Góp phần nghiên cứu về thực vật và thành phần hóa học của vị thuốc mộc thông

Gỗ cấp I; bị dồn vào phía ưong, ồ ngay dưới phần gỗ cấp 11, gổm các mạch gỗ nhỏ xếp thành hình tam giác có đỉnh hướng vào trong phân hóa li tâm... Định tính sơ bộ cắc nhóm chất trong dư

(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC s ĩ KHÓA 2001 - 2006)

THS HOÀNG VĂN LÂM

BỘ MÔN THỤC VẬT TRUỒNG ĐẠI HỌC DUỌC HÀ NỘI

V ;Ạ

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, tôi

đã nhận được sự chỉ bảo và giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo Tôi xin bày tỏ lòng biết 0fn sâu sắc tới:

PGS TS Vũ Văn Điền - Bộ môn Dược học cổ truyền

ThS Hoàng Văn Lâm - Bộ môn Thực vật

là những người thầy trực tiếp hướng dẫn và đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho tôi

Xin chân thành cảm Cfn: PGS TS Chu Đình Kính - Viện Hóa học -

TT KHTN & CNQG, PGS TS Nguyễn Quang Đạt - Bộ môn Hóa hữu cơ,

TS Trần Vãn ơ n - Bộ môn Thực vật đã giúp đỡ tôi trong một số lĩnh vực về chuyên môn

Tôi cũng xin cảm Cfn các thầy cô giáo, các cán bộ, kĩ thuật viên của các bộ mồn: Dược học cổ truyền, Thực vật, Dược liệu, các phòng ban trong trường, các cán bộ Phòng cấu trúc-Viện Hóa học TT KHTN & Œ Q G , Phòng TNTT - Trường Đại Học Dược Hà N ộ i đã tạo mọi điểu kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, ngưòfi thân, bạn bè đã luôn khích lệ, động viên tôi để tôi có được kết quả như ngày hôm nay

Hà Nội, ngày 10 / 5 / 2006

Sinh viên

Phan Thị Hồng Minh

MỤC LỤC» •

ĐẶT VẤN ĐỂ

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CHI lODES (BLUME) 2

1.1.1 Vị ư í phân loại 2

1.1.2 Đạc điểm chung của họ Mộc thông - Icacinaceae M iers 2

1.1.3 Đặc điểm chung của các loài trong chi lod^s (Blume) 3

1.2 PHÂN BỐ, SINH THÁI 6

1.3 BỘ PHẬN DÙNG VÀ CHẾ BIẾN 6

1.4 THÀNH PHẨN HÓA H Ọ C 6

1.5 TÍNH VỊ, QUI KINH - CÔNG NÃNG, CHỦ TRỊ 7

1.6 MỘT SỐ BÀI THUỐC c ó MỘC THÔNG 1

1.6.1 Chữa đái khó, đái buốt, đái dắt 7

1.6.2 Chữa viêm gan vàng da, viêm thân cấp, đái đỏ đục, đái ra m áu 7

1.6.3 Chữa phụ nữ đẻ có ít sữa 8

1.6.4 Chữa đau vùng tâm vị, ăn nuốt khó, hay bị nghẹn và đau tức vùng gan, đại tiện không thông, ợ hơi hoặc nôn ọe, miệng hôi, rêu lưõi vàng 8

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 NGUYÊN LIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP THƯC NGHIÊM 9

2.1.1 Nguyên liệu 9

2.1.2 Phưcỉng pháp thực nghiệm 10

2.2 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 12

2.2.1 Nghiên cứu vê thực vật 12

2.2.2 Nghiên cứu về hóa học 22

2.3 BÀN LUẬN 47

2.3.1 Về các kết quả nghiên cứu thực vật 47

2.3.2 Về các kết quả nghiên cứu hóa học 47

PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 3.1 KẾT LUẬN 49

3.1.1 Thực vật 49

3.1.2 Hóa học 49

3.2 ĐỂ XUẤT 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Công nghệ Quốc gia

DANH MỤC CÁC BẢNG

steroid 26

2 Bảng 2.2 : Kết quả định tính các nhóm chất trong thân cây Mộc thông 28

3 Bảng 2.3 : Thí nghiệm xác định chỉ sô'bọt 30

4 Bảng 2.4 : Thí nghiệm sơ bộ xác định chỉ số phá huyết 31

5 Bảng 2.5 : Cách điều chỉnh nồng độ dịch chiết dược liệu để xác định chỉ số phá huyết 32

6 Bảng 2.6 : Thí nghiệm xác định chỉ số phá huyết 32

7 Bảng 2.7 : Kết quả định lượng Saponin toàn phần 35

8 Bảng 2.8 : Kết quả SKLM của Saponin trong hệ S8 37

9 Bảng 2.9 : Kết quả định lượng Alcaloid toàn phần 40

10 Bảng 2.10 ; Kết quả SKLM của Alcaloid 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

1 ffinh 1

10 Hình 10

11 Hình 11

12 Hình 12

13 H ìn h lS ;

14 Hình 14

15 Hình 15

ỉ 6 Hình 16;

Cây Mộc thông ta 12

Dây Mộc thông ta 13

Cành Mộc thông ta 13

Vi phẫu rễ Mộc thông ta 14

Cấu tạo chi tiết rễ Mộc thông ta 15

Vi phẫu thân Mộc thông ta 16

Cấu tạo chi tiết thân Mộc thông ta 17

Vi phẫu lá Mộc thông ta 18

Cấu tạo chi tiết lá Mộc thông ta 19

Dược liệu Mộc thông 20

Bột Mộc thông ta 21

Sắc kí đồ của Saponin 38

Sắc kí đồ của Alcaloid 43

Tinh thể M j 44

Sắc kí đồ của Mj ưên 3 hệ dung m ôi 45

Công thức cấu tạo của p-stigmasterol 46

ĐẶT VẤN ĐỂ

Hiện nay, cùng với sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật và công nghệ, con người đã tìm ra nhiều nguồn nguyên ỉiệu làm thuốc; tổng hợp hóa dược, công nghệ vi sinh và chiết xuất từ dược liệu Song, bên cạnh các tác dụng điều trị bệnh, các thuốc được chế tạo theo con đường tổng hợp hóa dược còn gây không ít những tác dụng không mong muốn cho người bệnh Vì thế, xu hướng dùng thuốc có nguồn gốc thiên nhiên ngày càng được chú trọng hom và dược liệu là hướng còn nhiều triển vọng Tuy nhiên, để có thể khai thác tốt nguồn tài nguyên này, cần có những nghiên cứu một cách hệ thống về thực vật, thành phần hóa học , tác dụng sinh h ọ c của cây thuốc

