xác định virus hại đậu đỗ tại miền bắc việt nam

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp, trong suốt thời gian thực tập, nghiên cứu, tôi đã nhận đượ

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-o 0o -

HỒ NGỌC LINH CHI

XÁC ĐỊNH VIRUS HẠI ĐẬU ĐỖ

Trang 2

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng công bố trong bất kỳ một công trình khoa học nào khác Các thông tin trích dẫn sử dụng trong luận văn đều được ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2015

Hồ Ngọc Linh Chi

Trang 3

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp, trong suốt thời gian thực tập, nghiên cứu, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của Giáo viên hướng dẫn, của các tập thể, cá nhân, sự động viên của gia đình và bạn bè Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới TS Hà Viết Cường – Giám đốc Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam đã dành cho tôi sự chỉ dẫn và giúp đỡ tận tình trong suốt thời gian thực tập và nghiên cứu hoàn thành bản luận văn này

Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của tập thể các thầy, cô giáo bộ môn Bệnh cây – Khoa Nông học – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến sự giúp đỡ nhiệt tình của lãnh đạo và tập thể cán bộ Chi cục Kiểm dịch thực vật vùng 5 – Hà Nội, Trung tâm Nghiên Cứu Bệnh Cây Nhiệt Đới – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam đã động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa học và thực hiện

đề tài nghiên cứu

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn của mình đến tất cả bạn bè, người thân và gia đình đã luôn động viên và tạo điều kiện giúp đỡ tôt trong quá trình học tập và thực hiện luận văn này

Hà Nội, Ngày 25 tháng 5 năm 2015

Tác giả luận văn

Hồ Ngọc Linh Chi

Trang 4

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii

1.3 Kỹ thuật ELISA chẩn đoán virus thực vật 18

1.4 Kỹ thuật thuật PCR chẩn đoán virus thực vật 19

Trang 5

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv

1.5 Kỹ thuật thuật LAMP chẩn đoán virus thực vật 19

2.4.2 Phương pháp thu thập bảo quản mẫu lá bệnh 27 2.4.3 Phương pháp kiểm tra virus bằng ELISA 27 2.4.4 Phương pháp kiểm tra virus bằng PCR 29 2.4.5 Phương pháp kiểm tra virus bằng phản ứng LAMP 33

3.1 Điều tra bệnh virus trên đậu đỗ tại Hà Nội năm 2014 35 3.1.1 Tình hình sản xuất đậu đỗ tại Hà Nội 35 3.1.2 Điều tra bệnh virus trên đậu tương tại Hà Nội năm 2014 35

3.1.4 Điều tra bệnh virus trên đậu đen tại Hà Nội năm 2014 44

3.2.1 Kiểm tra phát hiện các Potyvirus trên đậu đỗ thu tại Miền Bắc

Trang 6

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v

3.2.2 Kiểm tra ELISA phát hiện các Comovirus trên đậu đỗ thu

3.2.3 Kiểm tra ELISA phát hiện Luteovirus trên mẫu đậu đỗ thu

3.2.4 Kiểm tra ELISA phát hiện Carlavirus trên mẫu đậu đỗ thu

3.2.5 Kiểm tra ELISA phát hiện CPMoV và SBMV trên mẫu

đậu đỗ thu tại tại Miền Bắc Việt Nam 60 3.3 Phát hiện virus bằng trên đậu đỗ bằng PCR 62 3.3.1 Phát hiện legumovirus trên đậu đỗ bằng PCR dung cặp

Trang 7

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi

3.9 Kiểm tra phát hiện các Potyvirus trên đậu đỗ thu tại Miền Bắc Việt

3.10 Kiểm tra ELISA phát hiện các Comovirus trên đậu đỗ thu tại

3.11 Kiểm tra ELISA phát hiện Luteovirus trên mẫu đậu đỗ thu tại Miền

3.12 Kiểm tra ELISA phát hiện Carlavirus trên mẫu đậu đỗ thu tại Miền

3.13 Kiểm tra ELISA phát hiện CPMoV và SBMV trên mẫu đậu đỗ thu

tại Miền Bắc Việt Nam năm 2014 bằng ELISA 61

Trang 8

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii

3.14 Kết quả PCR kiểm tra các legumovirus dùng cặp mồi chung Leg-cpF/R 62 3.15 Kết quả PCR kiểm tra MYMY trên đậu đỗ bằng mồi đặc hiệu 64 3.16 PCR phát hiện KuMV trên cây họ đậu tại khu vực Hà Nội năm 2014 67 3.17 Đánh giá khả năng phát hiện KuMV và MYMV bằng LAMP-PCR 71

Trang 9

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii

DANH MỤC HÌNH

1.1 Bệnh khảm lá do BCMV trên cây họ đậu (CABI, 2012) 7

1.2 Bệnh khảm lá do Soybean mosaic virus trên cây họ đậu (CABI, 2012) 12 1.3 Triệu chứng khảm vàng trên đậu xanh ở giai đoạn cuối của bệnh 15 1.4 Vị trí các mồi và các vùng thiết kế mồi cho phản ứng LAMP 20

1.14 Các bước tiến hành trong phương pháp LAMP 24 3.1 Khảm nhăn trên cây đậu tương tại Hà Nội năm 2014 36 3.2 Khảm vàng trên cây đậu tương tại Hà Nội năm 2014 37 3.3 Khảm lùn trên cây đậu tương tại Hà Nội năm 2014 37 3.4 Khảm vàng gân trên đậu xanh tại Hà Nội năm 2014 40 3.5 Khảm vàng trên đậu xanh tại Hà Nội năm 2014 40 3.6 Khảm nhăn trên đậu xanh tại Hà Nội năm 2014 40

3.8 Khảm gân xanh trên cây đỗ đen tại Hà Nội năm 2014 45 3.9 Khảm nhăn trên cây đỗ đen tại Hà Nội năm 2014 45 3.10 Khảm vàng lá trên cây đỗ cove tại Hà Nội năm 2014 47

Trang 10

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ix

3.11 Khảm gân xanh trên cây đỗ cove tại Hà Nội năm 2014 48 3.12 Khảm nhăn trên cây đỗ cove tại Hà Nội năm 2014 48 3.13 Kiểm tra ELISA phát hiện virus hại đậu đỗ thu tại Miền Bắc 2014 51 3.14 Kết quả PCR kiểm tra các legumovirus dùng cặp mồi chung Leg-

Trang 11

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page x

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BCMV Bean common mosaic virus

BCMNV Bean common mosaic necrosis virus

BCMV Bean Common Mosaic Virus

BLRV Bean leaf roll virus

BYMV Bean yellow mosaic virus

BBTMV Broad bean true mosaic virus

BBWV-2 Broad bean wilt virus 2

CNSH Công nghệ sinh học

CABMV Cowpea aphid-born mosaic virus

CPMMV Cowpea mild mottle virus

CPMV Cowpea mosaic virus

CPMoV Cowpea mottle virus

CPSMV Cowpea severe mosaic virus

CMV Cucumber mosaic virus

DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen DAS-ELISA Double-antibody sandwich ELISA

ELISA Enzyme Liked Immunosorbent Assay

FIP Forward inner primer

KuMV Kudzu mosaic virus

LAMP Loop-mediated isothermal amplification of DNA

MiYLCV Mimosa Yellow Leaf Curl Virus

MYMV Mung bean yellow mosaic virus

PEMV Pea enation mosaic virus

PSbMV Pea seed-borne mosaic virus

PCR Polymerase Chain Reaction

RT-PCR reverse transcriptase - Polymerase Chain Reaction

SBMV Southern bean mosaic virus

SMV Soybean mosaic virus

TMV Tobacco mosaic virus

TAS-ELISA Triple antibody sandwich ELISA

Trang 12

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1

về dinh dưỡng, cây họ đậu là cây trồng duy nhất có tác dụng cải tạo đất, làm tăng độ màu mỡ cho đất nông nghiệp

