Nâng cao hiệu suất các chủng nấm men có khả năng chuyển hóa chủng nấm men có khả năng chuyển hóa xylose thành xylitol

Có nhiều phương pháp để sản xuất xylitol trong đó con đường tổng hợp hóa học được tìm ra đầu tiên và hiện đang là phương pháp chủ yếu trên thế giới.. để phục vụ cho sản xuất xylitol cũng

BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC D ư ợ c HÀ NỘI

NGUYỄN HUY THANH

NÂNG CAO HIỆU SUẤT CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ KHẢ

NĂNG CHUYỂN HOÁ XYLOSE THÀNH XYLITOL

( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 1999-2004)

Giáo viên hướng dẫn:

TS Vũ Nguyên Thành

CN Nguyễn Lệ Phi

Nơi thực hiện:

Bộ môn vi sinh Viện công nghiệp thực phẩm

Bộ môn vi sinh trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI, THÁNG 5-2004

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

-TS Vũ Nguyễn Thành -CN Nguyễn Lệ Phi

Là thầy cô giáo đã tận tịnh hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn CN Dương Anh Tuấn, CN

Đỗ Ngọc Quang đã cho tôi những kinh nghiệm quý báu trong

công việc

Tôi xỉn cảm ơn cán bộ - Bộ môn vi sinh Viện Công nghiệp Thực phẩm, thầy cô giáo - Bộ môn vi sinh Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành

đê tài

Cuối cùng cho tôi gửi lòi cảm ơn đến người thân, bạn bè đã

động viên và giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Hà Nội, tháng 5 năm 2004

Sinh viên Nguyễn Huy Thanh

MỤC LỤC

Đặt vấn đề 2

Phần I Tổng q uan 3

1.1 Một vài nét về Hemicellulose và xylose 3

1.1.1 Hemicellulose 3

1.1.2 Xylose 4

1.2 Xylitol 5

12.1 Nguồn gốc, công thức cấu tạo 5

1.2.2 Trạng thái tự nhiên 6

1 1.3 Tầm quan trọng của Xylitol 6

1 1.4 Tình hình sản xuất xylitol 10

Phần n Thực nghiệm và kết quả 16

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cún 16

2.1.1 Nguyên vật liệu 16

2.1.2 Máy móc- thiết b ị 16

2.1.3 Một số môi trường sử dụng trong nghiên cứu 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Phương pháp quan sát hình thái tế bào 18

2.2.2 Phương pháp định lượng xylitol 18

2.2.3 Phương pháp lựa chọn chủng giống 20

2.2.5 Phương pháp chọn chủng chịu được nồng độ dịch thuỷ phân cao 21

2.2.6 Phương pháp nghiên cứu các điều kiện lên men 21

2.3 Kết quả và bàn luận 22

2.3.1 Quan sát hình thái tế bào 22

2.3.2 Định lượng xylitol bằng phương pháp enzyme 24

2.3.3 Tìm một số điều kiện len men xylitol thích hợp 30

Phần m Kết luận và đề xuất 37

Tài liệu tham khảo 38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, cùng với sự phát triển đời sống vật chất và xã hội của con người

là sự gia tăng của một số bệnh như: bệnh đái tháo đường, bệnh tim mạch và một số bệnh ở trẻ em .Vì vậy việc tìm kiếm những hoạt chất để phục vụ và nâng cao sức khoẻ cho con người đã và đang đươc đầu tư và nghiên cứu với quy mô lớn Vào năm 1891, nhà hoá học người Đức Emil Fisher là người đầu tiên phát hiện ra xylitol trong các loại hoa quả Ban đầu công dụng chủ yếu của xylitol chỉ là một chất làm ngọt thay thế đường Sau chiến tranh thế giới lần thứ II xylitol đã được biết đến như một hoạt chất dùng để cải thiện rối loạn glucid ở bệnh nhân đái tháo đường, làm giảm tỷ lệ sâu răng ở trẻ

em, làm chất ngọt, bổ dưỡng được đưa vào trong các sản phẩm công nghiệp thực phẩm và đồ uống

Có nhiều phương pháp để sản xuất xylitol trong đó con đường tổng hợp hóa học được tìm ra đầu tiên và hiện đang là phương pháp chủ yếu trên thế giới Nhưng quá trình sản xuất này bao gồm nhiều công đoạn phức tạp và giá thành sản phẩm cao Trong hoàn cảnh đó, việc tìm ra một phương pháp sản xuất mới đơn giản và hiệu quả là cần thiết Phương pháp lên men xylitol

từ xylose nhờ vi sinh vật hiện đang là một phương pháp hứa hẹn nhiều tiềm năng và thu hút được nhiều sự quan tâm nghiên cứu

Với mục đích tận dụng các nguồn nguyên liệu là chất thải nông nghiệp (rơm, bã mía, lõi ngô ) để phục vụ cho sản xuất xylitol cũng như góp phần tìm ra một phương pháp sản xuất xylitol bằng con đường lên men nhờ vi

sinh vật, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nâng cao hiệu suất các

chủng nấm men có khả năng chuyến hóa xylose thành xylitol" với các

mục tiêu:

> Phát triển phương pháp xác định xylitol dựa trên phản ứng enzyme

> Tìm các điều kiện lên men thích hợp để sản xuất xylitol

Bảngl: Hàm lượng hemicellulose trong một số nguyên liệu điển hình

Bảng 2: Thành phần Hemicellulose trong sinh khối (% trọng lượng)

Thân ngô khô 1 ,0 - 1 , 2 19-23 1 ,8 -3 ,4 0 ,3 -0 ,7cỏkhô (Switchgass) 1 ,0 - 1 , 1 2 3 -2 5 3 ,0 -3 ,4 0 , 1 - 0 , 8