Mộc thông là vị thuốc ta vừa nhập của Trung Quốc, vừa khai thác trong nước nhưng chưa có sự thống nhất loài sử dụng Người ta đã thống kê, phát hiện thấy hơn 10 loại cây khác nhau, thuộc các họ thực vật khác nhau mang tên mộc thông, chủ yếu thuộc 4 họ: họ Mộc hương (Aristolochiaceae) và họ Mao lương (Ranunculaceae), họ Mộc thông (Icacinaceae), họ Phytocrenaceae

Vì vậy, để đánh giá một cách đầy đủ, góp phần khai thác và sử dụng vị thuốc Mộc thông hợp lí, an toàn và hiệu quả, chúng tôi tiến hành để tài: “Góp phần nghiên cứu về thực vật và thành phần hóa học của vị thuốc Mộc thông” Trong khuôn khổ khóa luận này, chúng tôi nghiên cứu một số nội dung sau:

Nghiên cứu một số đặc điểm ứiực vật, đặc điểm vi học góp phần nhận dạng dược liệu

Định tính các nhóm chất trong dược liệu Mộc thông

Chiết xuất, phân lập và sơ bộ nhận dạng một thành phần có trong dượcliêu

Phân lớp Hoa hồng (Rosiđae)

Liên bộ Dây gối (Celastranae)

Bộ Dây gối (Celasưaỉes)Phân bộ Đỏ cọng (Icacinineae)

Họ Mộc ứìông (Icacinaceae)Chi Iodes

Loài ỉodes vitiginea (Hance) HemsL

1.1.2 Đặc điểm chung của họ Mộc thông - Icacinaceae Miers [2], [16], [21]

Cây to gỗ to, nhỡ, leo hay mọc đứng Lá mọc so le không có tua cuốnhay mọc đối (Iodes) có tua cuốn Mép lá nguyên, khía răng hay chia thùy, gân

lá hình ỉông chim hay hình chân vịt, không có lá kèm

Cụm hoa: hình xim, hình tán, hình ngù hay chùy Hoa nhỏ lưỡng tính hay đcfn tính, đều Đài thường rất nhỏ Cánh hoa 4-5 rời hay hợp, van, ít khi không có cánh hoa Số nhị bằng và mọc xen kẽ với các cánh hoa, bao phấn 2 ô (đôi khi có 4 thùy sâu), chỉ nhị tíiường có lông ở dưới, bao phấn rời, ít khi có triền Bộ nhụy: bầu trên một ô, ít khi 3-5 ô, hai noãn treo ở gần đỉnh của bầu;

có vòi hay không có vòi; núm nhụy hình đỉa Quả thịt, một hạch hóa gồ hay giòn; một hạt ít khi có cánh, phần lớn có nội nhũ thịt; phôi thường nhỏ, ít nhiều thẳng.

1.1.3, Đặc điểm chung của chi lodes (Blume) [14], [35]

ỉodes Blume, họ Mộc thông ta- ỉcacinaceae

Cây bụi leo Lá đơn mọc đối, có cuống; gân lá hình lông chim Cụm hoa xim ở nách lá hoặc gần nách lá, có khi biến đổi thành tua cuốn, hoa khác gốc Hoa đực: đài nhỏ với 4 - 5 - 8 thùy hình tam giác; tràng có 4 - 5 thùy xếp van; nhị 5, xen kẽ cánh hoa, bao phấn hai ô, mở trong; bầu tiêu giảm Hoa cái: đài và tràng như hoa đực, không có nhị, nhị lép và đĩa mật; bầu không cuống gồm một ô chứa hai noãn, đầu nhụy dạng đĩa Quả khô hoặc hctì nạc mang đầu nhụy, kèm theo đài không đồng trưởng Hạt một, phồi nhũ nạc, phôi dài gần hình hạt

1.1.4 Các loài trong chi ỉodes (Blume)

Theo tài liệu [20], ở Việt Nam có 3 loài: ỉodes cirrhosa Turcz, ĩodes

seguini (Le’vl.) Rehd, ỉodes vitiginea (Hance) Hemsl.

Theo tài liệu [14], chi lodes gồm 28 loài cực lục địa, ở nước ta có 4 loài:

ĩodes balanse Gagnep, ỉodes cirrhosa Turcz, ĩodes seguini (Le’vl.) Rehd, lodes vitiginea (Hance) Hemsl.

> ĩodes baỉanse Gagnep [14], [35]

Tên khác: Mộc thông quả lớn

Cây leo, nhánh hình trụ, có tua cuốn ở các mấu Lá xoan gần tròn, hình

tim ở gốc; có mũi nhọn ngắn ở đầu, dài 12 cm, rộng 7 cm; các lá ở ngọn nhỏ

hcfn; cuống lá cỡ 15 mm; có lông nhung ở gân mặt trên, có lông mềm ngắn ở

ở mặt trên

Cụm hoa ở nách, dài 4 cm, dạng ngù, rộng 15-20 mm với 20 hoa màu trắng Hoa đực có đài, gồm 5 lá đài có lông, 5 cánh hoa đính ở gốc, 5 nhị và bầu thô sơ.