Một trong những yếu tố chính hạn chế năng suất cây họ đậu là sâu bệnh hại, trong đó có các bệnh về virus Thành phần virus hại cây họ đậu rất đa dạng Trên thế giới, khoảng 111 loại virus có thể gây bệnh trên đậu

đỗ (CABI, 2012)

Ở Việt Nam, cho tới nay có rất ít các công bố về thành phần virus nhiễm trên cây họ đậu Đầu tiên là một nghiên cứu dựa trên phân tích miễn dịch liên kết men (Enzyme Liked Immunosorbent Assay - ELISA) và giải trình tự từ các mẫu hạt giống đậu đỗ thu thập ở miền Bắc Việt Nam Dựa trên nghiên cứu này, các tác giả đã xác nhận sự có mặt của Bean Common Mosaic Virus

(BCMV) trên hạt đậu (Vigna unguiculata) và cho thấy tỷ lệ hạt đậu nhiễm virus là từ 0.8 % tới 12.4 % (Hao et al., 2003) Nghiên cứu thứ hai là các phân

tích trình tự gen từ 9 mẫu BCMV phân lập từ các cây họ đậu biểu hiện triệu chứng bệnh như đậu đen, đậu đỏ, đậu đũa, đậu tương và muồng 3 lá (một cây

che phủ cà phê) thu thập tại nhiều tỉnh ở Việt Nam (Ha et al., 2008b) Tại

Việt Nam, có 2 begomovirus mới được xác định gần đây trên cây họ đậu là KuMV (Kudzu mosaic virus) gây bệnh khảm lá đậu tương ở Miền Bắc (Hà Viết Cường, 2010) và MYMV (Mung bean yellow mosaic virus) gây bệnh

Trang 13

khảm lá đậu xanh ở Miền Trung (Tsai et al., 2013)

Bệnh hại cây trồng là một trong những yếu tố chính gây mất năng suất

và giảm chất lượng nông sản hiện nay Sự phát sinh dịch bệnh trên cây trồng ngày càng khó kiểm soát bởi sự xuất hiện của những tác nhân gây bệnh mới

và sự biến đổi khí hậu theo hướng bất lợi cho cây trồng Việc chẩn đoán chính xác tác nhân gây bệnh là yếu tố quan trọng giúp cho sự thành công của biện pháp phòng trừ

Đối với bệnh virus, việc chẩn đoán chủ yếu dựa vào các kỹ thuật phân tử như ELISA, RT-PCR, PCR Gần đây, một kỹ thuật chẩn đoán dựa trên nguyên lý nhân gen đẳng nhiệt (LAMP- PCR) cũng đã được thử nghiệm trong chẩn đoán nhiều tác nhân gây bệnh kể cả virus

Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, được sự phân công của Bộ môn Bệnh cây, Học viện nông nghiệp Việt Nam dưới sự hướng dẫn của TS Hà

Viết Cường, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Xác định virus hại đậu đỗ tại miền Bắc Việt Nam”

2 Mục đích

Xác định được thành phần loài virus hại trên cây đậu đỗ ở miền Bắc Việt Nam

3 Yêu cầu

1 Điều tra bệnh virus tại một số điểm trồng đậu đỗ thuộc Hà Nội

2 Xác định một số virus trên đậu đỗ bằng ELISA

3 Xác định KuMV bằng PCR, và LAMP-PCR

4 Xác định MYMV bằng PCR và LAMP-PCR

Trang 14

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiêu cây họ đậu

1.1.1 Cây đậu tương

Đậu tương (Glycine max) là một cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị kinh tế

cao Khó có thể tìm thấy một cây trồng nào có tác dụng nhiều mặt như cây đậu tương Sản phẩm của nó làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp, hàng xuất khẩu và là cây cải tạo đất tốt Vì thế

cây đậu tương được gọi là "Ông Hoàng trong các loại cây họ đậu " Sở dĩ cây

đậu tương được đánh giá như vậy bởi lẽ cây đậu tương có giá trị rất toàn diện Giá trị về mặt thực phẩm, hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng prôtein trung bình khoảng từ 35.5% - 40%, trong khi đó hàm lượng prôtein trong gạo chỉ 6.2% - 12%; ngô: 9.8% - 13.2% thịt bò: 21%; thịt gà: 20%; cá: 17% - 20% và trứng: 13% - 14.8% Ngoài ra hàm lượng lipit trong đậu tương cũng rất cao từ 15% - 20 %, cao gấp hai lần so với các giống

đậu đỗ khác (Song et al., 2003)

Đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt, 1ha trồng đậu tương nếu sinh

trưởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30 - 60kg N Trong hệ thống luân canh, nếu bố trí cây đậu tương vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với cây trồng sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng mà giảm chi phí cho việc bón N Thân lá đậu tương có thể dùng bón ruộng thay phân hữu cơ bởi hàm lượng N trong thân chiếm 0.05%, trong lá 0.19% (Trần Văn Điền, 2007)

1.1.2 Cây đậu xanh

Đậu xanh hay đỗ xanh là cây đậu có tên khoa học Vigna radiata Cây

đậu xanh rất quan trọng cho thực phẩm dinh dưỡng của con người và làm giàu màu mỡ của đất (Shanmugasundaram & Britain, 2004) Đậu xanh là loại cây trồng chủ yếu ở châu Á

Qua nghiên cứu, người ta thấy rằng các nốt sần trên cây đậu xanh có khả

Trang 15

năng hút lấy chất đạm từ không khí và cung cấp cho đất khoảng 40Kg – 50Kg N/ha (tương đương 80kg – 100kg phân ure) Thân lá đậu xanh còn được sử dụng làm phân hữu cơ rất tốt Hạt được sử dụng để chế biến thành nhiều loại thực phẩm phong phú Hiện nay có một số giống đậu xanh cho năng xuất cao, phẩm chất hạt tốt, nếu người trồng chú trọng đầu tư, thâm canh sẽ cho sản lượng cao và đem lại hiệu quả kinh tế lớn (Hà Thị Hiến, 2004)

1.1.3 Cây đậu đen

Đậu đen là loài cây phân họ Đậu có danh pháp khoa học là Vigna

cylindrica Hiện nay cây đậu đen cũng được trồng ở khắp các vùng nhiệt đới

và cận nhiệt đới ở Châu Á, Châu Phi, Nam Mỹ và kể cả Hoa Kỳ (ở Hoa kỳ

cây đậu đen được trồng làm nguồn thức ăn gia súc) (Iqbal et al., 2006) Hạt

đậu đen có giá trị dinh dưỡng cao Ngoài việc dùng làm thực phẩm, đậu đen còn được dùng để bào chế thuốc hoặc ngâm tẩm các vị thuốc để giảm bớt độc tính của thuốc Ðậu đen có vị ngọt nhạt, tính mát có tác dụng bổ huyết, bổ gan thận giải phong nhiệt, giải độc, hạ khí, lợi tiểu

1.1.4 Cây đậu cove

Đậu cove (Phaseolus vulgaris) có nguồn gốc từ Trung Mỹ, được trồng

phổ biến ở Đông Phi, Bắc Mỹ, Nam Á, Phía Tây và Nam Châu Âu

Đậu cove có hai loại là: cove lùn và cove leo Quả non chứa khoảng 2.5% đạm, 0.2% chất béo, 7% chất đường bột và đặc biệt nhiều vitamin A, C

và chất khoáng, trái có thể ăn tươi, đóng hộp và đông lạnh Ở các nước Châu

Á như Ấn Độ, Miến Điện, Nepal, Sri-lanka, Bangladesh hạt đậu cove khô được sử dụng trong các bữa ăn kiêng Đậu cove là một trong những loại hoa màu thích nghi trong hệ thống luân canh với lúa và là loại đậu rau quan trọng bậc nhất vì phân bố rộng khắp, sản lượng tương đối lớn và có khả

năng là nguồn thu nhập khá cao cho các nông hộ (Koehler et al., 1987; Van

der Poel, 1990)

