nghiên cứu đông lạnh trứng lợn non và nuôi thành thục trứng sau đông lạnh

Kết quả tác động của nồng độ chất bảo quản trong môi trường đông lạnh lên sự sống và phát triển của trứng lợn non ở điều kiện nhiệt độ phòng .... Kết quả tác động của tổ hợp chất bảo quả

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện và một

số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác, các số liệu trong luận văn là trung thực và chính xác

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn đầy đủ, các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 18 tháng 6 năm 2015

Tác giả luận văn

Chu Xuân Cừ

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Phạm Kim Đăng – Phó trưởng khoa Chăn nuôi, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện và hướng dẫn trực tiếp đề tài luận văn của tôi cho tới khi hoàn thành

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Hạnh – Phó trưởng phòng Công nghệ phôi, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi thực hiện các thí nghiệm cũng như tạo mọi điều kiện để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn này

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Việt Linh, ThS Nguyễn Thị Hiệp, ThS Nguyễn Thị Nhung, ThS Nguyễn Thị Hồng, và các cô, chú, anh chị em ở Phòng Công nghệ phôi, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Bộ môn Sinh lý - Tập tính động vật và tập thể cán bộ, giáo viên khoa Chăn nuôi, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình đã động viên, ủng hộ, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn Thạc sỹ này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 18 tháng 6 năm 2015

Tác giả luận văn

Chu Xuân Cừ

MỤC LỤC

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục đồ thị viii

Danh mục hình ix

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Ý nghĩa của đề tài 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về tế bào trứng 3

1.1.1 Sự hình thành, phát triển nang trứng và tế bào trứng 3

1.1.2 Cấu tạo tế bào trứng 8

1.1.3 Quá trình sinh trứng 10

1.2 Tổng quan về tình hình đông lạnh trứng 13

1.2.1 Lịch sử đông lạnh trứng 13

1.2.2 Cơ chế đông lạnh tế bào trứng 15

1.2.3 Tình hình nghiên cứu đông lạnh trứng lợn 21

1.2.4 Đông lạnh trứng lợn và những vấn đề khó khăn 22

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 24

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.2 Thời gian nghiên cứu 24

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 24

2.2 Nôi dung nghiên cứu 24

2.2.1 Đánh giá khả năng thu mẫu trứng lợn non và nuôi thành thục trứng lợn non 24

2.2.2 Đánh giá tác động của các yếu tố môi trường bảo quản lạnh đến nuôi

thành thục trứng sau đông lạnh 25

2.2.3 Đánh giá tác động của yếu tố đông lạnh, giải đông lên sự sống và phát triển của trứng 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Phương pháp thu và phân loại chất lượng trứng 25

2.3.2 Phương pháp đông lạnh trứng 27

2.3.3 Phương pháp nuôi trứng 29

2.3.4 Phương pháp nhuộm trứng 29

2.3.5 Các phương pháp đánh giá 30

2.3.6 Các chỉ tiêu theo dõi đánh giá 33

2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 33

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Kết quả thu trứng và nuôi thành thục trứng lợn non 34

3.1.1 Kết quả thu trứng lợn non 34

3.1.2 Kết quả đánh giá khả năng thành thục theo chất lượng trứng 35

3.2 Kết quả tác động của các yếu tố môi trường bảo quản lạnh đến nuôi thành thục trứng sau đông lạnh 39

3.2.1 Kết quả tác động của nồng độ chất bảo quản trong môi trường đông lạnh lên sự sống và phát triển của trứng lợn non ở điều kiện nhiệt độ phòng 39

3.2.2 Kết quả tác động của tổ hợp chất bảo quản đông lạnh lên sự sống và phát triển của trứng non trong điều kiện nhiệt độ phòng 41

3.3 Kết quả tác động của tốc độ hạ nhiệt lên sự sống và phát triển của trứng lợn non 46

3.4 Kết quả tác động của thời gian xử lý lên sự sống và phát triển của trứng lợn non trong điều kiện nhiệt độ phòng 49

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52

1 Kết luận 52

2 Đề nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên đầy đủ

GDF-9 : Growth differentiation factor-9

màng nhân tan

LRF : Luteinizing releasing factor

MII : (metaphase II) trứng ở giai đoạn chu kỳ II

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả thu trứng từ mẫu buồng trứng thu ở lò mổ 34 Bảng 3.2 Kết quả nuôi thành thục trứng lợn non 36 Bảng 3.3 Tác động của nồng độ chất bảo quản lên tỷ lệ sống và phát triển của trứng lợn non 40 Bảng 3.4 Tác động của tổ hợp chất bảo quản đông lạnh lên tỷ lệ sống và phát triển của trứng lợn non 41 Bảng 3.5 Tác động của tốc độ hạ nhiệt lên tỷ lệ sống và phát triển của trứng 46 Bảng 3.6 Tác động của thời gian xử lý lên tỷ lệ sống và phát triển của trứng lợn non 50

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 3.1 Kết quả nuôi thành thục trứng lợn non 36

Đồ thị 3.2 Tác động của nồng độ chất bảo quản lên sự sống và phát triển của trứng lợn non 40

Đồ thị 3.3 Tác động của môi trường đông lạnh lên sự sống và phát triển của trứng lợn non 42

Đồ thị 3.4 Tác động của tốc độ hạ nhiệt lên sự sống và phát triển của trứng 47

Đồ thị 3.5 Tác động của thời gian xử lý lên tỷ lệ sống và phát triển của trứng lợn non 50

DANH MỤC HÌNH

STT Tên các hình ảnh Trang

Hình 1.1 Chu kỳ động dục ở lợn nái 3

Hình 1.2 So sánh mô hình sóng nang giữa các loài 4

Hình 1.3 Sự thay đổi buồng trứng trong chu kỳ động dục 5

Hình 2.1 Thu buồng trứng tại lò mổ 24

Hình 2.2 Phương pháp rạch nang và thu trứng 26

Hình 2.3 Phân loại tế bào trứng theo Mayes (2002) 27

Hình 2.4 Cấu trúc dụng cụ cryotop Thanh polypropylene (a) gắn với giá đỡ bằng nhựa (b) sau khi đặt mẫu đông lạnh lên trên thì đậy bằng ống nhựa (c) có nút bảo vệ mẫu trong nitơ (d) 28

Hình 2.5 Phương pháp nuôi trứng 29

Hình 3.1 Mẫu buồng trứng chuẩn bị thu trứng 34

Hình 3.2 Trứng lợn sau khi nuôi invitro: 37

Hình 3.3 Trứng sống sau khi nuôi invitro (trứng và tế bào cận noãn đều sống sau khi nuôi in vitro) (20X) 37

Hình 3.4 Trứng tại thời điểm thu, trước khi xử lý với chất chống đông và đông lạnh (20X) 44

Hình 3.5 Trứng lợn sau quá trình đông lạnh và rã đông (40X) 44

Hình 3.6 Trứng lợn được nhuộm FDA để theo dõi trạng thái sống/chếtcủa tế bào trứng (20X) sau khi xử lý qua các môi trường đông lạnh 45

Hình 3.7 Trứng lợn được cố định và nhuộm orcein để kiểm tra trạng thái thành thục sau quá trình đông lạnh – rã đông và nuôi thành thục (20X) 45

Hình 3.8 Trứng lợn sống sau đông lạnh nuôi invitro (20X) (trứng bắt màu sáng đậm là trứng sống, những trứng bắt màu nhạt là trứng đã bị chết) 48

Hình 3.9 Trứng thành thục sau khi đông lạnh và nuôi thành thục (40X) 51

quả nguồn gen invitro, chuyền gen, sinh sản vô tính

Đông lạnh trứng là hướng nghiên cứu đã được thực hiện từ rất sớm không chỉ trên các động vật nuôi, động vật hoang dã và mà còn được áp dụng trên người Đông lạnh trứng là cách để duy trì, bảo quản nguồn giao tử cái và sử dụng nó khi điều kiện cho phép Hiện nay, đông lạnh trứng đã trở thành nghiên cứu khả dụng và

áp dụng nhiều vào thực tế, tuy nhiên trên một số đối tượng hiệu quả của nghiên cứu vẫn chưa cao Do vậy, nhiều nghiên cứu nhằm cải thiện chất lượng trứng sau đông lạnh vẫn đang được triển khai Trong số đó, trứng lợn được xem là một trong số các loài có kết quả đông lạnh trứng thấp, việc đông lạnh trứng lợn vẫn còn là hướng nghiên cứu được quan tâm của nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới Nguyên nhân

là do trong thành phần trứng lợn có số lượng các giọt mỡ cao đã tác động đến hiệu quả quá trình đông lạnh

Các kết quả nghiên cứu cho thấy buồng trứng của các loài động vật có tiềm năng khổng lồ về sản sinh tế bào noãn Số lượng nang ở giai đoạn thành thục sinh sản là hơn

