phân lập, tuyển chọn vi sinh vật để sản xuất chế phẩm sinh học xử lý phụ phẩm sau thu hoạch quả vải

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --- --- ĐỖ MINH HẠNH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC XỬ LÝ PHỤ PHẨM SAU THU HOẠ

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

ĐỖ MINH HẠNH

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC XỬ LÝ PHỤ PHẨM SAU THU

HOẠCH QUẢ VẢI

CHUYÊN NGÀNH: KHOA HỌC MÔI TRƯỜNG

MÃ SỐ: 60.44.03.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS ĐINH HỒNG DUYÊN

HÀ NỘI – NĂM 2015

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân, được xuất phát từ yêu cầu phát sinh trong công việc để hình thành hướng nghiên cứu Các số liệu có nguồn gốc rõ ràng tuân thủ đúng nguyên tắc và kết quả trình bày trong luận văn được thu thập được trong quá trình nghiên cứu là trung thực chưa từng được ai công bố trước đây

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Tác giả luận văn

Đỗ Minh Hạnh

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật – Khoa Môi Trường – Học viện Nông nghiệp Việt Nam Để hoàn thành được luận văn này tôi đã nhận được rất nhiều sự động viên, giúp đỡ của nhiều cá nhân và tập thể

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Đinh Hồng Duyên đã tận tình hướng dẫn cho tôi trong thời gian thực hiện luận văn

Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo đã truyền đạt lại cho tôi những kiến thức quý báu trong những năm học vừa qua

Cũng xin gửi lời cám ơn chân thành tới Ban Giám hiệu, Ban quản lý Đào tạo, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập

Sau cùng tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, người thân, các em sinh viên K56, K57 đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học cũng như thực hiện luận văn

Do thời gian có hạn và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học chưa nhiều nên luận văn còn nhiều thiếu sót, rất mong nhận được ý kiến góp ý của Thầy/Cô trong

và ngoài trường

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Tác giả luận văn

Đỗ Minh Hạnh

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii

MỤC LỤC

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Yêu cầu của đề tài 2

Chương 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3 1.1 Tổng quan về cây vải 3

1.1.1 Giới thiệu về cây vải 3

1.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng quả vải và tình hình xử lý phụ phẩm sau thu hoạch quả vải 9

1.2 Cơ sở khoa học của quá trình phân giải phụ phẩm sau thu hoạch 15

1.2.1 Phân giải xenluloza 15

1.2.2 Phân giải tinh bột 17

1.2.3 Phân giải protein 18

1.3 Nghiên cứu về ứng dụng vi sinh vật trong xử lý phụ phẩm nông nghiệp sau thu hoạch 19

1.3.1 Nghiên cứu trên thế giới 19

1.3.2 Nghiên cứu ở Việt Nam 22

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tượng nghiên cứu 27

2.2 Phạm vi nghiên cứu 27

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv

2.3 Địa điểm nghiên cứu 27

2.4 Nội dung nghiên cứu 27

2.4.1 Phân lập vi sinh vật từ các mẫu nghiên cứu 27

2.4.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy phụ phẩm quả vải 27

2.4.4 Xử lý phụ phẩm quả vải bằng chế phẩm vi sinh vật 27

2.5 Phương pháp nghiên cứu 28

2.5.1 Phương pháp lấy mẫu 28

2.5.2 Phân lập vi sinh vật từ các mẫu phế thải 28

2.5.3 Đánh giá đặc tính sinh học của vi sinh vật 28

2.5.4 Phương pháp xác định sinh khối 29

2.5.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính enzyme ngoại bào, định lượng hoạt độ enzyme 29

2.5.6 Đánh giá ảnh hưởng của pH ban đầu 30

2.5.7 Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ ban đầu 30

2.5.8 Đánh giá ảnh hưởng của nguồn cơ chất đến vi sinh vật 30

2.5.9 Phương pháp xác định tính đối kháng giữa các chủng VSV 30

2.5.10 Phương pháp định tên vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm 30

2.5.11 Phương pháp sản xuất chế phẩm vi sinh vật 32

2.5.12 Phương pháp đánh giá chất lượng chế phẩm 32

2.5.13 Phương pháp xử lý số liệu 33

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1.Phân lập, tuyển chọn VSV từ các mẫu nghiên cứu 34

3.1.1 Kết quả phân tích VSV 34

3.1.2 Kết quả phân lập VSV 35

3.2 Tuyển chọn và đánh giá đặc tính sinh học 35

3.2.1 Đánh giá hoạt tính enzym ngoại bào VSV phân lập 35

3.2.2 Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy khác nhau 38

3.2.3 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sinh khối và hoạt tính enzym ngoại bào của các chủng VSV 42

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v

3.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh khối và hoạt tính enzym ngoại

bào VSV 44

3.2.5 Xác định khả năng kháng kháng sinh của các chủng VSV 47

3.2.6 Ảnh hưởng nguồn cacbon, nitơ đến sinh khối và hoạt tính enzym ngoại bào của các chủng VSV 49

3.3 Sản xuất và đánh giá chất lượng chế phẩm 54

3.3.1 Kiểm tra tính đối kháng 54

3.3.2 Định tên vi sinh vật 54

3.3.3 Sản xuất và đánh giá chất lượng chế phẩm 61

3.4 Xử lý phụ phẩm sau thu hoạch quả vải bằng chế phẩm VSV 62

3.4.1 Kết quả thí nghiệm chậu vại 62

3.4.2 Kết quả xử lý phụ phẩm quả vải quy mô đống ủ lớn 63

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 1 Kết luận 65

2 Kiến nghị 65

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi

DANH MỤC BẢNG

1.1 Diện tích và sản lượng của một số cây ăn quả 2009 - 2012 51.2 Tổng hợp thông tin vải thiều tỉnh Bắc Giang năm 2013 7

3.1 Số lượng vi sinh vật trong 1g mẫu phế phẩm (CFU/g) 34

3.4 Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy đến sinh khối và hoạt tính

3.5 Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy đến sinh khối và hoạt tính

3.6 Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy đến sinh khối, hoạt tính

3.7 Ảnh hưởng của pH đến sinh khối và hoạt tính enzym ngoại bào nấm 423.8 Ảnh hưởng của pH đến sinh khối, và hoạt tính enzym ngoại bào của

3.12 Ảnh hưởng của nguồn cacbon trong môi trường nuôi cấy đến sinh

3.13 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng nitơ đến sinh khối và hoạt tính

3.14 Đặc điểm hình thái, kích thước chủng xạ khuẩn X10 54

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii

3.16 Kết quả phân tích các thí nghiệm chậu vại sau 35 ngày 62

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii

DANH MỤC HÌNH

3.1 Vòng phân giải các nguồn cơ chất của 6 chủng xạ khuẩn 37 3.2 Vết thương trên căn hành và vòng đối kháng của X7 với chủng X10 54 3.3 Khuẩn lạc và hình thái khuẩn ty khí sinh, bào tử xạ khuẩn X10 55

3.6 Hình thái khuẩn lạc của V19, V98 trên môi trường LB 57

3.8 Cây phân loại chủng V19 dựa trên trình tự 16S rRNA 57

3.10 Cây phân loại chủng V98 dựa trên trình tự 16S rRNA 58

3.12 Sản phẩm PCR nhân mồi đặc thù vi khuẩn M marker; 1: 58 3.13 Đặc điểm khuẩn lạc và cơ quan sinh sản, cây phân loại chủng N34 59 3.14 Đặc điểm khuẩn lạc và cơ quan sinh sản, cây phân loại chủng N18 60

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ix

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BOD Biochemical Oxygen Demand - Nhu cầu oxy sinh hoá

Bộ NN & PTNT Bộ Nông Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn

CFU Colony forming unit - Đơn vị hình thành khuẩn lạc

GDP Gross Domestic Product - Tổng sản phẩm quốc nội

VietGAP Vietnamese Good Agricultural Practices - Thực hành

sản xuất nông nghiệp tốt ở Việt Nam

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây vải (Litchi chinensis) là một trong những loại cây ăn quả á nhiệt đới, là

đặc sản của Việt Nam Trong thành phần quả vải chứa nhiều chất có giá trị dinh dưỡng cao như đường dễ tiêu, vitamin B, vitamin C, photpho, sắt, canxi Quả vải ngoài ăn tươi còn được chế biến thành các sản phẩm rất phong phú như vải sấy khô, rượu vang, đồ hộp, nước giải khát, bánh kẹo, Do vậy quả vải được nhiều người tiêu dùng ưu tiên lựa chọn hơn so với các loại quả khác khi vào mùa quả chín

Cây vải là cây có tính thích ứng mạnh, dễ trồng, có thể chịu được hạn nên

có thể sinh trưởng tốt trên đất đồi vì vậy nhiều tỉnh như Bắc Giang, Hải Dương, Quảng Ninh, Phú Thọ đã và đang có kế hoạch đẩy nhanh diện tích trồng vải Một số tỉnh như Bắc Giang, Hải Dương đã trồng được hàng ngàn ha vải