Trang 16

1.2 Một số virus quan trọng trên cây họ đậu

1.2.1 Bean common mosaic virus (BCMV)

1.2.1.1 Phân loại

BCMV có bộ gen ARN sợi đơn dương (ssRNA), họ Potyviridae, chi

Potyvirus Virus còn được gọi bằng những tên khác nhau như: Bean common mosaic potyvirus, Bean mosaic virus, bean virus 1, Bean western mosaic virus, common bean mosaic virus Martyn 1968, Mungbean mosaic virus, Phaseolus virus 1 (Morales & Bos, 1988)

Tên thường được dùng phổ biến là Bean commom mosaic virus, viết tắt BCMV

Sự khác biệt trong các triệu chứng của cây kí chủ, huyết thanh học, tế bào học, chiều dài hạt virus và trọng lượng phân tử của protein áo giữa các chủng hoại tử và không hoại tử của Bean commom mosaic virus (BCMV) Và sự khác biệt trong các chuỗi protein áo tại N-thiết bị đầu cuối của các chủng gây triệu chứng hoại tử (NL8) và không hoại tử (NL4) của BCMV kết luận rằng BCMV nên phân loại lại thành hai potyviruses riêng biệt Họ cho rằng các chủng hoại tử được phân loại như chủng Bean necrosis mosaic virus (BNMV)

và chủng không hoại tử vẫn được phân loại như BCMV (Vetten et al., 1992)

Công bố kết quả nghiên cứu dựa vào phân tích peptide bằng kỹ thuật sắc

ký lỏng hiệu năng cao (high-performance liquid chromatographic) và trình tự gen của 22 chủng BCMV, chủng Blackeye cowpea mosaic virus (BlCMV) và chủng Peanut stripe virus (PStV) cho thấy có hai Potyvirus rõ ràng với chủng chết hoại tử NL3, NL5, NL8 và TN-1, có 90% mức độ tương đồng được xếp trong một nhóm A, các chủng BCMV với mức độ tương đồng từ 60% đến 80% được xếp vào nhóm B, các chủng không chết hoại NL4 và NL6, có chỉ

35% đến 40% tính tương đồng với dòng chết hoại (Larsen et al., 2005; Mink

& Silbernagel, 1992; Vetten et al., 1992)

1.2.1.2 Tầm quan trọng kinh tế

Trang 17

BCMV là virus gây thiệt hại quan trọng trên cây họ đậu ở khắp Châu Phi, Châu Âu, Bắc Mỹ và Mỹ Latinh Mức độ nhiễm bệnh có thể đạt tới 100%, tùy thuộc vào mức độ bị bệnh mà năng suất giảm từ 53% - 68% (CABI, 2012) Cây nhiễm bệnh BCMV vừa và nặng làm giảm 50% và 64%

số lượng của quả/cây, cắt giảm 53% và 68% sản lượng hạt giống (Hampton, 1975) Nghiêm trọng hơn vào những năm 1972 và 1975 dịch bệnh BCMV xảy ra tại Marốc, trong đó 50 % tất cả các cây đậu trồng nhiễm BCMV từ hạt của vụ trước và lan truyền nhờ rệp, thiệt hại năng suất ước tính tới 50% và 34% hạt bị nhiễm bệnh sau thu hoạch (CABI, 2012)

1.2.1.3.Triệu chứng gây hại

Cây đậu khi bị nhiễm virus BCMV có thể tạo ra một số triệu chứng sau: khảm thường, khảm vàng, khảm xanh (có các nốt phồng xanh đậm), lá thường nhăn, có thể cuốn, cây trồng từ hạt bị nhiễm bệnh gần như luôn luôn còi cọc

và không có năng xuất (Mukeshimana, 2003) Tuy nhiên triệu chứng phụ thuộc nhiều vào chủng virus, giống cây, giai đoạn phát triển, thời điểm nhiễm

và điều kiện ngoại cảnh

Triệu chứng bệnh thể hiện chủ yếu trên lá cây bệnh Triệu chứng có thể xuất hiện ngay sau khi cây nảy mầm Lá sò bị nhiễm bệnh thể hiện triệu chứng lá bị co lại, hai mép lá thường cụp xuống và uốn cong Trên lá thật có nhiều dạng triệu chứng như khảm xanh nhạt và xanh đậm, cuộn lá, lá bị dị dạng hoặc có những chấm màu vàng (Vũ Triệu Mân, 2007) Nếu cây nhiễm từ hạt thì các lá non đầu tiên bị đốm biến vàng và biến dạng, cây bệnh có ít quả, quả nhỏ, chín chậm, vỏ quả có các đốm màu xanh đậm Một số chủng virus có thể tạo triệu chứng chết hoại màu nâu đen ở gân lá gọi là bệnh “thối đen”

Triệu chứng này chỉ xuất hiện trên các giống có gen kháng trội I Vết chết

hoại có thể phát triển tới thân, rễ và đỉnh sinh trưởng Cây có thể chết nếu nhiễm sớm, nếu nhiễm muộn cây vẫn sống nhưng có thể sống từng phần (Hà Viết Cường, 2010) Sự phát triển của một loại triệu chứng phụ thuộc vào

Trang 18

giống cây trồng, thời gian bị nhiễm, chủng BCMV và điều kiện môi trường (Hart & Saettler, 1981)

Hình 1.1 Bệnh khảm lá do BCMV trên cây họ đậu (CABI, 2012)

1.2.1.4 Lan truyền

Qua hạt giống/phấn hoa

BCMV là một virus nhiễm trên hạt nhiều loại cây họ đậu, đặc biệt trên

các giống đậu P Vulgaris BCMV có khả năng truyền qua phấn hoa vì virus

đã được phát hiện thấy trong hạt phấn

BCMV có mặt ở nhiều bộ phận như lá đài, cánh hoa, nhị và nhụy Dịch chiết từ quả và phôi của hạt non có khả năng lây nhiễm rất cao Cây bị nhiễm sớm có tỷ lệ hạt nhiễm virus rất cao (có thể > 50%)

Thời điểm nhiễm bệnh ảnh hưởng đến khả năng truyền qua hạt Cây bị nhiễm ở giai đoạn lá thật đầu tiên thì tỷ lệ truyền qua hạt cao, có thể tới 90% Cây bị nhiễm ở giai đoạn 3 lá thật thì tỷ lệ bệnh virus truyền qua hạt giảm mạnh chỉ còn 1% Nếu cây bị nhiễm sau ra hoa khoảng 1 tuần thì hạt không

có khả năng truyền virus (mặc dù vẫn có thể bị nhiễm virus) Trong một nghiên cứu khác, tỷ lệ hạt truyền virus đạt tối đa ở giai đoạn lá thật thứ nhất

và hầu như không có khả năng truyền qua hạt khi cây bị nhiễm bệnh khoảng 1 tháng sau trồng

Lây nhiễm virus vào lá mầm dẫn tới biểu hiện bệnh cũng như khả năng truyền qua hạt đạt tối đa Virus tồn tại chủ yếu ở phôi nhưng cũng có thể ở

Trang 19

các bộ phận khác của hạt Virus có mặt ở vỏ hạt nhưng biến mất khi hạt khô Virus có khả năng tồn tại trên hạt rất lâu mà vẫn duy trì khả năng truyền bệnh

