ứng dụng chỉ thị phân tử chọn lọc cá thể ưu tú chứa gen kháng bệnh bạc lá và mùi thơm từ một số tổ hợp lai lúa f2

Trong thời gian qua nhóm nghiên cứu Lúa bộ môn Sinh học phân tử và CNSH Ứng dụng - Khoa CNSH - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tiến hành lai tạo được rất nhiều các tổ hợp F2 tốt từ nguồ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS PHAN HỮU TÔN

HÀ NỘI, NĂM 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng bảo vệ ở bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 10 tháng 6 năm 2015

Tác giả

Hà Thị Vân Anh

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận văn, ngoài sự nỗ lực và cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của rất nhiều cá nhân và tập thể Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, sự cảm ơn chân thành và sâu sắc tới thầy PGS.TS Phan Hữu Tôn, trưởng Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Tống Văn Hải cùng toàn bộ các cán bộ đang công tác tại bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị và bạn bè

đã giúp đỡ, động viên trong suốt quá trình học tập cũng như thực tập tốt nghiệp

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình đã luôn

là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 6 năm 2015

Tác giả luận văn

Hà Thị Vân Anh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 1

LỜI CẢM ƠN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH x

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xi

TÓM TẮT xii

MỞ ĐẦU 1

1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

2 Mục đích và yêu cầu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về bệnh bạc lá 3

1.1.1 Nguyên nhân, triệu chứng của bệnh bạc lá lúa 3

1.1.2 Tác hại của bệnh bạc lá lúa 5

1.1.3 Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh 5

1.1.4 Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá 8

1.1.5 Chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phân tử 9

1.2 Tổng quan về tính trạng mùi thơm của lúa 15

1.2.1 Các yếu tố cấu thành chất lượng của lúa 15

1.2.2 Bản chất hóa học của mùi thơm 17

1.2.3 Di truyền của tính trạng mùi thơm 18

1.2.4 Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu gen fgr của lúa gạo 19

CHƯƠNG 2 :VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 22

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

2.2 Nội dung nghiên cứu 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3.1 Quy trình chọn lọc 23

2.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm ngoài đồng ruộng 23

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Đặc điểm nông sinh học của các các thể được chọn lọc từ các quần thể phân ly F2 32

3.1.1 Kết quả chọn lọc từ tổ hợp 251F2 (AIQ6 x IRBB4/7) 32

3.1.2 Kết quả chọn lọc từ tổ hợp 309F2 ( H56-2-2 x Hương thơm 1) 33

3.1.3 Kết quả chọn lọc từ tổ hợp 392F2 (LC2 x Bắc thơm 7) 34

3.1.4 Kết quả chọn lọc từ tổ hợp 428F2 (10987 x 10861) 35

3.1.5 Kết quả chọn lọc từ tổ hợp 514F2 (KNL x 10921) 36

3.1.6 Kết quả chọn lọc từ tổ hợp 526F2 (11278 x 10911) 37

3.2 Kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7 bằng kỹ thuật PCR 38

3.2.1 Kết quả kiểm tra gen kháng bạc lá các cá thể được chọn lọc từ tổ hợp lai 251F2 (AIQ6 x IRBB4/7) 39

3.2.2 Kết quả kiểm tra gen kháng bạc lá các cá thể được chọn lọc từ tổ hợp lai 309F2 ( H56-2-2 x Hương thơm 1) 40

3.2.3 Kết quả kiểm tra gen kháng bạc lá các cá thể được chọn lọc từ tổ hợp lai 392F2 (LC2 x Bắc thơm 7) bằng chỉ thị DNA 42

3.2.4 Kết quả kiểm tra gen kháng bạc lá các cá thể được chọn lọc từ tổ hợp lai 428F2 (10987 x 10861) bằng chỉ thị DNA 43

3.2.5 Kết quả kiểm tra gen kháng bạc lá các cá thể được chọn lọc từ tổ hợp lai 514F2 (KNL x 10921) bằng chỉ thị DNA 44

3.2.6 Kết quả kiểm tra gen kháng bạc lá các cá thể được chọn lọc từ tổ hợp lai 526F2 (11278 x 10911) bằng chỉ thị DNA 44

3.3 Kết quả đánh giá mùi thơm và khả năng mang gen mùi thơm 46

3.3.1 Kết quả đánh giá mùi thơm bằng phương pháp kiểm tra với KOH 1,7% 47 3.3.2 Kết quả xác định gen mùi thơm bằng phương pháp PCR 53

3.3.3 So sánh kết quả kiểm tra với KOH 1,7% và kết quả xác định gen bằng PCR 57

3.4 Tổng hợp kết quả kiểm tra gen Xa4, Xa7 và gen thơm fgr của các cá thể được chọn lọc từ các tổ hợp lai 58

3.4.1 Kết quả kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7 và gen thơm fgr các cá

thể được chọn lọc từ tổ hợp 251F2 (AIQ6 x IRBB4/7) 58

3.4.2 Kết quả kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7 và gen thơm fgr các cá thể được chọn lọc từ tổ hợp 309F2 ( H56-2-2 x Hương thơm 1) 59

3.4.3 Kết quả kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7, gen thơm fgr các cá thể được chọn lọc từ tổ hợp 392F2 ( LC2 x Bắc thơm 7) 60

3.4.4 Kết quả kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7, gen thơm fgr các cá thể được chọn lọc từ tổ hợp 428F2 (10987 x 10861) 61

3.4.5 Kết quả kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7, gen thơm fgr các cá thể được chọn lọc từ tổ hợp 514F2 (KNL x 10921) 62

3.4.6 Kết quả kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7, gen thơm fgr các cá thể được chọn lọc từ tổ hợp 526F2 (11278 x 10911) 63

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 65

1 Kết luận 65

2 Đề nghị 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các loại DNA markers thông dụng 10

Bảng 1.2 Bản đồ liên kết di truyền với gen quy định tính trạng nông sinh học quan trọng với RFLP đánh dấu 11

Bảng 2.1 Các tổ hợp phân ly F2 sử dụng trong nghiên cứu 22

Bảng 2.4 Thành phần cho 1 phản ứng PCR phát hiện gen kháng bạc lá 28

Bảng 2.5 Các Primer dùng trong PCR phát hiện gen kháng bạc lá lúa 28

Bảng 2.6 Chu kỳ nhiệt cho gen Xa4, Xa7 29

Bảng 2.7 Chỉ thị DNA sử dụng để phát hiện gen mùi thơm 30

Bảng 2.8 Thành phần cho 1 phản ứng PCR phát hiện gen thơm 30

Bảng 2.9 Chu kỳ nhiệt cho gen thơm fgr 30

Bảng 3.1 Một số đặc điểm nông sinh học chính các cá thể được chọn lọc từ tổ hợp 251F2 33

Bảng 3.2 Một số đặc điểm nông sinh học chính các cá thể được chọn lọc từ tổ hợp 309F2 34

Bảng 3.3 Một số đặc điểm nông sinh học chính các cá thể được chọn lọc từ tổ hợp 392F2 35

Bảng 3.4 Một số đặc điểm nông sinh học chính các cá thể được chọn lọc từ tổ hợp 428F2 36

Bảng 3.5 Một số đặc điểm nông sinh học chính các cá thể được chọn lọc từ tổ hợp 514F2 37

Bảng 3.6 Một số đặc điểm nông sinh học chính các cá thể được chọn lọc từ tổ hợp 526F2 38

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá cảm quan mùi thơm các mẫu cá thể 48

Bảng 3.8 So sánh kết quả đánh giá mùi thơm bằng phương pháp sử dụng KOH 1,7% và kết quả kiểm tra gen fgr bằng phương pháp PCR 57

Bảng 3.9 Tổng hợp kết quả kiểm tra gen Xa4, Xa7, gen thơm fgr các cá thể được chọn lọc tổ hợp 251F2 58

Bảng 3.10 Tổng hợp kết quả kiểm tra gen Xa4, Xa7, gen thơm fgr các cá thể

được chọn lọc tổ hợp 309F2 ( H56-2-2 x Hương thơm 1) 59 Bảng 3.11 Tổng hợp kết quả kiểm tra gen Xa4, Xa7, gen thơm fgr các cá thể

được chọn lọc tổ hợp 392F2 (LC2 x Bắc thơm 7) 60 Bảng 3.12 Tổng hợp kết quả kiểm tra gen Xa4, Xa7, gen thơm fgr các cá thể

được chọn lọc tổ hợp 428F2 (10987 x 10861) 61 Bảng 3.13 Tổng hợp kết quả kiểm tra gen Xa4, Xa7, gen thơm fgr các cá thể

được chọn lọc tổ hợp 514F2 (KNL x 10921) 62 Bảng 3.14 Tổng hợp kết quả kiểm tra gen Xa4, Xa7, gen thơm fgr các cá thể

được chọn lọc tổ hợp 526F2 (11278 x 10911) 63 Bảng 3.15 Đặc điểm của 4 mẫu cá thể kháng bạc lá được chọn 64 Bảng 3.16 Đặc điểm của 9 mẫu cá thể chất lượng tốt được chọn 64

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hoạt động của bộ 4 mồi được mô tả trong nghiên cứu của Bradburry

và cộng sự (2005) 21

Hình 1.2 Vi trí gen thơm trên nhiễm sắc thể số 8 21

Hình 3.1 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa4 các cá thể trong tổ hợp lai 251F2 (AIQ6 x IRBB4/7) 39

Hình 3.2 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa7 các cá thể trong tổ hợp lai 251F2 40

Hình 3.3 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa4 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ hợp lai 309F2 ( H56-2-2 x Hương thơm 1) 40

Hình 3.4 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ hợp lai 309F2 ( H56-2-2 x Hương thơm 1) 41

Hình 3.5 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa4 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ hợp lai 392F2 (LC2 x Bắc thơm 7) 42

