suy giảm trong cà chua tươi và cà chua chế biến đạt tương ứng 46 và 66 triệu USD Trong số đó, có đến một nửa nguyên nhân gây ra tổn thất kể trên là do bệnh mốc sương (Haverkort and Struik, 2009)

Mặc dù trên thực tế nấm gây bệnh được coi là loài ký sinh chuyên tính và có

phổ ký chủ hẹp, song Phytophthora infestans đã được ghi nhận là gây bệnh trên

nhiều loài cây Erwin và Ribeiro (1996) đã liệt kê ra 89 loài ký chủ mà

Phytophthora infestans có khả năng gây hại Trong đó, hai loài ký chủ chính có ý nghĩa quan trọng trong sản xuất nông nghiệp phải kể đến là cây cà chua

(Lycopersicon esculentum) và cây khoai tây (Solanum tuberosum) Ngoài ra,

Phytophthora infestans còn có thể ký sinh gây hại trên ký chủ phụ là các cây cà dại

thuộc Solanum

1.1.1.2 Đặc điểm sinh sản của nấm P infestans

Sự phát triển mạnh mẽ của P infestans là nhờ cách thức sinh sản rất hiệu quả

của nó với cả hai hình thức sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính Trong hình thức

sinh sản vô tính, P infestans tạo ra hàng ngàn bọc bào tử trên mỗi vết bệnh, đây là

là những cấu trúc vô định hỗ trợ sự phát tán của bọc bào tử trong không khí bằng cách sử dụng chuyển động thụ động của gió, mưa (Cohen et al., 1997) Bọc bào tử

có thể nảy mầm trực tiếp ở nhiệt độ trên 15°C và nhanh chóng phát triển thành hệ sợi nấm và các cành bọc bào tử tiếp theo trên lá, thân, và mô quả (Mayton et al., 2000) Ở nhiệt độ thấp, các cành bọc bào tử bỏ qua giai đoạn tăng trưởng sợi nấm bằng cách hình thành và phát tán trực tiếp du động bào tử (bào tử vô tính), sau đó nảy mầm và gây tiếp tục gây nhiễm với tốc độ thậm chí còn nhanh hơn (Walker and

West, 2007) Tùy thuộc vào điều kiện môi trường, vòng đời của P infestans có thể

ngắn hơn và toàn bộ chu kỳ lặp đi lặp lại trong 5-7 ngày

P infestans là loài nấm dị tản (heterothallic) có hai kiểu ghép cặp (matin type) là A1 và A2 Sự sinh sản hữu tính của nấm phần lớn xảy ra ở các vùng lạnh

ẩm và phải có đủ cả 2 kiểu ghép cặp A1, A2 Khi có sự kết hợp giữa A1 và A2, bào

tử trứng được hình thành, cơ quan sinh sản trên sợi nấm là bao trứng (Oogonium),

và bao đực (Antheridium) Sau khi phối giao nhân của bao đực dồn sang bao trứng thụ tinh hình thành bào tử trứng lưỡng bội (Oospore) với kích thước khoảng 31 x 50

µm Bào tử trứng là bào tử có vách dày lớn cho phép nó tồn tại trong thời gian dài ở tàn dư thực vật hoặc trong đất, hoặc trên hạt giống, đặc điểm này không có ở các bào tử vô tính (Judelson, 1997)

Cho đến gần đây, chỉ có các kiểu ghép cặp A1 được phát hiện tại các vùng trồng khoai tây và cà chua bên ngoài Mexico, điều đó cho thấy sinh sản hữu tính không đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ bệnh Tuy nhiên, khi tìm kiếm lại một cách tỷ mỉ, người ta đã quan sát thấy cả hai dạng hữu tính trong nhiều cánh đồng sản xuất tại Hoa Kỳ và trên toàn thế giới (Fry et al., 1993; Sujkowski et al., 1994 )

Sự có mặt của cả hai dạng hữu tính cho phép xảy ra sự tái tổ hợp hữu tính và tạo ra các chủng mới có thể có độc tính cao hơn Do đó, việc kiểm soát bệnh mốc sương là không thể thiếu Các phương pháp phổ biến được sử dụng để chống bệnh bao gồm thay đổi tập quán trồng trọt, thuốc diệt nấm, và sử dụng các giống kháng (Black et al., 1996b) Trong đó, việc phát triển và sử dụng các giống kháng là vô cùng cần thiết và

có vai trò đặc biệt quan trọng trong công tác kiểm soát và phòng chống bệnh

1.1.1.3 Tổng quan về sự phát sinh và phát triển của P infestans

P infestans sử dụng một chế độ lây nhiễm hai bước Ở giai đoạn đầu, các tác nhân gây bệnh cần có tế bào ký chủ sống và thu các chất dinh dưỡng thông qua sự phát triển của các giác mút, sau đó gây hoại tử rộng mô tế bào cây chủ dẫn đến xâm

lấn hoàn toàn và hình thành bào tử Vòng đời của P infestans liên quan đến sự biệt

hóa thành 11 loại tế bào khác nhau Các loại tế bào được chuyên hóa cho các giai đoạn trong chu kỳ sống liên quan đến sinh sản hữu tính và vô tính, phát tán bào tử, bào tử nảy mầm, xâm nhập cây chủ, và các giai đoạn lây nhiễm ký sinh (biotrophic) hoặc hoại sinh (necrotrophic) (Avrova et al., 2003 )

Các giai đoạn đầu của triệu chứng bệnh dễ dàng bỏ qua do không phải tất cả các cây bị ảnh hưởng cùng một lúc Triệu chứng nhiễm bệnh đầu tiên, bao gồm các

tổn thương nhỏ trên lá và thân cây, các vết bệnh có thể nhìn thấy được chỉ sau 3-4 ngày, và trong một số trường hợp chỉ đạt đường kính 1-2 mm Sau đó, các vết tổn thương tăng nhanh kích thước và mốc trắng xuất hiện ở mặt dưới lá Toàn bộ cây nhiễm bệnh có thể bị phá hủy chỉ trong 5-10 ngày

1.1.1.4 Sự phát sinh của P infestans ở cấp độ tế bào

Việc hình thành các bào tử trứng giữa 2 dạng hữu tính A1 và A2, có thể dẫn đến việc tạo ra các dòng vô tính độc hơn (Gavino et al., 2000).Các bào tử trứng có thể đóng một vai trò quan trọng trong dịch tễ học của bệnh (Gavino et al., 2000) và đóng vai trò như một nguồn bệnh liên tục nhờ có vách dày với khả năng tồn lại lâu dài trong đất hoặc trong tàn dư cây bệnh (Zwankhuizen et al., 2000)

Mặt khác, các túi bào tử vô tính đóng vai trò điều khiển dịch bệnh trong suốt mùa Túi bào tử phát sinh động bào tử trong điều kiện thời tiết thuận lợi, gọi là thời

kỳ Smith, được định nghĩa là tình trạng ẩm cao với độ ẩm tương đối lớn hơn 90% kéo dài trong ít nhất hai ngày liên tiếp, và mỗi ngày ít nhất có 11 giờ với nhiệt độ trung bình 10°C hoặc cao hơn (Cohen et al., 1997) Túi bào tử có khả năng cảm nhận được môi trường và điều tiết sự nảy mầm Nếu nhiệt độ môi trường trong khoảng 20-240C bào tử phân sinh sẽ trực tiếp hình thành ống mầm sau đó tạo thành sợi nấm xâm nhập vào tế bào mô cây kí chủ Nếu nhiệt độ môi trường từ 12-180C trong điều kiện ẩm cao hoặc có giọt nước bào tử phân sinh sẽ giải phóng các du động bào tử (zoospore) có 2 roi Các du động bào tử này có khả năng chuyển động nhờ có giọt nước sẽ tìm tới các lỗ khí khổng nảy mầm tạo ra các sợi nấm và xâm nhập vào cây kí chủ Dù là phương thức nảy mầm trực tiếp hay gián tiếp nhưng khi xâm nhập sợi nấm đều dùng phương pháp cơ học là hình thành các vòi hút hình trụ hoặc hình cầu để xâm nhập vào mô lá Túi bào tử phát triển nhiều bào quan không có trong sợi nấm, chẳng hạn như các túi lớn bên phía ngoài, các túi nang, các kinetosome, và roi (Hardham and Hyde, 1997) Sự phát sinh bào tử động liên quan đến sự phân tách tế bào chất của bào tử nang đa nhân bằng màng bao bọc nhân, sự lắp ráp của hai roi, giải thể gai bào tử nang, và giải phóng các du động bào tử đơn nhân (Hardham and Hyde, 1997) Một số gene cảm ứng sớm mã hóa các thành phần

của bào tử túi đặc biệt có thể trợ giúp trong việc lắp ráp các cấu trúc này Dưới điều kiện môi trường thuận lợi, các túi bào tử có thể duy trì khả năng tồn tại khoảng một tuần, mặc dù mức độ mRNA cho phép nảy mầm và khả năng nảy mầm có thể thay đổi trong thời gian này (Hardham and Blackman, 2010)