Có thí nghiệm cho biết hạt vẫn có thể truyền bệnh sang cây con sau 30 năm

Có thí nghiệm cho thấy hạt bảo quản ở 2 oC - 4oC sau 6 năm vẫn có khả năng truyền bệnh với tỷ lệ 3% - 4% (Morales & Bos, 1988)

Hạt nhiễm virus nhìn chung không ảnh hưởng đến sức nảy mầm nhưng chất lượng hạt giảm sút mạnh

Truyền qua hạt là cách tạo sự nhiễm bệnh sơ cấp quan trọng nhất đối với cây đậu Tuy nhiên khả năng này cũng khác nhau tùy giống, chủng virus cũng như thời điểm cây mẹ bị nhễm bệnh

Qua vector

BCMV lan truyền tự nhiên ngoài đồng ruộng bằng nhiều loài rệp muội theo kiểu không bền vững Nhiều loài rệp mặc dù không sống trên cây đậu nhưng vẫn có khả năng truyền virus khi chúng di chuyển tìm thức ăn

Truyền qua rệp là cách truyền bệnh thứ cấp quan trọng trên đồng ruộng (Morales & Bos, 1988)

1.2.1.5 Phân bố địa lý

Châu Mỹ và là một trong những nơi đầu tiên trên thế giới báo cáo phát hiện ra bệnh virus BCMV (G.Mukeshimana, 2003) Ngày nay BCMV có thể được tìm thấy trên khắp thế giới, bất cứ nơi nào đậu được trồng, bao gồm nhiều khu vực ôn đới, cận nhiệt đới và nhiệt đới trên thế giới (CABI, 2012)

1.2.1.6 Phòng trừ

Do virus ký sinh nội bào và nhiễm hệ thống, nên việc phòng trừ trực tiếp bằng các biện pháp hóa học, cơ giới… là khó thực hiện Vì thế phòng trừ bệnh virus BCMV cần chú ý các vấn đề sau:

- Kiểm tra hạt giống trước khi gieo bằng cách: loại bỏ hạt bệnh trước khi gieo trồng, không thu hoạch hạt giống trên cây bệnh, chọn hạt giống khỏe trước khi gieo trồng và trong quá trình sinh trưởng của cây cần loại bỏ cây bệnh

Trang 20

- Phòng trừ côn trùng môi giới: do virus truyền lan trên đồng ruộng qua các côn trùng môi giới nên cần khống chế mật độ các côn trùng môi giới ở mức phù hợp bằng các biện pháp hóa học, sinh học, canh tác

- Chọn tạo giống chống chịu

- Biện pháp canh tác: luân canh cây trồng khác họ và xen canh có tác dụng cắt đứt nguồn bệnh, tăng tính đa dạng sinh học đồng ruộng, tăng mật độ các loài thiên địch, giảm lượng côn trùng môi giới, làm cản trở sự lây lan của virus

- Sử dụng tính kháng chéo bằng các chủng virus nhược độc (Lê Lương

Tề, 1998)

Tuy nhiên, phương pháp tốt nhất là kiểm soát bằng cách sử dụng hạt giống đã qua kiểm tra không nhiễm bệnh và các giống kháng hoặc cây trồng có gen kháng virus BCMV (French, 2010)

1.2.1.7 Chẩn đoán

Chẩn đoán dựa vào triệu chứng bệnh do BCMV gây ra là không dễ vì triệu chứng đa dạng và có nhiều virus khác cũng gây hại trên cây đậu với triệu chứng tương tự (đặc biệt các triệu chứng khảm lá)

Virus có thể được chẩn đoán bằng cây chỉ thị với 11 giống đậu (P

vulgaris) có thể phân biệt được 10 type gây bệnh khác nhau Virus có thể được chẩn đoán bằng ELISA dùng các kháng thể đơn dòng/đa dòng, đặc hiệu

loài thậm chí chủng (Musavi et al., 2014)

Virus cũng có thể được chẩn đoán bằng PCR Bằng cách áp dụng PCR, 4 chủng BCMV -PG -V được phân biệt chủng BCMV pathogroups I, II,

RT-IV và VII Phân biệt 2 BCMNV pathogroups ( PG- III và PG- VI) đã đạt được bằng enzyme giới hạn XbaI tiêu hóa của sản phẩm BCMNV PCR Có thể kết luận rằng một sự kết hợp của RT-PCR và phân tích enzyme hạn chế, nó có thể phân biệt cả hai loại virus (CABI, 2012)

1.2.1.8 BCMV tại Việt Nam

Ở Việt Nam, mặc dù các cây đậu đỗ thường biểu hiện triệu chứng giống

Trang 21

như bị nhiễm BCMV nhưng cho tới nay, chỉ có 2 công bố về virus quan trọng này Đầu tiên là một nghiên cứu dựa trên phân tích ELISA và giải trình tự từ các mẫu hạt giống đậu đỗ thu thập ở miền Bắc Việt Nam Dựa trên nghiên cứu

này, các tác giả đã xác nhận sự có mặt của BCMV trên hạt đậu (Vigna

unguiculata) và cho thấy tỷ lệ hạt đậu nhiễm virus là từ 0.8% - 12.4% Nghiên cứu thứ 2 là các phân tích trình tự gen từ 9 mẫu virus phân lập từ các cây họ đậu biểu hiện triệu chứng bệnh như đậu đen, đậu đỏ, đậu đũa, đậu tương và muồng 3 lá (một cây che phủ cà phê) thu thập tại nhiều tỉnh ở Việt Nam

Các nghiên cứu gần đây cho thấy vùng Đông Nam Á và đặc biệt Việt Nam là một trong những trung tâm phát hiện các chủng BCMV vì:

(i) BCMV đã được phát hiện thấy trên khá nhiều cây họ đậu như đậụ đen,

đậu đỏ (P vulgaris), đậu đũa (V unguiculata), đậu tương (Glycin max) và muồng 3 lá (Crotalaria anagyroides) – một cây che phủ cà phê tại Đắc Lắc

(ii) Phần lớn các mẫu BCMV phân lập tại Việt Nam đã phân nhóm với 2 nhóm chủng chính là chủng Black Eye Cowpea Mosaic (BlCM) và chủng Peanut Stunt Virus (PSt)

(iii) Đặc biệt, 2 mẫu BCMV phân lập từ đậu đen (BCMV-VN-BB2-5) và đậu đũa (BCMV-YB2) đã biểu hiện mức độ biến động trình tự gen rất cao, chẳng hạn thiếu các chuỗi epitope nằm ở đầu amin của protein CP và trong phân tích phả hệ, chúng nằm ở vị trí trung gian giữa cụm chứa tất cả các chủng BCMV và cụm chứa các potyvirus khác thuộc nhóm “BCMV”

(iv) Một phân tích phả hệ mới đây nhất dựa trên so sánh trình tự khoảng

400 chuỗi nucleotide mã hóa phần trung tâm và phần đầu vỏ virus đại diện cho 34 loài potyvirus thuộc nhóm “BCMV” đã chứng minh rõ ràng rằng các virus của nhóm này (kể cả BCMV) có nguồn gốc từ vùng Đông Nam Á, Nam