Hình 3.6 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ hợp lai 392F2 (LC2 x Bắc thơm 7) 42

Hình 3.7 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa4 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ hợp lai 428F2 (10987 x 10861) 43

Hình 3.8 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ hợp lai 428F2 (10987 x 10861) 43

Hình 3.9 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa4 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ hợp lai 514F2 (KNL x 10921) 44

Hình 3.10 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ hợp lai 514F2 (KNL x 10921) 45

Hình 3.11 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa4 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ hợp lai 526F2 (11278 x 10911) 45

Hình 3.12 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của tổ hợp lai 526F2 (11278 x 10911) 46

Hình 3.13 Ảnh điện di sản phẩm gen thơm của tổ hợp lai 251F2 53

Hình 3.14 Ảnh điện di sản phẩm gen thơm của tổ hợp lai 309F2 54

Hình 3.15 Ảnh điện di sản phẩm gen thơm của tổ hợp lai 392F2 54

Hình 3.16 Ảnh điện di sản phẩm gen thơm của tổ hợp lai 428F2 55

Hình 3.17 Ảnh điện di sản phẩm gen thơm của tổ hợp lai 514F2 55

Hình 3.18 Ảnh điện di sản phẩm gen thơm của tổ hợp lai 526F2 56

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP Amplified fragment length polymorphism

ALP Amplicon length polymorphism

PCR Polymerase Chain Reaction

RAPD Random amplified polymorphic DNA

RFLP Restriction fragment length polymorphism

SSCP Single strand conformation polymorphism

SSR Simple sequence repeat (microsatellite)

TGST Thời gian sinh trưởng

TL Tỷ lệ

Xoo Xanthomonas oryzae pv oryzae

TÓM TẮT

Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA nhằm chọn lọc những cá thể tốt trong các

quần thể phân ly chứa đồng thời các gen kháng bệnh bạc lá hữu hiệu Xa4, Xa7 và gen mùi thơm fgr làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống kháng bệnh có năng suất

cao, phẩm chất tốt, cơm thơm dẻo là một việc làm vô cùng có ý nghĩa Thí nghiệm

được thực hiện trên 6 quần thể phân ly 251F 2 (AIQ6 x IRBB4/7), 309F 2 (H56-2-2 x

Hương thơm 1), 392F 2 (LC2 x Bắc thơm 7), 428F2 (10987 x 10861), 514F2 (KNL

x 10921), 526F2 (11278 x 10911)

Sau khi có kết quả theo dõi một số đặc điểm nông sinh học, năng suất, các yếu tố cấu thành năng suất trên 6 quần thể phân ly đã chọn được 65 cá thể có năng suất cao, phẩm chất tốt hơn so với cây bố mẹ ở từng cặp lai Tiến hành chạy PCR các cá thể tốt đã chọn được 32 cá thể mang gen kháng ĐHT, và 28 cá thể mang gen

thơm fgr Trong đó có 15 cá thể mang gen kháng Xa4, 17 cá thể mang gen kháng

Xa7 , 4 cá thể mang cả 2 gen kháng Xa4/Xa7 và 9 cá thể vừa mang gen kháng (Xa4 hoặc Xa7) vừa mang gen thơm Đặc biệt có được 1 cá thể quy tụ cả 2 gen kháng và gen thơm Các cá thể vừa mang gen kháng ĐHT vừa mang gen thơm fgr này chính

là nguồn vật liệu quý giá trong công tác chọn tạo giống vừa có khả năng kháng bệnh bạc lá vừa có năng suất cao, chất lượng tốt, gạo thơm ngon Bên cạnh đó, các cá thể còn chứa gen kháng DHT cần được tiếp tục chọn tạo trong các thế hệ phân ly

MỞ ĐẦU

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Lúa là cây lương thực chiếm tỉ trọng cao trong tổng sản lượng lương thực hàng năm, cung cấp gần 80% nhu cầu tinh bột trung bình cho người dân Việt Nam Tuy nhiên, Việt Nam có khí hậu nhiệt đới là điều kiện thuận lợi cho nhiều loại sâu

bệnh hại phát triển Trong đó, bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv

oryzae gây ra, là một bệnh đặc biệt nguy hiểm đối với cây lúa Bệnh có khả năng gây giảm năng suất nghiêm trọng, thiệt hại lên đến 30-60%, hoặc có thể dẫn đến

mất trắng (Lã Vĩnh Hoa, Tống Văn Hải và cs., 2010) Cho đến nay, chưa có loại

thuốc hóa học nào đặc trị bệnh bạc lá, việc tạo ra các giống lúa có khả năng kháng bệnh bền vững được xem là hướng phòng chống bệnh hiệu quả nhất, cả về mặt kinh

tế và môi trường

Đã có trên 30 gen kháng bệnh bạc lá được phát hiện ở lúa trồng và lúa dại

(Ninox-Lui et al., 2006; Singh et al., 2007; Siriporn Korinsak, 2009) Tuy nhiên

mỗi gen kháng chỉ kháng được một hay một số chủng vi khuẩn nhất định, trong khi

đó mỗi vùng trồng lúa lại tồn tại nhiều chủng vi khuẩn khác nhau, vì vậy nếu giống chỉ chứa một gen kháng thì sau một thời gian ngắn sẽ bị nhiễm bệnh Vấn đề đặt ra

là cần phải quy tụ nhiều gen kháng vào một giống để giống đó có khả năng kháng được nhiều chủng vi khuẩn khác nhau Theo kết quả nghiên cứu của Phan Hữu Tôn

và cộng sự (2005) thì các gen Xa4, Xa7 kháng được hầu hết các chủng vi khuẩn ở

miền Bắc Việt Nam

Bên cạnh đó, ngày nay khi kinh tế đã khá ổn định, chất lượng cuộc sống được nâng cao nên nhu cầu về các sản phẩm lúa gạo có chất lượng cao của con người ngày càng tăng Hiện nay, một giống lúa muốn phát triển ngoài sản xuất đòi hỏi: thời gian sinh trưởng ngắn, thấp cây, chống đổ tốt, năng suất cao, chất lượng và

có khả năng chống chịu sâu bệnh tốt Người ta cũng đã tìm ra được gen fgr, Waxy là

những gen quy định mùi thơm và hàm lượng amylose ở các giống lúa tẻ

Trên thế giới, với sự phát triển của công nghệ sinh học, rất nhiều gen đã được định vị trên bản đồ, được xác định chỉ thị phân tử DNA liên kết Ứng dụng công nghệ này nhằm chọn tạo ra được các giống lúa mới có chất lượng cao, cơm

dẻo thơm và kháng bệnh bạc lá bền vững sẽ nâng cao thu nhập cho người dân, cung cấp gạo ngon cho thị trường và tạo được nông sản sạch, không gây ô nhiễm môi trường Tuy nhiên, các tính trạng tốt này lại nằm rải rắc trong từng giống, nên cần được quy tụ lại trong các giống lai nhằm tạo ra một giống vừa có năng suất, chất lượng tốt, cảm ôn, cơm dẻo, thơm mà lại kháng bệnh bạc lá tốt

Với mục đích quy tụ nhiều gen kháng hữu hiệu vào các giống lúa tốt Trong thời gian qua nhóm nghiên cứu Lúa bộ môn Sinh học phân tử và CNSH Ứng dụng - Khoa CNSH - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tiến hành lai tạo được rất nhiều các tổ hợp F2 tốt từ nguồn gen kháng bệnh bạc lá và chất lượng Để chọn lọc được các cá thể tốt từ các tổ hợp phân ly F2 kháng bệnh bạc lá, chất lượng, làm cơ sở tạo

ra các giống lúa thuần năng suất cao, chất lượng tốt, chống chịu sâu bệnh, đặc biệt

là bệnh bạc lá, chúng tôi tiến hành đề tài: “Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn lọc cá

thế ưu tú chứa gen kháng bệnh bạc lá và mùi thơm từ một số tổ hợp lai lúa F2.”

2 Mục đích và yêu cầu

Mục đích

- Chọn lọc được các cá thể có các đặc tính nông sinh học tốt, năng suất cao,

mang gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7 đồng hợp tử và gen mùi thơm fgr từ quần thể

phân ly F2 của một số tổ hợp lai

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về bệnh bạc lá

1.1.1 Nguyên nhân, triệu chứng của bệnh bạc lá lúa

1.1.1.1 Nguyên nhân

Bệnh bạc lá lúa được phát hiện đầu tiên ở Fukuoka - Nhật Bản vào năm

1884 Ban đầu các nhà nghiên cứu lầm tưởng nguyên nhân gây nên triệu chứng bệnh là do axit đất Nhưng sau đó, các nhà khoa học chỉ ra nguyên nhân của nó là

do vi khuẩn gây nên và theo Ishiyama, 1922 nó thuộc loại Bacillus oryzae Cuối cùng đã xác định là do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây nên (Yamamoto T et al.,

1977)

Theo Tagami Y và OU thì vi khuẩn Xanthomonas có hình gậy ngắn tròn ở

hai đầu Kích thước 1 - 2µm x 0,8 - 1µm, có một tiêm mao, nhuộm màu gram âm và không hình thành nha bào Tế bào vi khuẩn có màng nhầy bao bọc và được liên kết với nhau thành một khối vững chắc ngay cả trong nước Khuẩn lạc màu vàng rơm, dịch vi khuẩn tiết ra kết thành các hạt keo màu vàng, không hòa tan trong nước (Tạ Minh Sơn, 1987)