Quả thuôn dẹp, có bề mặt lồi lõm, phủ lông nhung ngắn, dài 30mm, rộng ỉ 5 mm; hạt dài 20 mm, rộng lOmm, lá mầm thuôn, lõm ở gốc

Phân bố ở Việt Nam và Nam Trung Quốc, ở nước ta gặp ở Hà Tây Cây mọc trong rừng

ở Vân Nam (Trung Quốc), rễ được dùng làm thuốc trị viêm thận, còn ở Quảng Tây, rễ được dùng trị phong thấp tê đau

> ĩ odes cirrhosa Turcz ĩ 141, Í20

Tên khác: Mộc thông quả đỏ, Tử quả

Cây nhỡ mọc leo cao tới lOm, nhánh non vàng, có lông màu hung, thường có tua cuốn từ nách lá Lá có cuống dài i-2 cm; phiến xoan dài 5-7

cm, rộng 4- 4,5 cm, mặt dưới đầy lông màu vàng; gân bên mảnh, 5-6 đôi

Chùm hoa khác gốc, ở nách hay ở trên nách lá; hoa đực có 4-5 nhị Hoa cái có bầu một ô với 2 noãn treo

Quả cỡ 17-12 mm, màu đỏ, chứa một hạt

Phân bố ở Nam Trung Quốc (Vân Nam) và ờ Việt Nam ở nước ta có ờ

các tỉnh phía Bắc vào Thừa Thiên Huế, Khánh Hòa và Đồng Nai

Cây leo trong rừng ở độ cao 400-1300m Mùa hoa tháng 5-12, mùa quả

từ tháng 7 trở đi Rễ chữa thiếu sữa, trị bế kinh, phù thũng

ở Vân Nam (Trung Quốc), rễ cây dùng trị viêm thận

> ỉodes sesuini (H Lév) Rehd r 141, [201

Tên khác: Mộc thông seguin, Tử quả seguin

Cây nhỡ leo, nhánh có lông dày ngắn, tua cuốn mọc từ mắt, chẻ 2 Lá

có cuống dài 1,5 cm; phiến hình xoan tròn, cỡ 12x7 cm, đầu nhọn, gốc hình tim, gân bên 6 đôi, mặt trên có lông ở gân, mặt dưới có lông dày sát

Ngù hoa gổm khoảng 20 hoa trắng, nhỏ, rộng 6 mm, mẫu 5; cánh hoa cao 3 mm, có lông thưa; nhị 5, có chỉ nhị ngắn Quả hạch thuôn dẹp, to 3x1,5

cm, chứa một hạt

Phân bố ở Nam Trung Quốc (Quảng Tây, Vân Nam) và Việt Nam ở nước ta có gặp ở vùng Thủ Pháp thuộc tỉnh Hà Tây

Cây mọc trong rừng, trên núi đá ở độ cao từ 700m trở lên

ở Quảng Tây, thân cây dùng trị phong thấp tê đau và lá dùng trị rắn cắn Còn ở Vân Nam, rễ dùng làm thuốc trị viêm thân

ỉodes vitisinea (Hance) Hemsĩ Modes ovaỉis Blume var vitisinea

(Hance) GagnepỊ [10], [12], [13], [14], [20], [24], [28], [31], [35]

Tên khắc: Mộc thông ta

Cây bụi leo, cao 7-1 Om Cành mảnh, có ít lông, có tua cuốn ở mấu Lá mọc đối: cuống lá dài 1-2, có lông; phiến lá hình bầu dục dài 6-12 cm, rộng 4-

Cụm hoa ở nách, gồm những chùy thưa mang hoa nhỏ đơn tính khác gốc màu lục nhạt Hoa đực có 4-5 lá đài, 4-5 cánh hoa dài hcfn lá đài và có lông ở mặt ngoài, 4-5 nhị đính xen kẽ với cánh hoa, không có chỉ nhị và bầu thô sơ Hoa cái có 4-5 lá đài, 4-5 cánh hoa giống hoa đực, không có vòi, đầu nhụy hình đĩa, dày, rộng hơn bầu, bầu thượng 1 ô hình trứng phủ đầy lông Quả thịt hình trứng dẹp dài 1,5-1,8 cm, rộng 1,2 cm, có lông mịn màu vàng nâu Hạt đcfn độc, nội nhũ có đầu

Loài này có ở Nam Trung Quốc và Việt Nam ở nước ta có gặp tại Thái Nguyên, Hải Phòng

Cây mọc ở vùng rừng núi Ra hoa tháng 5-6, có quả tháng 7-8

Thân dây và rễ được dùng chữa tiểu tiện không thông, phù thũng, viêm đường tiết niệu, còn dùng chữa bế kinh và thiếu sữa

Dân gian dùng thân và ỉá nấu nước tắm cho phụ nữ mới sinh nở và người ốm yếu để chóng phục hồi sức khỏe

Chúng tôi tập trung nghiên cứu cây này.

1.2 PHÂN BỐ, SINH T H Á I [13], [14], [17], [20], [28], [31], [35]

Họ Mộc thông trên thế giới có 45 chi và khoảng 400 loài, phân bố ở

vùng nhiệt đới và một phần á nhiệt đới về phương bắc; chúng phân bố tới Nam Phi, New Zealand và Chile (Takhtajan 1966) ở Việt Nam, họ Mộc thông có

13 chi (bao gồm cả họ Phytocrenaceae), 19 ỉoài

Chi Iodes Blume gồm một số loài là dây ỉeo, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á ở Việt Nam có 4 loài Loài mộc thông phân bố từ phần lục địa Nam Trung Quốc đến Việt Nam, Lào và có thể ở cả Campuchia

ở Việt Nam, Mộc thông có mặt ở hầu hết các tỉnh vùng núi và trung du

phía bắc, hiếm dần ở các tỉnh phía nam Cây ưa sáng, chịu bóng khi còn nhỏ,

thường mọc ở rừng thứ sinh và ven bờ nưcfng rẫy ở các tỉnh Vĩnh Phúc, Bắc Ninh, Hải Dương có ncfi cây mọc trong cả các lùm bụi quanh làng Độ cao phân bố thường dưới 1300m