P infestans ưu tiên hình thành bào tử trong giai đoạn tối Các nghiên cứu đã chứng minh rằng ánh sáng liên tục ức chế sự hình thành bào tử, mặc dù kết quả có khác nhau giữa các giống (genus) khác nhau (Cohen et al., 1975) Tại bề mặt cây

chủ, động bào tử P infestans vận động để mặt bụng của nó đối mặt với cây chủ

trước khi roi được tách rời và các protein từ ba túi vỏ khác nhau được tiết ra bề mặt bào tử động (Hardham and Gubler, 1990) Bằng cách đó, các bào tử hình thành u nang có vách bao quanh, rồi nảy mầm từ trung tâm của mặt bụng, cho phép các sợi nấm mọc dọc theo phần lồi giữa các tế bào biểu bì để phá vỡ các tế bào cây chủ Thỉnh thoảng, các túi bào tử đa nhân cũng có thể khởi đầu lây nhiễm (Hardham, 2007) Túi bào tử trưởng thành có thể hình thành các protein cần thiết cho hình thành bào tử động và bào tử nang (Judelson et al., 2009)

Trong giai đoạn tăng trưởng sinh dưỡng sớm của P infestans, chất dinh

dưỡng được lấy từ tế bào thực vật sống Chúng thực hiện điều này bằng cách hình thành một chốt thâm nhập, xuyên qua lớp biểu bì và xâm nhập vào một tế bào biểu

bì để tạo thành một túi lây nhiễm Hình thành các giác mút của các sợi nấm phân nhánh, và tiếp theo là tiết các enzyme phân hủy các thành phần của thành tế bào thực vật tiếp tục tạo thuận lợi cho việc tiếp cận chất dinh dưỡng Giác mút phát triển trong ranh giới của thành tế bào thực vật, mặc dù chúng vẫn nằm ngoài màng tế bào chủ (Hardham and Blackman, 2010) Các giác mút chuyên hóa cho sự hấp thu chất dinh dưỡng từ các tế bào chủ Trong giai đoạn sinh trưởng hoại dưỡng (necrotrophic), các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển mầm bệnh và sinh sản được lấy từ các tế bào chết và trong các tổn thương hoại tử phát triển khi các tác nhân gây bệnh xâm chiếm cây chủ Khi mô bị nhiễm chết hoại, các sợi nấm phát triển các cuống túi bào tử nổi lên thông qua các lỗ khí để sản xuất nhiều túi bào tử

vô tính (Hardham and Blackman, 2010)

1.1.2 Nguyên lý di truyền và chọn tạo giống cà chua kháng bệnh mốc sương

Kể từ khi xảy ra nạn đói ở Ireland vào những năm 1840, đã có rất nhiều sự quan tâm trong việc phát triển các giống khoai tây và cà chua kháng mốc sương

Trong quá trình này, đã quan sát thấy tính kháng P infestans có thể phân loại thành

tính kháng đặc hiệu chủng (tính kháng dọc) và kháng không đặc hiệu chủng (kháng ngang, hoặc kháng một phần) với các chủng đã được xác định bởi sự tương tác của bệnh với kiểu gen của các cây chủ khác nhau Phát triển các giống cây với khả năng kháng quy định bởi các gen chính (kháng dọc) vào lúc ban đầu có hiệu quả ngăn ngừa lây nhiễm và bảo vệ cây trồng khỏi bệnh mốc sương Do sự phát triển nhanh

chóng của các bộ phận tác nhân gây bệnh và sự sinh sản hữu tính của P infestans

dẫn đến tạo ra các dòng mới độc hơn (Klarfeld et al., 2009), làm cho tính kháng dọc chống lại bệnh cuối cùng có thể thất bại, gen kháng không bền vững (Klarfeld et al., 2009; Knapova et al., 2002) Ngược lại, khả năng kháng không đặc hiệu chủng (kháng ngang) thường được điều khiển bởi một số gen hoặc các locus tính trạng chất lượng (các QTL) bền vững hơn tính kháng dọc (Brouwer et al., 2004) Trong

cả khoai tây và cà chua, cả tính kháng dọc cũng như kháng ngang với mốc sương đều đã được báo cáo Tuy nhiên, các gen chính kháng đặc hiệu chủng (kháng dọc) thực tế đã cho thấy là hữu ích hơn trong chọn giống kháng mốc sương cũng như hầu hết các bệnh trên khoai tây và cà chua khác, đặc biệt là khi nhiều gen kháng đặc hiệu chủng được quy tụ để tăng cường tính kháng và độ bền vững của giống kháng

Vì vậy, việc xác định thêm các gen kháng chính với bệnh mốc sương là cần thiết, nhiệm vụ này đang được tiến hành trên nhiều chương trình chọn giống khoai tây và

cà chua trên khắp thế giới (Merk and Foolad, 2012)

Gen kháng bệnh mốc sương ở cà chua đã được quan tâm trong nhiều năm, hiện có 3 gen kháng chính kháng đặc hiệu chủng đã được xác định trong loài cà

chua dại S pimpinellifolium Những gen này định vị trên nhiễm sắc thể số 7 (Ph-1),

10 (Ph-2) và 9 (Ph-3) Ph-1 là gen trội duy nhất tạo được tính kháng với chủng T-0,

nhưng nó đã nhanh chóng bị khắc phục bởi các chủng gây bệnh mới (Peirce, 1971)

Tính kháng do gen kháng đơn trội không hoàn toàn Ph-2, nằm trên nhánh dài của

nhiễm sắc thể 10 (Moreau et al., 1998), chỉ cung cấp tính kháng một phần với một

số chủng phân lập P infestans (Peirce, 1971) Gen Ph-2 đúng ra chỉ làm giảm bớt

tốc độ phát triển bệnh, và nó thường không kháng được khi gặp các chủng độc hơn (Black et al., 1996a, Sujkowski et al., 1994 )

Một gen kháng mạnh hơn nhiều so với 2 gen kể trên là Ph-3 đã được tìm thấy trong mẫu giống L3708 thuộc loài dại S pimpinellifolium (còn được biết đến là

LA1269 hoặc PI365957) Gen này tạo ra tính kháng trội không hoàn toàn chống lại

một loạt khá rộng các chủng P infestans (Chen et al., 2008; Chunwongse et al.,

2002; Park et al., 2010) Một số giống cà chua được lai lai tạo thành công từ các chương trình chọn tạo giống trên toàn thế giới đã thành công trong việc chuyển gen kháng này tạo ra các giống cà chua tươi, cà chua chế biến thương mại hoặc các

dòng giống mới Ví dụ như giống NC1 CELBR 2 + Ph-3] và NC2 CELBR

[Ph-2 + Ph-3], giống lai Plum Regal [Ph-3], Mountain Magic [Ph-2 + Ph-3] và Mountain Merit [Ph-2 + Ph-3] (Gardner and Panthee, 2010; Panthee and Chen,

2010) Ngoài ra, nhiều dòng thuần và giống lai đang trong giai đoạn thử nghiệm

Một số chỉ thị phân tử DNA đã được xác định liên kết chặt với gen kháng Ph-3

Một trong số đó là chỉ thị SCAR (Sequence Characterized Amplified Region – đặc điểm trình tự vùng được khuếch đại) SCU602 sử dụng cặp mồi SCU602F3/R3, liên

kết chặt và cho phép xác định alen kháng Ph-3 (sản phẩm PCR 400 bp) và alen mẫn

cảm (450bp) có thể sử dụng hiệu quả để chọn lọc kiểu gen kháng (Truong et al.,

2013) Tuy nhiên, không may là gen kháng Ph-3 cũng là gen kháng đặc hiệu chủng

và dường như các chủng phân lập mới đã khắc phục được gen này (Chen et al.,

2008, Foolad et al., 2006)

Do các gen kháng kể trên (Ph-1, Ph-2 và Ph-3) đều là gen kháng đặc hiệu

chủng, cùng với sự xuất hiện của các chủng mới độc hơn đã làm giảm hiệu quả của các gen kháng này Vì thế cần thiết phải xác định, đánh giá, và sử dụng các nguồn kháng mới Gần đây, một vài mẫu giống kháng cao đã được xác định trong loài cà

chua dại S pimpinellifolium (43,44) Các mẫu giống mới xác định biểu hiện tính kháng chống lại 7 chủng phân lập P infestans khác nhau là các dòng vô tính US8,

US13, US14, hoặc US15 Trong số này, mẫu giống PSLP153 đã được lựa chọn để phân tích đặc điểm di truyền bộ gen cũng như xác định và lập bản đồ gen/các gen kháng bệnh mốc sương mới Một phân tích tương quan giữa bố mẹ - con bằng cách

sử dụng quần thể F2 và F3 của một tổ hợp lai giữa PSLP153 và một dòng cà chua mẫn cảm với bệnh mốc sương, cho thấy hệ số tính kháng mốc sương có thể di truyền là khoảng 0.86 (tính kháng tạo ra bởi PSLP153) (Merk and Foolad, 2012)

Sử dụng phương pháp chọn lọc kiểu gen các tác giả đã xác định hai vùng gen tạo ra tính kháng bệnh mốc sương trên nhiễm sắc thể 1 (đặt tên thử nghiệm là Ph-5-1) và