Con đường xâm nhập của vi khuẩn bạc lá Xanthomonas oryzea pv.oryzae: Vi

khuẩn xâm nhập có tính chất thụ động có thể xâm nhập qua thủy khổng, lỗ khí trên mút lá, mép lá đặc biệt qua vết thương xây xát trên lá Khi tiếp xúc với bề mặt có màng nước vi khuẩn dễ dàng xâm nhập vào bên trong qua các lỗ khí, qua vết thương mà sinh sản nhân lên về mặt số lượng theo các bó mạch dẫn lan rộng đi Trong điều kiện mưa ẩm thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, trên bề mặt vết bệnh tiết ra các giọt dịch vi khuẩn Thông qua sự va chạm giữa các lá lúa, nhờ mưa gió truyền lan bệnh sang các lá lúa khác để tiến hành xâm nhiễm lặp lại nhiều lần trong quá trình sinh trưởng của cây lúa

Cho nên tuy là một loại bệnh có cự ly truyền nhiễm lây lan hẹp song với phạm vi không gian khá rộng, giọt keo vi khuẩn hình thành với số lượng nhiều, đó chính là một trong những nguyên nhân quan trọng làm bệnh phát triển mạnh sau những đợt mưa gió vào cuối vụ xuân và trong suốt vụ mùa ở nước ta

rõ ràng theo đường gợn sóng, màu vàng hoặc khô vàng, có khi có một đường chỉ viền màu nâu sẫm đứt quãng hay không đứt quãng

Theo Lê Lương Tề, ở Việt Nam bệnh bạc lá có triệu chứng chủ yếu là bạc lá Tác giả còn cho biết triệu chứng bạc lá trên đồng bằng sông hồng chia làm hai dạng: Bạc lá gợn vàng và bạc lá tái xanh Loại hình bạc lá gợn vàng là phổ biến ở hầu hết các giống và các mùa vụ, còn bạc lá héo xanh thường chỉ xuất hiện trên một số giống lúa Còn theo Tạ Minh Sơn thì trong cùng một điều kiện, mức độ lây nhiễm như nhau thì các giống địa phương cây cao còn giữ nguyên hình dạng lá bệnh, còn các giống mới nhập nội thấp cây thì lá thường bị táp đi dễ mủn nát

Có thể căn cứ vào những đặc điểm triệu chứng trên để phát hiện bệnh Tuy nhiên, nhiều khi vết bệnh quá cũ hoặc biến đổi quá nhiều theo giống và điều kiện bên ngoài, nhất là ở mạ do vậy có thể nhầm lẫn với những hiện tượng khô đầu lá sinh lý Vì vậy, để phát hiện được bệnh sớm và chính xác cần có thêm phương pháp chẩn đoán Theo Gao Z và cs (2003) một cách thử nghiệm đơn giản để phát hiện bệnh là cắt mẫu lá có vết bệnh điển hình rồi nhúng trong dung dịch fuchsin loãng Các nhà khoa học của Học viện nông nghiệp Việt Nam cũng đã tham khảo phương pháp giọt dịch và phương pháp ép trên lam kính để phát hiện giọt dịch vi khuẩn

1.1.2 Tác hại của bệnh bạc lá lúa

Bệnh bạc lá gây thiệt hại đáng kể về năng suất và chất lượng hạt, là bệnh phổ biến và tàn phá mùa màng nghiêm trọng trên toàn thế giới (Khan, 1996) Tác hại của bệnh chủ yếu là làm cho lá đòng sớm tàn, khô xác, giảm quang hợp, tăng lượng hạt lép, dẫn đến giảm năng suất lúa

Bệnh có thể làm giảm 60% năng suất hạt hàng năm (Mew et al., 1981), ở Nhật

Bản hàng năm có từ 300000 - 400000 ha lúa bị bệnh nặng, với năng suất giảm từ 20 -

30 %, có nơi tới 50%, thậm chí lên tới 80% (Singh et al., 2007) Năm 1986, tại

Australia bệnh bạc lá lúa làm giảm năng suất tới 30 - 50%, với biểu hiện hạt lủng nhiều hơn và giảm trọng lượng hạt Ở Philippin, bệnh thường làm giảm 22.5% năng suất vào

vụ mưa, và 7.2%, có khi lên tới 9.5 - 18% năng suất vào mùa khô (Exconde, 1973)

Ở Việt Nam, bệnh bạc lá đã được phát hiện từ lâu trên các giống lúa mùa cũ Trong những năm gần đây, bệnh gây hại trên cả hai loại lúa lai và lúa thuần, đặc biệt gây hại nặng trên các giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc Theo tổng kết báo cáo một số kết quả nghiên cứu lúa lai thì có những năm trước ta có khoảng hơn 350.000 ha lúa bị nhiễm nặng ở vụ mùa và cả vụ xuân, trong đó hàng trăm ha bị mất trắng như vụ mùa năm 2002 ở Đan Phượng, Phú Xuyên, Bắc Ninh, Ninh Bình Cũng theo số liệu năm 2004 trên tạp trí BVTV số 03, bệnh bạc lá lúa xuất hiện ở tỉnh Hà Nam, Hải Phòng, Phú Thọ, Điện Biên, Bắc Giang, Nghệ An, Thanh Hóa với tổng diện tích là 3770 ha trong đó diện tích nhiễm nặng là 560 ha Tỷ lệ bệnh phổ biến là 8 - 20% số lá, nơi cao là 50 - 70% số lá

Mức độ tác hại của bệnh phụ thuộc vào giống, thời kỳ nhiễm của cây sớm hay muộn và mức độ nặng hay nhẹ Năm 1970 trên diện tích lúa mùa cấy giống NN8 bị bệnh ở mức độ 60- 100%, giảm năng suất từ 30- 60% Theo báo cáo của phòng bệnh cây Viện Bảo Vệ Thực Vật, 1998 thì tác hại của bệnh ngày càng lớn khi mức độ bị bệnh càng nặng

Tác hại chủ yếu của bệnh làm lá úa, đặc biệt là lá đòng sớm tàn, nhanh chóng bị khô chết, bộ lá úa xơ xác ảnh hưởng tới hiệu quả quang hợp tích luỹ chất khô, dẫn đến giảm khối lượng 1000 hạt, tỉ lệ lép cao, năng suất sút kém (Nguyễn Văn Viết và cs, 2005)

1.1.3 Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh

1.1.3.1 Quy luật phát sinh, phát triển của bệnh bạc lá lúa

Mỗi vùng lãnh thổ lại có một số chủng vi khuẩn bạc lá đặc trưng, phụ thuộc vào

cơ cấu các giống lúa và điều kiện tự nhiên của vùng: Philipin 6 chủng, Nhật Bản 12

chủng, Ấn Độ 9 chủng,… (Tika et al., 1999)

Ở Việt Nam, nhiều nghiên cứu trước đó đã xác định được 14 chủng vi khuẩn bạc

lá lúa có mặt ở miền Bắc Việt Nam (Du P.V and Le Cam Loan, 2007) Trong nghiên cứu

về bệnh bạc lá ở 15 tỉnh miền Bắc, Nguyễn Văn Viết và cộng sự (2005) đã nhận thấy các nhóm chủng Xoo thường xuất hiện đan xen, ở một địa phương có thể xuất hiện nhiều nhóm chủng, trái lại một nhóm chủng có thể hiện diện ở nhiều địa phương, trên một vết bệnh đôi khi có thể tồn tại một hoặc một số chủng vi khuẩn nhất định

Bệnh bạc lá phát sinh phát triển mạnh ở vụ mùa các tỉnh phía Bắc Bệnh phát triển, lây lan nhanh trong điều kiện nhiệt độ 26 - 29°C, ẩm độ 90 %, đặc biệt khi có mưa to và gió lớn làm rập nát lá lúa tạo thuận lợi cho bệnh truyền lan (Phan Hữu Tôn, 2004) Bởi vậy, vụ mùa bệnh thường gây tác hại nặng hơn vụ xuân Vụ chiêm xuân bệnh phát triển mạnh vào tháng 5 - 6, còn vụ mùa là tháng 8 - 9 khi có nhiều mưa bão gây tổn thương cho lá lúa Những đợt mưa tháng 8 không những tạo vết thương trên lá mà còn làm cho vi khuẩn sinh sản nhanh, số lượng keo vi khuẩn hình thành nhiều, tạo điều kiện cho sự xâm nhiễm và truyền lan nhanh chóng

Nhìn chung giai đoạn mẫn cảm nhất của cây lúa với bệnh là giai đoạn làm đòng đến chín sữa (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 2001)

1.1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát sinh và phát triển của bệnh

Hạt giống, tàn dư cây bệnh, cỏ dại là những nguồn gây bệnh chính, ngoài ra, đất, nước cũng như dạng viên keo vi khuẩn trên lá cũng có ý nghĩa nhất định trong việc lan truyền bệnh cho vụ sau (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 2004)

Bệnh phát sinh phát triển mạnh khi nhiệt độ không khí tương đối cao, độ ẩm cao, trong những đợt mưa gió, bão vào lúc lúa ở giai đoạn làm đòng cho đến khi thu hoạch Sự phát triển và tác hại của bệnh phụ thuộc vào điều kiện thời tiết đồng thời phụ thuộc vào giống lúa, thời kỳ nhiễm bệnh và các biện pháp kỹ thuật canh tác như bón phân, tưới tiêu… làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng

Devadath (1985) cho biết nhiệt độ tối thích làm cho bệnh phát triển là 24,3 - 34,00C Ở nhiệt độ dưới 180C hoặc trên 37,20C đều kìm hãm sự phát triển của bệnh Nhiệt độ ảnh hưởng rất rõ khi tiến hành lây nhiễm nhân tạo Vết bệnh phát triển ở 25

- 280C nhiều hơn là vết bệnh phát triển ở 17 - 210C Nhiệt độ thích hợp nhất cho lây nhiễm bệnh là 21,3 - 32,70C Theo Tạ Minh Sơn (1996) ngoài nhiệt độ được coi là yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của bệnh thì độ ẩm là nhân tố cho sự hình thành và phát triển của bệnh khi độ ẩm thấp đạt 60,3% đến 77,5% sẽ hạn chế sự phát triển của bệnh