Cây ra hoa quả hàng nãm, chưa quan sát được dây non mọc từ hạt Sau khi bị chặt phá, phần còn lại của cây tái sinh chồi khỏe

1.3 BỘ PHẬN DÙNG VÀ CHẾ BIẾN [12], [13], [14], [20], [24], [28]

Bộ phận dùng là thân và cành già đã phofi hay sấy khô của cây mộc

thông (ỉodes vitìgìnea (Hance) Hemsl, Icacinaceae)

C h ế biếm Thu hoạch tháng 7-8 Lấy những cành già về, cắt thành khúc

dài 40cm, cạo sạch vỏ bần xanh ở ngoài, phcd hay sấy khồ

Dược liệu dễ mốc mọt, nên để chỗ kín, khô ráo Không nên trữ nhiều,

để lâu sẽ đen, mất phẩm chất

1.4 THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Theo tài liệu [28], toàn cây mộc thông chứa acid béo.

Theo tài liệu [29], trong hạt có chứa tới 55,0% (về khối lượng) là dầu, chỉ số lod là 65,2, chỉ số xà phòng là 198,00 Trong đó acid béo chiếm 99,6%, bao gồm: acid palmitic 36,50%; acid palmitoleic 54,10%; acid stearic 0,60%; acid oleic 4,00%; acid linoleic 4,40%

Theo tài liệu [30], hạt của cây mộc thông lodes vitiginea (Hance) Hemsl (Icacinaceae) chứa 39-50% dẩu Các nghiên cứu cho thấy aciđ béo chính là hexadecenoic ở dạng cÌs-7-hexanđecenoic Bằng HPLC cũng phát hiện thấy 13 triglyceriđ (peak)

1.5 TÍNH VỊ, QUI KINH - CÔNG NĂNG, CHỦ TRỊ [3], [11], [12], [13], [14], [24], [28]

VỊ nhạt, hơi đắng, tính mát

Vào các kinh tâm, phế, tiểu trường, bàng quang

Công năng; giáng tâm hỏa, thanh phế nhiệt, lợi tiểu tiện, tiêu viêm, thông huyết mạch, thông kinh, thông tia sữa

Chủ trị: Rễ và thân Mộc thông được dùng chữa phù thũng, tiểu tiện không thông, viêm đường tiết niệu, đái đắt, đái buốt, bế kinh, tắc tia sữa Ngày

Phụ nữ có thai và những người tiểu đưcmg, tiểu nhạt không dùng được Trong dân gian, người ta dùng thân và lá Mộc thông nấu nước tắm cho phụ nữ mới sinh và người bị ốm yếu để chóng phục hồi sức khòe

1.6 MỘT SỐ BÀI THUỐC c ó MỘC THÔNG [12], [13], [14], [28]

ỉ 6.1 Chữa đái khó, đái buốt, đái dắt

Mộc thông 20g, phục linh 8g, trạch tả 12g, đãng tâm 8g, hạt mã đề 8g, tnr linh 8g sắc uống trong ngày

ỉ 6.2 Chữa viêm gan vàng da, viêm thận cấp, đái đỏ đục, đáỉ ra máu

Mộc thông 16g, sinh địa, huyền sâm, ngưu tất mỗi vị 12g, dành dành,

L6.3 Chữa phụ nữ đẻ có ít sữa

Mộc thông 20g, gạo nếp lOOg, xuyên scín giáp 30g (sao với cát cho

còn 300ml, chia làm hai lần uống trong ngày vào lúc đói

1.6.4 Chữa đau vùng tâm vị, ăn nuốt khó, hay bị nghẹn và đau tức vùng gan, đại tiện không thông, ợ hơi hoặc nôn ọe, miệng hôi, rêu lưỡi vàng.

Mộc thông, bách bộ, hạt muỗng sao, mỗi vị 16g; chỉ xác, nga truật,

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TH ựC NGHIỆM

2.1.1 Nguyên liệu

> Đổi tươns nshiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: cây Mộc thông ta {Ịodes vitiginea (Hance)

Hemsl, ỉcacinaceae)

- Nơi thu hái mẫu: Lô 6 phân khu Tản Lĩnh-Vườn Quốc gia Ba Vì ờ độ

cao 260m so với mặt nước biển, thuộc hệ sinh thái rừng tái sinh 2A

- Mẫu được thu hái ở hai thời điểm; Ngày 9/ 8/ 2005

Ngày 5/ 4/ 2006

- Thân cây thu về đem cắt thành khúc dài khoảng 30- 40 cm, cạo sạch vỏ bần màu xanh, thái phiến dày 2- 4 mm, phơi khô hoặc sấy khô ở nhiệt

độ 50“C Bảo quản để nghiên cứu hóa học, vi học

- Tiêu bản cây phơi sấy khô bảo quản để kiểm tra tên khoa học

> Phươns tiên

* Thiết bị- Máy móc

- Máy UV-VIS spectrophotometer cary lE -varían (Australia)

- Máy FT-IR spectrophotometer 1650-perkin Elmer (USA)

- Máy đo phổ khối 5989B MS

- Kính hiển vi Leica

- Máy cất quay BƯCHI waterbath B480 (Đức)

- Máy xác định độ ẩm Presica PH- HA60 (Thụy Sĩ)

- Tủ sấy Memmert

- Đèn tử ngoại

- Máy tính và phần mềm máy tính (Microsoft Word, Adobe Photoshop

9 0 )

* Hóa chất- Dung môi

- Hóa chất; Xanh methylen, Đỏ son phèn, Na2S04 và các hóa chất để định tính, định lượng khác

- Dung môi: Chloroform, Ether-dầu hỏa, Methanol, Benzen, Aceton, Butanol, acid acetic Các dung môi đều đạt tiêu chuẩn phân tích

- Bản sắc kí lớp mỏng Silicagen GF254 (M ERCK)

- Silicagel 60 cỡ hạt 0,036-0,2 mm (MERCK)

2.1.2 Phương pháp thực nghiêm

2.1.2.1 Nghiên cứu về thực vật

^ Kiểm tra tên khoa hoc của mẫu nshiên cứii

- Quan sát, mồ tả cây tại thực địa Lấy mẫu và làm tiêu bản khô.