10 (dự kiến đặt tên là Ph-5-2) Các tác giả đang nỗ lực mô tả thêm về hai vùng kháng này và lập bản đồ chi tiết về các gen kháng mới Đồng thời, những nỗ lực chọn giống để chuyển gen kháng Ph-5-1 và Ph-5-2 từ mẫu giống PSLP153 đã dẫn đến sự phát triển của một số dòng giống cà chua thương mại ăn tươi và chế biến mới được cải thiện tính kháng bệnh mốc sương Hơn nữa, những nỗ lực đang được tiến hành để phát triển các dòng giống thương mại và các giống lai có chứa các gen

kháng trong sự kết hợp với các gen kháng đã biết trước đây, cụ thể là Ph-2 và Ph-3

Đến nay, các gen kháng bệnh mốc sương được cho là hữu ích nhất đã được xác định trong cà chua là những gen kháng lớn với tính kháng đặc hiệu chủng Chiến lược chọn tạo giống khôn ngoan để tạo được các giống kháng bền vứng là quy tụ nhiều gen kháng lớn đặc hiệu chủng như trên hoặc xác định và kết hợp các kháng ngang hữu ích

Ngoài các gen kháng lớn đặc hiệu chủng kể trên, một số các QTL kháng không đặc hiệu chủng đã được báo cáo trong các mẫu giống khác nhau của loài cà

chua dại S habrochaites (Brouwer et al., 2004; Chen et al., 2008; Junming, 2010)

Ví dụ, trong mẫu giống LA2099, các QTL quy định tính kháng bệnh mốc sương đã được xác định dựa trên trên tất cả 12 nhiễm sắc thể cà chua (hình 1) (Junming, 2010) Sau đó, với mục tiêu chuyển các QTL kháng đã chọn vào cà chua trồng, ba dòng gần đẳng gen (NIL) đã được phát triển, mỗi dòng có một QTL kháng (Brouwer and Clair, 2004) Tuy nhiên, sự liên kết rất mạnh đã ngăn cản các dòng gần đẳng gen trở nên hữu ích cho các mục đích tạo giống Kiểm tra sâu hơn về các dòng gần đẳng gen đã xác định rằng chúng cũng chứa gen/các QTL cho các đặc

điểm khác, bao gồm kiểu cây, mật độ tán, sự trưởng thành, kích thước quả và năng suất trong khu vực đồng chuyển vị Các QTL kháng bệnh mốc sương trong cà chua thường liên kết chặt với tính chín muộn và kích thước cây lớn (Brouwer and Clair, 2004; Brouwer et al., 2004)

Các QTL kháng bệnh mốc sương cũng đã được xác định trong loài S

habrochaites ở mẫu giống LA1777 (Junming, 2010) Trong nghiên cứu này, năm QTL lớn (RLBhq4a, RLBhq4b, RLBhq7, RLBhq8, RLBhq12) được xác định trên

bốn nhiễm sắc thể sử dụng các dòng chuyển vị từ tổ hợp lai giữa S lycopersicum ×

S habrochaites Nghiên cứu này cũng xác định được một QTL mới kháng bệnh

mốc sương trong LA2099 (Junming, 2010) Một mẫu giống S habrochaites khác

với tính kháng bệnh mốc sương cũng đã được sử dụng cho các nghiên cứu di truyền

và lập bản đồ là LA1033 (Chen et al., 2008, Lough, 2003) Trong mẫu giống này, nghiên cứu về di truyền đã chỉ ra sự có mặt của ít nhất hai gen kháng mốc sương (Lough, 2003), nghiên cứu lập bản đồ đã chỉ ra sự có mặt của một số QTL góp phần vào phản ứng bảo vệ chống lại bệnh mốc sương

Một hạn chế lớn trong việc nghiên cứu tạo giống cà chua kháng bệnh mốc

sương là thiếu các tiêu chuẩn rõ ràng cho việc đánh giá các chủng P infestans Các

nhà nghiên cứu đã cố gắng để vượt qua khó khăn này bằng cách xác định các đặc

điểm khác nhau của các chủng phân lập P infestans, bao gồm các loại giao phối, sự

nhạy cảm với thuốc diệt nấm, kiểu gen isozyme, ti thể và DNA nhân (Chen et al., 2009; Guo et al., 2010; Sliwka et al., 2006; Sujkowski et al., 1994 ) Ngoài ra, một

số nhà nghiên cứu đã cố gắng mô tả và phân loại các chủng phân lập P infestans

dựa trên khả năng gây bệnh của chúng trên các giống kháng mang gen kháng bệnh

mốc sương đã biết (Malcolmson and Black, 1966) Các nhà nghiên cứu cà chua tại AVRDC đã bắt đầu phân tích các chủng phân lập P infestans của họ theo cách này

trong những năm đầu nghiên cứu

Năm 1990, khi mẫu giống L3708 thuộc loài dại S pimpinellifolium được biết

là mang gen kháng đơn Ph-3 và LA1033 thuộc loài S habrochaites được chỉ định là nguồn gốc của gen kháng Ph-4 Các nghiên cứu cho thấy tính kháng là phức tạp và

liên quan đến nhiều gen trong mẫu giống L3708 (Kim and Mutschler, 2005; Kim and Mutschler, 2006; Wang and Chen, 2005) hoặc nhiều QTL trong mẫu giống LA1033 (Lough, 2003) Cách phân loại như vậy là bước đầu để tiến tới phát triển một hệ thống phân loại toàn diện và hữu ích hơn về độc tính của các chủng phân lập

P infestans ở cà chua Dự kiến với thông tin đã có về bộ gen P infestans, ý nghĩa

về kinh tế và việc xác định các nguồn kháng bổ sung với bệnh mốc sương trong cà chua, thông tin về các chủng gây bệnh khác nhau của các tác nhân gây bệnh sẽ sớm được công bố

1.2 Tổng quan về các đột biến chín chậm và ứng trong dụng chọn giống chín chậm 1.2.1 Sự chín và các đột biến chín chậm

Sự chín được cho là một quá trình thoái hóa bao gồm sự già hóa và sự sụp đổ chung của tế bào, cuối cùng dẫn đến chết tế bào Một số thay đổi quan trọng trong thành phần hóa học xảy ra trong quá trình chín của quả cà chua là sự suy giảm tinh bột và quá trình sản xuất glucose và fructose, phân giải diệp lục, tổng hợp các sắc tố như β-carotene và lycopene, tăng pectin hòa tan do mềm hóa và suy thoái vách tế bào, sản xuất các hợp chất tạo hương vị và mùi thơm, tăng hàm lượng acid citric, acid malic, axit glutamic và phân giải các alkaloid độc tomatine (Grierson and A., 1986)

Quả cà chua là loại quả hô hấp “đột biến” vì nó biểu hiện sự suy giảm hô hấp đến mức tối thiểu ở thời kỳ tiền hô hấp đột biến ngay trước khi chín Lúc bắt đầu chín, sự hô hấp gia tăng đến tối đa sau đó suy giảm từ từ Ngoài ra, nó còn biểu hiện

ở sự gia tăng về tổng hợp ethylene trong quá trình chín Sự gia tăng trong việc tổng hợp carbon dioxide và ethylene thường là các dấu hiệu đầu tiên của sự khởi đầu quá trình chín Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự gia tăng trong sản xuất ethylene chắc chắn xảy ra trước khi có sự gia tăng về hô hấp (Sawamura et al., 1978.) Polygalacturonaza (PG) là enzyme làm mềm quan trọng nhất trong cà chua Enzyme này không có trong các loại quả xanh và tích lũy với số lượng lớn trong quá trình quả chín Sự xuất hiện của enzyme này có tương quan với sự khởi đầu của

sự suy thoái thành tế bào Tổng hợp ethylene tự nhiên bắt đầu trước khi PG xuất

hiện và ethylene ngoại sinh gây ra sự tích tụ của các enzyme trong quả trưởng thành (Grierson and Kader, 1986)

Để thuận lợi cho vận chuyển và bảo quản, quả cà chua thường được thu hoạch khi còn xanh, sau khi vận chuyển đến nơi cần thiết thì được làm chín bằng cách phun ethylen hoặc các chất khí có hoạt tính tương tự Tuy nhiên, cách làm này khiến cho quả không đảm bảo chất lượng và giá trị dinh dưỡng so với để chín tự nhiên Việc phát hiện ra một số gen đột biến liên quan đến quá trình chín ở cà chua trong những năm 1960 đã mở đường cho các nghiên cứu về di truyền để kéo dài

thời hạn sử dụng quả Những đột biến đó bao gồm đột biến chín chậm alc (alcobaca) (ALMEIDA, 1961), đột biến ức chế sự chín rin (ripening inhibitor) (ROBINSON and L, 1968) và đột biến không chín nor (non-ripening) (Tigchelaar et

al., 1973) Những gen đột biến này dạng đồng hợp tử có thể ức chế hoặc làm “rất“ chậm một loạt các quy trình liên quan đến quá trình chín của quả cà chua, dẫn đến thời hạn sử dụng quả tới 250-500% (Dhatt, 2001; Garg, 2006; Ignatova et al., 1999; Kopeliovitch et al., 1979; Lobo et al., 1984; Lu et al., 1995; Mutschler, 1984) nhưng đồng thời chúng cũng tạo ra hương vị quả kém (Kopeliovitch et al., 1982; Kopeliovitch et al., 1980) và màu sắc quả “nghèo nàn” (Kopeliovitch et al., 1980; Lobo et al., 1984; Sink et al., 1974) Tuy nhiên, ở dạng dị hợp tử, các gen đột biến này có thể tạo cho quả có thời hạn sử dụng lớn hơn nhiều lần so với quả bình thường (Agar et al., 1994; Buescher et al., 1976; Dhatt, 2001; Garg, 2006; Kitagawa

et al., 2005; Kopeliovitch et al., 1979; Lu et al., 1995; McGlasson et al., 1983; Mutschler et al., 1992; Nguyen, 1991) bên cạnh đó chúng cũng tạo ra quả cà chua chấp nhận được về màu sắc (Gavrish and G., 1991; Hobson, 1980; Kopeliovitch et al., 1981; Lu et al., 1994; Mutschler, 1984; Ng and Tigchelaar, 1977; Sink et al., 1974) và hương vị (Agar et al., 1994; Kopeliovitch et al., 1982)