Sự phát triển của bệnh biến đổi theo mùa rõ rệt Gió bão không những là nhân

tố lan truyền vi khuẩn mà còn tạo ra các vết thương cơ học trên lá lúa cho vi khuẩn xâm nhập Ở miền Bắc nước ta bệnh phát sinh gây hại ở tất cả các vụ trồng lúa nhưng bệnh gây nặng nhất vào vụ mùa

Ảnh hưởng của kỹ thuật trồng trọt đối với sự phát sinh phát triển của bệnh diễn ra tương đối phức tạp Trong các yếu tố kỹ thuật thì phân bón, nhất là phân bón

vô cơ có ảnh hưởng rất rõ rệt đến mức độ phát sinh, phát triển của bệnh Các dạng đạm vô cơ dễ làm cho cây lúa nhiễm bệnh mạnh hơn phân chuồng ủ hoại mục Với chân đất màu mỡ nhiều chất hữu cơ thì bệnh phát triển mạnh hơn những chân đất xấu cằn cỗi Theo Tạ Minh Sơn (1996) thì vi khuẩn xâm nhiễm mạnh, dễ dàng trong điều kiện ruộng ngập nước do đó nên cấy thưa, giữ mực nước vừa phải sẽ làm giảm tác hại của bệnh Còn Theo Vũ Triệu Mân

và Lê Lương Tề (2004) thì trong điều kiện đất chua, ngập úng, thiếu ánh sáng, bệnh phát triển sớm và mạnh hơn

Giống cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh bạc lá Các giống lúa cũ, lúa địa phương (Di Hương, Tám thơm, Tám Xoan, Tẻ tép, Ngân Tuyết) nhiễm bệnh nhẹ hơn so với các giống lúa nhập nội có thời gian sinh trưởng ngắn phàm ăn (Khang Dân, Sán Ưu, Nhị Ưu 838, Q5) Theo điều tra của Hà Bích Thu và cộng sự (2002, Viện bảo vệ Thực vật) thì các giống lúa lai Trung Quốc nhập nội từ năm 1993 - 1997 hầu hết đều bị nhiễm bạc lá với tỷ lệ bệnh 50% - 80%, cấp bệnh phổ biến là 5 - 7, nếu bệnh nặng thì năng suất giảm 20% - 50%

1.1.4 Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá

1.1.4.1 Biện pháp canh tác

Sử dụng kết hợp các kỹ thuật trong canh tác nhằm hạn chế nguồn bệnh và sự phát triển của bệnh Bao gồm các kỹ thuật: vệ sinh đồng ruộng, diệt trừ cỏ dại; xử lý hạt giống trước khi trồng; bón phân cân đối, tăng cường bón phân hữu cơ, bón đạm

sử dụng các hóa chất này là làm mất cân bằng sinh thái, đặc biệt là mất cân bằng về thành phần vi sinh vật đất

1.1.4.3 Biện pháp sinh học

Sử dụng vi sinh vật đối kháng: Một số loài vi sinh vật có khả năng đối kháng

với vi khuẩn Xoo đã được tìm thấy như: Pseudomonas fluorescens và một số chủng

Bacillus được phân lập từ các mẫu đất vùng rễ lúa có khả năng ức chế sự phát triển

của X oryzae pv oryzae trong phòng thí nghiệm (Gnanamanickam et al., 1999), hay chủng Lysobacter APMus được phân lập từ rễ lúa của tỉnh Yunnan, Trung

Quốc, có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại nấm và vi khuẩn gây bệnh

thực vật, trong đó có X oryzae pv oryzae (Jin et al., 2008) Đây là một hướng đi

mới trong chiến lược phòng chống bệnh bạc lá hứa hẹn mang lại hiệu quả cao Tuy nhiên, biện pháp này chỉ mới được tiến hành nghiên cứu và thử nghiệm trong những bước đầu tiên mà chưa thực sự được ứng dụng một cách rộng rãi

Chọn tạo giống kháng: là biện pháp khả thi và mang lại hiệu quả cao nhất trong công tác phòng chống lại bệnh bạc lá lúa hiện nay Ưu điểm của phương pháp này là có thể ứng dụng rộng rãi ở tất cả các nơi trồng lúa trên thế giới, việc phòng chống bệnh mang tính chất chủ động, lại không gây ô nhiễm môi trường và tạo ra nông sản sạch

1.1.5 Chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phân tử

1.1.5.1 Cơ sở khoa học của chọn giống kháng bệnh bạc lá

Trong lịch sử phát triển cây trồng con người luôn phải chống lại các bệnh và dịch hại cây trồng Những năm 60 là kỷ nguyên thuốc hóa học đã đưa vào sử dụng cho cây lúa nhưng việc sử dụng thuốc hóa học một cách tùy tiện đã gây hại cho con người và môi trường sống Do đó, cần phải có những phương hướng mới có hiệu quả nhất đó là sử dụng giống kháng bệnh

Vấn đề chọn giống kháng bạc lá đã được đưa ra tranh cãi gay gắt ở Nhật Bản vào những năm 60 Các nhà chọn giống cây trồng cho rằng có thể chọn được giống chống bệnh bạc lá, nhưng các nhà bảo vệ thực vật không đồng ý và cho rằng không thể

chọn giống chống bệnh mà phải sử dụng thuốc bảo vệ thực vật Đến những năm 80,

viện lúa quốc tế IRRI đã xác định bản chất di truyền tính chống bệnh bạc lá là do gen quy định Cây lúa chống bệnh này được chọn ra từ giống lúa nhiễm bệnh, nó được đặt tên là Kono 35 Giống này cung cấp gen chống chịu cho nhiều giống lúa ở Nhật Bản

Ở Indonesia, đã sử dụng giống lúa Polita 1/1 do họ tạo ra vào năm 1971 và một số giống lúa khác của Viện nghiên cứu lúa Quốc tế làm vật liệu cho nhiều cặp lai chống bệnh bạc lá Theo Khush (1989) thì Ấn Độ sử dụng nguồn gen chống bệnh bạc lá từ các giống IR20, IR22, IR26….làm bố mẹ cho nhiều cặp lai Một số giống như IR20 được đưa vào sản xuất đại trà ở Ấn Độ

Ở Philippin và Việt Nam, giáo sư Khush (1991) cho biết Philippin và Việt Nam là khu vực sử dụng rộng rãi nhất các giống chống bệnh bạc lá của IRRI (ở Philippin có tới 65% khu vực sản xuất, ở Việt Nam trước năm 1975 có khoảng 30% diện tích trồng lúa sử dụng các giống này) Các giống đó là IR20, IR22, IR26, IR8… Ông còn cho biết có trên 100 giống lúa có kiểu gen kháng bệnh được sử dụng vào chương trình chọn tạo giống kháng bệnh

Từ các nghiên cứu trên cho thấy vì tính kháng bệnh bạc lá là do gen quy định, chúng ta có thể tạo giống kháng bệnh với sự liên kết của các gen kháng Bằng phương pháp này có thể tạo được những giống lúa mới vừa kết hợp được những đặc tính nông sinh học tốt của các giống vừa mang gen kháng bệnh bạc lá

1.1.5.2 Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu và chọn giống kháng bệnh bạc lá

Sự phát triển của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ gen đã mang đến những bước tiếng đáng kể trong nghiên cứu và chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá

Vi khuẩn Xanthomonas oyzae pv Oyzae có thể được xác định nhanh chóng bằng

cách sử dụng các chỉ thị phân tử Adachi và T Oku (2000) đề xuất sử dụng 2 đoạn mồi XOR-F và XOR-R2 để nhân đoạn DNA, đoạn DNA này nằm giữa hai gen tổng hợp nên cấu tử 16S và 23 S của ribosome vi khuẩn bạc lá

Hiện nay chỉ thị phân tử DNA được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền và chọn giống Chỉ thị DNA đánh dấu gen gồm 10 phương pháp, sắp xếp theo thứ tự thường được sử dụng như trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Các loại DNA markers thông dụng

Marker Tên đầy đủ

RFLP Restriction fragment length polymorphism

ALP Amplicon length polymorphism

AFLP Amplified fragment length polymorphism

RAPD Random amplified polymorphic DNA

DAF DNA amplification fingerprinting

SSR Simple sequence repeat (microsatellite)

AP - PCR Arbitrary primer-PCR

SSCP Single strand conformation polymorphism

MRDHV - DNA Moderately repeated, dispersed, and highly variable

DNA(minisatellite) STS Sequence Tagged site

* Chỉ thị phân tử liên quan một số gen kháng bệnh bạc lá lúa

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, người ta đã xác định được các chỉ thị liên quan đến tính kháng bệnh Đối với bệnh bạc lá, xác định 7 gen kháng bệnh bạc lá và đánh dấu bằng phương pháp RFLP, kết quả được tổng hợp ở bảng sau:

Bảng 1.2 Bản đồ liên kết di truyền với gen quy định tính trạng nông sinh

học quan trọng với RFLP đánh dấu

Gen Tính trạng Nguồn cho NST RFLP và độ liên kết Tài liệu tham khảo

Xa1 Chống bạc lá Kogyoku 4

Npb235 3.3cM Npb197 7.2cM

Yoshimura et al

1992

Xa2 Chống bạc lá Tetep 4

Npb235 3.4cM Npb197 9.4cM

Yoshimura et al

1992

Xa3 Chống bạc lá Chugoku45 11

Npb181 2.3cM Npb78 3.5cM

Yoshimura et al

1992

Xa4 Chống bạc lá IR20 11

Npb181 1.7cM Npb78 1.7cM

Yoshimura et al

1992

xa5 Chống bạc lá IR1545-339 5 RG556 0-1cM McCouch et al.1991

xa13 Chống bạc lá Long grain 8 RZ28

5.1cM Zhang et al.1994

Xa21 Chống bạc lá

O

longistamin ata

11

pTA818,pTA248 0-1cM RG103

Ronald et al 1992

Chỉ thị phân tử đã được ứng dụng thành công trong việc xác định các gen

kháng (Nelson et al., 1996), trong việc tổ hợp nhiều gen kháng để tạo thành giống chứa gen kháng (Huang et al., 1997), trong chuyển gen kháng bằng phương pháp

nuôi cấy mô, dung hợp tế bào trần (Kelly, 1995)