Vùng vải Lục Ngạn – Bắc Giang được coi là vùng vải lớn ở miền Bắc Việt Nam Diện tích trồng vải chiếm 74,2% diện tích trồng cây ăn quả toàn huyện Sản lượng quả vải trồng tại huyện Lục Ngạn thay đổi phụ thuộc vào thời tiết từng năm, năm 2012 đạt 80.000 tấn song đến năm 2013 đạt trên 130.000 tấn quả tươi (Sở Công Thương Bắc Giang, 2013)

Phụ phẩm sau thu hoạch quả vải gồm cành quả, cuống quả, quả bị loại và các quả bị hỏng trong quá trình vận chuyển, tiêu thụ Ước tính lượng phụ phẩm này chiếm 1/4 – 1/3 so với khối lượng quả đem bán và đặc biệt phụ phẩm này bị thải, loại tập trung nhiều vào tháng 5-6 Do chưa có ý thức thu gom, xử lý nên đa phần phụ phẩm quả vải đều bị vứt không đúng nơi quy định, tại các lề đường, bờ ruộng Điều này đã gây mất mĩ quan, ô nhiễm cho môi trường của địa phương

Như vậy vấn đề cấp thiết được đặt ra với huyện Lục Ngạn, tỉnh Bắc Giang

là xử lý phụ phẩm sau thu hoạch quả vải để đảm bảo môi trường cho khu vực

Hiện nay có rất nhiều phương pháp đã và đang được áp dụng xử lý phế thải hữu cơ (rơm rạ, tàn dư thực vật, rác thải hữu cơ ) đạt hiệu quả cao, trong đó xử lý phế thải bằng chế phẩm sinh học được áp dụng một cách triệt để và sản xuất chế phẩm sinh học từ vi sinh vật bản địa là phổ biến nhất

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2

Với mong muốn áp dụng biện pháp sinh học để xử lý phụ phẩm quả vải sau

thu hoạch, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Phân lập tuyển chọn vi sinh vật để sản xuất chế phẩm sinh học xử lý phụ phẩm sau thu hoạch quả vải”

2 Mục đích nghiên cứu

- Phân lập, tuyển chọn được được một số chủng vi sinh có khả năng phân giải mạnh xenluloza, protein, tinh bột từ phụ phẩm sau thu hoạch qua vải để sản xuất chế phẩm sinh học

- Xử lý phụ phẩm sau thu hoạch quả vải bằng chế phẩm sinh học

3 Yêu cầu của đề tài

- Phân lập được từ 1-2 chủng vi khuẩn, 1-2 chủng xạ khuẩn, 1-2 chủng nấm

- Định tên các chủng VSV và lựa chọn được tổ hợp VSV để sản xuất chế phẩm VSV

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3

Chương 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Tổng quan về cây vải

1.1.1 Giới thiệu về cây vải

1.1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố cây vải

Cây vải còn gọi là Lệ chi (Litchi chinensis) là loài duy nhất trong chi Litchi thuộc họ Bồ Hòn (Sapindaceae) Đây là loại cây ăn quả thân gỗ vùng

nhiệt đới, có nguồn gốc từ miền nam Trung Quốc (Quảng Đông và Phúc Kiến) Người ta thấy vải dại trong rừng 4 tỉnh phía nam (Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam, đảo Hải Nam) và có nơi vải dại mọc trong rừng trên diện tích rộng Cây vải được di thực sang các vùng khác ở Đông Nam Á như: Việt Nam, Myanma, Malaysia Năm 1873, cây vải được trồng ở Hawai Năm 1874, cây vải được trồng rộng rãi ở Florida (Mỹ) và diện tích trồng vải được mở rộng ở nhiều nước trên thế giới khác (Trần Thế Tục, 2003)

Theo Trần Thế Tục (1998), ở Việt Nam, cây vải được trồng cách đây khoảng 2000 năm Vùng phân bố tự nhiên của vải ở nước ta từ 18 – 190 vĩ độ Bắc trở ra Vùng trồng vải chủ yếu của Việt Nam là vùng Đồng Bằng sông Hồng, trung

du, miền núi Bắc Bộ và một phần khu IV cũ Ở Huế có một số cây vải giống Hắc lệ chi và Hồng lệ chi, tương truyền do các sứ thần của ta đi Trung Quốc mang về (Trần Thế Tục, 2003)

Vải, đặc biệt là vải thiều là loại cây ăn quả mang lại giá trị kinh tế khá cao

so với một số loại cây ăn quả khác như chuối, cam, chanh Do vậy, cây vải đã được Nhà nước cũng như người nông dân quan tâm và đã phát triển hình thành một

số vùng trồng tập trung như Lục Nam – Lục Ngạn – Yên Thế (Bắc Giang), Thanh

Hà – Chí Linh (Hải Dương), Đông Triều (Quảng Ninh) và một số địa phương khác

1.1.1.2 Tình hình trồng và tiêu thụ vải trên thế giới và Việt Nam

a) Tình hình trồng và tiêu thụ vải trên thế giới

Hiện nay có gần 30 nước trồng vải, tập trung chủ yếu ở khu vực châu Á –

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 4

Thái Bình Dương Theo số liệu của FAO, sản lượng vải năm 2004 của thế giới đạt hơn 3 triệu tấn Một số nước sản xuất vải lớn như: Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Australia Tuy nhiên, nếu xét về sản xuất có tính chất hàng hóa thì chỉ có một số nước như: Trung Quốc, diện tích trên 161.681 ha, sản lượng 223.680 tấn; Ấn Độ: diện tích 23.442 ha, sản lượng 150.000 tấn; Australia có khoảng trên 1 triệu cây, sản lượng 35.000 tấn (1990); Mỹ năm 1981 sản lượng 2.000 tấn Ngoài ra vải còn trồng nhiều ở Nam Phi, Malayxia, Brazin, Newzilan (Dương Thanh Tuấn, 2012)

Năm 2006, tổng diện tích trồng vải của các nước trên thế giới vào khoảng 720.000 ha, trong đó 98% sản lượng được trồng ở châu Á Trung Quốc là nước đứng đầu thế giới là nước sản xuất vải, chiếm 70% tổng sản lượng sản xuất của thế giới Ấn

Độ là nước đứng thứ 2, chiếm 20%, Thái Lan chiếm 3,9%, Việt Nam chiếm 2,3%, các nước còn lại sản lượng sản xuất vải chưa đến 2% (Nguyễn Phan Thiết, 2011)

Ở Trung Quốc, vải có thể được sử dụng tươi, sấy khô hoặc chế biến Trái vải có thể được phơi nắng cho khô hoặc sấy để lưu giữ hương vị Hầu hết các loại trái cây khô được bán tại địa phương và một số xuất khẩu sang các nước khác trong khu vực

Ấn Độ là nước có sản lượng vải thiều lớn thứ hai sau Trung Quốc, với năng suất hơn 500.000 tấn một năm Các giống cây trồng chính của vải thiều ở

Ấn Độ là Shahi, Calcuttia, Bedana, Late Bedana và Longia Ấn Độ thường sử dụng tươi, hoặc có thể được sử dụng như một loại nước ép trái cây khi đã loại

bỏ vỏ và hạt

b) Tình hình trồng và tiêu thụ vải ở Việt Nam

Với điều kiện thuận lợi về khí hậu nhiệt đới, Việt Nam có rất nhiều loại trái cây đa dạng, có chất lượng cao phục vụ thị trường cả trong và ngoài nước

Năm 2008, nước ta có khoảng 775.500 ha cây ăn quả, trong đó diện tích đang thu hoạch khoảng 362.685 ha với sản lượng gần 3,9 triệu tấn/năm Dự kiến đến năm

2020, diện tích cây ăn quả cả nước sẽ tăng lên 1,1 triệu ha, kim ngạch xuất khẩu khoảng 1,2 tỷ USD (AgroViet, 2009)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 5

Bảng 1.1 Diện tích và sản lượng của một số cây ăn quả 2009 - 2012

Gần đây, Bộ NN và PTNT yêu cầu các tỉnh căn cứ vào điều kiện và thế mạnh của mình nên xác định từ 1 - 3 loại cây chủ lực để tập trung đầu tư, trong đó ưu tiên chọn những loại cây có thể cạnh tranh như măng cụt, bưởi, xoài, thanh long, sầu riêng, nhãn, chôm chôm

Một trong các loại trái cây được triển khai theo chương trình VietGAP là cây vải Huyện Lục Ngạn - Bắc Giang và huyện Thanh Hà – Hải Dương là 2 huyện nổi tiếng từ trước đến nay với cây vải, đặc biệt là vải thiều Nhờ có cây vải mà nguồn kinh tế của hai tỉnh ngày càng khởi sắc qua các năm Cây vải Lục Ngạn có nguồn gốc giống cây từ cây vải Thanh Hà Bởi giống cây này được một người dân Thanh Hà (Hải Dương) mang lên Bắc Giang trồng và từ đó mở rộng diện tích gieo

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 6

trồng nơi đây Do đó nếu xét về sản lượng thì Bắc Giang cung cấp cho thị trường lớn hơn tỉnh Hải Dương, song xét về chất lượng vải Thanh Hà vẫn ngon, ngọt hơn vải Lục Ngạn – Bắc Giang