- Đối chiếu mẫu cây thu hái với các tài liệu về thực vật và mẫu lưu giữ tại các trung tâm khoa học lớn: Viện Dược liệu, Khoa Sinh ĐHQGHN

- Sơ bộ xác định tên khoa học của mẫu cây nghiên cứu

> Nehiên cứu đâc điểm vi hoc (làm vi phẫu rễ, thân, lá; soi bột) theo tài

liệu [6], [9], [22], [23], [26].

2.1.2.2 Nghiên cứu về hóa học

> Đỉnh tính các nhóm chất trone dươc liêu theo phưcfng pháp phân tích

hóa thực vật thường qui ghi trong tài liệu [4], [5], [7], [18], [27]

> Nehiên cứu Saữonin

■ Định tính Saponin bằng sắc kí lớp mỏng dùng bản mỏng ưáng sẵn Silicagel GF254 (Merck), đo chỉ số bọt, chỉ số phá huyết theo phucfng pháp ghi ưong tài liệu [4], [7], [18], [27]

■ Định lượng Saponin toàn phần bằng phưcfng pháp cân

Chiết Saponin toàn phần bằng bằng dung môi hữu cơ thích hợp, tinh chế sơ

bộ, bốc hơi dung mồi thu được cắn Saponin toàn phần Sấy cắn đến khối lượng không đổi, cân, tính hàm lượng theo dược liệu khô tuyệt đối

Hàm lượng Saponin toàn phần được tính theo cồng thức:

S( %) = -- - X 100

dx( l -b)Với:

S: hàm ỉượng Saponin tính theo dược liệu khô tuyệt đối

c : khối lượng Saponin toàn phần d: khối lượng dược liệu đem chiết

b : hàm ẩm của dược liệu (%)

Nghiên cứu Alcaloid

mỏng tráng sẵn Silicagel GF254 (Merck)

■ Định lượng Alcaloid toàn phần bằng phuofng pháp cân

Chiết Alcaloid toàn phần bằng dung môi hữu cơ thích hợp, tinh chế sơ bộ, bốc hơi dung môi thu được cắn Alcaloid toàn phần Sấy cắn đến khối lượng khồng đổi, cân, tính hàm lượng theo dược liệu khô tuyệt đối.Hàm lượng Alcaloid toàn phần được tính theo công thức:

A{%) = -- - X 100

mx{l-b)Với:

A: hàm lượng Alcaloid tính theo dược liệu khô tuyệt đối

a : khối lượng Alcaloid toàn phần m: khối lượng dược liệu đem chiết

b : hàm ẩm của dược liệu (%)

y Phân ỉâp thành phần

- Dùng sắc kí cột hấp phụ vód chất nhồi cột là Silicagel 60 của MERCK,

dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần

- Kiểm ưa độ tinh khiết bằng SKLM và phổ ư v , IR

+ Phổ u v đo trên máy u v - VIS Specưophotometer cary lE-varian

+ Phổ IR đo trên máy FT-IR spectrophotometer 1650-perkin Elmer (ƯSA)tại Phòng thí nghiệm trung tâm-ĐH Dược Hà Nội

> Sơ hô nhân dans chất DỈìản ỉâp đĩứrc

Đo phổ MS đo trên máy 5989B MS lại Ptiòng cấu trúc-Viện Hóa học TTKHTN & CNQG

2 ỉ 2.3 Xử Ü kết quả nghiên cứu

Các kết quả được xử ỉí theo phương pháp thống kẽ toán học [19]

2.2 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật

2.2.ỉ ỉ Đâc điểm hinh thái thưc vât

Hình 1: Cây Mộc thông ta

Sau khi quan sát MNC, thấy rằng;

Dây leo, cao 5-7m (Hình 1) Thân hóa gỗ, ữòn, có đôi chỗ hcfi vặn vỏ

đỗ, đưcmg kính 2-4 cm, chứa nhiều dịch ưong suốt, v ỏ ngoàỉ hóa bần màu nâu, phía trong màu trắng ngà Cĩiiều dài trung bình một đốt thân 13-17cm (Hinh 2) Cânh màu xanh lục, có lông mềmmàu vàng nâu bao phủ DỊ dạng đặc biệt ỏ cành: có nốt sần màu vàng xanh ở đầu ngọn cành Lá đcfn, nguyên, mọc đối, cuống lá dài 1-1,5 cm; phiến lá hình trứng, dài 6-11 cm, rộng 5-7cm,

mặt trên màu xanh, tương đối nhẩn, có lông cúng ở đường gân, mặt dưới màu

vàng nâu nhạt, nhiều lồng mềm màu nâu nhạt; gốc lá khi còn non hình gần ữòn, khi già hơi hình tim; đầu nhọn; gân lá lông chim Tua cuốn mọc ra từ nách lá, có nhiều lông ngắn màu vàng nâu (Hình 3)

H ìa h 2: I>ày M ộ c th ô n g ta H ia h 3: C àflh M ồ c th ô n g ta

Lấy mẫu cây về ép khô và đối chiếu với các mẫu lưu tại Viện Dược liệu, Khoa Sinh ĐHQGHN, chúng tôi thấy mẫu của chúng tôí giống các mẫu vói tên khoa học là Iodes vitiginea (Hance) Hemsl., Icacinaceae

Lưu mẫu tiêu bản tại Phòng tiêu bản - Bộ môn thực vật Trường Đại học Dược Hà Nội Mã tiêu bản: HNIP/15018/06.

2.2.1.2 Đặc điểm vỉ phẫu

Làm vi phẫu rễ, thân, lá Mộc thông ta

Quan sát tiêu bản dưổi kính hiển vi ở vật kính 4, 10 và 40.