Từ năm 1997-2004, Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long đã sử dụng phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử kết hợp với lây nhiễm nhân tạo bằng 9 race vi khuẩn

phổ biến trong đánh giá khả năng kháng bệnh của 348 giống lúa địa phương thu thập được ở duyên hải Trung Bộ và đồng bằng sông Cửu Long Kết quả đã thu được

17 giống mang gen xa13, 6 giống mang gen Xa4, 4 giống mang gen xa5, 3 giống mang gen Xa7, 3 giống mang gen Xa14 Kiểm tra độ tin cậy của phương pháp chỉ

thị phân tử trong nghiên cứu phát hiện gen kháng ở quần thể con lai giữa

IR24/Barer đối với gen xa5 cho thấy độ chính xác lên tới 93,3% (Lang N.T and Buu

B.C, 2003) Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (2003, 2007) cũng đã sử dụng chỉ thị phân tử để kiểm tra tổ hợp BC4F4 của IR24 với giống lúa địa phương mang gen

kháng Xa4, xa5, xa13 với độ chính xác cao

* Kỹ thuật PCR trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo

các đoạn DNA với tốc độ nhanh chưa từng thấy và độ chính xác cao được thực hiện trong máy chu trình nhiệt (máy PCR)

Kỹ thuật PCR được Karry Mullis phát minh vào năm 1985 và tiếp tục được hoàn thiện phát triển thông qua sự phân lập và sản xuất thành công enzyme tổng

hợp DNA chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermus aquaticus, sự thiết kế thành công các máy

chu trình nhiệt cho phép thay đổi nhanh chóng và chính xác nhiệt độ cho từng giai đoạn phản ứng Cho đến nay, kỹ thuật PCR được xem như là một trong những phương pháp nền quan trọng nhất của công nghệ sinh học hiện đại

Ngày nay, đã có nhiều gen quan trọng của các loại cây trồng được phân lập bản đồ liên kết với các đoạn DNA genom, đặc biệt là gen kháng bệnh ở các cây

lương thực chính (Melchinger et al., 1990 ; Kelly, 1995; Penner et al., 1995; Miklas

et al., 1996) Dựa trên bản đồ này, kỹ thuật PCR xác định gen kháng bạc lá đã được xây dựng Kỹ thuật này ngày càng được sử dụng rộng rãi bởi tính khả thi, tính hiệu quả và tính tinh tế

G.S.Khush, N.Huang et al, (1997) đã sử dụng kỹ thuật PCR thông qua việc

sử dụng các DNA marker để dự đoán các genotypre của vi khuẩn bạc lá ở thế hệ

phân ly F2 của dòng lúa dại O.longistaminata, có ý nghĩa cung cấp một công cụ

mạnh mẽ để tăng hiệu quả gạo chăn nuôi Kết quả trong 34 cá thể có 31 cá thể mang gen kháng RR, 3 cá thể mang gen Rr, tính chính xác của phân tích PCR là 91.2%

Sử dụng kỹ thuật chuỗi phản ứng liên kết men (PCR) để xác định loại vi

khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae bằng 2 gen mồi (primer): R2 và

XOR-F đặc hiệu (Odachi et al., 1990) Bùi Trọng thủy và Phan Hữu Tôn (2004) đã nghiên

cứu khả năng kháng bệnh bạc lá 16 dòng lúa đa gen của IRRI-Nhật Bản được sử dụng làm cây chỉ thị (Tester) chứa đa gen kháng với một số chủng vi khuẩn

Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lá lúa phổ biến ở miền Bắc Việt Nam

đã cho kết luận chủng Y9 là chủng có độc tính rất cao, có thể lây nhiễm cho nhiều dòng lúa chứa các gen kháng bệnh bạc lá khác nhau và các tổ hợp gen có chứa gen

Xa7 như : Xa1/Xa7; Xa3/Xa7; Xa4/Xa7 có khả năng kháng các chủng Y1, Y5, Y6,

Y7, Y8 và Y10 Đây là những chủng vi khuẩn có phạm vi phân bố rộng rãi ở vùng đồng bằng sông Hồng, khu IV cũ, các tỉnh miền núi phía Bắc, nhưng có phản ứng nhiễm với chủng Y9, chủng này phân bố ở Hà Nội, Hưng Yên, Hòa Bình và Tuyên Quang

Tại Việt Nam, kỹ thuật PCR được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu bệnh bạc lá và chọn giống lúa kháng bệnh ở các trung tâm chọn giống

Trong các năm 2000-2005, Phan Hữu Tôn và cộng sự tiến hành việc tìm kiếm nguồn gen kháng từ các giống lứa địa phương bằng kỹ thuật PCR kết hợp lây nhiễm nhân tạo Năm 2000, theo kết quả nghiên cứu đã công bố của Phan Hữu Tôn thì trên cơ sở điều tra 145 giống lúa địa phương, phát hiện được 12 giống chứa gen

xa5 và 2 giống chứa gen Xa7 Năm 2004 tiếp tục điều tra trên 120 giống lúa địa phương, ông công bố thêm 8 giống chứa gen xa5 Năm 2005, điều tra trên 500 giống lúa địa phương thu được kết quả: 56 giống chứa gen Xa4, 36 giống chứa gen

xa5 , 16 giống chứa gen Xa7 và không giống nào chứa gen Xa21

Nghiên cứu đa dạng tập đoàn giống lúa có tính khác nhau với bệnh bạc lá bằng kĩ thuật RAPD, tác giả Đinh Thị Phòng đã sử dụng 21 mồi ngẫu nhiên với 36 giống lúa thu được tổng số 392 phân đoạn ADN được nhân lên Tất cả 21 mồi RAPD đều cho tính đa hình Sự sai khác về hệ số tương đồng di truyền giữa các giống khoảng 22% - 64 % Có tổng số 36 giống lúa có tính kháng bệnh bạc lá khác nhau có thể sử sử dụng như là những nguyên liệu để xác định nhóm gen kháng của

từng giống lúa làm cơ sở trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá có

năng xuất chất lượng cao (Đinh Thị Phòng và cs., 2003)

Nghiên cứu về việc đánh giá sơ bộ kiểu kí sinh các mẫu li trích vi khuẩn

Xanthomonas oryzae pv oryzae vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long kết quả cho thấy

41 mẫu vi khuẩn thuần cho phản ứng gây bệnh trên bộ chỉ thị 10 gồm dòng đẳng

gen chứa 10 gen kháng bệnh khác nhau (Hoàng Đình Đình và cs., 2008) Kết quả

phản ứng của các mẫu vi khuẩn này trên 10 gen kháng cho ra tính kháng nhiễm rất

khác biệt Gen xa5 có hiệu lực kháng bệnh cao nhất, kế đến là Xa7, Xa21 và xa13

Sáu nòi sinh lý đã được xác định và cho thấy chúng phân bố khác nhau trên các tỉnh vùng ĐBSCL Nòi A, E và F phổ biến nhất và có xuất hiện gây hại ở từ 6 đến 8 tỉnh trong toàn vùng, trong khi nòi B, C và D xuất hiện ở từ 3 đến 5 tỉnh trong vùng

Nguyễn Thị Pha và cộng sự (2004) đã sử dụng các chỉ thị STS (RG556, RG136, pTA248 ), SSR (RM21, RM114, RM122, RM164, RM190) để phát hiện

các gen Xa21, xa5, xa13 trên giống các giống lúa địa phương và bố mẹ lai Lã Vinh

Hoa và cs., 2010 đã sử dụng các chỉ thị Npb 181, P3 và RG 556 để phát hiện ra các

gen Xa4, Xa7, xa5 tương ứng với 150 mẫu giống thu được từ các địa phương ở

miền Bắc Việt Nam

Năm 2011, Vũ Hồng Quảng và cộng sự đã thành công sử dụng các chỉ thị

RM5509 và pTA248 để phát hiện gen kháng bạc lá tương ứng ở xa7, xa21 ở các

dòng bố mẹ 9311BB, D42BB, R308BB Chỉ thị phân tử liên kết chặt với các gen

Xa21, Xa7: pTA248, RM5509 tương ứng đã được sử dụng để phát hiện các gen này

trên 3 dòng bố 9311BB, D42BB, R308BB Kết quả kiểm tra cho thấy: dòng bố

R308BB có 90% số cá thể của mang gen kháng Xa21 đồng hợp tử, 10% số cá thể

mang gen dị hợp tử; dòng bố D42BB có 10% số cá thể mang gen kháng dị hợp tử,

dòng bố 9311BB có 100% số cá thể mang gen Xa7 và tất cả các cá thể này đều đồng hợp tử về gen Xa7

Như vậy, các giống lúa địa phương Việt Nam chứa nguồn gen chống bệnh hữu hiệu rất phong phú nên sử dụng và khai thác trong các chương trình chọn tạo giống chống bệnh quốc gia

1.2 Tổng quan về tính trạng mùi thơm của lúa

1.2.1 Các yếu tố cấu thành chất lượng của lúa

Lúa chất lượng là giống lúa không những có kích thước, hình dạng thon dài

mà còn có phôi nhũ, hàm lượng amyloza cao và đặc biệt các giống lúa chất lượng

có mùi thơm đặc trưng

Chất lượng của lúa phụ thuộc nhiều yếu tố như hàm lượng amyloza, dạng nội nhũ, hàm lượng protein và đặc biệt là hương thơm…