Á, và khu vực châu Đại Dương

Bảng 1.1 Một số isolate BCMV ở Việt Nam được giải trình tự gen CP

Trang 22

Bank

1 BlCMV-VN/BB1 DQ925417 Đậu đen (Phaseolus vulgaris) Hòa Bình

2 BlCMV-VN/BB2-6 DQ925423 Đậu đen (P vulgaris) Hòa Bình

3 BlCMV-VN/RB1 DQ925420 Đậu đỏ (P vulgaris) Huế

4 BlCMV-VN/RB2 DQ925421 Đậu đỏ (P vulgaris) Huế

5 BlCMV-VN/YB1 DQ925424 Đậu đũa (Vigna unguiculata) Vĩnh Phúc

6 PsTV-VN/SB1 DQ925418 Đậu tương (Glycin max) Đắc Lắc

7 PsTV-VN/Ca1 DQ925419 Muồng 3 lá (Crotalaria anagyroides) Đắc Lắc

8 BCMV-VN/BB2-5 DQ925422 Đậu đen (P vulgaris) Hòa Bình

9 BCMV-VN/YB2 DQ925425 Đậu đũa (V unguiculata) Yên Bái

1.2.2 Soybean mosaic virus

Virus có ARN sợi đơn dương (ssRNA), họ Potyviridae, chi Potyvirus,

loài Soybean mosaic potyvirus, ngoài ra virus còn có một số tên khác như : Soja virus 1, Soybean mosaic potyvirus, Soybean virus 1 (CABI, 2012)

Tên thường dùng Soybean mosaic virus, viết tắt SMV

Cây bị nhiễm thì các bộ phận trên cây thường nhỏ hơn về kích thước và cây bị còi cọc Cây con 60 ngày tuổi bị giảm trọng lượng dao động từ 35% -73% tùy thuộc vào chủng virus Chiều cao cây giảm 4.0% - 16.9%, số lượng

vỏ trên cây giảm khoảng 8.4% 33.4%, số hạt mỗi quả giảm khoảng 6.4% 15.2%, và tổng trọng lượng hạt giống trên cây giảm khoảng 6.6% - 17.8% (CABI, 2012)

-Khi nhiễm SMV hàm lượng protein trong hạt thường tăng lên, hàm lượng dầu trong hạt giảm, hàm lượng axit stearic và oleic tăng (CABI, 2012)

1.2.2.3 Triệu chứng gây hại

Các triệu chứng bên ngoài:

Đối với lá của cây bị nhiễm bệnh vùng gần gân lá thường phồng lên và

có nhiều nếp nhăn Lá của cây bệnh nhiễm từ hạt giống có biểu hiện những

Trang 23

vết lốm đốm và quăn xuống Cây bị nhiễm thường còi cọc vì cuống lá và lóng

bị rút ngắn lại, đặc biệt là khi cây còn non hay bị nhiễm từ hạt (CABI, 2012) Quả bị giảm về số lượng và kích thước, quả nhẵn hoặc không hạt và sản lượng có thể giảm đáng kể Virus có thể làm giảm kích thước của hạt giống, làm thay đổi thành phần hóa học và làm giảm khả năng nảy mầm của hạt giống do đó chất lượng của hạt giống giảm (CABI, 2012)

Truyền qua hạt giống

Virus gây bệnh có thể tồn tại và lan truyền qua hạt giống Trong hạt giống virus có thể tồn tại được 2 năm (Lê Lương Tề, 1998)

Trang 24

Tuy nhiên con người đóng vai trò chi phối trong việc lây lan của SMV bằng cách quyết định trồng cây họ đậu thông qua giống, thời gian trồng, mật

độ Con người cũng góp phần làm lây lan virus bằng việc mua bán hạt giống thương mại ( CABI, 2012)

SMV có thể được tìm thấy trên khắp thế giới, bất cứ nơi nào đậu được trồng Điều này bao gồm nhiều khu vực ôn đới, cận nhiệt đới và nhiệt đới trên thế giới (CABI, 2012)

- Nhổ bỏ những cây bị bệnh trên ruộng, tránh lây lan từ cây bệnh sang cây khỏe

- Diệt trừ côn trùng truyền bệnh bằng các loại thuốc hoá học

- Loại bỏ vĩnh viễn các nguồn của SMV thông qua luân canh cây trồng

và thực tiễn quản lý và kiểm soát vector bằng hành vi khác nhau, hóa học, di truyền, phương thức sinh học cũng sẽ rất hữu ích trong quản lý năng động

thời gian và không gian của SMV lây lan (Chen et al., 2008)

SMV được phân biệt tính sinh học từ potyvirus có phổ ký chủ tương đối hẹp Chủng của SMV có thể được xác định, và phân biệt từ virus gây bệnh khảm thông thường, sử dụng một tập hợp các giống khác biệt của đậu tương nhưng các thử nghiệm tốn thời gian Chủng phân lập của Trung Quốc cũng được phân biệt bằng cách sử dụng một tập hợp các giống khác biệt Thông thường sử dụng kháng huyết thanh để xét nghiệm huyết thanh

đa dòng cho SMV không thể phân biệt virus khỏi potyvirus khác, trừ trường hợp đặc biệt, bởi vì huyết thanh phản ứng chéo thường xảy ra giữa potyvirus Độ tin cậy, hiện nay phương pháp chẩn đoán và phát hiện chủ

Trang 25

yếu dựa vào các kỹ thuật huyết thanh học sử dụng kháng thể đơn dòng virus cụ thể và trên PCR (CABI, 2012)

Phân loại và xác định kiểu gen của SMV có thể đạt được bằng các kỹ thuật phân tử như chuỗi phản ứng polymerase (PCR) với gắn mồi thoái hóa, phiên mã ngược và PCR (RT-PCR), RT-PCR kết hợp với chiều dài đoạn đa hình (RT-PCR/RFLP) đảo ngược, lai tạo với 3' vùng không mã hóa của hệ

gen virus, và kết chuỗi nucleotide (Chen et al., 2008)

Lá cây đậu bị quăn xuống do bị phồng và có nhiều nếp gấp dọc theo gân

lá, tuy nhiên triệu chứng đó cũng không đủ bằng chứng thuyết phục để chứng

tỏ cây bị nhiễm SMV Triệu chứng khảm khác nhau thường biểu hiện khác nhau tùy theo điều kiện thời tiết và khó phân biệt trong thời kì nhiệt độ môi trường cao (CABI, 2012)

1.2.2.8 SMV tại Việt Nam

Hiện nay chưa có đánh giá ghi nhận virus SMV có gây hại tại Việt Nam

1.2.3 Mungbean yellow mosaic virus

Virus có DNA sợi đơn dương (ssDNA), họ Geminiviridae, chi

Begomovirus, loài Mungbean yellow mosaic virus, ngoài ra virus còn có một số

tên khác như: Mung bean yellow mosaic bigeminivirus, Mung bean yellow mosaic geminivirus, Mungbean yellow mosaic geminivirus ( CABI, 2012) Tên thường dùng Mungbean yellow mosaic virus, viết tắt MYMV

Bệnh do virus MYMV gây thiệt hại nghiêm trọng tới năng suất cây trồng

ở Ấn Độ Virus gây ra làm sản lượng của cây đậu tương giảm 15.2%, 51.8%

và 75.8% Đối với các loại cây họ đậu xanh khi cây bị nhiễm virus ở giai đoạn trước khi nở hoa, nở hoa và sau nở hoa thì giai đoạn tăng trưởng giảm 62.9%

và năng suất tối đa bị giảm 83.9%, các triệu chứng xuất hiện 20 ngày sau khi gieo Khi cây đậu bị nhiễm bệnh virus MYMV trong khoảng 3 tuần tuổi đầu thì mất hoàn toàn năng suất hạt giống (CABI, 2012)

Trang 26

1.2.3.3 Triệu chứng gây hại

Đậu xanh có đốm nhỏ màu vàng dọc theo gân lá rồi trải rộng ra phiến lá tạo các triệu chứng khảm vàng, quả vỏ mỏng và bị uốn cong lên (CABI, 2012)

Đậu đen có hai loại triệu chứng khảm vàng gây ra, tùy thuộc vào sự đa dạng: đốm vàng tổng quát trên lá gây vàng và đốm vàng hoại tử trên lá, trong

đó vàng lá bởi các điểm hoại tử nhỏ (CABI, 2012)