> Vi phẫu rễ (Hình 4, 5)

Mặt cắt rễ gần hình tròn, từ ngoài vào trong có;

Lớp bần tưcfng đối dày gổm 3-5 hàng tế bào hình chữ nhật xếp thành những vòng đổng tâm và dãy xuyên tâm, phần ngoài có nhiều chỗ bị bong ra

- Tầng phát sinh bần - mô mềm vỏ cấp II: là một hàng tế bào hình chữ nhật khá hẹp nằm sát lớp bần

Mô mềm vỏ: gổm mô mềm vỏ cấp I và mô mềm vỏ cấp n

kích thước gần bằng nhau xếp thành vòng tròn đồng tâm và dãy xuyên tâm

kích thước không đều nhau, xếp lộn xộn, có các khoảng gian bào nhỏ Trong mô mềm vỏ cấp I, sợi tập trung với nhau thành từng đám

Bó libe cấp I: bị các tổ chức cấp II đẩy ra ngoài nên quan sát không rõ

Bó libe gỗ cấp II: các bó mạch lớn, chia thành 2 phần đối xứng nhau Mỗi phần gồm 2 bó libe gỗ xếp sát nhau Libe bắt màu hồng nằm bên ngoài, gồm những tế bào nhỏ hình gần ưòn, xếp thành từng đám hơi vòng cung, ở giữa là tẩng phát sinh ỉibe gỗ gồm 5-7 lófp tế bào hình chữ nhật xếp sát nhau

GỖ nằm phía trong bắt màu xanh, có nhiều mạch gỗ kích thước khác nhau, các

bó gỗ xuất phát từ tâm và xếp đối diện nhau qua tâm rễ, cách nhau bởi những tia ruột khá rộng

H ln h 4 : V í p liẫii lẻ M ộ c tb ỏ ù g t a

Tãsgphit siah báa-mố m¿ni võ 2

Mô loỀm võ C4p 2

Níổ mỉm vô cáp ỉ

Tẩn^ pbát ãob ôbe 36 cấp ĩ

Gỏ cap 1

Tĩ3 luỏi

H ìab 5: Cấo tạo cbì tHSt I¿ M ộc thòag ta

Gỗ cấp I: bị đẩy vào phía trong, hình tam giác, gồm có vài mạch gỗ nhỏ

và còn giữ tính chất phân hóa hướng tâm

Tia ruột: các tế bào hình chữ nhật xuất phát từ tâm, xếp thành các vòng đồng tâm và dãy xuyên tâm

- Ruột: do bị các bó gỗ ép lại nên không nhìn thấy rõ

> Vi phẫu thán (Hình 6,7)

Mặt cắt thân gẩn tì*òn, từ ngoài vào tìrong có:

- Biểu bì cấu tạo bởi một 1 hàng tế bào nhỏ hình tròn xếp đều đặn mang lông che chỏ đcfn bào và lông tiết đofn bào

Hình 6: Vi phầu thản Mộc thông ta

Lôns die điở

ỈM

TPS bán*lục bì Lục b\

Libe cap 1

\í ỗ méni vò cftp ỉ Libe cáp 2

TPSíibe 26 cap 2

lìa mót

ũò cấp I Níố ntém niội Tmh ttaé cald a\alat

H ìok 7: Cấu rạo ck i tìềt ttaãa M ộc tk ớ ag ta

Tầng phát sinh bần-lục bì gổm các tế bào hình chữ nhật, kích thước tưcmg đối đều nhau bắt màu đỏ nhạt, nằm giữa !ớp biểu bì và ỉục bì

Lục bì: là mô mềm v6 cấp II, gồm 3 lớp tế bào bắt màu đỏ

Mô mềm vỏ cấp I: cấu tạo bcfi các tế bào hình nhiều cạnh không đều, có thành mỏng, ở các góc có khoảng gian bào Trong mô mểm rải rác có các tinh thể catci oxalat hình cầu gai

Bó libe cấp I: thường bị ép bẹp thành những lớp mỏng màu đỏ sậm, không nhìn rõ từng tế bào, nàm ưong mô mềm vỏ cấp I, gần sát lớp lục bì

Bó libe gỗ cấp I I : libe libe bắt màu hồng nằm bên ngoài, gổm những tế bào nhỏ, xếp thành từng dám ở giữa là tầng phát sinh libe gỗ Sát tầng phát sinh libe gỗ là mô mềm gỗ và các mạch gỗ bắt màu xanh

Gỗ cấp I; bị dồn vào phía ưong, ồ ngay dưới phần gỗ cấp 11, gổm các

mạch gỗ nhỏ xếp thành hình tam giác có đỉnh hướng vào trong (phân hóa li tâm)

\

Tia ruột gồm 1-2 dãy tế bào đi từ m ột qua lớp gỗ cấp II.

Mô mểm ruột ở chính giữa thân, gỗm các tế bào hình đa giác kích thước

không đều nhau, có thành rất mỏng, các góc có khoảng gian bào nhỏ

> Vi pìiẫu lá (Hình 8.9Ì

■ Phần phiến iá:

dày

~ Mô giậu cấu tạo bồi 2 hàng tế bào hình trụ xếp vuông góc vồi bề mặt lá

- Mô khuyết: nằm giữa phần thịt lá

Hình 8: Vi phẫu lá Mộc thông ta

■ Phần gân lá: cả hai mặt đều lồi, mặt dưới lồi nhiều hơn mặt trên.

- Biểu bì trên cấu tạo từ một lớp tế bào tròn, nhỏ, xếp đều đặn, mang lông che chở đơn bào

- Mô dày trên: gồm nhiều lớp tế bào xếp sát biểu bì trên, kích thước lớn hơn tế bào biểu bì, tế bào tròn, thành dày khá đều nhau

- Mổ mềm gồm những tế bào nhiều cạnh, thành mỏng, kích thước không đểu, các góc có khoang gian bào nhỏ Trong mô mểm có các tinh thể calci oxalat hình cầu gai nằm rải rác.