1.2.1.1 Tính trạng hàm lượng Amyloza

Hàm lượng amylose được kiểm soát bởi gen waxy, nằm trên nhiễm sắc thể số

6 Gen waxy có hai allen là Wxa và Wxb Allen Wx a xuất hiện chủ yếu ở các giống

lúa O sativa indica, còn Wx b chủ yếu ở các giống lúa O sativa japonica Trình tự

Wxa và Wxb khác nhau một nucleotide tại vị trí cắt nối intron 1 Trình tự cắt nối từ

đầu 5’ của intron 1 của Wxa là AGGTATA, của Wxb là AGTTATA Sự thay thế

nucleotide G bằng T ở Wxb đã làm giảm hàm lượng mRNA thành thục dẫn đến giảm enzyme Granule-Bound Starch Synthase (GBSS) tạo thành, từ đó giảm hàm

lượng amylose (Saito et al., 1991, Hirano, 1998)

Các giống có hàm lượng amylose thấp cho cơm dẻo, các giống có hàm lượng amylose trung bình cho cơm mềm và các giống có hàm lượng amylose cao thì cho cơm cứng hoặc rất cứng

Tại Việt Nam, việc nghiên cứu về hàm lượng amylose trong các giống lúa cũng đã rất được chú ý trong những năm vừa qua Tại Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long, các nhà chọn giống đã sử dụng MAS trong chọn giống có hàm lượng amylose thấp và trung bình trên cơ sở marker phân tử Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu (2007) đã sử dụng microsatellite marker liên kết với hàm lượng amylose trung bình là WxF-R định vị trên NST số 6 Kết quả ghi nhận QTL mục tiêu liên kết với marker này đã giải thích biến thiên kiểu hình hàm lượng amylose trung bình là 17,8% cho cặp lai IR64/ Hoa Lài và 19,7% cho IR24/ Khao Dawk Mali105 Khi đánh giá trên quần thể của Nàng Nhen và OM3536 về mức độ ước đoán chính xác giữa kiểu gen và kiểu hình đạt 97%

1.2.1.2 Tính trạng hàm lượng protein

Lúa có hàm lượng protein ít hơn các cây lương thực khác, chỉ khoảng 7-8% Tuy nhiên lúa gạo lại cung cấp từ 40-80% lượng calo và từ 40-50% lượng protein trong khẩu phần dinh dưỡng của người dân châu Á

Đặc điểm di truyền về hàm lượng protein do đa gen kiểm soát phân bố trên các nhiễm sắc thể số 1, 2, 4, 6, 9, 12, (các thành phần của glutein) nhiễm sắc thể 7,

11, (protein dự trữ trong nội nhũ) nhiễm sắc thẻ 5, 7, 12, (các thành phần của prolamin) Hàm lượng protein biến đổi mạnh mẽ do tác động của môi trường từ

0,130 đến 0,372 Kết quả nghiên cứu của Shenoy và cs., (1991), chứng tỏ rằng hệ số

di truyền hàm lượng protein đạt 71% Một số cặp lai nghiên cứu cho thấy hệ số di truyền hàm lượng protein rất thấp 11,1% Từ những biến động đó cần phải phân nhóm di truyền trên các nhóm khác của các giống lúa địa phương, xem như là nguồn vật liệu lai phục vụ cho chương trình chọn giống lúa tốt hơn

1.2.1.3 Tính trạng mùi thơm

Phân tích hóa học trên một phổ rộng các giống lúa thơm và không thơm cho thấy có rất nhiều các thành phần khác nhau và có sự thay đổi của các thành phần này trong quá trình bảo quản Những nghiên cứu trước đây đã chứng minh mùi vị của gạo có liên quan tới thời gian bảo quản, trong lúa mới được xác định có các hợp chất tạo thành mùi thơm 1- butanal, 1- hexanal, 1- heptanal, methyl ethyl ketone, 1 pentalnal và propanal, sau một thời gian bảo quản chỉ thấy còn butanal và 1- heptanal Hàm lượng của hexanal trong gạo cân bằng tuyến tính với nồng độ của

axit linoleic đã oxi hóa trong gạo (Shin MG et al., 1986), khi được bảo quản ở nhiệt

độ 35oC trong hai tuần, một vài loại gạo đã giảm hàm lượng pentanal, hexanal và

petanol đáng kể so với các loại gạo khác (Szuki Y et al., 1999)

Tuy nhiên, trong những nghiên cứu gần đây đã cho thấy đặc tính mùi thơm của lúa chủ yếu do hợp chất 2 acetyl - 1- pyrroline tạo thành Sử dụng các phân tích

bằng cảm quan và sắc kí khí, Butterry và cs., (1986) đã xác định 2 acetyl - 1 -

pyrroline (2AP) là một chất mặc dù có hàm lượng rất thấp trong các loài lúa thơm nhưng là chất khởi đầu tạo hương thơm ở các giống lúa Jasmine và Basmati

(Buttery RG và cs., 1986), Một nghiên cứu khác cũng cho thấy 2AP có mặt trong

các giống lúa không thơm nhưng có hàm lượng thấp hơn so với các giống lúa thơm

từ 10 - 100 lần (Widjaja R et al., 1996), (Wilkie K and Wootton M, 2004) Ngưỡng

nồng độ của 2AP mà con người có thể cảm nhận được trong khoảng 0,1ppb khi tan trong nước Để cảm nhận được 2AP có trong gạo thơm, nồng độ 2AP thường cao hơn khoảng 3000 lần so với ngưỡng nồng độ tan trong nước và chỉ cao gấp 30 lần ở gạo không thơm

1.2.2 Bản chất hóa học của mùi thơm

Hiện nay, mùi thơm của lúa là một tính trạng chất lượng đang rất được ưa

chuộng hiện nay Theo Widjaja et al., (1996), mùi thơm của lúa là kết quả tạo thành

bởi một loạt các hợp chất hóa học khác nhau nhưng hợp chất 2-acetyl-1- pyrroline AP) là chất bay hơi đóng vai trò là thành phần chính tạo nên mùi thơm của lúa 2-

(2-AP xuất hiện trên tất cả các bộ phận của cây (thân, lá và hạt) ngoại trừ phần rễ

(Buttery et al., 1983; Lorieux et al., 1996; Yoshihashi và cs., 2002) 2-AP không

hình thành trong quá trình thu hoạch và nấu chín mà hình thành trong quá trình sinh trưởng của cây Chính vì vậy mà mùi thơm của lúa có thể được xác định trên cả hạt

và mô lá (Yoshiyashi và cs., 2002; Nguyễn Lộc Hiền và cs., 2006)

Có ba gen trội quy định mùi thơm ở lúa đã được xác định là Ska, Skb và Skc (Reddy and Sathyanarayanaiad, 1980) Tuy nhiên, tùy từng tác giả, tùy từng tổ hợp lai sử dụng mà kết luận về số lượng gen quy định mùi thơm có khác nhau, từ 1- 3 gen trội quy định Quá rình tổng hợp 2-AP phụ thuộc gián tiếp vào hoạt tính của enzyme Betaine Aldehyde Dehydrogenase (BAD2) Khi BAD2 hoạt động mạnh sẽ cạnh tranh cơ chất với enzyme sinh tổng hợp ra 2-AP dẫn đến hàm lượng 2- AP bị

giảm và lúa sẽ không có mùi thơm (Kuo et al., 2006) Ngược lại, nếu gen sinh

enzyme BAD2 bị đột biến dẫn đến xuất hiện mã kết thúc sớm sẽ làm enzyme BAD2 mất hoạt tính, dẫn đến enzyme tổng hợp sinh ra 2- AP nhiều và thơm, chứa gen lặn

fgr Giống lúa nào mang gen mã hóa BAD2 nguyên vẹn bình thường sẽ không thể

hiện mùi thơm 2- AP, không chứa gen mùi thơm fgr Sự đa hình DNA này là cơ sở

để Bradbury et al, (2005), Kuo et al, (2006), Chen et al, (2006) xây dựng phương pháp chỉ thị phân tử DNA nhằm phát hiện ra gen thơm fgr ở lúa

1.2.3 Di truyền của tính trạng mùi thơm

Di truyền tính trạng thơm ở lúa đã được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Khi nghiên cứu tỷ lệ phân ly giữa cá thể thơm và không thơm trong quần thể F2 của nhiều tổ hợp lai, một số nhà nghiên cứu cho rằng, có một số gen khác nhau (trội hoặc lặn) liên quan tới tính trạng thơm

Cho đến nay, rất nhiều quan điểm khác nhau về di truyền tính trạng mùi thơm đã được đưa ra Jodon (1944) cho rằng tính trạng mùi thơm do 1 gen trội quy định, nhưng trước đó Kandam và Paatanka (1938) lại cho rằng tính trạng này do 2 gen quy định Nagaraju (1975) đưa ra quan điểm là có 3 gen tham gia quy định tính trạng mùi thơm Dhulappanavar (1976) kết luận rằng tính trạng mùi thơm do 4 gen quy định

Tuy nhiên, phần lớn các nghiên cứu đều kết luận rằng tính trạng mùi thơm của lúa do 1 gen quy định (Sood and Siddiq,1978; Reddy PR and Sathyanarayaniah

K, 1981; Berner and Hoff, 1986; Bollich et al, 1992; Li and Gu, 1997) Berner and

Hoff (1986) kết luận rằng 1 gen trội quy định tính trạng mùi thơm của lúa

Li và Gu (1997) nghiên cứu về di truyền và vị trí của gen quy định mùi thơm trên giống lúa Shenxiangjing đã phát hiện ra mùi thơm được điều khiển bởi 1 gen lặn Ngoài ra, từ kết quả lai thuận nghịch giữa các giống lúa thơm, các tác giả này cũng đi đến kết luận rằng gen quy định mùi thơm di truyền đa allen Tiến hành lai chéo giống lúa thơm WX với các dòng tam bội có nguồn gốc từ IR36 và giống lúa thơm WJ, Li và Gu kết luận gen quy định mùi thơm nằm trên nhiễm sắc thể số 8