68.000 - 70.000 đối với bò (Erickson, 1996a); 12.000 – 86.000 đối với lợn (Driancourt et

al., 1985) (Dẫn theo Nguyen B.X (2006) Tính nhạy cảm trong quá trình đông lạnh của

trứng phụ thuộc vào loài (Bou et al., 2009) Trong quá trình đông lạnh, những yếu

tố làm giảm sự thành công của quá trình bảo quản lạnh trứng bao gồm sự hình thành tinh thể đá, các dạng tổn thương lạnh và độc tính của các chất bảo vệ lạnh

(Liebermann et al., 2002) Theo Smorag and Gajda (1994); Vajta and Kuwayama

(2006), sự hình thành tinh thể đá có thể được ngăn chặn nhờ vào tốc độ đông lạnh - giải đông và nồng độ chất bảo vệ lạnh trong dung dịch thủy tinh hóa Kết quả nuôi

trứng thành thục chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường nuôi, thời gian nuôi, nhiệt độ nuôi, cũng như trạng thái chất lượng trứng khi đưa vào nuôi thành thục Môi trường sống ở miền Bắc Việt Nam, điều kiện khí hậu, chế độ dinh dưỡng và đặc biệt là phương thức chăn nuôi chưa tiêu chuẩn hóa ảnh hưởng nhiều đến sự phát triển của vật nuôi từ đó ảnh ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng trứng trước khi đem nuôi thành thục và tỷ lệ thành thục sau khi nuôi

Ở Việt Nam, với mục đích bảo vệ nguồn gen đa dạng sinh học động vật, kĩ thuật lạnh nhanh đã được áp dụng đối với tế bào sinh dưỡng của các loài đông vật quý hiếm có nguy cơ tuyệt chủng cao như Sao la, Mang lớn, bò tót, khỉ, lợn rừng Đông lạnh trứng mặc dù đã được ứng dụng để bảo quản trứng ở một số bệnh viện

có ứng dụng kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm Tuy nhiên, để xây dựng một ngân hàng

lạnh bảo tồn nguồn gen các giống lợn bản địa Việt Nam, việc “Nghiên cứu đông lạnh trứng lợn non và nuôi thành thục trứng sau đông lạnh” nhằm xây dựng

phương pháp đông lạnh và nuôi thành thục trứng là rất cần thiết

2 Mục tiêu của đề tài

Tối ưu được các yếu tố ảnh hượng đến quá trình đông lạnh và nuôi thành thục tế bào trứng lợn non

3 Ý nghĩa của đề tài

Nghiên cứu này góp phần đánh giá khả năng xây dựng phương pháp đông lạnh trứng lợn để lập ngân hàng giao tử cái cho mục đích bảo tồn lâu dài nguồn gen các giống lợn bản địa ở Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về tế bào trứng

1.1.1 Sự hình thành, phát triển nang trứng và tế bào trứng

Các giai đoạn phát triển nang trứng và sự hình thành tế bào trứng gắn liền với các hoạt động chu kỳ của buồng trứng

Buồng trứng được hình thành từ quá trình phát triển phôi thai, nó là một bộ phận sinh dục của con cái, buồng trứng của lợn cái có một cặp hình hạt đậu, nằm ở hai bên hốc xoang bụng Buồng trứng có chức năng sản sinh ra giao tử cái (noãn bào - tế bào trứng) và hormone sinh sản cái (oestrogen và progesterone)

Lợn là gia súc đa thai, mỗi chu kỳ động dục có thể có 15 – 20 tế bào trứng thành thục và rụng Sự phát triển của các nang trứng chịu sự tác động bởi yếu tố thần kinh và thể dịch, nang trứng phát triển có sự tương quan chặt chẽ với nồng độ của các loại hóc môn khác nhau Các yếu tố kiểm soát chu kỳ động dục như: GnRH, FSH, LH, oestradiol, progesterone inhibin.v.v Sự phát triển của nang trứng lên đến rụng trứng và thả trứng vào thời điểm tốt nhất để được thụ tinh (hình 1.1)

Hình 1.1 Chu kỳ động dục ở lợn nái

(nguồn http://www2.unipr.it/~fderensi/rip_pig/rip_pig.htm)

Ở lợn sóng nang tương đối đồng đều, độ dài của các sóng nang đầu tiên không có sự khác biệt, do lợn là gia súc đa thai Còn sóng nang của các loài khác như Bò, Ngựa, Cừu không có sự đồng đều, các sóng nang phát triển với các độ dài khác nhau (hình 1.2)

Hình 1.2 So sánh mô hình sóng nang giữa các loài

(nguồn http://www2.unipr.it/~fderensi/rip_pig/rip_pig.htm)

Ở lợn cái sự thành thục sinh dục xuất hiện từ lúc 6 - 7 tháng tuổi (đối với các giống lợn ngoại), 4-5 tháng (đối với các giống lợn nội) Chu kỳ động dục của lợn cái dài từ 18-24 ngày, trung bình 21 ngày Thời gian động dục của lợn cái từ 4-5 ngày (đối với lợn ngoại), 2 - 3 ngày (đối với lợn nội) Sự rụng trứng bắt đầu xảy ra

và đặc trưng bởi sự tiết progesteron từ thể vàng (CLs) Những thể vàng bắt đầu phát triển ngay sau khi trứng rụng, mặc dù sau 2 - 4 ngày chúng vẫn chưa đạt khả năng cực đại tiết progesteron Khi progesteron tiết nhiều thì chúng ức chế sự phát triển của các bao noãn ở con cái Progesteron tác động lên trung khu sinh dục làm giảm thiểu sản sinh các yếu tố giải phóng FRF (Follice releasing factor) và LRF (Luteinizing releasing factor) Hơn nữa progesterone gây nên sự tiết dinh dưỡng vào

tử cung để nuôi dưỡng phôi giai đoạn đầu làm tổ vào khoảng 12 - 16 ngày sau khi phối

Sau 16 - 17 ngày vào thời kỳ cuối và kết thúc chu kỳ, chức năng thể vàng bị giới hạn bởi hormone Prostaglandin F2α được sản xuất với nồng độ cao Hormone này được tiết bởi tử cung bắt đầu khoảng 12 - 14 ngày sau khi trứng rụng Ở những lợn nái không có chửa, khi các buồng trứng tăng về khối lượng, đồng thời khi nồng

độ hormone prostagladin đủ sẽ tiêu huỷ thể vàng ở khoảng ngày thứ 16 - 17 sau rụng trứng, thể vàng tiêu biến và không có chất tiết của nó là progesterone Kết quả

là tăng nhanh sự tiết các yếu tố giải phóng FRF và LRF và dẫn đến tăng tiết FSH và

LH Các hormone đó kích thích các bao noãn phát triển nhanh chóng lại sau 4 - 5 ngày Sự sinh trưởng này được kết hợp với mức tiết oestrogen trong máu bởi các bao noãn Oestrogen tăng tiết làm phát triển lớp tế bào bề mặt tử cung chuẩn bị cho việc phối tinh Giai đoạn tiết oestrogen cao nhất sẽ làm tăng tiết LH và rụng trứng

Sự tăng tiết oestrogen ở nồng độ cao sẽ làm xuất hiện hiện tượng động dục

Trong chu kỳ động dục buồng trứng có sự thay đổi, sau khi trứng rụng khoảng 2 - 4 ngày thể vàng tiếp tục phát triển, từ ngày thứ 5 đến ngày 15 thì thể vàng thành thục Thể vàng thoái hóa vào ngày thứ 16 đến ngày thứ 20 và từ ngày 21 lại động dục trở lại (hình 1.3)

Hình 1.3 Sự thay đổi buồng trứng trong chu kỳ động dục

(nguồn partners in reproduction)

Buồng trứng lợn có hình hạt đậu, màu hồng vân, kích thước trung bình từ 0,8 – 1,2 cm, nằm ở hai bên hốc bụng Buồng trứng gồm có 2 miền, miền tuỷ bên trong

và miền vỏ bên ngoài Miền tuỷ có nhiều mạch máu, thần kinh và mô liên kết Miền

vỏ gồm các tế bào, các lớp mô có nhiệm vụ tạo ra tế bào trứng và hormone Lớp ngoài cùng của miền vỏ trứng là biểu mô bề mặt Biểu mô bề mặt là một lớp tế bào lập phương Ngay bên dưới biểu mô bề mặt là một lớp mỏng, dày đặc các mô liên kết Phía dưới là nhu mô (parenchyma), được coi là lớp chức năng bởi vì nó chứa nang trứng và các tế bào phân tiết hormone buồng trứng