Đột biến rin xuất hiện trong một dòng F4 được phát triển bởi H M Munger tại Đại học Cornell Gen lặn rin làm thay đổi một vài mặt của quá trình chín như

làm quả không chín hoàn toàn, quả chuyển sang màu vàng và sự mềm hóa rất chậm

(Robinson and Tomes, 1968) Quả của đột biến rin không biểu hiện tính hô hấp đột

biến, đồng thời không phát sinh ethylene hay hoạt động của enzyme PG tại thời điểm khi khi quả chín bình thường và thời điểm bắt đầu quá trình già hóa (Herner and Sink, 1973; Buescher and Tig- chelaar, 1975) và chúng biểu hiện một sự bất thường về suy giảm diệp lục và tổng hợp carotenoid (Sink et al., 1974) Quả thiếu hương vị so với cà chua bình thường và có thể lưu trữ được trong một thời gian rất

dài Gen này nằm trên nhiễm sắc thể số 5 và liên kết chặt với gen macrocalyx (mc)

(Tigchelaar, 1978)

Đột biến không chín nor được xác định trong giống "Italian Winter” được

giới thiệu bởi tác giả E A Kerr làm việc tại Viện Nghiên cứu Làm vườn Ontario

Tác động của đột biến nor đến sự chín tương tự như đột biến rin nhưng làm cho

màu sắc quả cuối cùng là màu cam nhạt (Tigchelaar et al., 1973.) Alen này liên kết

chặt (khoảng 3,5 đơn vị bản đồ) với gen u (uniform ripening) quy định tính chín

đồng nhất quả (chín rộ) trên nhiễm sắc thể 10 (Tigchelaar and Barman, 1978) Đột

biến nor 2 được xác định trong giống Da Serbo và đột biến nor 3 trong giống Tondo Liscio di Pescara Các giống này được trồng trong vườn nhà ở Ý do có thời hạn sử dụng rất dài và được tiêu dùng trong những tháng mùa đông; chúng được xác định

là các alen trên cùng locus với nor (Soressi, 1975) Tigchelaar và Rios (1989) đã đưa ra giả thuyết có nhiều hơn hai alen tại locus nor và/hoặc có sự tồn tại của các gen đột biến có thể thay đổi mức độ biểu hiện của gen nor

Giống cà chua Alcobaca của Bồ Đào Nha sở hữu gen chín chậm alc đã được

mô tả là giống cà chua có thời gian bảo quản quả kéo dài (Almeida, 1961) và có dạng lá khoai tây (Lu et al., 1995) Đột biến “hô hấp bán bột phát” này tạo ra hiệu ứng chín đặc trưng bởi sự suy giảm hoạt động hô hấp và giảm sản sinh ethylene, làm chậm sự mềm hóa của quả, làm cho hoạt động của enzyme PG ở mức thấp và kéo dài thời hạn sử dụng quả (Mutschler, 1984b; Kopeliovitch et al., 1980) thấy

rằng màu sắc cuối cùng của quả đột biến alc khi thu hái ở giai đoạn chín xanh, giai

đoạn bắt đầu chín (<10% diện tích quả chuyển màu) và hai tuần sau giai đoạn bắt đầu chín lần lượt là màu vàng, màu cam và màu đỏ sáng Không giống như quả của

đột biến rin và nor, quả alc vừa cho thời hạn sử dụng dài đồng thời khi để chín trên

cây thì có hương vị thích hợp và màu sắc quả chấp nhận được Kopeliovitch et al

(1979, 1980) báo cáo rằng alen alc không không cùng locus với alen nor và alc ảnh

hưởng đến quá trình chín theo kiểu tính trạng số lượng chứ không phải tính trạng

chất lượng Mutschler (1984 a) cũng đề nghị alc không có quan hệ alen với nor và gen alc nằm ở gần cuối nhánh ngắn của nhiễm sắc thể 10, khoảng 17 đơn vị bản đồ

từ locus nor và 20 đơn vị bản đồ từ gen u Ngược lại, Lobo et al (1982, 1984) mô tả

alc như một alen trong locus nor mà họ gán cho ký hiệu là nor A

, và họ đã chứng

minh alc là trội một phần so với alen nor

1.2.2 Các đặc tính của cây đồng và dị hợp tử tại locus rin, nor và alc

Thời điểm chín

Các đột biến rin, nor và alc đồng hợp tử cần tương đối nhiều thời gian hơn

để phát triển từ từ ngày nở hoa đến giai đoạn chín hoàn toàn so với kiểu gen bình thường (Dhatt, 2001; Garg, 2006) Thời gian phát triển từ giai đoạn nở hoa đến giai đoạn chín xanh là như nhau đối với cả dạng đột biến đồng hợp tử và dạng bình thường, nhưng thời gian từ chín xanh đến giai đoạn chín hoàn toàn ở các đột biến đồng hợp tử được kéo dài hơn (Simpson et al., 1976; Mutschler, 1984 b) Tuy nhiên, Kopeliovitch et al (1980) và Dhatt (2001) đã quan sát thấy thời gian phát triển từ giai đoạn nở hoa đến chín xanh của các đột biến đồng hợp tử cũng dài hơn

so với các đối chứng bình thường

Nghiên cứu cho thấy thời gian để quả cà chua phát triển từ giai đoạn bắt đầu chín (<10% bề mặt quả chuyển màu) đến giai đoạn chín đỏ (>90% bề mặt quả

chuyển màu) ở các quả lai F1 có gen rin dị hợp là 7 ngày, gen nor dị hợp là 10

ngày, so với 5 ngày ở quả giống Flora-Dade chín bình thường (McGlasson et al., 1983; Nguyen et al., 1991) Một nghiên cứu khác cho thấy thời gian từ chín xanh

đến chín đỏ là 10 ngày trong tổ hợp lai UC82B x alc Rutger (ALC/alc), 11 ngày trong UC82B x rin Rutger (RIN/rin) và 12 ngày trong UC82B x nor Rutger (NOR/nor), so với bốn ngày trong giống bình thường Rutger, và năm ngày ở giống bình thường UC82B (Dhatt, 2001) Quả của các giống lai F1 dị hợp tử về alen rin,

nor và alc cần 44,0 - 54,4 ngày để phát triển từ nở hoa đến giai đoạn chín hoàn toàn,

so với 40,3-44,0 ở các kiểu gen đồng hợp bình thường và 49,8-60,0 ngày ở các kiểu gen đột biến đồng hợp, điều này phản ánh khả năng trì hoãn sự chín hoàn toàn của các quả F1 có đột biến dị hợp tử so với các kiểu gen bình thường Do đó, các giống lai F1 dị hợp tử về các đột biến này có ưu điểm là cho phép thu hái quả trong một khoảng thời gian dài hơn so với kiểu gen bình thường mà không phải lo lắng đến nguy cơ quả bị mềm hóa khi chín làm giảm khả năng chịu vận chuyển (Garg, 2006)

Năng suất cá thể và năng suất cá thể thương phẩm

Năng suất cao là một trong những mục tiêu quan trọng nhất của tất cả các chương trình cải tiến giống cây trồng Nghiên cứu cho thấy các alen đột biến không ảnh hưởng đến tiềm năng năng suất của cà chua Cụ thể, tổng năng suất/cây của các

dòng đẳng gen alc Rutger, nor Rutger và rin Rutger là ngang bằng với giống Rutger

bình thường (Dhatt, 2001) Tuy nhiên, tiềm năng năng suất được cải thiện trong con

lai F1 do biểu hiện ưu thế lai Tổng năng suất của các con lai F1 alc đã được báo

cáo là cao hơn hoặc tương đương với các dòng bố mẹ (Souza et al., 2001) Các nghiên cứu khác cho thấy ưu thế lai chuẩn của con lai lên tới 41,73 % (Dhatt, 2001)

và ưu thế lai trung bình lên đến 258,09 % (Garg, 2006) đã được quan sát thấy trong

các con lai dị hợp ở các alen rin, nor hay alc

Cây dị hợp tử nor cho năng suất thương phẩm cao hơn so với dòng bố mẹ

bình thường, có thể bởi vì chúng được cải thiện khả năng lưu trữ quả trên đồng ruộng (Grazzini and Tigchelaar, 1979) Nguyen et al (1991) đã báo cáo ưu thế lai

của con lai mang gen rin dị hợp tử cao hơn 60 % so với giống Flora Dade về năng

suất cá thể thương phẩm Garg (2006) tìm thấy ưu thế lai thực lên đến 291,01 % và

ưu thế lai trung bình lên đến 203,10 % trong con lai F1 mang gen nor dị hợp tử về

năng suất cá thể thương phẩm

Số quả/cây

Ở cà chua, năng suất cá thể phụ thuộc vào số lượng và khối lượng quả (Kaul

et al, 1972; Bhutani et al, 1973) Trong đó, số quả/cây đóng vai trò lớn hơn khối lượng quả trong việc cải thiện tổng năng suất (Haskell and Brown, 1955; Dhillon et

al., 1979; Govindarasu et al., 1981; Lonkar and Borikar, 1988) Sự gia tăng về số quả/cây là biểu hiện chủ yếu của ưu thế lai trong cà chua (Singh et al., 1998) Nghiên cứu ưu thế lai về số quả/cây cho thấy ưu thế lai chuẩn lên tới 174,15 %