Trước đó, sử dụng kỹ thuật RFLP, Ahn et al, (1992) cũng đã định vị được gen này

trên nhiễm sắc thể số 8

Kato và Itani (1996) tiến hành nghiên cứu về sự liên quan di truyền của mùi thơm và các tính trạng nông sinh học khác bằng cách nghiên cứu trên các tổ hợp của thế hệ F8 bằng phương pháp chọn lọc một hạt của tổ hợp lai giữa giống BGT x Koshihiraki Sau khi so sánh sự khác biệt của các cặp tính trạng giữa nhóm có mùi thơm và nhóm không có mùi thơm, các tác giả này đưa ra kết luận gen quy định mùi thơm di truyền hoàn toàn độc lập với các gen khác

Trong các nghiên cứu của mình, Khush và Dela Cruz (1998) đã nhấn mạnh

tính trạng mùi thơm của lúa là tính trạng số lượng với dãy biến dị rộng

Bradbury et al, (2005) đã công bố nghiên cứu về vị trí, cấu trúc và cơ chế hoạt động của gen fgr quy định tính trạng mùi thơm của lúa Trong nghiên cứu này, Bradbury et al, đã phát hiện ra ở các giống lúa thơm dạng Basmati và Jasmine

(Oryza sativa) có gen mã hóa cho BAD2 nằm trên NST số 8 Gen này bị đột biến mất 8bp và có sự đa hình nucleotide đơn tại 3 vị trí (3 SNPs) trên exon 7, dẫn đến dịch chuyển khung đọc mở và làm thay đổi chức năng của BAD2 Theo đó các giống lúa thơm có BAD2 không hoạt động và các giống lúa không thơm BAD2 hoạt động bình thường Điều này có thể được giải thích dựa trên mối quan hệ của BAD2 với sự tổng hợp 2AP đã được đề cập ở trên Ngoài ra, các tác giả đã sử dụng các NST nhân tạo của vi

khuẩn để kiểm tra vị trí của gen fgr và đã phát hiện được vị trí chính xác của gen này

trên NST 8 Kết quả của nghiên cứu này đã được công nhận rộng rãi và được sử dụng trong rất nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tử trong chọn tạo các giống lúa thơm

Trong nghiên cứu của Bourgis và cộng sự (2008) về gen mùi thơm ở giống lúa

thơm thuộc loài phụ japonica đã cho thấy sự biểu hiện mùi thơm ở các giống lúa thơm japonica không phải do gen fgr quy định mà tuân theo một cơ chế phân tử

khác Nghiên cứu đã xác định được một gen mã hóa tổng hợp betaine aldehyde

dehydrogenase 2 khác (badh2 gen) là một locus ứng viên chịu trách nhiệm về mùi

thơm, có sự biểu hiện đột biến giống như ở giống lúa thơm Basmati và Jasmine

Giống có mùi thơm sẽ vắng mặt một MITE và có mặt allen badh2 (đột biến 12bp tại exon7 của allen badh2)

Theo Phan Hữu Tôn và Tống Văn Hải (2010) khi tiến hành sàng lọc xác định

gen mùi thơm trên các giống lúa thu được kết quả hầu hết các giống lúa nếp (chủ yếu thuộc loài phụ japonica) có mùi thơm lại không mang gen fgr Điều này cũng chứng tỏ

bản chất di truyền tính trạng mùi thơm ở lúa nếp khác với lúa tẻ

1.2.4 Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu gen fgr của lúa gạo

Đến nay, nhiều chỉ thị phân tử như SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) hay

SSRs (Simple Sequence Repeats) liên kết với gen fgr đã được áp dụng trong chọn lọc giống lúa thơm (Cordeiro et al., 2002)

Ahn et al, (1992) đã xác định được chỉ thị RG28 nằm trên nhiễm sắc thể số 8

liên kết với gen fgr ở khoảng cách 4,5cM Theo tác giả, chỉ thị này có thể áp dụng

để dự đoán sớm sự có mặt của gen mùi thơm trên một giống lúa, phân biệt được

tính trạng đồng hợp tử hay dị hợp tử của gen fgr và phát hiện nhanh mùi thơm trong các dòng lai (Ahn et al, 1993) Nghiên cứu của Li et al, năm 1996 đã kết luận

tính trạng mùi thơm do 1 gen lặn nằm trên NST số 8 quy định đã củng cố thêm quan

điểm RG28 là một chỉ thị đặc hiệu cho gen thơm Pandey et al, (1994, 1995) nghiên

cứu về liên kết giữa RG28 và thơm bằng cách nghiên cứu tổ hợp lai chéo giữa giống có mùi thơm Pusa 751 với giống không thơm IR72 đã đưa ra kết luận chỉ thị RG28 có khoảng cách là 10cM với gen thơm thay vì 4,5cM như kết luận của Ahn

(Pandey et al, 1994, 1995)

Các cặp mồi thiết kế từ RG28 đã được ứng dụng rộng rãi trong việc phát hiện nhanh các giống lúa thơm (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2002; Cordeido

et al., 2002; Jin et al., 2003) Tuy nhiên nhược điểm lớn nhất của các mồi này là

chúng chỉ liên kết với gen thơm ở một mức độ nào đó nên không thể chính xác đến

100% (Hiền và cs., 2005; Louis M T Bradbury et al., 2005).

Bradbury et al, (2005) dựa vào cấu trúc và cơ chế hình thành của gen thơm đã

sử dụng phương pháp ASA (Allele Specific Amplification) thiết kế một bộ mồi gồm

4 mồi là ESP, IFAP, EAP và INSP Trong đó, ESP, EAP nhân cả vùng gen thơm,

ESP và IFAP nhân gen lặn fgr, INSP và EAP nhân gen trội Fgr: không thơm Với bộ

mồi này, phản ứng PCR sẽ nhân được 4 đoạn có kích thước như sau: một đoạn khoảng 580bp sẽ xuất hiện ở cả hai trường hợp thơm (577bp) và không thơm

(585bp), một đoạn 355bp xuất hiện ở trường hợp đồng hợp tử trội Fgr/Fgr (không thơm), một đoạn 257bp xuất hiện ở trường hợp đồng hợp lặn fgr/fgr (thơm) và đối với trường hợp dị hợp tử Fgr/fgr (không thơm) sẽ xuất hiện đồng thời cả hai đoạn

355bp và 257bp Bộ 4 mồi này có tính chính xác tới 100% do chúng được thiết kế từ trình tự của chính gen mã hóa tổng hợp BAD2 (Robert Henr and Daniel Waters, 2006;

Wakil Ahmad Sarhadi et al., 2008) Hoạt động của bộ mồi được minh họa ở hình 1.1

Hình 1.1 Hoạt động của bộ 4 mồi được mô tả trong nghiên cứu của Bradburry

và cộng sự (2005)

Shu Xia Sun et al, (2008) tiến hành kiểm tra gel thơm và không thơm trên

lúa ở nhiễm sắc thể số 8 bằng kỹ thuật SSR với tám cặp mồi Kết quả cho thấy rằng cặp mồi Ch - 29B và R2 không đa hình mà chỉ cặp mồi Aro7 đa hình, kích thước của cặp mồi Aro7 được xác định 302 bp Ngoài ra, cũng xác định được mồi RM23097 liên kết với locus hương thơm với khoảng cách là 0,71 cM Các gen

thơm (fgr) được thể hiện giữa marker Aro7 (0,57 cM) và RM515 (0,71 cM) Dựa

trên cơ sở liên kết phân tử và BAC (bacterial artificial chromosome) trên nhiễm sắc thể số 8 được xây dựng (hình 2) (Panaud O, X Chen and SR McCouch, 1996)

Hình 1.2: Vi trí gen thơm trên nhiễm sắc thể số 8

CHƯƠNG 2 :VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu gồm 6 tổ hợp phân ly F2:

Bảng 2.1 Các tổ hợp phân ly F2 sử dụng trong nghiên cứu

1 251F2 ( AIQ6 x IRBB4/7) Lúa tẻ IRBB4/7 chứa gen Xa4, Xa7

AIQ6: thơm

2 309F2 ( H56-2-2 x Hương thơm 1) Lúa tẻ H56-2-2 chứa gen Xa4, Xa7

Hương thơm 1: Thơm

3 392F2 ( LC2 x Bắc thơm 7) Lúa tẻ LC2: chứa gen Xa4, Xa7

Bắc thơm 7: Thơm

4 428F2 (10987 x 10861) Lúa nếp 10987: chứa gen Xa4, Xa7

10861: mang gen thơm

5 514F2 (KNL x 10921) Lúa nếp 10921: mang gen Xa4, Xa7

KLN: Thơm

6 526F2 (11278 x 10911) Lúa nếp 10911: mang gen Xa4, Xa7

11278: Thơm

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: nghiên cứu được tiến hành vào vụ mùa năm 2014

- Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử và được bố trí tại khu thí nghiệm đồng ruộng thuộc bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng và Trung tâm Bảo tồn và Phát triển nguồn gen cây trồng, Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Trâu Quỳ – Gia Lâm – Hà Nội

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá đặc điểm nông sinh học của 1 số cá thể tốt trong từng quần thể phân ly

- Dùng kỹ thuật PCR phát hiện cây tốt có chứa gen kháng bạc lá và gen mùi thơm ở dạng đồng hợp trội và tìm được 1 số cây quy tụ đồng thời nhiều gen kháng hữu hiệu và gen mùi thơm ở mỗi quần thể phân ly

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Quy trình chọn lọc

2.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm ngoài đồng ruộng

2.3.2.1.Bố trí thí nghiệm

+ Thời vụ: Vụ mùa năm 2014

+ Thí nghiệm được bố trí theo từng ô, mỗi ô 1 giống, các tổ hợp được bố trí tuần tự không nhắc lại, mỗi giống cấy 5 m2