Hình 1.3 Triệu chứng khảm vàng trên đậu xanh

ở giai đoạn cuối của bệnh

1.2.3.4 Lan truyền

- Qua vecto

MYMV truyền nhiễm qua bọ phấn Bemisia tabaci trích hút và lan

truyền bệnh có thể được thực hiện trong ít nhất 15 phút Virus vẫn tồn tại theo kiểu bán bền vững tuần hoàn tối đa là 3 và 10 ngày, nhưng không tồn tại trong suốt cuộc đời của vector (CABI, 2012)

Giai đoạn nhộng có thể thu được virus con trưởng thành có được chủng

URD virus từ hạt đậu (Vigna mungo) trồng 1 - 3 ngày trước khi sự xuất hiện của các triệu chứng Virus không lây truyền qua trứng của B tabaci ( CABI, 2012)

Trang 27

rằng MYMV không di truyền qua hạt giống đối với cây đậu xanh hoặc đậu đen (CABI, 2012)

MYMV có thể được tìm thấy tại một số nước thuộc khu vực châu Á và châu Đại Dương Tại Ấn Độ, virus gây bệnh khảm vàng gây nghiêm trọng đối với cây đậu đen hơn với cây đậu xanh Tuy nhiên, ở Thái Lan bệnh thường gặp ở đậu xanh nhưng hiếm khi được quan sát thấy trong cây đậu đen trong điều kiện tự nhiên (CABI, 2012)

1.2.3.6 Phòng trừ

Dùng giống kháng bọ phấn

Dùng thuốc hóa học

Trồng cây trong nhà lưới, nhà kính

Dùng bẫy hấp dẫn màu vàng hoặc bề mặt phản xạ (chỉ áp dụng có hiệu quả trong điều kiện nhà lưới)

Các xét nghiệm huyết thanh học:

Tại Thái Lan sử dụng kháng huyết thanh để phân lập MYMV, với hiệu giá 1/512 trong gel xét nghiệm khuếch tán đôi, đã được sử dụng để phát hiện MYMV và phương pháp ELISA đã được sử dụng gần đây để xác định virus (CABI, 2012)

Thăm dò nhân bản vô tính đã được chuẩn bị cho mỗi hai ADN hệ gen, những cho cả DNA có thể được sử dụng trong các thử nghiệm tại chỗ lai để phát hiện nhiễm MYMV Thăm dò cho DNA B đã được sử dụng ở Ấn Độ để phát hiện MBYV ở thực vật và ruồi trắng (CABI, 2012)

1.2.3.8 MYMV tại Việt Nam

Tỷ lệ mắc cao của các triệu chứng khảm vàng đã được quan sát trên đậu tương và cây đậu đỗ ở Indonesia trong năm 2009 và trong cây đậu xanh tại Việt Nam trong năm 2011 Tất cả năm mẫu đậu tương và 20 mẫu đậu đỗ từ

Trang 28

Java, Indonesia, 15 mẫu đậu xanh từ Việt Nam với các triệu chứng dương tính với nhiễm trùng begomovirus bởi phản ứng dây chuyền polymerase (PCR) với cặp mồi PAL1v1978B/PAR1c715H Trên cơ sở vị trí thu thập và so sánh trình tự nucleotide của các thành phần 1.5 kb begomoviral DNA-A khuếch đại, một tập hợp con của các mẫu bao gồm hai mẫu đậu tương và sáu mẫu đậu

đỗ chủng phân lập tại Indonesia và năm chủng phân lập từ đậu xanh Việt Nam đã được đưa về kiểm tra chi tiết So sánh trình tự và phân tích phả hệ mẫu phân lập tại Indonesia và Việt Nam cùng với begomoviruses cây họ đậu lây nhiễm khác tiết lộ rằng tất cả các chủng phân lập từ Mungbean Yellow Mosaic India Virus (MYMIV) strain-A, và tất cả mẫu từ Việt Nam nhiễm Mungbean Yellow Mosaic Virus (MYMV) strain-B Theo sự hiểu biết của chúng tôi, đây là việc xác định đầu tiên của MYMIV và MYMV liên quan

đến khảm vàng của cây họ đậu ở Indonesia và Việt Nam (Tsai et al., 2013)

1.2.4 Kudzu mosaic virus

Tại Việt Nam, có 2 begomovirus mới được xác định gần đây trên cây họ đậu là KuMV (Kudzu mosaic virus) gây bệnh khảm lá sắn dây và MiYLCV

(Mimosa Yellow Leaf Curl Virus) gây bệnh xoăn vàng lá cây xấu hổ (Ha et

al., 2008a) KuMV được phát hiện lần đầu tiên trên cây sắn dây tại tỉnh Hòa

Bình năm 2005 (Ha et al., 2008a) và tiếp theo được phát hiện thấy cũng trên

cây sắn dây tại Trung Quốc năm 2008 (Zhang & Wu) Năm 2009, trong một thí nghiệm phát hiện begomovirus trên cây đậu đỗ dùng cặp mồi chung BegoAFor1/Rev1, 5 mẫu đậu tương bị bệnh khảm vàng tại khu thí nghiệm Gia Lâm - trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội đã có phản ứng dương tính Việc phát hiện thấy begomovirus trên đậu tương có ý nghĩa lớn vì đây là lần đầu tiên một begomovirus được phát hiện thấy trên cây trồng họ đậu tại Việt Nam (Hà Viết Cường, 2010)

Phát hiện KuMV bằng PCR trên các mẫu đậu đỗ

Phản ứng PCR nhằm phát hiện KuMV đã được thực hiện trên 141 mẫu

Trang 29

cây họ đậu biểu hiện triệu chứng bệnh virus (Hà Viết Cường, 2010)

Nghiên cứu cho thấy: kiểm tra 90 mẫu đậu tương biểu hiện triệu chứng như khảm vàng, khảm nhăn và lùn, nhăn lá, biến vàng mép lá thì có tới 26 mẫu (28.8%) cho phản ứng PCR dương tính Mặc dù phần lớn các mẫu đậu tương kiểm tra (70 mẫu) được thu thập tại các huyện ngoại thành – Hà Nội kể

cả Hà Tây cũ cũng đã phát hiện thấy 1/3 mẫu thu tại Hòa Bình và 1/8 mẫu thu tại Hưng Yên có phản ứng PCR dương tính

Ngoài ra, khi kiểm tra 5 mẫu sắn dây thu tại Hà Nội và Hải Phòng biểu hiện triệu chứng khảm lá (lá không bị biến dạng) thì thấy cả 5/5 mẫu đều có phản ứng dương tính (Hà Viết Cường, 2010)

1.3 Kỹ thuật ELISA chẩn đoán virus thực vật

1.3.1 Nguyên lý

Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay - xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện (Copeland, 1998; Koenig & Paul, 1982)

Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu, thực hiện qua hai bước:

- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể

- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm (Copeland, 1998; Koenig & Paul, 1982)

Trang 30

Nhóm gián tiếp (indirect ELISA): Kháng thể liên kết enzyme không

phải là kháng thể phát hiện kháng nguyên (Copeland, 1998; Koenig, 1981;

Koenig & Paul, 1982)

1.4 Kỹ thuật thuật PCR chẩn đoán virus thực vật

1.4.1 Nguyên lý

PCR là một trong các phát minh quan trọng nhất của thế kỷ 20 trong sinh học phân tử PCR là một kỹ thuật đơn giản nhưng được sử dụng trong hầu hết các nghiên cứu CNSH Các bước cơ bản trong 1 phản ứng PCR gồm 3 bước :

Biến tính Hỗn hợp phản ứng được đặt ở nhiêt độ cao (92OC – 94OC) trong thời gian ngắn (khoảng 20 giây – 60 giây) Ở nhiệt độ này, khuôn DNA dạng sợi kép tách thành sợi đơn