Nang sơ cấp (nang bậc I) được hình thành trước khi con vật cái được sinh ra

Số lượng lớn nhất được tìm thấy ở bào thai lợn ở giai đoạn từ 50 – 90 ngày sau khi thụ thai Nang sơ cấp là một tế bào sinh dục được bao quanh bởi một lớp tế bào hạt Chúng nằm trong nhu mô và thường xuyên được nhìn thấy theo nhóm gọi là tổ trứng (egg nest), số nang trứng tối đa là 2.700.000, số nang lúc sinh 135.000, số nang mất trong quá trình phát triển 95%, mỗi lần động dục lợn nái có thể rụng từ 10 – 30 noãn bào Kích thước nang xoang là 8 – 10 mm, kích thước nang noãn thành thục là 8 – 12 mm Một số noãn bào có khả năng phát triển đến thành thục hoàn toàn sẽ được giải phóng vào đường sinh dục (ống dẫn trứng) để thụ tinh và phát triển thành phôi, những noãn bào khác sẽ tiếp tục phát triển rồi thoái hoá Vì thế, số noãn bào có khả năng phát triển thu được từ buồng trứng để tạo ra lợn lớn hơn nhiều so với thực tế nhận thấy

Giải phẫu miền vỏ buồng trứng của một gia súc cái có hoạt động sinh sản cho ta thấy nang sơ cấp (nang bậc I – primary follicle) Sau giai đoạn nang sơ cấp là

sự tăng sinh các tế bào hạt bao quanh một tế bào trứng có khả năng phát triển Một

tế bào trứng có khả năng phát triển được bao quanh bởi hai hay nhiều lớp tế bào hạt được gọi là nang thứ cấp (nang bậc II - secondary follicle) Trong quá trình phát triển, các tế bào hạt nang thứ cấp tiết ra dịch, đẩy chúng tách rời và hình thành một xoang Có nhiều lớp tế bào trong nang Graaf được coi là có chức năng quan trọng Ngoài cùng là lớp tế bào sợi được gọi là tế bào vỏ bên ngoài (theca externa) Tiếp theo là lớp tế bào vỏ bên trong (theca interna) Trong các lớp này có nhiều mạch máu Các tế bào vỏ, các mạch máu được hình thành khi nang trứng lớn lên và di chuyển

vào miền tuỷ Màng mềm (basement membrane) tách lớp tế bào vỏ bên trong khỏi lớp tế bào trong cùng - lớp tế bào hạt, ngăn cản sự di chuyển của hệ thống mạch máu vào các tế bào này Ngoài ra, khối Cumulus Oophorus, tế bào hạt, nằm ở phía bên kia của xoang Noãn bào có khả năng phát triển nằm trong khối tế bào Cumulus với những tế bào hạt bao quanh và tiếp xúc trực tiếp với tế bào trứng có khả năng phát triển được gọi là vành phóng xạ Cả tế bào vỏ bên trong và bên ngoài đều liên quan đến việc tạo ra oestrogen Lý thuyết gần đây được chấp nhận là tế bào vỏ bên trong tạo ra androgen, chất này thấm qua màng mềm để biến đổi thành oestrogen bởi enzyme aromatase trong các tế bào hạt Ngoài ra, tế bào hạt là tế bào chủ yếu tạo ra progesterone trong thể vàng Chúng cũng phân tiết một số thành phần khác được nhận biết trong dịch nang trứng, giúp điều khiển chức năng của buồng trứng, một số

tế bào hạt và tế bào trứng có khả năng phát triển vào xoang cơ thể gần với chỗ mở ra của ống dẫn trứng Trong lúc giải phóng ra, tế bào trứng được bao quanh bởi vành phóng xạ và một khối tế bào hạt (Cumulus) dính giúp ống dẫn trứng thu tế bào trứng

và dịch chuyển xuống ống dẫn trứng

Ở lợn cũng như ở phần lớn các loài động vật có vú khác, sự phát triển của tế bào trứng được kiểm soát trước tiên bởi một hệ thống tương tác ngược có tham gia của hormone giải phóng từ vùng đồi thị, hormone kích thích tế bào trứng FSH, LH và các steroids (oestrogens, androgens, progestins), proteins (inhibin-relared proteins) được tiết từ buồng trứng Kết quả hiện tại cho thấy các yếu tố cổ điển được coi là có tham gia vào quá trình trao đổi chất như hormone sinh trưởng (GH) insulin và yếu tố sinh trưởng giống insulin (IGF), cũng có một ảnh hưởng quan trọng đến sự phát triển của tế bào trứng ở lợn Điều này quan trọng là sự tham gia của chúng có thể là một phần của cơ chế đã được biết là ảnh hưởng của các yếu tố môi trường, dinh dưỡng lên sinh sản ở lợn

Những nghiên cứu gần đây đã khám phá ra những nhân tố được trứng tiết ra điều chỉnh sự khởi đầu phát triển nang nguyên thủy (Picton 2001 for review) và điều hòa sự hoạt động vùng chí tuyến của FSH và LH lên sự phát triển nang tiền xoang và có xoang (Knight and Glister, 2006)

Các nhân tố được trứng tiết ra bao gồm c-Kit, GDF-9, BMP 15… Trong đó, c-kit là nhân tố kích thích sự phát triển của trứng Sự tiết thụ thể c-kit đã được tìm thấy ở trứng chuột ở giai đoạn diplotene và ở trứng thai cừu ở nang nguyên thủy Phối tử c-kit được tiết bởi GCs ở nang nguyên thủy chuột và cừu Khi thêm vào kháng thể anti-c-kit làm ngăn cản sự bắt đầu phát triển của nang chuột Còn GDF-9 (Growth differentiation factor-9) và BMP 15 (bone morphogentic protein) là thành viên của liên họ TGF-ß, được tiết theo kiểu đặc biệt của trứng từ giai đoạn rất sớm Hai yếu tố này đóng vai trò chìa khóa trong xúc tiến sự phát triển nang vượt xa hơn giai đoạn nang sơ cấp chuột với sự chuyển biến vô hiệu của gen gdf-9 hoặc cừu với

sự mất hoạt tính của gen gdf-9 hay bmp 15 là giảm hiệu quả với sự phát triển nang dừng ở giai đoạn sơ cấp (Knight and Glister, 2006) Sự tiết GDF-9 mARN của trứng được tìm thấy ở tất cả các giai đoạn phát triển, trừ nang nguyên thủy và được tiếp tục tiết sau khi trứng rụng nhưng không xuất hiện ở 1,5 ngày sau khi thụ tinh BMP 15 có vai trò quan trọng trong điều chỉnh sự nảy nở và biệt hóa của GCs ở buồng trứng Đó là kích thích nguyên phân GCs và ngăn cản thụ thể FSH mARN ở

GC bằng cách đó đóng vai trò then chốt trong cơ chế phức tạp điều khiển sự hình thành nang buồng trứng Nhưng tác động này của BMP 15 bị mất dưới ảnh hưởng của follistatin

1.1.2 Cấu tạo tế bào trứng

Trứng có hình cầu hoặc hình trứng, có đường kính từ 60 tới 20 mcrm ở động vật có vú và cầu gai từ 1mm đến 2 mm ở cá ếch, ở bò sát và chim, trứng có thể có đường kính tới vài centimet và cân nặng tới hàng kilogram (Nguyễn Mộng Hùng, 1993)

Cấu tạo tế bào trứng được chia làm ba phần: Màng, nguyên sinh chất và nhân (Trần Tiến Dũng và cs., 2002)

Màng tế bào trứng gồm 3 loại màng: Màng ngoài, màng giữa, màng trong

Màng ngoài bao gồm nhiều lớp tế bào nang bao quanh trứng theo hình phóng

xạ còn gọi là màng phóng xạ, các tế bào gắn liền với nhau bởi axit hyaluronilic, axit này bị phân huỷ bởi men hyaluronidase có ở xoang acrosome của tinh trùng

Màng giữa (Zona pellucida) còn gọi là màng sáng rất bền vững, được xây dựng nên từ nhiều tế bào sinh ra từ các tế bào hình nang Màng giữa chính là nơi tích trữ nhiều dinh dưỡng trong nuôi dưỡng trứng, màng giữa có men Zonalizin là men đặc hiệu chủng loại có tác dụng ngăn ngừa tinh trùng khác loài vào nhân trứng trong quá trình thụ tinh

Màng trong là một lớp mỏng bao bọc phần nguyên sinh chất còn gọi là màng noãn hay màng nguyên sinh chất Giữa màng giữa và màng trong có khoảng trống

có độ dày là 1,4 – 2 mm chứa nồng độ ion cao 3 – 5 PH, đây là màng có vai trò nuôi dưỡng trứng sau khi được thụ tinh, trong màng cũng chứa một loại men là Muraminidase