(Dhatt, 2001) ở con lai dị hợp về gen rin và ưu thế lai trung bình lên đến 188,30 % (Garg, 2006) ở con lai dị hợp về gen nor

Khối lượng quả trung bình

Đặc điểm chất lượng quan trọng này phản ánh kích thước quả của kiểu gen

Khối lượng quả trung bình của dòng đẳng gen alc Rutger, nor Rutger và rin Rutger

tương ứng là 57,00 g, 56,55 g và 68,75 g, so với dòng Rutger là 31,45 g (Dhatt, 2001) Tuy nhiên, khối lượng quả trung bình của con lai có thể mang giá trị trung gian của bố mẹ (Singh et al., 1998) McGlasson et al (1983) đã quan sát thấy ưu thế

lai cao hơn 70 % trong con lai dị hợp tử nor so với giống Flora Dade Siddiqui et al

(1995) đã báo cáo một sự gia khối lượng quả trung bình của tất cả 13 con lai mang

gen rin dị hợp tử so với dòng bố mẹ mang gen rin đồng hợp tử Ưu thế lai chuẩn về

khối lượng quả trung bình lên tới 41,57 % đã được báo cáo trong con lai mang gen

alc dị hợp tử (Dhatt, 2001) và ưu thế lai trung bình lên đến 45,72 % trong con lai

mang gen nor dị hợp tử (Garg, 2006)

Giảm hàm lượng lycopene

Lycopene là chất tạo ra màu đỏ của quả, cà chua có màu đỏ đồng được ưa chuộng cả trong chế biến và ăn tươi Hơn nữa, lycopene có tính chống oxy hóa cao

nhất trong tất cả các loại carotenoid (Rai et al., 2004)

Các alen đột biến rin, nor và alc làm giảm hàm lượng lycopene trong quả cà chua Mức độ sắc tố lycopene trong các dòng đẳng gen rin và nor đã được ghi lại, trong khi ở giống mang gen alc đồng hợp tử là 25% so với bình thường (Sink et al.,

1974; Kopeliovitch et al., 1980) Sự bất thường về sắc tố lycopen làm hạn chế sự

phát triển màu sắc đến 50% trong dạng alc đồng hợp tử và 90% ở cả dạng rin và

nor đồng hợp tử (Lobo et al., 1984)

Các dạng dị hợp tử rin, nor và alc phát triển màu sắc chấp nhận được cho

thương mại (Kopeliovitch et al., 1981; Nguyen et al., 1991; Lu et al., 1994; Dhatt, 2001; Garg, 2006) Tuy nhiên, quả nên được chọn ở giai đoạn sau của quá trình chín

để cải thiện sự phát triển màu sắc và các thành phần chất lượng khác (Kopeliovitch

et al., 1979; Tigchelaar and Rios, 1989)

Nhìn chung, sự thiếu hụt lycopene nhiều hơn rõ rệt ở các con lai nor dị hợp

tử so với rin và alc dị hợp tử Sắc tố lycopene ít nhiều tương tự như dạng bình thường trong các con lai rin và alc và bằng khoảng một nửa so với bình thường trong con lai nor (Sink et al., 1974; Ng and Tigchelaar, 1977; Hobson, 1980;

Mutschler, 1984 b) Agar et al (1994) nhận thấy sự phát triển màu sắc đầy đủ trong

con lai rin, màu sắc nghèo và không đều trong con lai nor và cũng đề nghị rằng quả

từ các con lai này phải được thu hoạch ở giai đoạn chín hồng (30-60% bề mặt quả chuyển màu) nếu không nó sẽ không phát triển được thành màu đỏ đầy đủ sau khi thu hái

Các con lai alc phát triển thành màu đỏ bình thường khi thu hoạch ở giai

đoạn bắt đầu chín (<10% bề mặt quả chuyển màu), màu sắc cuối cùng bên trong và bên ngoài của quả chín mọng cũng tương tự như các kiểu gen bình thường (Mutschler, 1984 b; Mutschler et al., 1992; Araujo et al., 2002; Garg, 2006)

Khả năng cải thiện độ cứng quả

Các giống có quả cứng được ưa chuộng hơn nhờ khả năng vận chuyển đi xa

và ít bị hỏng khi hoạch bằng máy (Ram, 1999) Các đột biến rin, nor và alc không trực tiếp làm tăng độ cứng quả như quả chuyển gen rin biểu hiện vỏ quả mềm hơn

và khả năng chống nén kém hơn (Martin et al., 1998) Độ cứng được cải thiện trong

các đột biến alc, rin và nor đồng hợp tử có lẽ là do tốc độ mềm hóa chậm trong quá

trình chín (Robinson and Tomes, 1968; Chậu et al., 1974; Lu et al., 1994)

Khi thử độ cứng quả bằng phương pháp đo khả năng chịu nén, quả của đột

biến nor cứng nhất với sự biến dạng quả ít nhất là 2,2 mm, tiếp theo là rin (2,4 mm)

và alc (3,0 mm) (Lobo et al., 1984) Độ cứng quả của dòng đẳng gen alc Rutger ở

giai đoạn chín hoàn toàn là 108% so với dòng Rutger bình thường, trong khi đó độ

cứng của dòng rin Rutger và nor Rutger là 145% so với dòng Rutger bình thường Quả có đột biến rin trong nền tảng là giống T-3 biểu hiện độ cứng lớn hơn 185%

(Dhatt, 2001) Do đó, có thể thấy độ cứng quả chịu ảnh hưởng bởi cả gen đột biến

và kiểu gen nền tảng mà các gen này được tích hợp (Kopeliovitch et al., 1979) Do

đó, chuyển các gen đột biến này vào các giống có quả cứng có thể cải thiện tốt hơn khả năng bảo quan dài và vận chuyển xa (Mutschler, 1984 b)

Một sự suy giảm mạnh về độ cứng từ giai đoạn bắt đầu chín đến giai đoạn chín đỏ đã được quan sát thấy trong các quả bình thường, trong khi sự suy giảm độ

cứng ở các đột biến dị hợp tử rin, alc và nor diễn ra chậm hơn nhiều (Ng and

Tigchelaar, 1977; Lu et al.,1995; Seroczynska et al., 1998.) Vì vậy, ngay cả ở trạng thái dị hợp tử, các đột biến này cũng góp phần tăng độ cứng quả bằng một tốc độ mềm hóa quả chậm hơn (Nguyen et al., 1991; Agar et al., 1994; Lu et al., 1995; Dias

et al., 2003; Faria et al., 2003; Andrade-Junior et al., 2005), từ đó cho phép thu hoạch quả thậm chí ở nhiều giai đoạn chín hơn mà không sợ quả bị mềm hóa nhanh chóng

Các quả dị hợp tử alc sở hữu độ cứng trung gian của dòng bố mẹ bình thường và dòng alc đồng hợp tử (Mutschler, 1984b; Mutschler et al., 1992; Freitas

et al., 1999; Souza et al., 2001; Araujo et al., 2002) Buescher et al (1976) nhận

thấy quả của các con lai C17 x rin và C17 x nor có độ cứng cao hơn so với dòng mẹ C17 bình thường tương ứng là 20% và 50% Các con lai rin, nor hay alc dị hợp tử

biểu hiện sự giảm biến dạng quả lên đến -52,94% so với bố mẹ bình thường (Dhatt, 2001) và lên đến -26,37% so giá trị trung bình của hai dòng bố mẹ (Garg, 2006)

Ảnh hưởng đến hàm lượng các chất rắn không hòa tan trong rượu (AIS)

Các chất rắn không tan trong rượu chủ yếu bao gồm protein, các chất pectic, hemicellulose và cellulose (Grierson and Kader, 1986) Một sự tương quan rất cao

đã được báo cáo giữa hàm lượng AIS của quả cà chua và độ nhớt của dịch quả

(Janoria, 1974) Độ nhớt là một đặc tính chất lượng quan trọng của cà chua chế biến

quyết định rất lớn đến độ đặc của sản phẩm cuối cùng Độ đặc rất quan trọng trong một số sản phẩm như nước sốt và nước sốt cà chua (Stevens and Paulson, 1976)