- Cung mô cứng liên tục hoặc gián đoạn gổm những tê' bào có thành dày hóa gỗ

- Bó libe gỗ: làm thành hình vòng cung, mặt íõm quay về phía trên, nằm giữa gân lá Libe gồm nhíhig tế bào nhỏ, xếp thành từng bó gần hình nón, xếp với các bó gỗ thành từng chồng riêng biệt

2.1.2.3 Đặc điểm bột thán

> Mỗ tả dươc liêu

HMi lO r D ụ liíu ^ iổ c tin i«

Dược liệu hình trụ tròn đài, h d cong, dài khoảng 50 cm, đường kính 2 - 3,5 cm Mặt ngoài màu nâu hcfi vàng, có rãnh nứt dọc Mấu thường phình to,

có vết sẹo cùa lá và cành, vỏ còn sót lại dễ bóc, rách Chất cứng, không dễ bẻ

gẫy Khi sử dụng, phiến thái dày 2 - 4 mm, mép không đều, vỏ còn sót lại màu nâu hơi vàng, gỗ màu nâu hơi vàng hcặc vàng nhạt, có vân xuyên tầm màu trắng hơi vàng và có khe nứt, có nhiều lỗ mạch rải rác Tủy tương đối nhỏ, màu hơi irẳng hoặc nâu hcd vàng, đôi khi có khoang rỗng, không mùi, vị nhạt (Hình 10).

> Đăc điểm bôt thân

Thân cây mộc thông ta sau khi thái phiến mỏng, phơi khô, tán thành bột Rây íấy phần bột mịn, làm tiêu bản theo phưcttig pháp giọt ép, quan sát dưft kính hiển vi ở vật kính 10,40

Đặc điểm bột dược liệu: bột thân cây có màu vàng hcfì nâu, mùi hơi thơm nhẹ, vị nhạt

Hình 11: Bật Mộc diôiỊg ta

Soi dưới kính hiển vi có các đặc điểm (Hình 11):

- Sợi (1)

Mảnh mạch (2, 6, 7)(‘^

Tế bào cứng có thành dày và khoang hẹp (5)

Tinh thể calci oxalat hình cầu gai (10)

2.2.2 Nghiên cứu về hóa học

2.2.2.1 Định tính sơ bộ cắc nhóm chất trong dược liệu (thân)

> Đinh tính Aỉcaỉoid

Lấy 5g bột dược liệu thô cho vào bình nón dung tích 200- 250ml, thấm

ẩm được liệu bằng dung dịch NH4OH 6N, trộn thấm đểu, đậy kín, để yên 30 phút Sau đó để khô tự nhiên Thêm vào bình nón 50 ml Cloroform, lắc 5- 10 phút, để yên Ih Gạn lọc qua giấy lọc không gấp nếp thu được dịch Qiloroform

đến phản ứng acid, lắc 2- 3 phút, sau đó để yên cho đến khi 2 lớp trong suốt Gạn phần acid để làm phản ứng

Q io vào 4 ống nghiệm, mỗi ống Iml dịch chiết Thêm vào từng ống:Ống 1 : 2 - 3 giọt thuốc thử Mayer

Ông 2 : 2 - 3 giọt thuốc thử Dragendorff

Ống 3 : 2 - 3 giọt thuốc thử Bouchardat

Ống 4: 2- 3 giọt acid picric 1%

Kết quả:

Ống 1 : có tủa trắng (phản ứng dưcfng tính)

Ống 3: có tủa màu nâu đỏ (phản ứng dưcfng tính)

ô n g 4: có tủa màu vàng (phản ứng dưcmg tính)

N hận x é t qua kết quả trên có thể sơ bộ kết luận trong dược liệu có alcaloid

^ Đinh tính sỉycosìd tim

Lấy lOg dược liệu khô đã tán nhỏ, cho vào bình nón dung tích 250ml, thêm lOOml nước cất, ngâm ở nhiệt độ phòng 24h Gạn dịch vào cốc có mò, thêm vào dịch gạn 5 ml đung dịch chì acetat 30%, khuấy đều, để lắng, tiếp tục thêm dđ chì acetat đến khi không còn tủa nữa, để ỉắng, gạn, lọc lấy dịch trong Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn 125ml ơ iiế t glycosyđ tim bằng 15 ml chloroform (chia làm 3 lần, mỗi lần 3 ml) Gạn lớp Qoroform vào cốc có mỏ khô, dịch gạn phải trong suốt, nếu còn lẫn nước phải lọc qua bông Chia đều dịch vào bốn ống nghiệm nhỏ, bốc hod trên nồi cách thủy đến khô, cắn còn lại tiến hành phản ứng:

Phản ứng Liberman

Cho vào ống nghiệm chứa cắn trên Iml anhydrid acetic, lắc đều đến khi tan hết cán Nghiêng thành ống nghiệm 45®, cho thêm đồng lượng acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm để dịch lỏng trong ống nghiệm phân thành

Kết quả: đd thử không chuyển màu (Phản ứng âm tính)

Phản ứng Keỉỉer - Kiỉiani

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn thử 2ml Ethanol 90^ lắc đều cho cắn được hòa tan hết Thêm vài giọt dd sắt (III) clorid 5% pha ưong acid acetic

Lắc đều, nghiêng ống nghiệm 45®

Kết quả: ở mặt tiếp xúc giữa hai chất lỏng không có vòng màu tím đỏ,

lắc nhẹ ống nghiệm lớp chất lỏng phía trên không có màu xanh (Phản ứng âm tính)

Nhận xét: qua kết quả trên có thể sơ bộ kết luận trong dược liệu không

Cho vào ống nghiêm Iml dịch chiết, thêm 1 giọt FeClj

Kết quả: không thấy xuất hiện màu xanh đen (Phản ứng âm tính)

N h ậ n xét qua các phản ứng trên có thể sơ bộ kết luận trong dược liệu

không có fiavonoid

> Đinh tính Anthrasỉycosid

- Phàn ứng Borntrager

Lấy 2g bột dược liệu cho vào bình nón lOOml, thêm 15 ml H2SO4 10% Đun cách thủy 15 phút, lọc, chuyển dịch lọc vào bình gạn, lắc với 5- 7ml ether ethylic trong 1- 2 phút, để yên cho phân thành 2 lớp, loại phần nước, cho vào phần ether ethylic 5ml NaOH 10%, lắc, thấy lớp ether ethylic có màu vàng nhạt, lófp kiềm không màu (Phẩn ứng âm tính).