Nguyên sinh chất bao gồm thành phần chủ yếu là nước, vật chất hữu cơ, các muối khoáng và các vật chất khác Thành thục nguyên sinh chất của trứng được đặc trưng bằng sự dịch chuyển của các hạt vỏ (Granule Corticale) theo hướng từ bộ máy golgi đến màng bào tương của trứng Những hạt này có chứa ovoperoxidase góp phần vào việc giảm thiểu sự thụ tinh đa tinh trùng có mặt trong trứng của tất cả các loài động vật có vú, các hạt này cố định trên bề mặt màng bào tương bởi một protein lạ gọi là Calpactine

Một trong những điều kiện cần thiết để màng trong suốt có thể nhận biết một cách đặc hiệu những tinh trùng đã kiện toàn năng lực thụ tinh của loài đó là sự thành thục của màng trứng Đặc biệt phải kể đến sự có mặt của glycoprotein ZP3

trên màng trong suốt, nó chính là nhân tố chịu trách nhiệm nhận biết trước tiên các giao tử đực Vùng trong suốt gồm 95% của 3 glycoprotein được tổ chức thành các sợi dài hợp nhất gọi là ZP1, ZP2, ZP3 (Cù Xuân Dần và cs., 1996) Phần ZP3 và ZP2

hợp thành các sợi, còn ZP1 làm nhiệm vụ bắc cầu liên kết các sợi với nhau Chỉ có glycoprotein ZP3 được tinh trùng nhận biết và phát ra thể đỉnh; ZP2 có vai trò can thiệp khi xảy ra sự thụ tinh bằng cách cố định tạm thời đầu tinh trùng trong khi tinh trùng đi qua vùng trong suốt

Nhân tế bào noãn bao gồm lưới nhiễm sắc thể và nhiều loại nhân Với mỗi giai đoạn phát triển của noãn thì tế bào trứng cũng sinh trưởng và phát triển dần dần thành thục Sự phát sinh tế bào trứng bắt đầu từ tế bào trứng

nguyên thuỷ trải qua 3 lần phân chia cuối cùng hình thành tế bào trứng chính thức

Các trứng thành thục phải đủ chất lượng để thụ tinh, bình thường không được dị dạng, teo lại hay trương phồng, cần có màu hồng tươi đẹp

1.1.3 Quá trình sinh trứng

Sự thành thục tế bào chất

Sau khi đạt tới kích thước cực đại, noãn bào chuyển sang một giai đoạn mới,

đó là giai đoạn thành thục Sự kiện này xảy ra dưới ảnh hưởng của các cơ chế điều chỉnh, có vai trò quan trọng là cơ chế thần kinh – hormone trong tương tác noãn bào với các tế bào xung quanh Sự chuyển sang thời kỳ thành thục được thực hiện dưới ảnh hưởng của các hormone kích dục tố của thuỳ trước tuyến yên vào cuối giai đoạn lớn noãn bào và kích thích quá trình thành thục (hay quá trình chín) Quá trình thành thục được nghiên cứu kỹ ở lưỡng thê, cá, động vật có vú, do đó ngày nay người ta có

thể gây chín noãn bào invitro

Trong điều kiện tự nhiên, các hormone kích dục chỉ tiết vào máu trong những thời kỳ xác định của chu kỳ sinh sản Ở động vật sinh sản theo mùa, nó diễn

ra vào trước thời kỳ đẻ trứng Số nang chịu phản ứng phụ thuộc vào nồng độ hormone và đặc trưng cho từng loài Tuy nhiên có thể tiêm thêm hormone vào cơ thể để gây chín đồng loạt nhiều trứng

Đồng thời với các diễn biến của nhân, trong tế bào chất cũng diễn ra những biến đổi Trứng trở nên mọng nước, tăng áp suất nội bào, giảm tính thấm, lớp tế bào chất bề mặt trở nên có tính co dãn, xuất hiện khả năng phân chia Trong tế bào chất của trứng cũng xuất hiện một loạt các tác nhân có ý nghĩa quan trọng cho sự phát triển tiếp theo Một trong những sự kiện quan trọng trong thành thục là sự vỡ màng nhân, màng nhân bị vỡ dưới ảnh hưởng của tác nhân phá huỷ màng nhân Tác nhân này xuất hiện trong noãn bào dưới ảnh hưởng của hormone progesterone và không

có sự tham gia của nhân (trong thí nghiệm với noãn bào không nhân) Hoạt tính của tác nhân này xuất hiện trước khi màng nhân vỡ Nếu lấy tế bào chất của noãn bào giai đoạn này tiêm cho noãn bào chưa chín thì sẽ làm màng nhân vỡ mà không cần

kích thích hormone Tác nhân không có tính đặc hiệu loài, có bản chất protein và có khả năng nhân lên trong tế bào chất

Sự thành thục nhân tế bào chất

Trong noãn hoàng chuẩn bị thành thục, nhân có kích thước rất lớn thường được gọi là bóng phôi (germinal vesicle) Nó có vị trí khác nhau trong noãn bào ở các loài khác nhau: ở trung tâm, lệch về cực động vật, lệch hẳn tới giữa đĩa tế bào chất, sát bề mặt trứng trên cực động vật Sau khi tiếp nhận kích thích bởi các kích dục tố, nhân nhanh chóng tiếp tục các kỳ phân bào giảm nhiễm (Meiose) Các lưỡng trị hội tụ trở lại và qua giai đoạn cuối cùng của tiền kỳ là Diakines Đồng thời nhân

di chuyển tới bề mặt trứng trên cực động vật, màng nhân vỡ ra, dịch nhân hoà vào tế bào chất, các lưỡng trị sắp xếp thành tấm trung kỳ của thoi phân chia Thoi phân chia trực giao với bề mặt trứng Sự phân ly các lưỡng cực xảy ra ở hậu kỳ Sau mạt

kỳ (Meiose 1) hình thành nên hai tế bào Một gồm có nhân và một chút tế bào chất tách khỏi noãn bào và nằm ngoài màng sinh chất nhưng ở trong màng noãn hoàng

đó là thể cực thứ nhất Tế bào thứ hai là noãn bào bậc hai Các nhiễm sắc thể trong nhân noãn bào ngay lập tức phân bố thành tấm trung gian kỳ của lần phân chia thứ hai Sự phân chia có thể tiếp biến tiếp tục và ở hậu kỳ này xảy ra sự phân ly các nhiễm sắc thể của bộ đơn bội (giống như phân bào nguyên nhiễm nhưng với số nhiễm sắc thể đơn bội) Sau mạt kỳ thể cực thứ hai được hình thành và trứng thành thục (Nguyễn Mộng Hùng,1993)

Trứng phát triển đến độ thành thục sẽ kèm theo những biến đổi về mặt hình thái, sinh lý và sinh hoá liên quan đến nhân trứng, nguyên sinh chất và màng trứng

Sự thành thục của nhân trứng bắt đầu bằng việc tan biến màng (GVBD: Germinal Vesicle Break Down), các nhiễm sắc thể đặc lại, điển hình nhất là sự xuất hiện của thể cực thứ nhất (First Polar Body) và nhiễm sắc thể ở trạng thái Metaphase II Trạng thái này sẽ được duy trì cho đến khi tinh trùng xâm nhập

Sau khi vỡ màng nhân bắt đầu hoạt động một tác nhân khác, đó là nhân hội

tụ nhiễm sắc thể Tác nhân này xuất hiện chỉ khi có sự hoà lẫn dịch nhân với tế bào chất, cơ chế xuất hiện còn chưa rõ, tác động cả tác nhân này cũng không đặc hiệu

Nó gây hội tụ nhiễm sắc thể của bất kỳ tế bào nào (như của tế bào thần kinh nếu như nhân nó được tiêm vào noãn bào đã vỡ màng nhân)

Trong noãn bào đang thành thục cũng xuất hiện một loại tác nhân, nếu không

có chúng, nhân tinh trùng không thể biến thành nhân nguyên đực và không có sự hoạt hoá tổng hợp AND Đó là các tác nhân trương nhân tinh trùng Để xuất hiện tác nhân này phải có sự tham gia của cả nhân và tế bào chất của noãn bào Trong quá trình thành thục còn xuất hiện các phân bào Không có tác nhân này, sự phân cắt sau thụ tinh sẽ không thực hiện được Tác nhân này xuất hiện trong nhân ở giai đoạn sớm của tạo noãn và giữ trong nhân cho tới khi vỡ màng nhân (Nguyễn Mộng Hùng,1993)