Năm 2013, toàn huyện Thanh Hà – Hải Dương có 3.975 ha diện tích trồng vải, trong đó diện tích vải thiều là 2.965 ha, vải sớm là 1.010 ha Đây là năm thứ hai, huyện Thanh Hà triển khai thực hiện dự án “Xây dựng, phát triển mô hình sản xuất vải thiều Thanh Hà đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm theo quy trình VietGAP” trên diện tích 37 ha tại 361 hộ dân hai xã Thanh Sơn và Thanh Khê Ban chủ nhiệm Dự án đã tổ chức tập huấn kỹ thuật chăm sóc cây vải thiều, tổ chức khám sức khỏe cho người lao động trực tiếp tham gia sản xuất, tổ chức hỗ trợ phân bón, thuốc bảo vệ thực vật, tem nhãn, túi đựng cho các hộ tham gia dự án Do thời tiết cuối vụ đông liên tục có rét đậm kéo dài nên tỷ lệ vải ra hoa cao, tỷ lệ đậu quả đạt 80%, cây vải sinh trưởng, phát triển tốt, năng suất của trà vải sớm ước đạt 10 – 11 tấn/ha, năng suất vải thiều ước đạt 7 – 8 tấn/ha Tổng sản lượng vải toàn huyện ước đạt 24.000 – 25.000 tấn, trong đó sản lượng vải sớm ước đạt 10.000 – 12.000 tấn, sản lượng vải thiều ước đạt 12.000 – 13.000 tấn Trong đó, sản lượng vải thiều theo tiêu chuẩn VietGAP đạt 150 tấn (Anh Nguyên, Báo điện tử Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Hải Dương, 8/2013)

Đất đồi Lục Ngạn – một mảnh đất có tiểu vùng khí hậu đặc trưng riêng và được người dân chăm sóc, vun trồng với những quy trình kỹ thuật đầy sáng tạo nên quả vải thiều đã có bước tiến mới về chất “như ngọc được mài” Điều đó đã tạo nên thương hiệu vải thiều Lục Ngạn – một sản phẩm đặc sản có những hương vị thơm ngon riêng biệt mà không nơi nào có được Sản lượng vải thiều cung cấp ra thị trường mỗi năm từ 60.000 đến trên 100.000 tấn, giá trị thu về hàng năm đạt trung bình khoảng 500 tỷ đồng Lục Ngạn đã trở thành “Kinh đô vải thiều” của cả nước

Theo đó, đối với cây vải (sản phẩm chủ lực), UBND huyện Lục Ngạn luôn chú trọng việc chỉ đạo, hướng dẫn, khuyến cáo nông dân áp dụng khoa học kỹ thuật vào sản xuất và chế biến, hướng tới sản phẩm sạch, an toàn nhằm giữ vững thương hiệu vải thiều Lục Ngạn Nhìn chung, năng suất, chất lượng Vải thiều không ngừng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 7

được tăng lên: sản lượng vải thiều năm 2011 là 120.000 tấn, giá bán bình quân là 6.500 đồng/kg Năm 2012, tổng diện tích vải thiều của Bắc Giang khoảng 34.000

ha, sản lượng toàn tỉnh đạt khoảng 150.000 tấn, trong đó sản lượng của huyện Lục Ngạn là 83.500 tấn, giá bán bình quân là 15.000 đồng/kg Tiêu thụ nội địa đạt khoảng 90.000 tấn (60% sản lượng); xuất khẩu khoảng 60.000 tấn Thị trường xuất khẩu chính là Trung Quốc (chiếm 95% lượng xuất khẩu); xuất sang các thị trường Campuchia, Lào, Australia, các nước EU (Sở Công Thương Bắc Giang, 2013)

Năm 2013, thời tiết không thuận lợi cho việc ra hoa và kết trái, xong sản lượng vẫn đạt lớn Với tổng diện tích trên 31.000 ha, sản lượng toàn tỉnh đạt trên 130.000 tấn quả tươi (Sở Công Thương Bắc Giang, 2013)

Bảng 1.2 Tổng hợp thông tin vải thiều tỉnh Bắc Giang năm 2013

Diện tích (ha)

Sản lượng (tấn)

Vải sớm (tấn)

Vải muộn (tấn)

Giá bình quân (đồng)

Giá trị sản xuất (Đvt: 1.000đ)

(Nguồn: Sở Công Thương Bắc Giang, 2013 )

Theo báo cáo, sản lượng toàn tỉnh có 21.000 tấn vải sớm (chiếm 16%), vải muộn khoảng 110.000 tấn (chiếm 84%) Đồng thời, huyện Lục Ngạn có diện tích chiếm 54,8% tổng diện tích toàn tỉnh và sản lượng chiếm 54,9% tổng sản lượng Như vậy huyện Lục Ngạn chiếm vị trí quan trọng trong trồng và cung cấp vải Với thương hiệu “Vải thiều Lục Ngạn” đã giúp cho quả vải Lục Ngạn bao giờ cũng có giá cao hơn so với các giống vải khác

Những năm gần đây, Lục Ngạn đã không khuyến khích mở rộng thêm diện tích vải thiều mà tập trung đi vào thâm canh, nâng cao chất lượng của quả vải Một

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 8

trong những biện pháp kỹ thuật chăm sóc vải thiều được nhân dân áp dụng thành công, góp phần nâng cao giá trị cho quả vải là quy trình chăm sóc vải thiều theo tiêu chuẩn VietGAP – sản xuất vải thiều sạch, an toàn Nếu như năm 2009 vải thiều Lục Ngạn sản xuất theo tiêu chuẩn này mới chỉ có 2.500 ha thì đến nay đã tăng lên 4.000

ha ở 20 xã, thị trấn Thực hiện VietGAP vào chăm sóc vải thiều, người dân đã áp dụng triệt để các quy trình kỹ thuật từ khâu bón phân, tưới nước, phòng trừ sâu bệnh đến khâu thu hoạch đều phải bảo đảm tiêu chuẩn sạch – an toàn Cũng nhờ vậy chất lượng quả vải không ngừng được nâng lên: Quả to, hạt nhỏ, mã đỏ đẹp, gai nhẵn, vỏ mỏng, ăn có vị ngọt dịu và thơm ngon hơn trước Vải thiều Lục Ngạn đã từng bước đáp ứng được với nhu cầu của cả các thị trường “khó tính” như ở các nước Châu Âu, Mỹ, Nhật (Sở Công Thương Bắc Giang, 2013)

Về thị trường tiêu thụ vải thiều, huyện Lục Ngạn đã cử các đoàn công tác đi khảo sát, nghiên cứu, xúc tiến thương mại tại một số tỉnh, thành phố, địa phương trong nước và các cửa khẩu quốc tế Tổ chức các hội nghị khách hàng và mở 2 gian hàng giới thiệu sản phẩm vải thiều tại thị trấn Chũ và xã Quý Sơn

Hình 1.1 Địa điểm thu mua vải thiều

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 9

Tiêu thụ vải thiều tươi tại thị trường lớn như Hà Nội, Huế, Đà Nẵng, TP Hồ Chí Minh và các tỉnh phía Nam chiếm khoảng 60% sản lượng Thị trường xuất khẩu gồm Trung Quốc, Lào, Campuchia, (quả tươi và sấy khô), một số nước Châu

Âu (vải thiều chế biến) chiếm khoảng 40% sản lượng Trong đó, Trung Quốc là thị trường xuất khẩu truyền thống quan trọng, chủ yếu của vải thiều Bắc Giang, chiếm khoảng 95% tổng sản lượng xuất khẩu, tương ứng khoảng 50.000 tấn và được xuất khẩu theo cả đường chính ngạch và tiểu ngạch (chủ yếu chính ngạch) (Sở Công Thương Bắc Giang, 2013)

1.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng quả vải và tình hình xử lý phụ phẩm sau thu hoạch quả vải

1.1.2.1 Phụ phẩm sau thu hoạch quả vải

Phụ phẩm quả vải phát sinh trong cả quá trình thu hoạch và sau thu hoạch Phụ phẩm sau thu hoạch quả vải gồm cành quả, cuống quả, quả bị loại và các quả bị hỏng trong quá trình vận chuyển, tiêu thụ

Lá, cành, cuống vải: Trong quá trình thu hoạch, người dân dùng dao sắc cắt tỉa những chùm quả chín Tuy nhiên để được những chùm quả đẹp, hấp dẫn khách hàng thì cần phải cắt, tỉa và bỏ đi lá, cuống, cành thừa

Quả vải: Những chùm vải chín với mật độ quả dày có thể cọ xát nhau làm một số quả bị rụng, rơi ở quanh gốc vải hay khu vực thu gom vải Đến thời kỳ thu hoạch, quả vải chín rất nhanh, chất lượng quả vải thay đổi theo từng ngày do vậy nếu không thu hoạch kịp, cộng thêm yếu tố nhiệt độ cao của thời tiết khiến cho quả vải bị hỏng nhanh hơn và khối lượng quả vải bỏ đi ngày càng tăng Bên cạnh đó, trong quá trình vận chuyển cũng gây dập quả và phải bỏ đi