Mặc dù các báo cáo là trái ngược nhau (Janoria and Rhodes, 1974), thỉnh thoảng có

một mối liên quan mạnh giữa độ cứng quả và độ nhớt Mối quan hệ này tồn tại do vách quả dày dẫn đến tăng độ chắc và thường cũng tăng hàm lượng chất rắn hòa tan trong rượu (Stevens, 1976) Một mức AIS cao hơn đã được tìm thấy trong cây đồng

hợp tử nor so với rin và alc (Garg, 2006) Trong các con lai có đột biến chín, mức

độ của AIS là trung gian giữa 2 dòng bố mẹ (Garg, 2006)

Các ảnh hưởng đến hương vị quả

Hương vị quả được tạo ra bởi các axit hữu cơ (citric, malic, axit formic và acetic), đường và các hợp chất dễ bay hơi Hương vị quả có thể được cải thiện bằng cách cải thiện hàm lượng các chất rắn hòa tan và acid (Kalloo, 1994) Nói chung, các thuộc tính hương vị bị ảnh hưởng bởi kiểu gen nền trong đó alen đột biến được tích hợp (McGlasson et al., 1983; Dhatt et al., 2002) Do đó, việc chuyển gen đột biến vào các giống chất lượng tốt bằng cách lai hồi quy nhiều đời và sau đó lai chúng với các giống bố mẹ bình thường có hương vị ngon hơn có thể mang lại các con lai F1 có hương vị tuyệt vời (Kopeliovitch et al., 1982)

Độ axit, độ pH và chất rắn hòa tan tổng số (TSS) của các quả chín tương tự ở

các dòng đẳng gen Rutger và a.lc Rutger (Kopeliovitch et al., 1980; Mut- schler,

1981; Mutschler, 1984b) Tương tự, Hobson (1980) báo cáo độ axit, axit tổng số và

độ pH của các dòng đồng hợp tử rin cũng tương tự và hàm lượng TSS thấp hơn so

với giống bình thường Alisa Craig Một mức độ pH rất thấp, hàm lượng axit tổng số

rất cao và mức độ TSS bình thường đã được quan sát thấy trong dòng nor đồng hợp

tử (Tigchelaar et al., 1978 a) Dhatt (2001) báo cáo mức độ TSS cao hơn và độ axit

và pH thấp hơn ở các dòng đột biến đồng hợp tử so với các đối chứng bình thường Garg (2006) quan sát thấy mức độ axit và TSS thấp hơn trong các đột biến đồng hợp tử so với kiểu gen bình thường

Các đánh giá cảm quan không báo cáo bất kỳ sự khác biệt lớn nào về hương

vị của dòng alc và Rutger, trong khi các dòng đồng hợp tử rin và nor cho thấy

hương vị kém hơn tương ứng 44 và 48% (Kopeliovitch et al., 1980) Quả của cây

đồng hợp tử rin và nor là không ngon, được mặc định cho là do sự tăng nồng độ của

các hợp chất dễ bay hơi không ngon vì các nghiên cứu do thấy mức độ pH, TSS và chuẩn độ axit của các dòng này đều nằm trong phạm vi của các giống bình thường, loại bỏ ảnh hưởng của các yếu tố này đến hương vị quả (Kopeliovitch et al.,1982)

Trong giai đoạn chuyển đổi từ giai đoạn chín xanh sang chín đỏ có sự gia tăng về TSS và giảm độ chua, nhưng những thay đổi này là tối đa trong các giống

cà chua lai lai bình thường, tối thiểu trong con lai nor và trung gian trong con lai rin

(Tigchelaar et al., 1978 b) Agar et al (1994) đã ghi nhận hàm lượng TSS thấp hơn

và giá trị axit citric cao hơn trong các con lai rin và nor so với các giống lai bình thường Trong số 13 con lai rin thử nghiệm bởi Siddiqui et al (1995), 8 con lai cho

thấy hàm lượng axit tổng số cao hơn đáng kể và 11 con lai có hàm lượng TSS ngang bằng với các dòng bố mẹ bình thường Souza et al (2001) báo cáo rằng hàm

lượng TSS của các giống lai alc là ngang bằng và axit tổng số cao hơn so với bố mẹ

bình thường Kopeliovitch et al (1982) báo cáo rằng con lai F1 của các dòng đồng

hợp rin và nor với giống Rutgers có hương vị ngon hơn so với các đột biến đồng hợp tử nhưng kém hơn so với Rutgers Ngoài ra, hương vị quả của con lai nor là kém hơn so với các con lai rin tương ứng

Ảnh hưởng đến nống độ ascorbic acid

Hàm lượng axit ascorbic cao trong cà chua ngoài cải thiện giá trị dinh dưỡng còn giúp cho sản phẩm có màu sắc tự nhiên tốt hơn và duy trì hương vị Ngoài ra, với sự gia tăng hàm lượng axit ascorbic trong quả, khả năng kháng của cây với một

số bệnh như bệnh thối quả gây ra bởi Phytophthora parasitica cũng tăng lên

(Thamburaj, 1998) Theo Clutter and Miller (1961) các giống chín chậm có hàm lượng axit ascorbic thấp hơn so với các giống chín nhanh Mức độ axít ascorbic là

thấp hơn đáng kể trong dòng nor so với rin và alc đồng hợp tử (Garg, 2006) Quả của hầu hết các con lai F1 liên quan đến alen rin, nor và alc có hàm lượng axit

ascorbic cao hơn hoặc bằng giá trị trung bình của các bố mẹ (Siddiqui et al., 1995; Dhatt et al., 2001; Garg, 2006)

Khả năng kéo dài thời hạn sử dụng quả

Các đột biến chín chậm ở dạng đồng hợp tử biểu hiện thời gian sử dụng cực

kỳ dài, không phụ thuộc vào giai đoạn thu hoạch quả Nói chung, đột biến nor và

rin có tác dụng rõ rệt hơn về thời hạn sử dụng so với alc Các nghiên cứu đã báo

cáo sự gia tăng về thời hạn sử dụng lên đến 500% (Kope- liovitch et al., 1979),

400% (Dhatt, 2001), 200% (Garg, 2006) trong cả hai dạng nor và rin đồng hợp tử, 300% (Lobo et al, 1984; Dhatt, 2001) và 250% (Garg, 2006) trong alc đồng hợp tử Thời gian bảo quản quả chín của alc đồng hợp tử tại 20°C là 40 ngày, của rin và nor

đồng hợp tử là trên 50 ngày, so với chỉ 9 ngày ở giống bình thường Rutger (Mutschler, 1984 b) Lu et al (1995) đã báo cáo thời gian bảo quản quả chín xanh

của rin, nor và alc đồng hợp tử ở 16°C lần lượt là 10.8, 9.25 và 6 lần so với giống

bình thường

Thời hạn sử dụng quả của các con lai F1 liên quan đến các đột biến chín chậm hầu hết thấp hơn phần nào so với dòng bố mẹ đột biến đồng hợp tử và cao hơn đáng kể so với dòng bố mẹ bình thường Buescher et al (1976) đã báo cáo thời

hạn sử dụng ở 20°C của quả chín đỏ nor và rin dị hợp tử tương ứng là 42 và 19

ngày, so với 15 ngày của giống bình thường Ở 20°C, thời hạn sử dụng của quả chín

ở con lai rin là 40 ngày so với 28 ngày của giống bình thường Flora-Dade (Nguyen

et al., 1991) Ở 20°C, quả chín hồng (30-60% bề mặt quả chuyển màu) của giống

bình thường, rin và nor dị hợp tử có thể được giữ trong thời gian tương ứng là 8, 12

và 16 ngày (Agar et al., 1994) Tại nhiệt độ phòng ở 30-34°C, thời hạn sử dụng của

quả ở giai đoạn chín hồng rin, nor và alc dị hợp tử là 14.2, 12.9 và 15.0 ngày so với

8.6 ngày của giống bình thường (Garg, 2006)

Kopeliovitch et al (1979) đã báo cáo thời gian bảo quản quả chín xanh của con

lai nor và rin tương ứng là 30 và 15 ngày, so với 10 ngày của giống bình thường ở 20°C Lu et al (1995) đã báo cáo thời gian tồn trữ quả chín xanh của các con lai nor,

rin và alc ở 16°C lần lượt là 16, 17.5 và 18 ngày, so với 10 ngày của giống bình thường Thời gian bảo quản quả chín xanh của các con lai nor, rin, alc ở 20°C lần lượt

là 20, 18 và 16 ngày, so với 9 ngày của giống bình thường (Dhatt et al., 2003)

Khả năng rải vụ để kéo dài thời gian cung cấp quả cho thị trường

Các đột biến chín chậm rin, nor và alc đồng hợp tử và dị hợp tử làm gia tăng

thời gian rải vụ của quả cà chua dưới cả 2 điều kiện stress nhiệt độ thấp và cao bằng cách cho phép giữ quả lâu hơn ở trên cây và sau đó giữ ở nhiệt độ phòng hoặc trong điều kiện lạnh Tuy nhiên, năng suất tiềm năng của các con lai là quá thấp trong điều kiện nhiệt độ cao, vì thế khi nhiệt độ cao thì không nên trồng Để có thể sử dụng các

alen rin, nor và alc cho việc rải vụ giúp kéo dài thời gian sẵn có quả cả khi nhiệt độ

môi trường cao thì nên kết hợp các alen chín chậm với các kiểu gen chịu nhiệt và phát triển các giống lai bằng cách lai chúng với các dòng bình thường hoặc các dòng chịu nhiệt để kéo dài thời kỳ sẵn có quả chung cấp cho thị trường (Garg, 2006)