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự tồn tại một yếu tố thúc đẩy sự thành thục hay còn gọi là MPF (Manturation Promoting Factor) Người ta nhận thấy progesterone có vai trò kích thích sự sinh sản ra MPF, một yếu tố thúc đẩy sự phân bào, sự có mặt của yếu tố này dẫn đến sự đặc lại của nguyên sinh chất, nó tác động đến sự phát triển của nhân và góp phần làm xuất hiện các thoi phân bào Về bản chất, MPF là một phức hợp protein bao gồm sự liên hợp của một số cycline và một protein kinase P34 (khối lượng phân tử là 34 kdal); đây là histone kinase H1 tương tự một yếu tố men được sản xuất bởi gen cdc2, gen này tham gia vào việc kiểm soát quá trình phân bào Để được hoạt hoá, protein kinase P34 phải được khử gốc photpho bởi các cyclin Sự lớn lên của nguyên sinh chất, sự biệt hoá của ty thể, sự tổng hợp, sự tích luỹ noãn hoàng và các ARN thông tin, cuối cùng là sự biến mất của các hạt trung tâm, đó là những sự kiện phải được hoàn tất trước khi xảy ra sự hồi phục phân bào ở nhân trứng

Sự tạm dừng của trứng ở trạng thái Metaphase II cho đến khi được thụ tinh là

do một sản phẩm có trong bào tương có nguồn gốc từ một gen ung thư (proto – oncogen) C – mos, được gọi là nhân tố ổn định sự phân bào MSF (Meiosis stabilizing factor) Sự hoạt hoá trứng phụ thuộc đồng thời vào các quá trình photphoryl – dephotphoryl hoá; mà quá trình này lại bị ức chế bởi 6 – DMAP (6-dimethyl – aminopurine) và các quá trình tổng hợp protein, chúng lại bị ức chế bởi puromicine Hai chất này có thể làm dừng một cách độc lập với nhau nhờ sự đặc lại

của nguyên sinh chất hay cũng chính là làm cản trở sự phục hồi khả năng phân bào của trứng

1.2 Tổng quan về tình hình đông lạnh trứng

1.2.1 Lịch sử đông lạnh trứng

Vào nửa cuối thập kỷ 1940, Chang đã thực hiện những nghiên cứu đầu tiên

về bảo quản phôi thỏ ở nhiệt độ thấp (Hoàng Kim Giao và cs., 1997) Đến năm

1949, Polge và cộng sự phát hiện ra glycerol có thể giữ được sự sống của tinh trùng gia cầm khi nhiệt độ được hạ xuống -700C Phát hiện này mở ra khả năng có thể bảo quản các loại tế bào và mô ở nhiệt độ thấp hơn Smith (1952), đã đông lạnh phôi thỏ

ở nhiệt độ -790C và -1960C nhưng đạt kết quả không cao, sau khi rã đông chỉ có 1%

số phôi được bảo quản còn giữ được một phôi bào có khả năng tiếp tục phân chia

Năm 1976, Parkening và cộng sự tiến hành đông lạnh trứng chuột ở -300C và -500C có tỷ lệ sống đạt 51% - 56%; ở -750C chỉ đạt 18% trứng sống Một loạt

nghiên cứu của tác giả Willadsen (1977), Trouson et al (1977), đã cải tiến phương

pháp đông lạnh và rã đông theo phương pháp giảm từng bước một, nhằm pha loãng các chất bảo quản lạnh, tăng nhanh tốc độ đông lạnh và rã đông mà vẫn bảo tồn sức sống của phôi, thu được kết quả tốt ở bò và chuột Những cải tiến này cũng hạn chế được sự biến đổi về hình thái học của phôi Việc đơn giản hóa kỹ thuật đông lạnh và

rã đông theo phương pháp một bước (one –step method) do Leibo (1980), đề xuất

đã thực sự thúc đẩy việc sử dụng phôi cũng như tinh trùng đông lạnh rộng rãi trong sản xuất Hiệu quả cho thấy khi sử dụng tinh đông lạnh thì sức sống của phôi đạt trên 80% và tỷ lệ thụ thai đạt 50 – 60%

Đến năm 1985, Rall and Fahy đã công bố phương pháp đông lạnh cực nhanh vitrification hay còn gọi là phương pháp thủy tinh hóa, bằng cách nhúng trực tiếp phôi chuột 8 tế bào vào nitơ lỏng từ nhiệt độ trên 00C, do đó chỉ mất vài giây để đông lạnh Và ông đã thành công trong trữ lạnh phôi gia súc (bò) Phương pháp này không yêu cầu những dụng cụ lành lạnh đắt tiền hay kỹ năng đặc biệt mà có thể tiến hành rất nhanh Mặt khác, phương pháp thủy tinh hóa đơn giản hơn phương pháp đông lạnh thông thường Từ đó, phương pháp thủy tinh hóa được sử dụng rộng rãi

và bây giờ được xem như là phương pháp thay thế phương pháp đông lạnh chậm

Mặc dù, phương pháp đông lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa được Rall và Fahy thực hiện thành công đầu tiên trên phôi bò vào năm 1985 Tuy nhiên, quy

trình này chỉ được Kuleshova et al (1999) ứng dụng đầu tiên trên trứng người vào

năm 1999 và sau đó vài tháng, quy trình này được thực hiện đầu tiên trên phôi

người đang phát triển ở giai đoạn phôi nang bởi Lane et al (1999)

Kỹ thuật đông lạnh bằng phương thủy tinh hóa áp dụng thành công trên

trứng bò (Martino et al., 1996) Trên chuột, tỷ lệ hình thái trứng sống sau quy trình đông lạnh và rã đông bằng phương pháp thủy tinh hóa là 80% (Shaw et al., 1991); 99% (Lane and Gardner, 2001); 90% (Kim et al., 2007) Trên bò, tỷ lệ trứng sống sau đông lạnh và rã đông là 85% (Otoi et al.,1998); 87% (Asada and Fukui, 2000); 88% (Men et al., 2002); đặc biệt Chian Ri et al (2004), thu được tỷ lệ trứng bò

sống sau rã đông đạt 92% khi dùng chất bảo quản đông lạnh là 15% ethylene glycol (EG) kết hợp với 15% dimethyl sulphoside (DMSO), và đạt 98% khi dùng 15% ethylene glycol (EG) kết hợp với 15% propylene glycol (PG)

Martins et al (2005) đã tiến hành đông lạnh trứng bò chưa chín bằng phương

pháp thủy tinh hóa, sử dụng chất bảo quản là EG và sucrose, tỷ lệ trứng sống là 20%

so với nhóm đối trứng là 74,6% Năm 2006, Cetin và Bastan đã bảo quản trứng bò chưa trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa với các chất bảo quản khác nhau, tỷ lệ sống trên 20% so với nhóm đối chứng là 79,6%

Somfai et al (2006), khảo sát ảnh hưởng của Cytohalasin B trên quá trình

thủy tinh hóa trứng heo sử dụng phương pháp thủy tinh hóa trên bề mặt kim loại

Họ sử dụng quy trình bổ sung CPA qua 2 bước (trong EG 4% khoảng 10 – 15 phút

ở 370, sau đó trong dung dịch thủy tinh hóa cuối cùng EG 35% với 5% PVP và trehalose 0,3M

Gupta et al (2006), sử dụng quy trình thủy tinh hóa tương tự với quy trình

trên Trong thử nghiệm sử dụng trứng giai đoạn túi mầm, kết quả được cải thiện khi kết hợp sử dụng EG và DMSO, vì vậy họ sử dụng kết hợp hai chất này trên đối tượng trứng MII Tuy nhiên, phương pháp này làm giảm đáng kể khả năng phát triển của trứng, chỉ 3,4% phát triển đến blastocyst so với lô đối chứng là 20,1%

1.2.2 Cơ chế đông lạnh tế bào trứng

1.2.2.1 Khái niệm

Đông lạnh tế bào nói chung, đông lạnh TBT lợn nói riêng là quá trình chuyển

tế bào từ trạng thái sinh lí bình thường sang trạng thái tiềm sinh đông lạnh, bảo quản trong nitơ lỏng (nhiệt độ -1960C) Tại điều kiện này, mọi hoạt động sống, các quá trình chuyển hóa và phát triển của TBT đều dừng lại, nhưng các cấu trúc và thành phần sinh học của chúng được bảo tồn, nhờ đó người ta có thể giữ TBT ở trạng thái tiềm sinh trong một thời gian dài Sau khi giải đông, mọi hoạt động sống của tế bào, các quá trình chuyển hóa… trở lại trạng thái bình thường (Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2006; Anchamparuthy, 2007; Jacque and Kim, 2011)

1.2.2.2 Cơ chế sinh học lạnh của tế bào

* Tốc độ làm lạnh và giải đông

Tốc độ làm lạnh (cooling rate)