Thời vụ thu hoạch quả vải thường vào tháng 6, 7 diễn ra chỉ trong vòng gần 2 tuần

Chỉ trong vòng gần 2 tuần, hơn 30.000 ha vải được thu hoạch, sản lượng vải lên đến hàng nghìn tấn do vậy không thể tiêu thụ và bảo quản hết Vì vậy nếu không tiêu thụ kịp quả vải tươi thì người ta thường chế biến bằng cách sấy khô,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 10

sản phẩm sau đó gọi là vải khô Tuy nhiên trong khâu sấy vải khô, do phải đảo vải sấy trên lò nên tỷ lệ quả vải bị dập vỡ khá lớn (thường 50 kg vải sấy bị dập

vỡ mất 1 kg), chất lượng quả vải sấy không đồng đều và khi sấy xong, chủ lò tiến hành phân loại quả một lần nữa mới mang tiêu thụ được (Đức Thọ, Cổng thông tin huyện Lục Ngạn, 2012)…

Đồng thời vụ mùa thu hoạch vải chủ yếu vào mùa hè nên phụ phẩm quả vải

bị dồn ứ sẽ nhanh chóng thối rữa, bốc mùi ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường khu vực

Hình 1.2 Sấy vải ở Bắc Giang

Theo Công ty xuất nhập khẩu rau - quả Bắc Giang nằm trên địa bàn xã Phượng Sơn, huyện Lục Ngạn tỉnh Bắc Giang cho biết mỗi năm công ty chế biến trên 200.000 tấn vải thiều tươi để đóng hộp xuất khẩu sang thị trường các nước Châu Âu, Nhật Bản và Mỹ Mỗi ngày công ty sản xuất cần từ 15 – 20 tấn vải tươi

do vậy phế phẩm thải ra ngoài gồm vỏ, hạt chiếm từ 40 – 60%

Trong khi đó người nông dân tại huyện mới chỉ có một biện pháp xử lý duy nhất đó là sau vụ vải thì gom cành, lá rồi đốt, dùng tro để bón cho cây chuẩn bị cho

vụ vải năm sau; còn các quả thối, hỏng thì đổ ra thành đống, rải rác khắp đường,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 11

mương và ngay cả tại vườn vải (Đức Huy, Báo Người lao động điện tử) Hơn nữa, theo những người nông dân thì cây vải là cây yêu cầu lượng phân bón khá lớn, đặc biệt là phân hữu cơ từ 20 – 30kg/cây/1 đợt, trong khi để thu hoạch được quả vải là

từ 3 – 5 năm, mỗi năm có nhiều đợt bón, tùy thuộc vào thời gian sinh trưởng của cây (Trần Thế Tục, 2002) Như vậy nếu tận dụng được lượng phế phẩm sau thu hoạch quả vải chuyển thành phân hữu cơ bón trở lại cho đất và cây thì sẽ vừa tiết kiệm chi phí chăm sóc cho người dân, vừa đảm bảo môi trường cho khu vực

Hình 1.3 Phụ phẩm quả vải dồn lại thành đống và bỏ đi

1.1.2.2 Thành phần hóa học và các yếu tố tác động đến quả vải sau thu hoạch

Thành phần hóa học của quả vải

Thành phần hóa học của trái vải bao gồm các chất hữu cơ, vô cơ, được chia 2 thành phần cơ bản là nước và chất khô Trong trái vải, nước chiếm khoảng 80 – 85 % trọng lượng Nước vừa là một thành phần hóa học, vừa được coi là môi trường hòa tan, thực hiện các quá trình phân giải, tổng hợp vật chất trong quá trình sống quả Xét về thành phần chất khô chiếm từ 15 – 19%, chủ yếu gồm những chất sau: Gluxit, các axit hữu cơ, các hợp chất Nitơ, các hợp chất phenol, các vitamin, các enzym, các chất khoáng, các chất thơm, các chất

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 12

màu (Trần Thế Tục, 2002)

Theo GS.TS Phạm Xuân Sinh, trong hạt vải có tanin, độ tro, chất béo Phần

áo hạt vải thường gọi là múi vải, thành phần chủ yếu là đường, ngoài ra có vitamin

A, B, C Vitamin A và vitamin B chỉ có trong múi vải tươi (Phạm Xuân Sinh, Báo điện tử Sức khỏe & Đời sống, 2011)

Vỏ quả vải chứa các chất cyanidin diglycosid, anthoxanthin

Bảng 1.3 Thành phần dinh dưỡng chính trong trái vải

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 13

Ảnh hưởng của vi sinh vật

Quả vải tươi giàu về hydrat cacbon, rất nghèo protein (1%) và có pH 4,5 hoặc thấp hơn Do vậy, sự gây hư hỏng quả hoặc các sản phẩm về quả do vi sinh vật chỉ

giới hạn ở nấm mốc và vi khuẩn chịu axit (các vi khuẩn lactic, Acetobacter,

Gluconobactor) Quả tươi mẫn cảm với sự thối do các loại nấm mốc khác nhau từ

các chi Penicilium, Aspergillus, Alternaria, Botrytis, Rhizopus và các chi khác (Lê

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 14

cơ đã tiêu hao không được bù đắp lại như còn ở trên cây nên chúng sẽ tồn tại cho đến khi nguồn dự trữ cạn kiệt Hoạt động hô hấp thường làm biến đổi thành phần hóa sinh của quả, tiêu hao vật chất dự trữ, làm giảm đáng kể chất lượng dinh dưỡng

và cảm quan cũng như rút ngắn tuổi thọ của quả Quả vải là loại quả hô hấp đột biến, không có thời gian chín sau thu hoạch (Joubert, 1986) Akamine và Goo (1973) cho rằng trong giai đoạn phát triển của quả cường độ hô hấp giảm nhưng khi chín và thu hoạch cường độ hô hấp tăng lên rất mạnh

Hiện tượng thoát hơi nước

Là hiện tượng bất lợi cho sản phẩm là hoa quả tươi, vì khi quả héo vi sinh vật

dễ dàng tấn công hơn Đối với quả vải, hiện tượng thoát hơi nước gắn liền với sự nâu hóa bề mặt vỏ quả, làm cho quả nhanh khô, cứng hơn và lúc này mất đi độ đàn hồi vốn có, độ cứng của quả tăng

Thối hỏng

Sự lây nhiễm phát triển không ngừng, đặc biệt nấm bệnh gặp môi trường có lợi và tỷ lệ thối hỏng cũng tăng do sự tăng hô hấp tại những mô bệnh, tại đây hàm lượng etylen được sản sinh ra nhiều hơn Burchill và Maude cho rằng một số nấm bệnh tự nó cũng sản sinh ra etylen và ảnh hưởng lên mô tế bào khỏe sau đó lan ra trên cả quả

Sự thay đổi các sắc tố

Sắc tố màu sẽ bị biến mất trong quá trình bảo quản, đặc biệt là sự biến nâu trên vỏ quả vải Sử dụng lưu huỳnh và axit hay là sự kết hợp giữa chúng để duy trì màu đỏ trên vỏ quả vải, đó là kết quả nghiên cứu của Tongdee Ơ Cả hai cách xử lý này đều làm gia tăng tính thấm của tế bào và axit hóa chất sáp, nhưng lưu huỳnh cũng tạo ra hợp chất sunfit gây biến màu Do vậy xử lý lưu huỳnh có phần nào đó liên quan đến sự tẩy trắng, trong khi xử lý axit thì màu đỏ của quả vải được cải thiện Tuy vậy, hiện nay trên thế giới phương pháp sử dụng lưu huỳnh được hạn chế nhằm đảm bảo vệ sinh an toàn thực thẩm

Biến đổi hóa học

Trong quá trình bảo quản, hầu hết các thành phần hóa học của quả đều bị

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 15

biến đổi do tham gia hô hấp hoặc do hoạt động của hệ enzym

Các loại đường dần dần bị thủy phân thành đường đơn giản Sau đó, các đường đơn này tham gia vào quá trình hô hấp để tạo năng lượng duy trì sự sống của quả Ngoài ra, các chất hữu cơ khác như axit, vitamin đều giảm

1.1.2.3 Biện pháp xử lý phụ phẩm quả vải sau thu hoạch

Hiện nay, một trong các biện pháp được người nông dân sử dụng rộng rãi để

xử lý phụ phẩm nông nghiệp nói chung và xử lý phụ phẩm sau thu hoạch quả vải nói riêng là đốt

Phụ phẩm được thu gom, phơi khô và đốt hoặc làm nguyên liệu để đun nấu

Ưu điểm của biện pháp này là nhanh, đơn giản, dễ làm, chi phí thấp, không mất nhiều công sức Tuy nhiên nhược điểm của biện pháp này là ảnh hưởng xấu tới môi trường bởi khói và bụi phát sinh khi đốt Đồng thời sự gia tăng nhiệt trong quá trình đốt cũng ảnh hưởng tới hệ sinh vật đất Vì thế biện pháp này ít có ý nghĩa trong cải tạo đất và bảo vệ môi trường sinh thái