Khả năng kháng các tác nhân gây thối quả

Bệnh thối quả sau thu hoạch do Alternaria alternata, Rhizopus stolonifer và Botrytis cinerea là những loại bệnh chính của quả cà chua sau thu hoạch, gây tổn thất lớn trong khi bảo quản (Barkai-Golan, 1973; Barkai- Golan and Kopeliovitch, 1981;

Lavy-Meir et al., 1989) Ngược lại với quả chín bình thường, quả của đột biến nor, rin

và các quả lai dị hợp của chúng ít bị thối hơn rõ rệt cả trong điều kiện tự nhiên cũng như khi lây nhiễm nhân tạo với các tác nhân gây thối quả kể trên (Barkai-Golan và Kopeliovitch, 1981, 1986, 1989; Lavy-Meir et al., 1989; Agar et al., 1994) Tính kháng của quả đột biến có được là do các tác nhân gây bệnh thối quả không thể xâm nhập xuyên qua lớp vỏ quả đột biến (Barkai-Golan và Kopeliovitch, 1981, 1989; Lavy-Meir

et al., 1989) Tuy nhiên, tiến hành xử lý nóng hoặc lạnh làm tổn thương quả trước khi lây nhiễm dẫ đến loại bỏ một phần lớp sáp tự nhiên của cà chua sẽ làm giảm đáng kể hoặc không còn sự khác biệt trong phản ứng kháng nhiễm các tác nhân gây thối giữa quả bình thường và quả đột biến (Barkai-Golan and Kopeliovitch, 1981, 1989; Lavy-

Meir et al., 1989) Khả năng kháng các tác nhân gây thối của đột biến nor, rin và các

con lai của chúng có vai trò quan trọng trong khả năng thương mại quả cà chua vì ở nơi bảo quản quả thường tiếp xúc với điều kiện môi trường thuận lợi cho sự phát triển của các loại nấm gây thối quả, các đột biến này giúp làm giảm tỷ lệ quả thối hỏng khi bảo quản (Lavy-Meir et al., 1989)

Khả năng kháng các stress phi sinh học

Trong các cây được xử lý bằng NaCl (3g/lít) , tất cả các thông số về sự chín

của các quả cà chua đồng hợp tử nor tăng lên, tuy không đến mức bình thường, trong khi không có sự thay đổi các thông số về sự chín ở đột biến rin đồng hợp tử (Mizrahi et al., 1982) Dưới điều kiện stress về ngập nước, các quả đồng hợp tử nor

đã chín, tuy không được như quả bình thường (Arad và Miz- Rahi , 1983) Các kết

quả này đã gợi ý một phương án để cảm ứng sự chín của các quả đồng hợp tử nor

có thời hạn sử dụng lâu dài cùng với màu sắc và hương vị chấp nhận được và từ đó

có thể được thương mại hóa

1.2.3 Các thành tựu tạo giống cà chua chín chậm sử dụng các đột biến rin, nor

và alc

Ở Australia, các giống lai sử dụng đột biến rin là “Red Centre” (tổ hợp lai HRAS 87-70 Rin-HRAS × 81-85) và “Juliette” (79T-1 × rin-795.054-1) đã được

đưa vào sản xuất, là các giống cà chua lai được phát triển bởi Trạm nghiên cứu và

tư vấn làm vườn Gosford (Gosford Horticultural Research & Advisory Station), chúng đều có kiểu sinh trưởng bán hữu hạn (1,2-1,4m), quả có thể bảo quản trong thời gian 40 ngày ở điều kiện 20oC mà vẫn giữ được chất lượng tốt (Nguyen, 1991,

Nguyen, 1994) Ở Nga, giống lai năng suất cao sử dụng đột biến nor là “Vasilisa”

đã được giới thiệu vào sản xuất (Gavrish and Bogdanov, 1992) Ở Trung Quốc,

giống cà chua lai “Changling” được đánh giá là rất tốt với gen nor dị hợp tử đã được phát hành (Lu et al., 1994) Tại Ba lan, giống lai F1 (S15 × nor) đã được đăng

ký tên là "Rafa" và được đưa vào sản xuất, cho năng suất cao và chất lượng quả tốt

(Seroczynska et al., 1998) Tại Bulgaria, 2 giống cà chua lai “Asya” và “Lorin” dị hợp tử về gen rin đã được phát triển cho sản suất (Danailov, 2002) Giống cà chua lai ăn tươi “Mountain Crest” (tổ hợp NC84173PVP x NC1rinEC) được phát triển bởi đại học North Carolina State University, Hoa Kỳ, là giống cà chua lai cho năng

suất cao, có thời gian bảo quản dài, khi chín chịu được vận chuyển, có kiểu hình

sinh trưởng vô hạn, kháng héo Verticillium và Fusarium, chịu nhiệt, quả khi chín có màu đỏ đẹp, mang gen ức chế sự chín rin dị hợp tử (Gardner, 2006)

1.3 Nghiên cứu về bệnh xoăn vàng lá và chọn tạo giống cà chua kháng TYLCV 1.3.1 Nguyên nhân gây bệnh xoăn vàng lá

Bệnh xoăn vàng lá cà chua lần đầu tiên được xác định tại Israel vào năm

1930 và hiện nay đã được xác định do một nhóm các loài begomovirus khác nhau thuộc họ geminivirus gây ra, được lan truyền bởi vector bọ phấn trắng (Bemisia

tabaci ) theo kiểu bền vững tuần hoàn Mặc dù nhóm geminivirus này bao gồm các

loài riêng biệt, nhưng chúng vẫn được gọi chung là virus xoăn vàng lá cà chua -

Tomato yellow leaf curl virus (Vidavski, 2007)

TYLCVD cho đến nay được biết có liên quan tới ít nhất 11 loài và hơn 25

chủng monopartite begomoviruses (Fauquet et al., 2008) Bệnh virus xoăn lá cà chua (Tomato leaf curl virus disease - ToLCVD) có những triệu chứng khác rất nhỏ với TYLCVD, nó được chú ý sau này do được gây ra bởi các loài begomovirus bộ gen kép (bipartite begomovirus) và bởi sự khác biệt trong chuỗi DNA-A (Pena et al., 2010) Các loài begomovirus bộ gen kép (bipartite genome) gồm hai phân tử

DNA sợi vòng đơn: DNA-A (2,6-2,8 kb) và DNA-B (2,5-2,8 kb) (Gronenborn, 2007), các loài có bộ gen đơn tương đương phân tử DNA-A

1.3.2 Nghiên cứu về gen kháng chọn tạo giống cà chua kháng virus xoăn vàng lá

Locus Ty-1 đã được lập bản đồ đầu tiên trên nhiễm sắc thể số 6 với các Chỉ

thị RFLP TG297 và TG97 sử dụng các quần thể được tao ra từ từ hợp lai giữa dòng

mẹ mẫn cảm cảm M82-1-8 (S lycopersicum) với mẫu giống kháng LA1969 thuộc loài dại S chilense (Zamir et al., 1994) Các cây mang alen đồng hợp tử từ LA1969

nằm trong vùng giữa các chỉ thị RFLP TG297 và TG97 thể hiện tính kháng cao, không có triệu chứng bệnh khi lây nhiễm với TYLCV Các chỉ thị dựa trên RFLP

TG97 liên kết chặt với gen Ty-1 đã được phát triển tại Hebrew University of Jerusalem, Israel Chỉ thị CAPS JB-1 liên kết chặt với Ty-1 đã được xác định, nó cho phép chọn lọc nhanh gen Ty-1 bằng phản ứng PCR với một cặp mồi đặc hiệu (Castro

et al., 2007) Marker JB-1 có nguồn gốc từ RFLP C21, nó tạo ra 3 alen khác nhau nhờ cắt hạn chế sản phẩm PCR bằng enzyme TaqI Alen 1 có kích thước gần 400bp,

alen 2 hơi lớn hơn 400 bp và alen 3 có kích thước 500bp Alen 2 và 3 là đồng trội và

trội hơn alen 1 Các giống xuất hiện alen 3 là giống có gen Ty-1, các giống có alen 1

là alen mẫn cảm ty-1, alen 2 có nguồn gốc từ một loài cà chua dại khác Mới đây,

Cuixuan et al (2012)đã phát triển thành công chỉ thị TG97, cho phép phát hiện và phân

biệt kiểu gen kháng Ty1 cả dạng đồng và dị hợp tử Theo đó, sản phẩm PCR tạo bởi cặp mồi TG97F/R có kích thước 398 bp, sau khi cắt bằng TaqI, các giống có kiểu gen kháng

Ty-1 đồng hợp cho 2 vạch là 303 và 95 bp; kiểu gen Ty-1 dị hợp tử cho 3 vạch 398, 303

và 95 bp; các giống không mang alen kháng thì không bị cắt (398 bp)