Hỗn hợp các muối và các chất hòa tan khác có trong môi trường đông lạnh vẫn giữ nguyên trạng thái đông lạnh và tạo thành phần không đông Tốc độ làm lạnh sẽ ảnh hưởng lớn đến khả năng khử nước và khả năng sống của tế bào sau giải đông Nếu tốc độ làm lạnh quá nhanh, có thể tạo ra chênh lệch lớn về áp suất thẩm thấu giữa hai bên màng bào tương, làm tổn thương độ đàn hồi của màng Ngược lại, nếu tốc độ làm lạnh quá chậm, tế bào có nhiều thời gian để khử nước, nhưng có thể bị mất nước quá nhiều, điều này cũng làm tổn thương màng tế bào Tế bào tiếp xúc với điều kiện áp suất thẩm thấu của môi trường ngoại bào cao, các muối, chất bảo vệ lạnh (cryoprotectant agents - CPA), các chất hòa tan khác trong thời gian dài có thể gây độc cho tế bào Tính đàn hồi của màng tế bào cũng bị ảnh hưởng do tế bào ở trạng thái co nguyên sinh quá lâu (Hồ Mạnh Tường và cs., 2011; Jacque and Kim, 2011)

Tốc độ giải đông (warming rate)

Tốc độ giải đông phụ thuộc rất nhiều vào tốc độ làm lạnh tối ưu đã thực hiện với chính tế bào trước đó Một số nghiên cứu trước đây cho thấy giải đông nhanh tế bào động vật có vú sau khi bảo quản lạnh luôn tốt hơn, bởi vì các tế bào có thời gian ngắn để tái hình thành tinh thể đá và tiếp xúc với các chất bảo vệ trong thời gian ngắn hơn Tuy nhiên, Whittingham (1977), đã chứng tỏ rằng có ngoại lệ đối với quy

luật này trên phôi chuột Nghiên cứu này cho thấy các phôi được bảo quản bằng phương pháp làm lạnh chậm và giải đông với tốc độ chậm có sức sống tốt hơn Phương pháp phổ biến nhất để giải đông TBT sau khi được thủy tinh hóa là nhanh và trực tiếp Thông thường TBT được đặt trong dung dịch giải đông ở 20°- 37°C Sau khi giải đông, TBT phải tái hấp thu nước và các chất bảo vệ phải bị loại

bỏ Việc này được làm nhanh và cần thực hiện pha loãng từ từ qua từng bước để tránh sự thay đổi áp suất thẩm thấu đột ngột, gây tổn thương cho tế bào (Hồ Mạnh

Tường và cs., 2011; PoIge et al., 1949)

* Những biến đổi trong quá trình đông lạnh

Sự hình thành tinh thể đá

Sự hình thành tinh thể nước đá trong và ngoài tế bào là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sức sống của tế bào sau đông lạnh Tốc độ làm lạnh chính là yếu tố quyết định dạng tinh thể nước đá hình thành Khi làm lạnh với tốc độ thích hợp thì tinh thể nước đá hình thành có dạng sáu cạnh Khi tốc độ làm lạnh được đẩy lên thì hình dạng của nó sẽ là hình cây thông không đồng dạng và hình cầu (Hồ Mạnh Tường và

Huỳnh Thùy Dương, 2001; Huang et al., 2006)

Ở môi trường đẳng trương (áp lực thẩm thấu ở khoảng 300mOm/kg), tinh thể

đá thường được hình thành ở nhiệt độ -5 đến -15oC Tuy nhiên, tinh thể đá chỉ được hình thành ở nhiệt độ -10oC khi trong dung dịch có các phân tử chất rắn nhỏ Nhiệt

độ càng giảm thì tinh thể đá càng tăng Ở nhiệt độ khoảng -130oC, tất cả các chất liệu trong dung dịch đều ở dạng hạt kết tinh hay dạng thủy tinh Quá trình này gọi là

sự kết tinh hay hiện tượng thủy tinh hóa (vitrification) (Hồ Mạnh Tường và cs.,

2011; Morato et al., 2008)

Sự khử nước

Sự khử nước của tế bào là rất cần thiết trong quá trình làm lạnh Một khi tế bào không được khử nước thì cấu trúc đá nội bào sẽ hình thành nếu nhiệt độ xuống dưới 0oC Tốc độ khử nước của tế bào phụ thuộc vào nhiều yếu tố: tính thấm nước của màng, năng lượng hoạt hóa của tính thấm và tỉ lệ diện tích bề mặt/thể tích tế bào (S/V) Những yếu tố này thay đổi tùy thuộc vào loại tế bào, vì vậy, chúng đóng vai trò quyết định trong việc xác định quá trình đông lạnh thích hợp nhất (Hồ Mạnh

Tường và cs., 2011; Prentice, 2010)

Độ pH của dung dịch

Độ pH của dung dịch sẽ giảm theo nhiệt độ Cân bằng acid - base của môi trường biến đổi theo hướng tăng lực ion, làm cho các phân tử protein hòa tan trong môi trường dễ bị kết tủa (salting out) Các chất bảo vệ đông lạnh với bản chất hóa học của nó giữ vai trò quan trọng trong việc kiểm soát biến đổi acid - base của dung dịch Glycerol và các glycol hoạt động như những base yếu, trong khi DMSO lại hoạt động như những base mạnh Độ pH thích hợp nhất để duy trì hoạt động sinh lí của tế bào phụ thuộc vào nhiệt độ mà tế bào được bảo quản Người ta nhận thấy rằng, sự sống có thể tồn tại sau bảo quản ở các nhiệt độ xấp xỉ 0oC với độ pH lớn hơn 9 (Hồ Mạnh Tường và cs., 2011; Jacque and Kim, 2011)

Sự hình thành bọt khí

Trong quá trình bảo quản lạnh, tế bào bị tổn thương và có thể chết vì nhiều cách khác nhau do sự hình thành tinh thể đá Thể tích nước bị đông lạnh sẽ tăng lên (tỉ trọng của nước đá thấp hơn tỉ trọng của nước) dẫn đến việc bọt khí có thể hình thành khi nhiệt độ giảm xuống Kích thước của bọt khí thay đổi từ 25-100µm và tỉ

lệ nghịch với tốc độ làm lạnh, trong khi số lượng bọt khí tỉ lệ thuận với tốc độ làm lạnh (Hồ Mạnh Tường và cs., 2011; Jacque and Kim, 2011)

Bên cạnh các khí hòa tan theo nồng độ, môi trường nuôi cấy còn sử dụng

CO2 làm đệm nhằm cân bằng acid - base Khi làm lạnh thì các khí này không còn ở dạng hòa tan mà tách ra thành những bọt khí có khả năng gây tổn thương cho tế bào Khi tiến hành giải đông, bọt khí có thể được hình thành và có thể phát triển thành không bào rất lớn trong nội bào, làm tế bào phồng to quá mức và có thể bị

phá hủy hoàn toàn Sự tạo thành bọt khí xảy ra nhiều trong môi trường sử dụng đệm bicarbonate, vì vậy, sử dụng môi trường PBS (Phosphate-buffered saline) có thể hạn chế số lượng bọt khí (Hồ Mạnh Tường và cs., 2011; Jacque and Kim, 2011)

1.2.2.3 Những tổn thương trong quá trình đông lạnh

Trong quá trình bảo quản lạnh, mức độ tổn thương phát sinh trong các tế bào chủ yếu phụ thuộc vào kích thước, hình dạng của tế bào, tính thấm của màng tế bào

và chất lượng (cấp độ) của tế bào Các yếu tố này thay đổi giữa các loài, giai đoạn phát triển và nguồn gốc của chúng (Vajta and Kuwayama, 2006) Đã có các bê con được sinh ra từ các TBT đông lạnh - giải đông, nhưng khả năng để hỗ trợ cho sự phát triển phôi sau quy trình bảo quản lạnh thường thấp Nguyên nhân được cho là

do những tổn thương của TBT sau khi bảo quản lạnh (Chen et al., 2003) Trong quá

trình phát triển phôi, sự tập trung các sợi actin được polyme hóa dạng màng tăng lên

và hình dạng (cấu tạo, comformation) của nó thay đổi Điều này tạo điều kiện cho việc thấm nước và các chất bảo vệ lạnh, đồng thời thúc đẩy sự mất nước và làm giảm sự hình thành tinh thể đá nội bào trong suốt các quá trình bảo quản lạnh Thêm vào đó, màng tế bào của phôi tăng sức chịu đựng thẩm thấu trong suốt quá trình giải đông và cho phép phôi chịu được sự đông lạnh và giải đông tốt hơn TBT (Chen

et al., 2003) Ngoài ra, các giai đoạn phát triển của TBT tại thời gian bảo quản lạnh được cho là ảnh hưởng đến các đặc tính sinh học lạnh của tế bào (Pereira and Marques, 2008)

Cơ chế phân tử đặc trưng làm đứt gãy trong quá trình đông lạnh chưa được hiểu rõ, nhưng các yếu tố siêu cấu trúc để duy trì và phát triển về sau bị tổn thương