Bên cạnh một số hộ gia đình thu gom phụ phẩm để đốt thì vẫn có các hộ gia đình đổ, vứt bừa bãi ra ngoài lề đường, bờ ruộng, Các cành, lá và vỏ quả vải chứa thành phần chủ yếu là xenluloza thì thời gian tự hoai mục rất lâu Còn với quả vải chứa nhiều đường, khi để tự phân hủy mà không che đậy thì có rất nhiều ruồi muỗi, gây mùi khó chịu Vì vậy việc làm không có ý thức của người dân đã gây mất mỹ quan và ảnh hưởng xấu tới môi trường sống của khu vực

Đây là 2 biện pháp được người dân áp dụng phổ biến để xử lý phụ phẩm sau thu hoạch quả vải Tuy nhiên hai biện pháp không nên được áp dụng bởi chúng ảnh hưởng xấu đến môi trường, mỹ quan khu vực

Hiện nay trên thế giới chưa có biện pháp khoa học cụ thể nào được đưa ra để

xử lý phụ phẩm sau thu hoạch quả vải

1.2 Cơ sở khoa học của quá trình phân giải phụ phẩm sau thu hoạch

1.2.1 Phân giải xenluloza

Khái quát về xenluloza

Hàng năm có khoảng 30 tỷ tấn chất hữu cơ được cây xanh tổng hợp trên Trái Đất, 30% trong số đó là xenluloza Xenluloza 90% trong bông, 40% trong gỗ

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 16

Xenluloza là thành phần chính trong tế bào thực vật, kết hợp với Hemixenluloza và lignin tạo nên độ cứng của thành tế bào Xenluloza là polysaccarit mạch thẳng gồm 1.400 đến 12.000 gốc β – D glucopyranoza liên kết với nhau bằng các liên kết β- 1,4 glucozit tạo thành dạng chuỗi Trong phân tử xenluloza các gốc β – D glucoza thường có cấu hình dạng ghế và quay một góc 1800 với nhau, do các nhóm Hydroxyl (-OH) đều nằm trên đường thẳng xích đạo

Nhờ phân tích Rơnghen, người ta biết rằng xenluloza có cấu tạo sợi Các sợi liên kết vơi nhau bằng các liên kết hydro và các lien kết Vanđervan tạo thành các micro fibrin có cấu trúc không đồng nhất và tạo nên cấu trúc mixen của xenluloza

Xenlulaza

Enzyme xenlulaza do hoạt động sống của vi sinh vật tiết ra để phân hủy chuyển hóa xenluloza Đây là hệ phức hệ các enzyme thủy phân xenluloza tạo ra các đường đủ nhỏ để đi qua vách tế bào vi sinh vật Ơ một số vi sinh vật, enzyme oxy hóa khử và enzyme phân giải protein cũng tham gia vào quá trình trên Phức hệ xenlulaza bào gồm 3 enzyme chủ yếu: Endoglucanaza hay CMC-aza, β-glucozidaza hay xenlobiaza

Người ta cho rằng tính đa hình của xenlulaza là nhằm phù hớp với các cấu trúc phức tạp của mạch phân tử xenluloza, gồm nhiều vùng có đặc tính thủy phân khác nhau Tùy thuộc vào loài vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy, tỷ lệ các enzyme thành phần trong phức hệ xenlulaza và hiệu lực phân giải xenluloza của xenlulaza là khác nhau Nhưng để phân giải hoàn toàn xenluloza trong tự nhiện cần tác dụng hiệp đồng của 3 thành phần trong phức hệ xenlulaza

Vi sinh vật phân hủy xenluloza

Trong tự nhiên khu hệ VSV phân giải xenluloza rất phong phú và đa dạng bao gồm các vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm và các nguyên sinh động vật

Nấm: Có nhiều loại phân giải xenluloza mạnh, trong đó nấm sợi là nhóm có

khả năng tiết ra môi trường một lượng lớn enzyme với đầy đủ các thành phần nên

có khả năng phân giải mạnh xenluloza Nấm có hoạt tính phân giải xenluloza đáng

chú ý là Trichoderma bao gồm hầu hết các loại sống hoại sinh trong đất

Vi khuẩn: Các vi khuẩn hiếu khí có khả năng phân giải mạnh xenluloza khá

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 17

mạnh như Bacillus, Cellulomonas, Vibrio, Archombacter Niêm vi khuẩn cũng có khả năng này, đáng chú ý là: Cytophaga, Sporcytophaga, Sarangium

Xạ khuẩn: Bên cạnh nấm và vi khuẩn, xạ khuẩn cũng có khả năng phân giải

xenluloza khá cao, đáng chú ý là Streptomyces, Actinomyces, Nocardia,

Micromonospora Người ta thường sử dụng xạ khuẩn phân hủy rác sinh hoạt Những xạ khuẩn này thường thuộc nhóm ưa nhiệt, sinh trưởng, phát triển tốt ở nhiệt

độ 45-500C, rất thích hợp với quá trình ủ rác thải

1.2.2 Phân giải tinh bột

Khái quát về tinh bột: Tinh bột là chất dự trữ chủ yếu của thực vật, trong

tế bào thực vật tinh bột tồn tại dưới dạng các hạt tinh bột Hạt tinh bột có kích thước hình dạng thay đổi tùy loại thực vật Thường kích thước biến đổi 0,02 -0,12mm Lượng tinh bột ở hạt ngô và lúa mì khoảng 60-75%, trong hạt lúa 75-80% Tinh bột cũng có nhiều ở các loại củ như: khoai tây, sắn, củ mài Một lượng tinh bột đáng kể

cũng thấy ở các loại hoa quả như chuối, và nhiều loại rau xanh

Tinh bột có vai trò dinh dưỡng lớn trong quá trình tiêu hóa, chúng bị phân hủy thành glucoza là chất tạo nên nguồn calo chính của thực phẩm cho con người Tinh bột gồm 2 thành phần khác nhau: amilo và amilopectin

Amilo thường chiếm khoảng 15-27% trọng lượng tinh bột của thực vật Amilo là những chuỗi không phân nhánh được cấu tạo bằng các gốc D.glucoza liên kết với nhau bằng dây nối α-1,4 glucozit tạo nên chuỗi dài khoảng 200 – 1000 gốc glucoza và phân tử amilo có đầu khử

Trong phân tử amilopectin các gốc glucoza được gắn với nhau không chỉ bằng các liên kết α-1,4 glucozit mà còn bằng các α-1,6 glucozit Vì vậy, các phân tử amilopectin có cấu trúc nhánh, có một đầu khử

Amylaza và cơ chế phân hủy tinh bột

Quá trình phân giải tinh bột có sự tham gia của nhiều loại enzyme khác nhau

và mỗi enzym có một phương thức tác dụng đặc hiệu riêng Người ta biết đến 4 loại amylaza sau: α –amylaza, β-amylaza, Amila 1-6 glucozidaza, Glucoamylaza

Vi sinh vật phân giải tinh bột

Nhiều nhóm VSV có khả năng thủy phân tinh bột như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 18

Trong số các loài VSV thì nấm mốc là nhóm có khả năng phân giải tinh bột mạnh nhất Các giống nấm mốc điển hình có khả năng phân giải tinh bột mạnh đó

là: Aspergillus, Rhizopus Xạ khuẩn cũng là một nhóm VSV có khả năng sinh amylaza như S.limosus, S.aurefaciens, S.praecox….Một số chủng nấm men cũng có khả năng tổng hợp amylaza như Candida antaritica, Saccharomyces cerevisiae,… Trong các vi khuẩn thì gram dương đặc biệt là Bacilus thường tạo ra nhiều α

–amylaza hơn các vi khuẩn gram âm

1.2.3 Phân giải protein

Khái quát về protein

Protein là thành phần không thể thiếu được của tất cả các cơ thể sinh vật nhưng lại có tính đặc thù cao cho từng loài, từng cá thể của từng loài… Protein rất đa dạng về cấu trúc và chức năng, là nền tảng về cấu trúc và chức năng cho

cơ thể sống

Protein là các polime phân tử lớn chủ yếu bao gồm các L-axit amin kết hợp với nhau qua lien kết pettit Liên kết peptit (-CO-NH) được tạo thành do phản ứng kết hợp giữa nhóm cacboxil của một axit amin này với nhóm amin của một axit amin khác và loại đi một phân tử nước Theo cách kết hợp này, các liên kết pettit nằm trên một mạch thẳng không phân nhánh, có đầu N (có đầu amin tự do) và đầu

C (có nhóm Cacboxil tự do) Trình tự sắp xếp các gốc axit amin trong mạch polipeptil tạo nên cấu trúc bậc I của protein Tiếp theo là cấu trúc bậc II, III, IV với

sự phức tạp tăng dần trong tương tác không gian

Proteaza và cơ chế phân hủy protein

Enzym prteaza là nhóm enzyme xúc tác qua trình phân hủy theo cơ chế sau: Protein Pepton Polypettit Axit amin

Quá trình phân giải protein là một quá trình thủy phân tương đối phức tạp và

có sự tham gia của nhiều enzyme khác nhau Proteaza gồm 2 loại chính: endoproteaza, exoproteaza