Vi thăng hoa

Cho vào nút chai nhôm một ít bột dược liệu, đun nhẹ để bay hơi hết nước Đậy một phiến kính trên có đặt miếng bông tẩm nước lạnh Lấy phiến kính ra, đem soi kính hiển vi

Kết quả: không thấy tinh thể hình kim màu vàng (Phản ứng âm tính)

ĩỉh ậ n x é t từ các phản ứng trên có thể sơ bộ kết luận trong dược liệu

không có anthraglycosid

> Đinh tính Coumarin

Lấy 5g bột dược liệu cho vào cốc, thêm 50ml cồn 90° Đun cách thủy

10 phút, lọc nóng qua giấy lọc Dịch lọc thu được đùng làm các phản ứng:

Phản ứng mở- đóng vòng lacton

Cho vào hai ống nghiệm, mỗi ống Im l dịch chiết, ống thứ nhất thêm 0,5

ml NaOH 10%, ống thứ hai để nguyên Đun cả hai ống đến sồi, để nguội và quan sát thấy: ống 1 vàng đục, ống 2 dịch trong

Thêm vào cả hai ống nghiệm 2 ml nước, ỉắc thấy ống 1 trong, ống 2đục

Acid hóa ống 1 bằng HCl đặc thấy ống 1 đục như ống 2 (Phản ứng dương tính)

Vi thăng hoa

Cho vào nắp chai nhôm ít bột dược liệu, đun nhẹ, để bay hơi hết nước Đậy phiến kính ưên để 1 miếng bông ướt Lấy phiến kính ra, nhỏ 1 giọt KI 10% Soi dưới kính hiển vi

Kết quả: không có tinh thể màu nâu (Phản ứng âm tính)

Phản ứng Diazo

Lấy Iml dịch cồn, thêm vào 2ml NaOH 10%, đun cách thủy đến sôi, để nguội, thêm vài giọt thuốc thử Diazo vừa mới pha

Kết quả: màu chuyển từ vàng sang đỏ (Phanả ứng dương tính)

N hận xét: qua nhũng kết quả trên có thể sơ bộ kết luận trong dược liệu

có Coumarin

> Định tính saponin

Hiện tượng tạo bọt

Cho vào ống nghiệm to một ít bột dược liệu, thêm khoảng 5 ml nước cất, lắc mạnh trong 5 phút, để yên trong 15 phút, thấy có cột bọt bền vững

Sơ bộ phân biệt 2 loại saponin triterpenoid và saponin steroid

Cho vào ống nghiệm to 2,0 g bột dược liệu, thêm 20 ml cồn 90®, đun sôi, lọc Dịch lọc tiến hành làm thí nghiệm như bảng 2.1:

Bảng 2.1 Thí nghiệm phân biệt saponin triterpenoid và saponin steroid

Lấy Im l dịch chiết MeOH , cô cách thủy đến cắn, hòa tan trong 1 ml

nghiệm, thấy xuất hiện một vòng/n â u ^ ^ iữa bề mặt phân cách 2 chất lỏng (Phản ứng dưcfng tính)

Phản ứng Hirchshon

Cho vào ống nghiêm 1 ml dịch chiết MeOH, thêm 1 ml aciđ Tricloacetic, đun cách thủy khoảng 5 phút, thấy dung dịch chuyển từ vàng sang đỏ (Phản ứng dưcíng tính).

ỉ^hận xét: qua các kết quả trên có thể sơ bộ kết luận trong dược ỉiệu có

Phản ứng với dung dịch geỉaũn 1%

không thấy xuất hiện tủa bông trắng (Phản ứng âm tính)

Nhận xét: từ các kết quả trên có thể sơ bộ kết luân trong dược liệu

không có tanin

> Đinh tính acid hữu cơ

Lấy 1 g bột dược ỉiệu, thêm 5 ml nước cất, đun sôi trong vài phút, lọc Lấy 3 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm nhỏ, thêm vài tinh thể Na2C03 thấy có

một ít bọt khí nhỏ nổi lên

N hận xét: có thể sơ bộ kết luận trong được liệu có acid hữu cơ.

^ Đinh tính đườne khử tư do

Lấy khoảng 2 g dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 5 ml cồn 90“,

đun cách thủy 10 phút, lọc lấy dịch ƠĨO 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm

0,5 ml thuốc thử Fehling A và 0,5 ml thuốc thử Fehling B Đun cách thủy vài phút thấy có tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm

N hận xét: có thé sơ bộ kết luận trong dược liệu có đường khử.

> Đỉnh tính chất béo, caroten steroỉ

Định tính chất béo

Lấy 5 g được liệu vào bình nón có nút mài, thêm ether dầu hỏa ngập bội dược liệu, đun cách thủy 10 phút, lọc Nhỏ 1 giọt dịch lọc lên miếng giấy lọc,

hơ nóng cho bay hết hơi dung môi Không thấy để lại vết mờ trên giấy lọc

N hận xét: có thể sơ bộ kết luận dược liệu không có chất béo.

Định tính caroten

Cho vào ống nghiệm to 2 ml dịch chiết ether đầu hỏa, bốc hơi trên nồi

cách thủy đến cắn, thêm vài giọt H2SO4 đặc vào cắn, thấy dịch lỏng không có

N hận xét: có thể sơ bộ kết luận trong dược liệu có sterol.

Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân mộc thông ta được trình bày tóm tắt theo bảng 2.2

Bảng 2.2 Kết quả định tính các nhóm chất trong thân cây mộc thông