(Tharasanit et al., 2009) Các TBT sau khi giải đông thường bị đứt gãy màng trong

suốt và màng TBT Khi TBT được làm lạnh từ 370C xuống 200C hoặc dưới 200C thường dẫn đến có nhiều biến đổi về cấu trúc tế bào và nhiễm sắc thể, nhưng trong một số trường hợp, tế bào có khả năng tự sửa chữa toàn bộ hoặc một phần (Massip, 2003; Vajta and Kuwayama, 2006) Những tác dụng ngược chủ yếu trong suốt quá trình bảo quản lạnh là do sự hình thành tinh thể nước đá, tổn thương thẩm thấu, các hiệu ứng độc của các chất bảo vệ lạnh, các chất điện giải bên trong tế bào cô đặc, tổn thương lạnh, đứt gãy màng và những biến đổi của các bào quan bên trong tế

bào, sự tiếp xúc giữa tế bào với tế bào (Martins et al., 2005; Vajta, 2000) Các giải

pháp để vượt qua những hậu quả này bao gồm giảm thể tích vật mang, gia tăng gradient nhiệt, thay đổi tỉ lệ diện tích/thể tích tế bào và thêm vào các chất như: các protein chống đông, đường, các chất chống oxi hóa làm ổn định màng tế bào trong suốt quá trình đông lạnh; đồng thời gia tăng sự dung nạp lạnh (cryotolerance)

(Ledda et al., 2001; Pereira and Marques, 2008)

Các giai đoạn phát triển của TBT tại thời điểm bảo quản lạnh cũng ảnh hưởng đến đặc tính sinh học lạnh của tế bào Một số nghiên cứu cho thấy việc đông lạnh TBT GV là một ý tưởng hay do không có sự hiện diện của thoi vô sắc trong quá trình giảm phân và vật liệu di truyền được ráp với nhân Tuy nhiên, TBT GV thường có độ nhạy cao với “stress” trương lược không đều và tính ổn định của màng tế bào thấp hơn TBT MII Bảo quản lạnh TBT GV dưới 4oC làm giảm sự hình thành các thoi vô sắc giảm phân bình thường và giảm sự thụ tinh Một giả thuyết khác cho rằng bảo quản lạnh TBT GV làm tổn thương đến cấu trúc toàn vẹn của màng nhân, ảnh hưởng đến sự sao chép, phiên mã của DNA và chức năng của tế bào, tuy nhiên, nhân có khả năng ráp lại (reassemble) sau khi giải đông (Van

Blerkom et al., 1994) Để bảo quản lạnh TBT GV thành công thường phụ thuộc vào

sự bảo đảm tính toàn vẹn về cấu trúc và chức năng của COC (cumulus-oocyte complex) Các tổn thương về tế bào cumulus bao quanh TBT cũng ảnh hưởng đến

sự thành công trong bảo quản lạnh TBT GV Khe nối giữa TBT và cumulus đóng vai trò quan trọng trong sự chín trưởng thành của TBT vì có cung cấp các chất dinh dưỡng trong quá trình IVF (Massip, 2003) Đã có nghiên cứu chứng minh rằng khi TBT không còn cumulus thì khả năng trưởng thành nhân và tế bào chất là rất thấp

(Bogliolo et al., 2007; Hochi et al., 1996)

Đối với TBT MII, những thay đổi xảy ra ở màng bào tương làm ảnh hưởng đến tính thấm nước và các chất bảo vệ lạnh Khi TBT tiếp tục giảm phân lần thứ nhất, màng nhân biến mất, cho phép vật chất di truyền hòa vào tế bào chất Lúc này

có những biến đổi về sự tổ chức của nhân và sự phân bố của các bào quan: ti thể, cấu trúc tế bào và các hạt vỏ, chính điều này cũng góp phần ảnh hưởng đến kết quả của kĩ thuật bảo quản lạnh Thêm vào đó, các tế bào cumulus bao quanh TBT bị

giãn nở, các vi sợi của actin cần phải thay đổi hình dạng tế bào và sự chuyển động, các vi ống được hình thành từ thoi vô sắc (Massip, 2003)

Sự thụ tinh thành công phụ thuộc vào việc duy trì được tính toàn vẹn về cấu trúc và chức năng của các phức hợp COC Mặc dù ảnh hưởng của tế bào cumulus lên sự sống sót của TBT sau đông lạnh và giải đông được tranh luận nhiều, nhưng

những tác động có lợi đã được báo cáo (Im et al., 1997; Imoedemhe and Sigue,

1992) Theo các tác giả này, sự hiện diện của tế bào cumulus có thể tạo sự bảo vệ chống lại sự thay đổi áp suất thẩm thấu và stress Sự thay đổi áp suất thẩm thấu và stress được gây ra bởi sự di chuyển vào hoặc ra một cách nhanh chóng của các chất bảo vệ lạnh trong suốt quá trình cân bằng và loại bỏ chất bảo vệ khi giải đông Tuy nhiên, việc bảo quản lạnh phức hợp trứng - cumulus nguyên vẹn còn là một vấn đề bởi vì thời gian tối ưu cho việc cân bằng tương đối khác nhau giữa TBT hơn là các

tế bào cumulus Ngoài ra, TBT nằm trong dung dịch bảo vệ ưu trương làm tế bào co lại, điều này có thể gây nên sự phá vỡ liên kết giữa tế bào cumulus và TBT, vì vậy, tương tác lí sinh giữa TBT và tế bào dinh dưỡng bao quanh không còn đảm bảo

(Fuku et al., 1995a; Gosden, 2005) Chính vì vậy, khi TBT MII tiếp xúc với các

chất bảo vệ lạnh và nhiệt độ thấp có thể làm tổn thương đến thoi vô sắc, sợi actin; cản trở sự hoạt động của NST và sự tái trùng hợp của vi ống TBT có độ nhạy rất cao khi làm lạnh, có thể bị tổn thương ngay cả khi ở nhiệt độ phòng Một phần chính là do thoi vô sắc mỏng manh và trong tế bào chứa hàm lượng lipid cao TBT

là tế bào duy nhất mà DNA của giao tử cái được treo trên thoi vô sắc trong tế bào chất khi phân bào giảm nhiễm và không được màng nhân bảo vệ Những tổn thương của DNA và các vi ống làm hạn chế thành công của sự bảo quản lạnh TBT Khi TBT bò bị tổn thương ở nhiệt độ phòng thì khả năng sống giảm đáng kể và hệ thống thoi vô sắc giữ các nhiễm sắc thể bị đứt gãy (disassembled) (Saunders and Parks,

1999; Wu et al., 1999) và chromatid có thể không phân chia trong quá trình làm lạnh, dẫn đến hình thành đa bội thể (Eroglu et al., 1998) hoặc dị bội thể (Sathananthan et al., 1987) sau khi thụ tinh

1.2.3 Tình hình nghiên cứu đông lạnh trứng lợn

1.2.3.1 Tình hình nghiên cứu đông lạnh trứng lợn trên thế giới

Những năm trở lại đây, việc nghiên cứu đông lạnh trứng lợn trên thế giới đã

có sự phát triển tích cực Nhìn chung, những nghiên cứu cho thấy trứng lợn ở giai đoạn MII rất nhạy cảm với phương pháp đông lạnh bằng phương pháp đông lạnh cực nhanh Quá trình này có thể làm gãy các vi ống và giảm khả năng sống của

trứng (Galeati et al., 2011) Cũng đã có những thông báo thành công trong việc

đông lạnh trứng lợn ở giai đoạn MII, mà kết quả cuối cùng sau khi thụ tinh đã phát

triển thành phôi nang, nhưng chưa thể phát triển tới giai đoạn lợn con sinh ra (Lin et

al , 2009; Liu et al., 2008) Nhưng từ những trứng đông lạnh, sau khi thụ tinh ống

nghiệm (IVF) tỷ lệ phát triển lên phôi nang vẫn đạt tỷ lệ cao đến 43% (Ogawa và cs., 2010) Theo những thông tin chúng tôi có được, cho đến nay vẫn chưa có lợn con nào được sinh ra từ trứng đông lạnh và IVF Nhưng nghiên cứu chỉ ra rằng, thai lợn từ trứng đông lạnh bị yếu tố ức chế phát triển trong quá trình mang thai (Ogawa

et al., 2010) Nghiên cứu phát triển kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm và tách màng sáng

trước khi cấy chuyển phôi đã cho ra đời những lợn con khỏe mạnh (Wu et al.,

2004) Đây là hướng nghiên cứu có thể giúp tháo gỡ khó khăn trong quá trình đông lạnh