Vi sinh vật phân hủy protein

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19

Nhiều VSV có khả năng tổng hợp mạnh proteaza như Bacillus subtilis,

Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, Aspergillus wenti, Mucor delemar và một số

loài thuộc chi Penicillium

1.3 Nghiên cứu về ứng dụng vi sinh vật trong xử lý phụ phẩm nông nghiệp sau thu hoạch

1.3.1 Nghiên cứu trên thế giới

Từ thế kỷ XIX, các nhà khoa học đã nghiên cứu và nhận thấy một số vi sinh vật kỵ khí có khả năng phân giải xenluloza Những năm đầu của thế kỷ XX người ta phân lập được các loài vi khuẩn hiếu khí cũng có khả năng này Trong các vi khuẩn hiếu khí phân giải xenluloza thì niêm vi khuẩn là quan trọng nhất

Năm 1946, Hungate đã phân lập được loài xạ khuẩn có tên là Micromonospora

propionici có khả năng thủy phân xenluloza cao Sau đó vào năm 1966, Hungate Presvot đã tiếp tục phân lập được 9 chủng vi khuẩn yếm khí có hoạt tính xenlulaza

thuộc chi: Bacteroides, Butyrivibrio, Clostridium, Ruminococcus và Cillobacterium

Nối tiếp các nghiên cứu của Hungate và Shuval (1981); năm 2007, Hesham khi đi nghiên cứu về khả năng xử lý rơm rạ của 3 chủng xạ khuẩn thuộc

chi: Micromonospora, Streptomyces và Nocardiodes đã kết luận rằng: việc bổ

sung vào xạ khuẩn đã giúp đẩy nhanh quá trình phân hủy rơm rạ và làm giảm thể tích của đống ủ; sau 3 tháng ở đống ủ có bổ sung xạ khuẩn thể tích đống ủ giảm xuống 38,6 – 64% so với ban đầu trong khi đó đống ủ đối chứng thể tích đống ủ chỉ giảm 13,6% so với trước khi ủ; việc bổ sung xạ khuẩn vào đống ủ còn làm tăng chất hữu cơ (organic matter) lên 34,9% và hàm lượng nitơ lên 0,59mg/g, trong khi đó ở đống ủ đối chứng không bổ sung xạ khuẩn chất hữu cơ là 20% và hàm lượng nitơ chỉ đạt 0,2 mg/g

Stutzenberger đã nuôi cấy Thermonospara curyata trên môi trường chứa

xenluloza và cao nấm men có bổ sung 0,1% bông nghiền nhỏ thì thấy chúng có khả năng tích lũy enzym phân hủy xenluloza

Jeris và Regan (1973) thấy trong đống ủ có các loài vi khuẩn phân giải

xenluloza sau: Achromobacter, Clostridium, Cellulomonas, Cytophaga, Cellvibrio,

Bacillus, Pseudomonas, Sorangium, Sporocytophara, Và các loại nấm phân giải

xenluloza như: Alternaria, Aspergillus, Chactomium, Fomes, Fusarium,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20

Myrothecium, Polyponus, Rhizoctonia, Rhozopus,

Tại New Delhi - Ấn Độ, từ năm 1985 đến 1987 , Gaur và Bhardwaj đã phân lập và tuyển chọn được rất nhiều chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy xenluloza

và lignin Sau đó Gaur đã sử dụng các chủng nấm Trichurus spiralis, Trichoderma

viride, Paecilomyces fusisporus, Aspergillsus sp để đưa các đống ủ (rơm, lá khô) và kết quả cho thấy: hàm lượng C hữu cơ giảm từ 48% xuống 25% trong vòng một tháng đầu tiên của quá trình ủ; và chỉ trong 8 đến 10 tuần rơm rạ đã phân hủy hoàn toàn thành một loại phân hữu cơ có chất lượng tốt Trong phân này chứa khoảng 1,7% N, và tỷ lệ C/N là 12:3

Ở Trung Quốc cũng có rất nhiều nghiên cứu về việc phân lập vi sinh vật và ứng dụng trong xử lý phế thải hữu cơ Năm 2005 Wen-Jing Lu và đtg đã phân lập được 5 chủng vi khuẩn ưa ẩm xenluloza cao từ phế thải rau quả vi sinh và thân lá

hoa thuộc giống Bacillus, Halobacillus, Aeromicrobium, Brevibacterium Khi ứng

dụng các chủng vi sinh vật này để ủ phụ phẩm rau quả và thân lá hoa cho thấy: bổ sung 1% các chủng vi sinh vật vào đống ủ đã làm tăng quá trình phân hủy sinh học các nguyên liệu lên 23,64% so với đống ủ không bổ sung thêm vi sinh vật, do đó rút ngắn thời gian ủ và tăng chất lượng của phân ủ

Từ những năm 80 trở lại đây, trên thế giới mà nhất là ở những nước sản xuất

cà phê xuất khẩu, việc nghiên cứu các biện pháp sinh học để xử lý phế thải cà phê được nhiều người quan tâm Theo số liệu của C Hajipakkos cho thấy nước thải từ các nhà máy chế biến cà phê có hàm lượng BOD và COD rất cao (tương ứng 3.000kg/ngày và 4.000 mg/lít, đôi khi có thể cao hơn 9.000 mg/lít) Chất rắn lơ lửng

là 1.500 mg/lít, gấp 3 lần hàm lượng cho phép, ngoài ra còn có các chất dầu, mỡ với nồng độ cao gấp 2 lần bình thường (Nguồn KHCN04- 04 2000) Các nhà khoa học

đã dùng một số chủng giống vi sinh vật yếm khí có khả năng phân giải vỏ cà phê

(các chất xenluloza, lignin ) như nấm: Chladomyces, Penicilium, Trichderma,

Fusarium oxysporium ; vi khuẩn: Sporocytophaga methanogenes; Rudbeckia hirta

L để xử lý đống ủ vỏ cà phê Kết quả rất khả quan, sau 2 - 3 tháng ủ tỷ lệ xenluloza trong vỏ cà phê giảm 60 - 80% so với đống ủ đối chứng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21

Trên thế giới hiện nay có trên 60 quốc gia có ngành công nghiệp mía đường,

dự kiến niên vụ 2007- 2008 sản lượng đường thế giới đạt khoảng 169 triệu tấn Bên cạnh đó, lượng chất thải của nhà máy mía đường cũng tăng theo Hiện nay, những nước có nền công nghiệp mía đường lớn như CuBa, Braxin, Ấn Độ,…thì bã mía được thải ra từ nhà máy vẫn chủ yếu được sử dụng vào hai lĩnh vực chính là: làm nhiên liệu (bằng cách đốt trực tiếp hoặc ép viên nhiên liệu) và sử dụng bã mía, các chất thải cuối khác làm phân hữu cơ vi sinh rất được coi trọng Về công nghệ sản xuất nói chung bã mía được nghiền nhỏ kết hợp với các nguồn hữu cơ khác trộn đều

ủ để vi sinh vật phân giải sau đó phối trộn thêm NPK và cấy men vi lượng sẽ cho ra được phân vi sinh từ bã mía Trong công đoạn sản xuất trên kích thước bã mía sau khi nghiền co ảnh hưởng rất lớn đến thời gian sản xuất, độ đồng đều cũng như chất lượng của phân vi sinh, do đó việc tính toán thiết kế thiết bị nghiền bã mía là rất quan trọng Nhìn chung, với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật thì các nước trên thế giới đã phân lập tuyển chọn được rất nhiều giống vi sinh vật có khả năng phân hủy phế thải hữu cơ Các kết quả nghiên cứu đều cho thấy rằng, việc bổ sung vi sinh vật vào đống ủ phế thải hữu cơ đã rút ngắn thời gian ủ, làm giảm thể tích và tăng hàm lượng dinh dưỡng của đống ủ, do đó góp phần bảo vệ môi trường

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22

1.3.2 Nghiên cứu ở Việt Nam

Việt Nam là một nước nông nghiệp với khoảng 74% dân số làm nghề nông

do vậy phế thải nông nghiệp rất lớn và thích hợp cho việc làm phân ủ Có nhiều phương pháp làm phân ủ có thể áp dụng, từ phương pháp ủ đống tĩnh đơn giản nhất đến hệ thống lên men trong các thiết bị phức tạp Việt Nam có khí hậu nóng ẩm nên các quá trình phân hủy phế thải xảy ra rất mạnh mẽ vì thế việc xử lý phế thải làm phân ủ là biện pháp rất thích hợp Tuy nhiên việc xử lý phế thải ở Việt Nam gặp một số khó khăn: vốn đầu tư cho xử lý phế thải còn thiếu thốn; đòi hỏi phải có các biện pháp kỹ thuật đơn giản, dễ vận hành, dễ bảo quản và sửa chữa; ý thức người dân chưa cao

Hiện nay có nhiều nghiên cứu và ứng dụng thành công vi sinh vật trong việc

xử lý rác thải, phế thải hữu cơ Trong đó, các đề tài cấp Nhà nước KHCN-02-04, cấp Bộ B99–32-46, B2001-32–09 và các nghiên cứu khác về xử lý phế thải hữu cơ thành phân bón hữu cơ sinh học đã khẳng định vi sinh vật bổ sung vào vào các đống