Gắn mồi Hỗn hợp phản ứng được đặt ở nhiệt độ gắn mồi (Ta) trong thời gian ngắn Ta được tính toán tùy thuộc đặc điểm mồi, thường trong khoảng

40OC– 60OC Ở nhiệt độ này, mồi gắn vào khuôn sợi đơn ở vị trí đặc hiệu

Tổng hợp sản phẩm PCR Hỗn hợp phản ứng được tăng tới nhiệt độ tối ưu

cho phản ứng tổng hợp chuỗi (72OC hoặc 68OC tùy DNA polymerase chịu nhiệt)

1.4.2 Phạm vi áp dụng

Hiện nay PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán tách dòng gene, và xác định huyết thống

1.5 Kỹ thuật thuật LAMP chẩn đoán virus thực vật

LAMP (Loop-mediated isothermal amplification of DNA) là một kỹ

Trang 31

thuật nhân DNA được phát triển đầu tiên vào năm 2000 (Notomi et al., 2000)

Phản ứng LAMP sử dụng một enzyme DNA polymerase (Bst DNA polymerase) có hoạt tính tách sợi khuôn (sợi kép) và kéo dài mồi ở cùng một nhiệt độ

Phản ứng LAMP cũng cần tối thiểu 4 mồi ký hiệu là:

• F3 (Forward outer primer)

• B3 (Backward outer primer)

• FIP (Forward inner primer

• BIP (Backward inner primer)

Vị trí các mồi và các vùng thiết kế mồi cho phản ứng LAMP được trình bày ở Hình

Hình 1.4 Vị trí các mồi và các vùng thiết kế mồi cho phản ứng LAMP

(Tomita et al., 2008)

Nguyên Tắc Phản Ứng

Khi đoạn gene quan tâm và hoá chất được ủ ở nhiệt độ cố định khoảng 60°C - 65°C trong vòng 45 phút - 60 phút và kết thúc phản ứng bằng cách ủ ở nhiệt độ 80 độ trong 2 phút -10 phút, các bước phản ứng xảy xa:

Bước 1

DNA mạch đôi là tình trạng cân bằng động học ở nhiệt độ khoảng 65°C,

1 trong những LAMP primers có thể bám vào mạch bổ sung của đoạn DNA

Trang 32

mạch đôi quan tâm và khởi động quá trình tổng hợp DNA sử dụng DNA polymerase có hoạt tính thay thế mạch, thay thế và giải phóng DNA mạch đơn Với phương pháp LAMP, không giống như PCR, không cấn biến tính nhiệt đoạn DNA mạch đôi thành mạch đơn Cơ cấu khuếch đại sau đây giải thích từ khi FIP bám vào để giải phóng DNA template mạch đơn

Hình 1.5 Primer FIP bắt cặp với sợi DNA đơn Bước 2

Thông qua hoạt tính thay thế mạch của DNA polymerase, đoạn DNA bổ sung cho template DNA được tổng hợp, bắt đầu từ đầu 3’ của đoạn F2 của FIP

Hình 1.6: Tổng hợp mạch bổ sung Bước 3

F3 Primer bám vào đoạn F3c, ngoài FIP trên đoạn DNA quan tâm và bắt đầu tổng hợp DNA thay thế mạch, giải phóng mạch bổ sung gắn FIP

Hình 1.7: Gắn primer F3 vào Bước 4

Mạch đôi được tạo thành từ đoạn DNA tổng hợp từ F3 primer và đoạn

Trang 33

Hình 1.9: Đoạn DNA đơn được tạo bởi primer FIP

Bước 6

Đoạn DNA đơn trong bước (5) là template cho sự tổng hợp DNA do BIP khởi đầu và sự tổng hợp DNA thay thế mạch do B3 làm mồi sau đó BIP bám vào đoạn DNA tạo thành trong bước (5) Bắt đầu từ đầu 3’ của BIP, sự tổng hợp DNA bổ sung bắt đầu Thông qua quá trình này, đoạn DNA chuyển từ cấu trúc mạch vòng thành cấu trúc thẳng B3 primer bám bào bên ngoài BIP

và sau đó qua hoạt tính của DNA polymerase bắt đầu từ đầu 3’, DNA được tổng hợp từ BIP được thay thế và giải phóng thành mạch đơn trước khi tổng

hợp DNA từ B3 primer

Hình 1.10: Vị trí gắn primer BIP và B3 Bước 7

Mạch đôi DNA được tạo thành qua quá trình điễn tả trong bước (6)

Trang 34

Hình 1.11: Tổng hợp mạch bổ sung nhờ primer B3

Bước 8

Đoạn bổ sung gắn BIP thay thế trong bước (6) tạo thành cấu trúc vòng ở mỗi đầu nhìn như cấu trúc quả tạ Cấu trúc này là cấu trúc khởi đầu cho vòng khuếch đại trong phương pháp LAMP Quá trình bên trên được coi như là quá trình tạo ra cấu trúc ban đầu cho vòng LAMP

Hình 1.12 Sự tạo thành đầu vòng của đoạn DNA đơn

Bước 8-11

Cấu trúc DNA hình quả tạ nhanh chóng chuyển thành DNA mạch vòng

do tổng hợp DNA tự mồi FIP bám vào đoạn mạch đơn trong DNA vòng và mồi quá trình tổng hợp DNA thay thế mạch giải phóng đoạn DNA tổng hợp trước Mạch đơn giải phóng tạo cấu trúc mạch vòng ở đầu 3’ tạo bởi đoạn B1c bổ sung và B1 Sau đó bắt đầu từ đầu 3’ của đoạn B1, sự tổng hợp DNA dùng cấu trúc của mình làm template và giải phóng mạch bổ sung gắn FIP (Bước 9) Mạch đơn mới được giải phóng tạo cấu trúc quả tạ vì hai đầu có đoạn bổ sung F1 - F1c và B1c - B1 (Bước 11) Cấu trúc này là cấu trúc ngược lai của cấu trúc tạo thành trong bước (8) Giống như từ bước (8) đến (11), cấu trúc trong bước (11) dẫn đến quá trình tổng hợp DNA tự mồi bắt đầu từ đầu 3’ trong đoạn B1 Hơn nữa, BIP bám vào đoạn B2c và bắt đầu sự tổng hợp DNA thay thế mạch, giải phóng đoạn DNA do B1 mồi Theo đó, cấu trúc tương tư như ở bước (9) và (10) cũng như giống cấu trúc do bước (8) tạo thành Với cấu trúc tạo thành ở bước (10), BIP bám vào đoạn mạch đơn B2c,

Trang 35

sự tổng hợp DNA tiếp tục bởi sự thay thế đoạn mạch đôi DNA Kết quả của quá trình này là nhiều cấu trúc bao gồm nhiều đoạn lặp lại ngược của đoạn

quan tâm trên cùng một mạch được tạo thành

Hình 1.13: Tiến trình các bước 8 đến bước 11

Hình 1.14: Các bước tiến hành trong phương pháp LAMP

1.5.1 Phạm vi áp dụng

LAMP là một phản ứng rất đơn giản (không cần máy PCR), tốc độ phản ứng nhanh (trong vòng khoản 60 phút), có tính đặc hiệu cao (do có ít nhất 4 mồi với tổng kích thức mồi ~ 120 nucleotide), có thể được phát hiện bằng mắt thường (thông qua đổi màu của một số chất chỉ thị) Do có các ưu điểm trên nên kỹ thuật LAMP đã được ứng dụng trong chẩn đoán nhiều tác nhân gây

bệnh bao gồm nấm (Revill et al., 2004) vi khuẩn (Moradi et al.), virus (Wei et

Trang 36

al , 2012) và phytoplasma (Sugawara et al.) Kỹ thuật LAMP cũng đặc biệt thích hợp cho các quốc gia đang phát triển (Tomita et al., 2008)