Nghiên cứu đông lạnh trứng lợn thành thục bằng kỹ thuật vitrification sử

dụng cọng ra đã được thực hiện (Wu et al., 2006) Tuy nhiên, gần đây kỹ thuật đông

lạnh sử dụng cryotop đã được chứng minh có nhiều ưu thế hơn so với phương pháp

đông lạnh trước đây (Ogawa et al., 2010; Sripuya et al., 2010) Liu et al (2008), đã

có thông báo về nghiên cứu so sánh hiệu quả đông lạnh trứng lợn thành thục của phương pháp sử dụng cryotop với phương pháp sử dụng cọng rạ thông thường Nghiên cứu đã tiến hành lặp lại trên 1.153 trứng, kết quả cho thấy đông lạnh bằng phương pháp sử dụng cryotop đạt tỷ lệ phân chia sau thụ tinh là 34,7% cao hơn so với phương pháp đông lạnh dùng cọng ra thông thường đạt 11,5% Đối với đông lạnh trứng người, kết quả đông lạnh bằng cryotop cũng đạt tỷ lệ trứng có hình thái bình thường sau giải đông đạt 91% cao hơn so với phương pháp dùng cọng rạ thông thường đạt 78% (Kuwayama, 2005) Những nghiên cứu so sánh trên các đối tượng

trứng bò (Inaba et al., 2011) và trứng chuột đều cho kết quả tương tự Tuy, hiệu quả

của phương pháp đông lạnh bằng cryotop đã được khẳng định trên nhiều đối tượng nhưng đối với trứng lợn non, một mẫu nghiên cứu được đánh giá là khó đông lạnh hơn so với các loại mẫu khác, vẫn chưa được nghiên cứu ứng dụng phương pháp này

1.2.3.2 Tình hình nghiên cứu đông lạnh trứng lợn ở Việt Nam

Ở Việt Nam, với mục đích bảo vệ nguồn gen đa dạng sinh học động vật, kĩ thuật lạnh nhanh đã được áp dụng đối với tế bào sinh dưỡng của các loài động vật quý hiếm có nguy cơ tuyệt chủng cao như Sao la, Mang lớn, bò tót, khỉ, lợn rừng Đặc biệt, trong trường hợp Sao la, kĩ thuật đã áp dụng thành công để bảo quản mẫu

tế bào thu từ động vật trong vòng 24 giờ sau khi đã chết Các nghiên cứu cấu trúc nhiễm sắc thể tế bào sau giải dụng, tạo phôi nhân bản vô tính và bộc lộ gen của phôi

cũng thấy tế bào đã được bảo quản trong ni tơ lỏng một cách an toàn (Uoc et al.,

2002) Trong giai đoạn 2008 - 2010, nhóm nghiên cứu đã tiến hành đề tài hợp tác khoa học giữa Việt Nam và Viện nghiên cứu Nông nghiệp Tsukuba, Nhật Bản Trong giai đoạn này, các nghiên cứu liên quan đến nuôi thành thục trứng lợn và khả năng bảo tồn nguồn gen dựa vào phương pháp đông lạnh Nguyễn Thị Ước và cs (2008), đã có báo cáo về khả năng sản xuất phôi lợn nội địa bằng công nghệ tạo phôi ống nghiệm và nhân bản vô tính

1.2.4 Đông lạnh trứng lợn và những vấn đề khó khăn

Trứng lợn là một tế bào đơn, chứa trên 80% là nước, TBT dễ bị tổn thương

do thay đổi môi trường hơn so với phôi trước khi cấy - chứa nhiều tế bào (Leibo et

al., 1978) Mỗi bước trong quá trình bảo quản lạnh góp phần làm giảm khả năng phát triển của TBT đông lạnh TBT là một tế bào đặc biệt, có màng trong suốt bao quanh, nên tính thấm nước và chất bảo vệ lạnh của nó giảm Tỉ lệ diện tích bề mặt trên thể tích của TBT thấp hơn so với các loại tế bào khác, gây khó khăn cho sự vận chuyển nước và chất bảo vệ qua màng nguyên sinh chất, tăng nguy cơ hình thành tinh thể đá ngoại bào trong quá trình đông lạnh TBT phải duy trì tính nguyên vẹn của vài cấu trúc đặc thù của nó cần cho sự thụ tinh và phát triển sau

đó (Prentice, 2010)

Bảo quản lạnh trứng và phôi nhiều loài động vật có vú (bò, chuột…) đã thành công Tuy nhiên, bảo quản lạnh thành công trứng lợn đã và đang gặp thách thức, vẫn chưa có lợn con được sinh ra từ trứng lợn đông lạnh, do tính nhạy cảm của chúng với các tổn thương lạnh Trứng lợn rất nhạy cảm với làm lạnh dưới nhiệt

độ sinh lý (Fahy et al., 1984) Bởi vì tính nhạy cảm, phương pháp làm lạnh nhanh

đã được tập trung để cố gắng bảo quản trứng lợn (Fujihira et al., 2005; Nagashima

et al., 1999) Tuy nhiên, tổn thương tới thoi vô sắc và khả năng phát triển vẫn là

một vấn đề (Shi et al., 2006; Wu et al., 2006) Để ngăn cản sự hình thành tinh thể

đá khi làm lạnh với tốc độ cao, nồng độ cao của những dung dịch thấm và không

thấm qua màng cần được sử dụng như là chất bảo quản lạnh (Fahy et al., 1984)

Nhưng nhúng tế bào vào dung dịch có nồng độ cao có thể gây tổn thương do độc tính hóa học trực tiếp của những thành phần đó và cũng do tác động của áp lực thẩm thấu

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu buồng trứng lợn được thu từ các các lò mổ thuộc khu giết mổ tập trung của Công ty TNHH Minh Hiền, huyện Thanh Oai, thành phố Hà Nội Các mẫu được lựa chọn là buồng trứng bình thường, không bị thiểu năng, dị dạng, viêm nhiễm và được thu ngay sau khi giết mổ

Hình 2.1 Thu buồng trứng tại lò mổ

- Buồng trứng được bảo quản trong bình ổn nhiệt chứa nước có nhiệt độ từ 35-370C và vận chuyển về phòng công nghệ phôi để tiến hành xử lý các công đoạn tiếp theo

2.1.2 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 6 năm 2014 đến tháng 03 năm 2015

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu

Phòng Công nghệ phôi - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Việt Nam, 18 đường Hoàng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, thành phố Hà Nội

2.2 Nôi dung nghiên cứu

2.2.1 Đánh giá khả năng thu mẫu trứng lợn non và nuôi thành thục trứng lợn non

- Đánh giá khả năng thu mẫu trứng lợn non

- Đánh giá khả năng thành thục của trứng lợn non

2.2.2 Đánh giá tác động của các yếu tố môi trường bảo quản lạnh đến nuôi thành thục trứng sau đông lạnh

- Đánh giá tác động của nồng độ chất bảo quản lên sự sống và phát triển của trứng lợn non trong điều kiện nhiệt độ phòng

- Đánh giá tác động của tổ hợp chất bảo quản lên sự sống và phát triển của trứng lợn non trong điều kiện nhiệt độ phòng

2.2.3 Đánh giá tác động của yếu tố đông lạnh, giải đông lên sự sống và phát triển của trứng

- Đánh giá tốc độ hạ nhiệt lên sự sống và phát triển của trứng lợn non

- Đánh giá tác động của thời gian xử lý lên sự sống và phát triển của trứng non trong điều kiện nhiệt độ phòng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu và phân loại chất lượng trứng

2.3.1.1 Phương pháp thu mẫu buồng trứng và trứng lợn non

Dụng cụ lấy mẫu được chuẩn bị sẵn từ phòng thí nghiệm gồm có panh, kéo, găng tay, túi nilon sạch và bình ổn nhiệt chứa nước có nhiệt độ từ 35 – 37oC

Tại lò mổ lợn, buồng trứng được thu ngay sau khi con vật bị giết Dùng panh kẹp buồng trứng và kéo để cắt buồng trứng cho vào túi nilon buộc kín và để trong bình ổn nhiệt Trứng sau khi thu được vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm trong vòng 1 giờ đến 1 giờ 30 phút tính từ lúc con vật bị giết

Buồng trứng sau khi thu về được tách các mạch máu và rửa trong nước muối sinh lý ở 37oC từ 3 – 4 lần Sau đó tiến hành thu trứng bằng phương pháp rạch nang

để giải phóng tế bào trứng khỏi nang trứng

Cách tiến hành rạch nang, thu trứng:

Cho buồng trứng vào đĩa nhựa petri vô trùng, dùng dao vô trùng rạch nang Dịch lỏng thu được cho vào ống 12 ml để lắng trong tủ ấm 37oC khoảng 5 phút Dùng pipet 1000 µl hút loại bỏ phần dịch bên trên rồi hút lấy phần lắng ở đáy cho vào đĩa Petri Dùng nước rửa trứng cho cùng vào đĩa Petri để cho phần lắng hòa lẫn với nước rửa trứng PBS, sau đó tiến hành thu trứng dưới kính hiển vi soi nổi bằng

bộ dây và kim hút có đường kính thích hợp Trứng được rửa lại 3 – 4 lần trong dung