ủ phế thải hữu cơ góp phần rút ngắn thời gian ủ và nâng cao chất lượng phân ủ Nguyễn Lân Dũng (2006) đã phân lập được hàng trăm chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza, hemixenluloza, lignin Xây dựng được quy trình sản xuất chế phẩm VSV phân giải chất hữu cơ đạt huy chương vàng hội chợ triễn lãm kinh tế kỹ thuật toàn quốc năm 1987 Kết quả thử nghiệm cho thấy chế phẩm đã rút ngắn thời gian ủ xuống còn 45 – 60 ngày thay vì 6 tháng đến tận 1 năm ủ trong điều kiện tự nhiên

Lê Văn Nhương (2001) đã phân lập tuyển chọn được 11 chủng nấm sợi, 7 chủng vi khuẩn, 6 chủng xạ khuẩn có hoạt tính xenlulaza cao Đã xác định khi các loại vi sinh vật này được phối trộn với nhau theo một tỷ lệ thích hợp sẽ cho hiệu suất phân giải cao nhất, đã tạo ra được 3 bộ phối trộn các chủng vi sinh vật thích ứng với sự phân giải lá mía, rác nông thôn và vỏ cà phê Khi xử lý rác nông thôn bằng EMUNI, đảm bảo độ ẩm 50-60%, 7 ngày đảo trộn một lần thì sẽ cho hiệu quả

xử lý nhanh nhất

Năm 2001, Nguyễn Xuân Thành cùng đtg đã nghiên cứu xử lý rác thải hữu

cơ và phế thải nông công nghiệp bằng vi sinh vật bón cho cây trồng Kết quả cho

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23

thấy: xử lý phế thải bằng chế phẩm VSV hạn chế mùi hôi; rút ngắn thời gian ủ xuống còn 45-60 ngày; phân hữu cơ VSV chế biến từ rác thải và phế thải hữu cơ đạt tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 134B – 1996; phân bón sản xuất ra được thử nghiệm trên cây đậu tương đạt kết quả tăng năng suất từ 9 – 15%; đề tài có nhiều ý nghĩa kinh tế, văn hóa xã hội và môi trường

Việc dùng rơm rạ để sản xuất phân hữu cơ không những tận dụng được tối đa

và hiệu quả nguồn phế phẩm nông nghiệp, mà điều này còn đồng nghĩa với việc đem lại hiệu quả về kinh tế Theo tính toán của các hộ làm phân hữu cơ từ rơm rạ,

để sản xuất 1 tấn phân hữu cơ từ rơm rạ thì chỉ mất khoảng 600.000 đến 650.000 đồng, trong khi các loại phân hữu cơ vi sinh hiện bán trên thị trường có giá từ 2 đến 3,5 triệu đồng/tấn

Nguyễn Xuân Thành và đtg nghiên cứu thành công đề tài khoa học cấp Bộ B2004 – 32 – 66: “ Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh xử lý tàn sư thực vật trên đồng ruộng thành phân hữu cơ tại chỗ bón cho cây trồng” Đề tài đã phân lập được 8 chủng VSV để làm giống sản suất chế phẩm VSV Đã xây dựng được quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật, chế phẩm vi sinh đạt tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 134B – 1996) Đã xây dựng được quy trình xử lý tàn dư thực vật bằng chế phẩm VSV tại nông hộ với thời gian từ 30 – 60 ngày ủ phụ thuộc vào từng nhóm cây trồng khác nhau, phế thải sau ủ có hàm lượng mùn, hàm lượng dinh dưỡng tăng có thể làm phân bón hữu cơ tại chỗ cho các loại cây trồng Tính trung bình trong một vụ, lượng tàn dư thực vật để lại trên đồng ruộng là 28,17 tấn/ha, nếu đem toàn bộ đi xử lý bằng chế phẩm vi sinh vật, thì sẽ cho ra được 8,1 tấn phân hữu cơ Lãi suất mang lại cho nông hộ là 718.000 đồng/ha

Phan Bá Học (2007) trong nghiên cứu về “ Ứng dụng chế phẩm vi sinh vật

xử lý tàn dư thực vật trên đồng ruộng thành phân hữu cơ tại chỗ bón cho cây trồng trên đất phù sa sông Hồng” đã có kết luận: cứ 1 tấn rơm rạ ủ thì cho ra 0,2 – 0,25 tấn phân hữu cơ; 1 tấn thân và lá ngô sau khi ủ cho ra 0,3 – 0,33 tấn phân hữu cơ; 1 tấn thân và lá khoai tây sau khi ủ cho ra 0,2 tấn phân hữu cơ Phân hữu cơ chế biến từ tàn dư thực vật khi bón cho cây rau cho các kết quả sau: Đối với cây cải bắp: Năng suất khi bón phân khoáng kết hợp 18 tấn phân chuồng/ha tăng thêm 3,9 tấn/ha, khi bón phân khoáng kết hợp với 18 tấn phân hữu cơ tái

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24

chế/ha tăng thêm 6,6 tấn/ha so với đối chứng chỉ bón phân khoáng Hiệu quả kinh tế khi bón phân hữu cơ tái chế tăng thêm 3,12 triệu đồng/ha, khi bón phân chuồng tăng thêm 0,96 triệu đồng/ha so với đối chứng Đối với súp lơ, năng suất và hiệu quả kinh tế khi bón phân hữu cơ tái chế kết hợp với phân khoáng

so với đối chứng tăng thêm 4,9 tấn/ha, 5,55 triệu đồng/ha

Lý Kim Bảng và đtg ở viện Khoa học Công Nghệ Việt Nam đã nghiên cứu thành công chế phẩm VIXURA và công nghệ xử lý rơm rạ đem lại hiệu quả kinh tế,

xã hội rất cao Chế phẩm VIXURA chứa 12 – 15 chủng vi sinh vật được phân lập tại Việt Nam, có khả năng sinh ra các enzym khác nhau để phân hủy chất hữu cơ trong rác thải và rơm rạ, đồng thời tăng khả năng chống chịu sâu bệnh của cây trồng Tàn dư cây lúa sau thu hoạch được gom thành từng đống; rơm rạ được xếp thành từng lớp có rắc xen kẽ phân chuồng, phân NPK và chế phẩm VIXURA Chiều cao mỗi đống rạ từ 1,5 – 2m, phủ kín bằng nilon, có một lỗ nhỏ để tưới nước; đống rạ ủ được tưới ẩm thường xuyên Sau 5 – 7 ngày, nhiệt độ đống ủ tăng lên 70 – 800, đống ủ xẹp xuống, rạ mềm đi Sau 25 – 30 ngày, nhiệt độ đống ủ giảm dần, rơm rạ trong đống ủ mềm hết, chuyển sang màu đen và trở thành một loại phân bón hữu cơ rất tốt cho đồng ruộng

Năm 2011, Đinh Hồng Duyên đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu quá trình sản xuất chế phẩm vi sinh dùng trong sản xuất phân bón hữu cơ tại đồng ruộng” đã phân lập và tuyển chọn được 3 chủng VSV: VP-14, XX-7 và NT-18 có sức sống cao, khả năng cạnh tranh lớn và khả năng thích ứng pH rộng để làm giống sản xuất chế phẩm VSV phân hủy phế thải sau thu hoạch Cụ thể: Chế phẩm VSV đã rút ngắn thời gian ủ phụ phẩm rơm rạ từ 3 - 4 tháng xuống còn 40 ngày, thời gian ủ phụ phẩm hành tỏi từ 5 - 6 tháng xuống còn 50 ngày, thời gian ủ phụ phẩm rau quả từ 2

- 3 tháng xuống còn 30 ngày Hàm lượng photpho, kali trong các đống ủ thí nghiệm

có bổ sung chế phẩm vi sinh vật đều cao hơn trong đống ủ đối chứng và cao hơn trước khi ủ

Ở Việt Nam có trên 350.000ha cà phê và sản lượng cà phê trung bình là 3.000 tấn nhân khô/năm với lượng vỏ cà phê khô khoảng 200.000 tấn/năm, mà thành phần của nó chủ yếu là ligno- celluloza, một hợp chất rất khó phân giải trong

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25

điều kiện tự nhiên Những năm qua tuy đã dùng vỏ cà phê để làm giá thể nuôi trồng nấm ăn, nhưng phần rất lớn vẫn thải ra môi trường gây ô nhiễm nặng Hiện nay các nhà khoa học đang thử nghiệm xử lý phế thải này bằng công nghệ vi sinh vật và tái chế thành phân hữu cơ bón cho cây trồng