Locus Ty-2 đã được lập bản đồ trên nhiễm sắc thể số 11 với các Chỉ thị

RFLP TG393 và TG36 sử dụng nguồn kháng là dòng giống H24 có nguồn gốc từ

S habrochaites (Hanson et al., 2000) Hiện nay, một số chỉ thị dựa trên PCR cho

vùng DNA chuyển vị từ S habrochaites đã được phát triển Chỉ thị CAPS TG105A

cho thấy khả năng khuếch đại mạnh và cắt hạn chế sản phẩm PCR bằng enzyme

TaqI đã tạo ra các đoạn DNA đa hình cho S habrochaites và S lycopersicum Một marker dựa trên PCR khác là T0302 cũng được phát triển cho locus Ty-2 mà không

phải dùng enzyme giới hạn Phân tích liên kết cho thấy TG105A và T0302 liên kết

chặt với nhau, khoảng cách của các marker này với gen Ty-2 là xấp xỉ 10 cM (Ji et

al., 2007c) Các nghiên cứu chọn tạo giống sử dụng chỉ thị phân tử để chọn lọc gen

kháng Ty-2 gần đây đều chấp nhận sử dụng chỉ thị T0302 như là chỉ thị tốt nhất đối

với gen kháng này

Năm 2006, Agrama và Scott đã đưa ra một bản đồ QLT cho tính kháng

TYLCV và ToMoV (Tomato Mottle Virus) trong các accession S chilense

LA2779 và LA1932 sử dụng các chỉ thị RAPD (Ji và cộng sự, 2007a; Pena và cộng

sự, 2010) Nghiên cứu này cho thấy có 3 vùng trên nhiễm sắc thể số 6 góp phần tạo nên tính kháng cả hai virus TYLCV và ToMoV Vùng thứ nhất chính là vùng có

chứa gen khánh Ty-1, trong khi hai vùng khác nằm hai bên sườn của locus sp pruning) và c (potato leaf) Các Chỉ thị RAPD liên kết với tính kháng trong các

(self-vùng này đã được xác định bằng cách sử dụng các dòng giống kháng có nguồn gốc

từ các accession LA2779 và LA1932 Sau đó, Ji và cộng sự (2007b) đã lập một bản

đồ chi tiết cho tính kháng begomovirus và nhận ra một vùng DNA lớn được chuyển

vị từ S chilense kéo dài từ marker C2_A2g39690 đến T0834 trong các dòng giống

có nguồn gốc từ LA2779 kháng cả hai virus TYLCV và ToMoV Một locus kháng

begomovirus đã được lập bản đồ ở khoảng giữa marker cLEG-31-P16 và 1079 trên

nhánh dài của nhiễm sắc thể số 6, và được xác định là Ty-3 Phía trên locus Ty-3, vùng DNA lớn được chuyển vào này cũng nối với vùng Ty-1 gần gen Mi, gợi ý rằng các alen tại cả hai locus Ty-1 và Ty-3 có khả năng cùng tồn tại và nối với

nhau Trái lại, các dòng giống tiên tiến có nguồn gốc từ LA1932 có một vùng DNA được chuyển vào ngắn hơn, từ cLEG-31-P16 đến C2_A5g41480, vùng này cũng

mang một locus kháng begomovirus có lẽ là một alen thuộc locus Ty-3 Ji và Scott (2006) đã xác định rằng các locus Ty-3 định vị trong một khu vực bao gồm locus

FER (25 cM, BAC clone 56B23, AY678298) Kết quả giải trình tự gen G8 của BAC clone 56B23 cho thấy trình tự tại đây là khác nhau đối với các dòng có nguồn

gốc từ S chilense LA2779 và LA1932 (Maxwell et al., 2007) Để phân biệt hai vùng chuyển vị này, vùng LA2779 được chỉ định là Ty-3 và vùng từ LA1932 được chỉ định là Ty-3a Chỉ thị đồng trội FLUW25 (SCAR marker) đã được phát triển (Ji

et al., 2007c) cho phép phát hiện được kháng Ty-3 và mẫn cảm ty-3 (S

lycopersicum ), nhưng không phát hiện được alen Ty-3a (Ji et al., 2007a) Để khắc

phục vấn đề này, nhóm tác giả trên đã phát triển chỉ thị đồng trội SCAR đặt tên là

P6-25 cho phép phát hiện được các alen Ty-3, ty-3 và Ty-3a (Ji et al., 2007a) Khi

sử dụng cặp mồi P6-25F2/R5 này để sàng lọc một vài giống lai thương mại từ các công ty, các tác giả đã thu được đoạn DNA PCR kích thước 660 bp từ 3 giống lai thương mại, các doạn DNA này được giải trình tự và cho thấy 100% tương đồng

với đoạn từ S chilense LA1969 Vùng chuyển vị mới được phát hiện có nguồn gốc

từ S.chilense LA1969 này được gọi là Ty-3b (Ji et al., 2007a)

Ji et al (2008) đã phát hiện một vùng chuyển vị S chilense 14 cM trên

nhánh dài của nhiễm sắc thể số 3 trong một số dòng giống kháng có nguồn gốc từ

LA1932 Sau đó, một locus kháng begomovirus mới là Ty-4 đã được lập bản đồ

bằng các chỉ thị vào khoảng 2,3 cM giữa C2_A4g17300và C2_A5g60160 trong

vùng chuyển vị (Ji et al., 2009) Phân tích quần thể phân ly về locus Ty-3 và Ty-4

đã chứng minh rằng Ty-3 giải thích 59,6% biến dị kiểu hình kháng (phenotypic variation), trong khi Ty-4 chỉ giải thích cho 15,7%, điều này gợi ý rằng Ty-4 tạo ra một hiệu lực kháng TYLCV nhỏ hơn Các dòng tái tổ hợp mang cả Ty-3 và Ty-4 có

mức kháng cao hơn với TYLCV (Ji et al., 2009)

Hình 1.1 Bản đồ gen Ty-3 trên nhiễm

sắc thể số 6 (Ji et al., 2007b) Hình 1.2 Bản đồ phân tử gen Ty-4 trên nhiễm sắc thể số 3 (Ji et al., 2009)

Anbinder et al (2009) đã lập bản đồ một QLT lớn và bốn QLT phụ nhỏ góp phần

tạo nên tính kháng TYLCV trong dòng giống TY172 có nguồn gốc từ S peruvianum

QLT lớn được đặt tên là Ty-5, được lập bản đồ trên nhiễm sắc thể số 4 trong vùng lân cận của marker SINAC1 và chịu trách nhiệm 39.7 - 46.6% biến dị kiểu hình Các QLT nhỏ, bắt nguồn từ các dòng bố mẹ kháng hoặc mẫn cảm, được lập bản đồ trên nhiễm sắc thể số

1, 7, 9 và 11, và chịu trách nhiệm 12% biến dị về mức độ nghiêm trọng theo triệu chứng,

bổ sung tính kháng cho gen Ty-5 (Anbinder et al., 2009b)

Đã có nhiều cố gắng trong việc nhận diện và lập bản đồ các gen qui định

tính kháng TYLCV trong S pimpinellifolium và S cheesmaniae nhưng không tạo

ra được các bản đồ tốt cũng như không tìm ra được các marker liên kết chặt phù hợp cho MAS (Pena et al., 2010)

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu

- 21 tổ hợp cà chua lai F1 chín chậm, kháng virus xoăn vàng lá và mốc

sương được cung cấp bới trung tâm bảo tồn và phát triển nguồn gen cây trồng (bảng 3.1)

- Quần thể phân ly 331/1219 F2 được gây tạo tại trung tâm bảo tồn và

phát triển nguồn gen cây trồng từ tổ hợp lai giữa dòng bố 331 (là dòng cà

chua mang gen ức chế sự chín rin đồng hợp tử được chọn tăng tiến đến đời F7

từ tổ hợp lai 138x159) với dòng mẹ 1219 mang các gen kháng Ph-3, 3,

Ty-2 và Ty-1 đồng hợp tử (được Trung tâm Bảo tồn và phát triển nguồn gen Cây

trồng chọn tạo bằng chỉ thị phân tử)

- Đối chứng là giống cà chua lai F1 Savor, là giống có gen kháng xoăn

vàng lá Ty-1 đang được trồng phổ biến trong sản xuất

Bảng 2.1 Danh sách các THL F1 sử dụng trong nghiên cứu

- Thí nghiệm 1: Đánh giá đặc điểm nông sinh học, năng suất, chất lượng,

tính chín chậm, khả năng kháng xoăn vàng lá và mốc sương của các THL F1

- Thí nghiệm 2: sử dụng chỉ thị phân tử DNA chọn lọc các cá thể tốt có năng

suất cao, mang gen rin, Ty1, Ty2, Ty3 và Ph-3 từ quần thể phân ly 331/1219 F2

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp đánh giá các đặc điểm nông sinh học, năng suất, chất lượng quả

a/ Bố trí thí nghiệm

- Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khảo sát tuần tự không nhắc lại, mỗi THL trồng 25 cây

- Khoảng cách, mật độ: hàng x cây = 70 x 50 cm, mật độ khoảng 2,67 vạn cây/ha

- Thời vụ: vụ thu đông (9/2014 đến 2/2015)

- Kỹ thuật trồng, chăm sóc:

Giai đoạn vườn ươm: hạt giống được gieo trên giá thể gồm trấu hun và đất

bột theo tỷ lệ 1:1 Hạt được gieo trong khay bầu, tưới phun mù đủ ẩm, đặt trong nhà