+ Khoảng cách: Hàng cách hàng 20 cm, cây cách cây 11 cm, cấy 1 dảnh.+ Mật độ cấy: 45 cây/m2

+ Kỹ thuật trồng và chăm sóc:

- Cày bừa, làm giầm đất, nhặt cỏ sách sẽ, san phẳng ruộng

- Gieo mạ, gieo theo đúng luống, ô

- Bón phân: Bón phân, chăm sóc như đại trà:

Lượng bón: 120kg N + 90kg P2O5 + 60kg K2O /ha

Cách bón:

+ Bón lót: 100% P2O5 + 20% N sau lần bừa cuối cùng, giữ mực nước thấp + Bón thúc lần 1: 50% N + 40% K2O thúc đẻ nhánh kết hợp làm cỏ sục bùn, giữ mực nước 12 cm

+ Bón thúc lần 2: toàn bộ lượng phân còn lại , bón vào lúc bước vào giai đoạn phân hóa đòng , làm đòng kết hợp làm cỏ

- Làm cỏ: Trộn thuốc trừ cỏ với đạm qua các lần bón phân

- Phun thuốc: Phun 2 giai đoạn, phòng trừ sâu đục thân, cuốn lá và bệnh khô vằn Phòng trừ kịp thời khi thấy xuất hiện dấu hiệu bệnh

2.3.2.2 Chọn lọc các cá thể tốt

Để chọn lọc được các cá thể tốt mang gen kháng bệnh bạc lá, trước tiên ta phải chọn được các cá thể có đặc điểm nông sinh học tốt và năng suất cao Chọn lọc

cá thể tốt được tiến hành qua 3 giai đoạn:

*Giai đoạn đẻ nhánh: Chọn 30 cá thể dựa vào khả năng đẻ nhánh (không

chọn những cây ở hàng ngoài) của các cá thể trong mỗi tổ hợp Chọn những cá thể sinh trưởng phát triển tốt, đẻ nhánh tập trung, có 6-8 nhánh trở lên, các nhánh đều

to, các cá thể xung quanh của cá thể được chọn còn nguyên, không bị sâu bệnh Cắm thẻ theo dõi và tiến hành thu mẫu từng cá thể để tách chiết DNA

*Giai đoạn trỗ: Từ những cá thể cắm thẻ theo dõi, chọn ra những cá thể trỗ

đều, có 6 – 7 nhánh hữu hiệu trở lên ở lúa tẻ hoặc 4 – 6 nhánh hữu hiệu trở lên ở lúa nếp, thời gian trỗ ngắn, không nhiễm sâu bệnh Giai đoạn này chọn 15 – 20 cá thể

*Giai đoạn chín: Tiếp tục chọn ra những cá thể tốt nhất, có it nhất 4 - 6 bông

hữu hiệu/ khóm, chín sớm, năng suất cao, số hạt chắc/bông đạt 150 - 200 hạt trở lên, không nhiễm sâu bệnh, gạo trong không bị bạc bụng Chọn 10 – 15 cá thể tốt

Sau khi có kết quả theo dõi một số đặc điểm nông sinh học, năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các cá thể đánh dấu, tiến hành chọn lọc cá thể tốt bằng phương pháp chọn lọc cá thể mang gen kháng bệnh bạc lá và mang gen thơm bằng chỉ thị phân tử DNA

2.3.2.3 Phương pháp đánh giá một số đặc điểm nông sinh học cơ bản

Các đặc điểm nông sinh học được khảo sát theo “Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá cây lúa của IRRI, 2002”

Xác định thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng

- Từ cấy đến bắt đầu trỗ

- Từ trỗ đến chín

Sau đó tính tổng thời gian sinh trưởng từ ngày gieo đến ngày lúa chín hoàn toàn Đặc điểm nông sinh học chính thời kỳ ruộng cấy: Chiều dài bông, Chiều

cao cây cuối cùng, Đo chiều dài, chiều rộng hạt thóc

Đặc điểm nông sinh học thời kỳ chín liên quan đến năng suất: Số bông hữu hiệu/khóm, số hạt chắc/bông, khối lượng 1000 hạt, năng suất tiềm năng

- Năng suất tiềm năng = A x B x C x D x 10-4

Trong đó: A: Số khóm/m2 (45 khóm/m2)

B: Số bông hữu hiệu/khóm C: Số hạt chắc/bông chính D: Khối lượng 1000 hạt Với mỗi giai đoạn quan sát, tiến hành lập bảng

Cụ thể hiện nay các chỉ tiêu theo dõi được tiến hành theo QCVN

+ Số bông hữu hiệu/khóm: số bông có từ 10 hạt chắc trở lên

+ Số hạt/bông, số hạt chắc, tỷ lệ hạt chắc/bông: theo dõi 3 bông/cá thể + Cân năng suất cá thể: khối lượng của tất cả các hạt chắc trên cá thể

2.3.2.4 Phương pháp đánh giá cảm quan mùi thơm

Theo Sood và Siddiq, 1978, mùi thơm được đánh giá cảm quan như sau:

Mùi thơm trên lá

Thu 10 lá của mỗi mẫu tổ hợp lai ở giai đoạn lúa đẻ nhánh rộ Lấy 1g lá, cắt thành những đoạn dài 5 mm, bỏ vào ống nghiệm, ngâm với 5ml dung dịch KOH 1,7%, đậy nắp lại và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút Mức độ thơm được chấm điểm theo 3 mức rồi lấy trung bình

Điểm 1: không thơm Điểm 2: hơi thơm Điểm 3: thơm

Mùi thơm của gạo

Lấy 10 hạt của mỗi tổ hợp lai, vừa mới thu hoạch, bóc vỏ, làm trắng rồi nghiền nhỏ Bột gạo của mỗi tổ hợp lai được cho vào một ống chứa 500µl KOH 1,7%, đậy nắp và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút Đánh giá mùi thơm cũng bằng phương pháp ngửi cảm quan rồi cho điểm như trên

2.3 3 Thí nghiệm trong phòng

2.3.3.1 Phương pháp tách chiết DNA

Quy trình chiết tách DNA theo Phan Hữu Tôn, 2000 và Zheng và cộng sự,

1995 gồm các bước sau :

Bước 1: lá cây khỏe thu vào buổi sáng, cắt dài khoảng 2cm bỏ vào ống

nghiệm có dung tích dài 1.5ml, đánh dấu tên tổ hợp lai bỏ vào đá lạnh

Bước 2: Trong phòng thí nghiệm các cối chày sứ đã được khử trùng đặt

trong đá lạnh, các mẫu lá được cắt nhỏ khoảng 0.5cm vào cối sứ

Bước 3: nhỏ 400µl dung dịch chiết tách DNA vào cối sứ rồi lấy chày nghiền

nhỏ mẫu lá cho đến khi dịch chiết chuyển sang màu xanh đen

Bước 4: nhỏ thêm 400µl dung dịch chiết tách DNA vào, trộn đều và chuyển

dung dịch này vào ống nghiệm đã đánh dấu cùng giống

Bước 5: cho vào ống nghiệm 400µl dung dịch hỗn hợp Phenol : chloroform :

Isolamyl alchohol (25:24:1) Sau đó đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ 40C rồi chuyển phần dung dịch phía trên sang ống nghiệm được đánh dấu cùng tổ hợp lai

Bước 6: cho thêm 400µl dung dịch chloroform: Isolamyl alchohol (24:1) sau

đó ly tâm 13000 vòng/phút ở 40C trong vòng 3 phút rồi chuyển phần dung dịch phí trên sang ống nghiệm đã được đánh dấu cùng tổ hợp lai

Bước 7: Cho 800µl ethanol 96% trộn đều sau đó ly tâm 13000 vòng/phút

trong 5 phút ở nhiệt độ 40C, đổ phần dung dịch phía trên giữ lại phần kết tủa dưới đáy ống nghiệm

Bước 8: Rửa kết tủa bằng ethanol 70% và để khô tự nhiên bằng cách úp ngược

ống nghiệm trên giấy thấm

Bước 9: hòa tan kết tủa bằng 50µl dung dịch TE rồi bảo quản ở nhiệt độ 40C

Hỗn hợp 50ml dd chiết tách Tris-HCl pH=8 1M 50mM 2,5ml

2.3.3.3 Kỹ thuật PCR dùng trong phát hiện gen kháng bệnh bạc lá và gen mùi thơm

Quy trình phản ứng PCR: sau khi cho đủ các thành phần phản ứng và DNA cần nhân vào ống PCR (các ống này được đánh số theo thứ tự) sau đó cho vào trong máy nhân gen để chạy phản ứng PCR Đặt chu kì nhiệt cho phản ứng

a, Kỹ thuật PCR dùng trong phát hiện gen kháng bệnh bạc lá

Quy trình PCR xác định gen kháng bệnh bạc lá do GS.TS.S Taura và cộng

4 Primer Forward 10 pmol/µl 1,0

5 Primer Reverse 10 pmol/µl 1,0

6 DNA taq polymerase 5unit/µl 0,1

Bảng 2.5 Các Primer dùng trong PCR phát hiện gen kháng bạc lá lúa

Xa4 MP2 11 F: 5’ATC GAT CGA TCT TCA CGA GG 3’ R: 5’GTG CTA TAA AAG GCA TTC GGG 3’ 1.7cM N Furuya et al, 1992

Xa7 P3 6 F 5’ CAG CAA TTC ACT GGA GTA GTG GTT 3’

R 5’ CAT CAC GGT CAC CGC CAT ATC GGA 3’ 2.5 cM

Taura và cs (2004)

- Chu trình PCR nhân gen

Đặt ống nghiệm chứa dung dịch vào trong máy nhân gen theo chu kỳ :