Để sản xuất đường, hàng năm Việt Nam phải trồng từ 10 đến 12 triệu tấn mía cây, khi biến số lượng mía này để làm đường sinh ra một lượng phế thải khổng lồ: 2,5 triệu tấn bã mía, 250.000 tấn bã bùn (sau khi đã lấy nước đường) và 250.000 tấn mật rỉ Trước đây 80% lượng bã mía này được dùng để đốt lò hơi trong các nhà máy sản xuất đường, sinh ra 50.000 tấn tro và 20% còn lại là 500.000 tấn bã được dùng làm ván ép, còn mật rỉ dùng để sản xuất cồn, mỳ chính hoặc dùng cho các công nghệ vi sinh khác như chế biến thành thức ăn chăn nuôi Riêng tro và đặc biệt là bã bùn không sử dụng phải đổ ra các bãi đất trống gây ô nhiễm nghiêm trọng

Đứng trước tình hình đó, đã có thêm nhiều giải pháp được đặt ra để sử dụng triệt để nguồn chất thải này đơn cử như làm thức ăn chăn nuôi, với giải pháp này chỉ

sử dụng với những loại bã mía sạch, chất lượng tốt mặt khác vẫn chưa giải 14 quyết được thành phần bã bùn (nguyên nhân chính gây hôi thối khi đổ ra ngoài môi trường) Một giải pháp được coi khả quan nhất xét cả về mặt kinh tế đó là làm phân

vi sinh Sở dĩ như vậy vì giải pháp này đã quay lại cải tạo đất trồng mía, đơn cử diện tích canh tác từ 250.000 đến 300.000 ha chủ yếu là đất bạc màu và vùng nhiễm phèn nặng (không trồng được các loại cây khác) Vì thế, để trồng được 250.000 ha mía, ngoài phân hóa học (đạm - lân - kali) tối thiểu phải bón 4 ÷ 5 tấn phân chuồng cho 1 ha tức là phải có 1 triệu tấn phân chuồng bón cho 250.000

ha Số lượng phân này sẽ được bù đắp bằng lượng phân vi sinh được sản xuất từ

bã mía Nắm được vấn đề này đã có nhiều đề tài nghiên cứu công nghệ sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh (phân bón Huđavil, Fitohoocmon) từ nguồn chất thải nhà máy mía đường Hai công nghệ này đã được áp dụng thử nghiệm ở bảy nhà máy đường, ngoài mía đã được bón thử nghiệm cho lúa, chè, hồ tiêu ở một số địa phương đạt kết quả tốt: Cho phép thâm canh tăng năng suất lúa lên 25% - 30% ở Tam Điệp (Ninh Bình), tăng năng suất chè lên 70% ở Văn Chấn, Nghĩa

Lộ (Yên Bái), tăng năng suất hồ tiêu gần 100% ở Tân Lâm (Quảng Trị); một số

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26

loại cây công nghiệp trồng ở Tuyên Quang, Hà Nam, Thanh Hóa, Nghệ An năng suất tăng gấp ba lần; mía trồng ở Thạch Thành, Nông Cống (Thanh Hóa), Quảng Hà (Cao Bằng) luôn xanh tốt, chịu được hạn, giữ được đường lâu, ít sâu bệnh nên được người dân ưa dùng loại phân bón này Tuy nhiên với công nghệ này nguồn hữu cơ dùng vẫn chủ yếu là bã bùn, tro lò sau khi đốt bã mía, lượng

bã mía còn chiếm tỷ lệ nhỏ do thời gian vi sinh vật phân huỷ chất xơ lâu, để rút ngắn thời gian này đòi hỏi bã mía phải nghiền nhỏ và mịn

Tóm lại nhờ có những sự thay đổi trong nhận thức về môi trường và những kết quả khá quan trọng nghiên cứu mà việc xây dựng các cơ sở xử lý, tái chế phế thải ngày càng tăng lên Các nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật trong xử lý phế thải và tải chế phân hữu cơ đã bước đầu góp phần làm giảm thiểu ô nhiễm đồng thời

mở ra hướng đi mới trong việc khắc phục hậu quả của thời đại công nghiệp, dần thay đổi phương thức sản xuất nông nghiệp hiện nay để hướng tới nền nông nghiệp bền vững – nền nông nghiệp hữu cơ Tuy nhiên chế phẩm vi sinh vật hiện nay vẫn chưa rút ngắn được thời gian ủ xuống như mong muốn của con người Vì vậy công tác phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng xử lý các chất hữu cơ vẫn

là hướng đi mới

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Vi sinh vật (Vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm) phân lập từ phụ phẩm quả vải

2.2 Phạm vi nghiên cứu

Nguồn phụ phẩm quả vải từ huyện Lục Ngạn, Bắc Giang, thời gian từ tháng 6-10

2.3 Địa điểm nghiên cứu

Bộ môn Vi Sinh Vật – Khoa Môi Trường, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam

2.4 Nội dung nghiên cứu

2.4.1 Phân lập vi sinh vật từ các mẫu nghiên cứu

2.4.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy phụ phẩm quả vải

2.4.2.1 Định tên vi sinh vật

2.4.2.2 Xác định thời gian mọc, hình thái và kích thước

2.4.2.3 Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật đã lựa chọn

- Ảnh hưởng của pH ban đầu và nhiệt độ

- Ảnh hưởng của nguồn cơ chất (C,N)

2.4.4 Xử lý phụ phẩm quả vải bằng chế phẩm vi sinh vật

2.4.5.1 Thử nghiệm chậu vại

2.4.5.2 Thử nghiệm trên đống ủ phụ phẩm quả vải

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp lấy mẫu

Lấy mẫu đất chứa tàn dư thực vật và phụ phẩm hoai mục theo TCVN

7538-2:2010 Mẫu đất hữu cỡ: 150 mẫu Mẫu phụ phẩm quả vải hoai mục 150 mẫu

2.5.2 Phân lập vi sinh vật từ các mẫu phế thải

Pha loãng mẫu đến nồng độ 10-3 theo TCVN 6168:2002

Tại mỗi nồng độ dùng pipet hút dung dịch được pha loãng cấy trên các môi trường thạch bằng đã chuẩn bị sẵn, đem nuôi trong tủ nuôi ở 27 – 28oC từ 2 – 3 ngày Khi các chủng VSV mọc rõ ràng đem cấy truyền và làm thuần khiết Sau khi được làm thuần khiết, đem các chủng giống đó cấy vào các ống nghiệm chứa môi

trường thạch nghiêng để giữ giống

2.5.3 Đánh giá đặc tính sinh học của vi sinh vật

a) Xác định thời gian nuôi cấy của các chủng giống vi sinh vật

Các chủng VSV được nuôi trên môi trường thạch bằng chuyên tính bán rắn trong tủ nuôi 28 – 300C Theo dõi khả năng mọc của các chủng VSV tại các mốc thời gian khác nhau: 16h, 24h, 48, 60h, 72h và > 72h Xác định xem chủng đó mọc

nhanh (trước 72h) hay chậm (sau 72h)

b) Xác định hình thái, kích thước khuẩn lạc và hình thái vi sinh vật

Hình thái và kích thước khuẩn lạc

Các chủng VSV được nuôi trên môi trường thạch bằng chuyên tính bán rắn trong tủ nuôi 28 – 300C trong 3 ngày Xác định hình thái và kích thước khuẩn lạc bằng phương pháp quan sát và đo trực tiếp bằng thước đo

Quan sát hình thái vi sinh vật

- Đối với vi khuẩn: Tiến hành phương pháp nhuộm Gram để xác định vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hay Gram dương, quan sát bằng kính hiển vi

để biết hình thái của vi khuẩn

- Đối với xạ khuẩn và nấm: Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gauze

1, nấm được nuôi cấy trên môi trường thạch, khoai tây (PDA) có găm lamen nghiêng 450 trên bề mặt môi trường Sau 7 – 9 ngày nuôi ở nhiệt độ phòng lấy ra

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận v ăn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29

quan sát hình dạng chuỗi sinh bào tử trên lamen dưới kính hiển vi quang học

Chuỗi sinh bào tử có các dạng thẳng hay lượn sóng ký hiệu là RF (Rectusflexibilis), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Ratinaculiapert) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spira)

So sánh với khóa phẩn loại Klich (2004) để sơ bộ định tên chủng nấm và

khóa phân loại Bergey (1989) để sơ bộ định tên các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn

2.5.4 Phương pháp xác định sinh khối

Cân giấy lọc đã được sấy khô đến khối lượng không đổi (ở 1050C/2h) Lọc dịch nuôi cấy qua giấy lọc, đem sấy khô giấy lọc đến trọng lượng không đổi Cân lại giấy lọc Trọng lượng khô của tế bào được xác định bằng công thức:

Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào

Xác định cường độ phân giải CMC, xenluloza, tinh bột, protein của các

chủng VSV theo phương pháp khuếch tán phóng xạ trên đĩa thạch, (Wiliam, 1983)

Xác định hoạt độ xenluloza bằng phương pháp DNS

Phương pháp DNS – phương pháp định lượng, (Miller, 1959)

Ctn: Số đọc từ đường chuẩn glucose của ống thí nghiệm, µmol/l

Cdc: Số đọc từ đường chuẩn glucose của ống đối chứng, µmol/l

D: Độ pha loãng mẫu, V: Thể tích mẫu của phản ứng (0,15ml)

T: Thời gian phản ứng (30 phút)

Dựa trên khả năng hydro hóa cơ chất CMC của xenluloza để biến đổi thành