Trang 37

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Bệnh virus hại cây họ đậu

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu

2.1.2.1 Thời gian nghiên cứu

- Năm 2014 – 2015

2.1.2.2 Địa điểm nghiên cứu

- Điều tra đồng ruộng: Vùng trồng cây họ đậu tại Hà Nội và vùng phụ cận

- Thí nghiệm trong phòng: Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới

– Học viện Nông Nghiệp Việt Nam

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Điều tra bệnh virus trên cây đậu đỗ tại Hà Nội

- Phát hiện virus đậu đỗ bằng ELISA

- Phát hiện virus trên đậu đỗ bằng PCR

- Phát hiện KuMV và MYMV bằng LAM-PCR

2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Mẫu bệnh cây

Mẫu cây bệnh có triệu chứng điển hình được thu thập từ các địa điểm điều tra ( giống đỗ xanh, đỗ đen, đỗ tương, đỗ cove ), sau đó được bảo quản khô bằng hạt Silica gel để kiểm tra virus

Trang 38

- Phễu lọc, vải lọc, giấy thấm

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp điều tra ngoài đồng

Phương pháp điều tra tỷ lệ bệnh virus hại cây họ đậu ở ruộng sản xuất: Áp

dụng phương pháp nghiên cứu, điều tra và phát hiện bệnh hại theo “Phương

pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật” của Viện Bảo vệ thực vật (2003)

Chọn 1 ruộng đại diện cho giống, đại diện cho giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây Điều tra theo phương pháp 5 điểm trên đường chéo góc (cách bờ 2 mét) mỗi điểm điều tra từ 50 cây đến 100 cây đối với ruộng có diện tích lớn, điều tra 100% số cây đối với ruộng có diện tích nhỏ

Tính tỷ lệ bệnh: Quan sát và mô tả đặc điểm cây nhiễm bệnh

2.4.2 Phương pháp thu thập bảo quản mẫu lá bệnh

Được tiến hành theo giai đoạn sinh trưởng, chọn những lá có triệu chứng điển hình của bệnh hại đem về bảo quản khô bằng hạt Silica gel

2.4.3 Phương pháp kiểm tra virus bằng ELISA

Sử dụng các kít ELISA phát hiện virus cây họ đậu do Viện DSMZ cung cấp Các kít và phương pháp thử ELISA bao trình bày ở Bảng 2.1

Bảng 2.1 Các kít ELISA phát hiện virus đậu đỗ (Viện DSMZ)

1 Bean common mosaic necrosis virus BCMNV DAS-ELISA AS2039

2 Bean common mosaic virus BCMV TAS-ELISA AS0915-0228/1

Trang 39

3 Bean leaf roll virus BLRV TAS-ELISA AS0142-0227/1

4 Bean yellow mosaic virus BYMV DAS-ELISA AS-0717

5 Broad bean true mosaic virus BBTMV DAS-ELISA AS-0152

6 Broad bean wilt virus 2 BBWV-2 DAS-ELISA AS-0862

7 Cowpea aphid-born mosaic virus CABMV DAS-ELISA AS-0417

8 Cowpea mild mottle virus CPMMV DAS-ELISA AS-0907

9 Cowpea mosaic virus CPMV DAS-ELISA AS-0012

10 Cowpea mottle virus CPMoV DAS-ELISA AS-0212

11 Cowpea severe mosaic virus CPSMV DAS-ELISA AS-0013

12 Pea enation mosaic virus PEMV DAS-ELISA AS-0017

13 Pea seed-borne mosaic virus PSbMV DAS-ELISA AS-0129

14 Southern bean mosaic virus SBMV DAS-ELISA AS-0033

15 Soybean mosaic virus SMV DAS-ELISA AS-0543

16 Tobacco mosaic virus TMV DAS-ELISA AS-0041

17 Cucumber mosaic virus CMV DAS-ELISA AS-0929 Quy trình thử ELISA gồm 2 phương pháp là TAS-ELISA và DAS-ELISA) được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Ngoài ra, kiểm tra virus bằng ELISA gián tiếp dùng kháng huyết thanh thô được thực hiện theo phương pháp của Mofat (1999) như sau:

Bước 1: Nghiền mẫu

Tiến hành nghiền mẫu trong dung dịch đệm Carbonate pH 9.6 với tỷ lệ 0.5g lá/ 1ml dung dịch đệm

Nghiền mẫu đối chứng dương

Nhỏ vào mỗi giếng ELISA 100 µl/giếng Sau đó để bản ELISA vào hộp

ẩm và ủ qua một đêm ở tủ lạnh thường

Bước 2: Rửa bản ELISA

Sau khi ủ qua đêm, sáng hôm sau đem bản ELISA đi rửa (trước khi rửa vảy mạnh bản ELISA để loại hết nước ở trong bản ELISA) 3 lần bằng đệm PBS – T, mỗi lần cách nhau 3 – 4 phút Mỗi lần rửa bản ELISA đều vảy mạnh

để loại hết đệm PBS – T ra khỏi các giếng, sau đó mới tiến hành nhỏ đệm PBS – T mới vào để rửa tiếp

Ủ bản ELISA ở 370C trong 45 phút

Bước 3: Cố định kháng thể thỏ đặc hiệu virus vào bản ELISA

Nghiền lá cây khỏe trong dung dịch đệm PBST – PO với tỷ lệ 1 g lá/30

Trang 40

ml dung dịch đệm PBST – PO

Lọc lấy dịch cây khỏe, hòa kháng huyết thanh của virus BCMV với tỷ lệ

1/500 và kháng huyết thanh của BlCMV với tỷ lệ 1/500

Nhỏ dịch cây khỏe + kháng huyết thanh của BCMV và BlCMV vào bản

ELISA, mỗi giếng nhỏ 100µl

Để bản ELISA trong hộp ẩm rồi đem ủ ở 370C trong 2 giờ

Bước 4: Hòa kháng thể đơn dòng IgG (thỏ) của hãng Sigma với tỷ lệ 1/10000 trong đệm PBST – Ovanbumel

Rửa bản ELISA 3 lần bằng đệm PBS – T, mỗi lần cách nhau 2 phút

Bước 5: Cố định chất nền

Hòa 2 viên chất nền của hãng Sigma vào 2ml đện cơ chất đã pha, nhỏ

100 µl/giếng

Bước 6: Đánh giá kết quả

Để bản ELISA trong hộp ẩm, rồi để trong tối 2 giờ Sau đó đánh giá kết

quả bằng mắt thường và đo trị số ELISA (OD) ở bước sóng 405nm

Các giếng có màu vàng là các giếng có phản ứng (+) Giếng không có

màu là cây không bị nhiễm bệnh Đọc kết quả tiếp bằng cách đưa vào máy

đọc ELISA ở bước sóng 405nm

Phản ứng ELISA (+) là phản ứng có trị số mật độ quang đo được của

mẫu (ODMẫu) lớn hơn hai lần trị số mật độ quang trung bình của mẫu khỏe

(XTrung bình OD của mẫu khỏe)

2.4.4 Phương pháp kiểm tra virus bằng PCR

2.4.4.1 Chiết DNA tổng số từ mô lá

DNA tổng số từ mô lá được chiết theo 2 phương pháp:

+ Phương pháp chiết DNA tổng số từ mô lá bằng NaOH (Wang và cs,

1993) Cho khoảng 50 mg mô lá mẫu bệnh vào tube 1.5mL, cho tiếp 500µl dung

dịch NaOH 0.5 M vào tube 1.5mL, dùng chày nhựa chuyên dụng để nghiền

nhuyễn mẫu lá Lấy 100µl dung dịch đệm Tris 0.1 M, pH = 8 vào tube 1.5mL

Định dạng
Số trang	111
Dung lượng	5,13 MB