Sericea lespedeza 1 ,6 - 1 , 8 1 0 -1 4 1 , 3 -1 , 6 2,0 - 2,5Cây gỗ ngắn ngày 0 , 7 -1 , 2 1 3 -1 7 0 , 4 -1 , 1 0 ,9 - 1,3

Chú thích : NR - K lông được công bố

Hemicellulose là nguồn nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm Việc tận dụng nguồn nguyên liệu này sẽ mang đến những ý nghĩa về mặt kinh tế và môi trường

1.1.2 Xylose

Xylose là một đường pentose có công thức như sau:

yHO

H— ý — OH HO— c — H

H — j: — OH CH2OH

Xylose có thể biến đổi thành xylitol bằng hai cách:

+ Khử hoá nhờ xũc tác raney nikel

+ Trong tế bào vi sinh vật xylose bị khử thành xylitol nhờ enzyme xylose reductase với coenzyme là NADH hoặc NADPH

1.2 Xylitol

1 2.1 Nguồn gốc, công thức cấu tạo

Xylitol là một polyol có 5 carbon Công thức cấu tạo như sau:

c h 2 o h H— ỳ — OH

HO— c — H

„ Ĩ

H — c — OH CH2OH

Công thức phân tử: C5H]205

Khối lượng phân tử: 152,15

một số hoa quả va rau xanh (Bảng 3), và được tạo ra trong cơ thể với hàm lượng thấp

Bảng 3: Hàm lượng của xylitol trong một số loại rau quả

Rau, quả Xylitol (mg/lOOg sản phẩm khô)

1.2.2 Trạng thái tự nhiên và tính chất hóa lý

**** Trạng thái tự nhiên

Xylitol là chất bột kết tinh, màu trắng, không mùi, có vị ngọt như đường Thu nhiệt khi tan trong nước nên tạo cảm giác mát cho người sử dụng

♦♦♦ Tính chất lý hóa [1 1 ]

Tính chất lý hoá của Xylitol được nêu trong Bảng 4:

Bảng 4 :Một số tính chất lý hoá của xylitol

1 2.3 Tầm quan trọng của Xylitol

♦> Trong công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm

Xylitol là một đường polyol gồm năm carbon có vị ngọt Giá trị calo mà xylitol cung cấp thấp hơn so với saccharose nhưng tương đương với glucose Không những thế, xylitol tạo cảm giác mát lạnh trong miệng do có đặc điểm thu nhiệt khi hoà tan Đặc tính này làm xylitol rất hấp dẫn trong một số sản phẩm thực phẩm, đặc biêt là đồ uống Vì vậy xylitol được sử dụng để thay thế glucose và saccharose trong các loại kẹo, socola, đồ uống mát, đồ uống

bổ dưỡng, thuốc ho, kem đánh răng, kẹo cao su Đặc biệt, xylitol có hàm lượng năng lượng thấp nên được dùng để thay thế các loài đường khác trong chế độ dinh dưỡng của các bệnh nhân mắc bệnh béo phì.

Trong ngành mỹ phẩm, xylitol có tính chất giữ ẩm cho da mà không làm hại đến da, vì vậy xylitol được đưa vào kem dưỡng da, kem chống nắng, sữa rửa mặt

♦♦* Trong ngành Y- Dược

Trong những năm gần đây xylitol ngày càng được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong ngành Y, Dược Hiện nay, xylitol đã được sử dụng trong điều trị một số bệnh như: bệnh sâu răng, bệnh đái tháo đường, bệnh viêm tai giữa ở trẻ em

Xy/ữo/ với bênh sâu răng và các bênh rang miêns:

Xylitol có tác dụng trực tiếp lên các vi khuẩn gây sâu răng, chủ yếu là

Streptococcus mutants Thông thường các vi khuẩn này sử dụng lượng

đường tiết ra trong quá trình tiêu hoá thức ăn tại miệng của cơ thể Chúng sử dụng lượng đường này để sinh trưởng, phát triển Quá trình đồng hoá các nguồn đường của chúng tạo ra các sản phẩm phụ là acid (đặc biệt là acid lactic) , các acid này được tiết ra môi trường ngoại bào Chính môi trường

acid này lại tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của s mutants và của

các vi sinh vật gây sâu răng khác Đồng thời, các acid được tiết ra đó chính

là yếu tố gây sâu răng, acid tạo phức chelate hoà tan canxi và phospho cấu thành men răng, phá huỷ các liên kết phân tử giữa chúng và tạo các lỗ hổng

ăn sâu vào trong răng Thông thường, chúng ta sử dụng florua để khắc phục hiện tượng này, ĩlorua có tác dụng trong việc bảo vệ răng chống acid nhưng lại không có tác dụng đến bản chất của quá trình gây sâu răng, đó là vi khuẩn

Xylitol tác dụng đến quá trình này theo cách khác với ílorua, xylitol làm thay đổi khu hệ vi sinh vật trong miệng theo hướng duy trì các vi sinh vật

không có hại cho răng s mutants hấp thụ xylitol vào trong tế bào nhưng nó

lại không có khả năng đồng hoá xylitol do đó chúng không lấy được năng lượng cùng với việc pH của môi trường không thay đổi theo hướng acid hoá nên các sinh vật này không có khả năng phân chia Ngược lại các vi sinh vật không có hại đối với răng lại gặp điều kiện thuận lợi của chúng và bắt đầu phân chia Mặc tổng số dù vi sinh vật trong miệng không thay đổi nhưng khu hệ vi sinh vật của miệng đã thay đổi theo hướng không có hại cho răng

và theo cách đó xylitol giúp ngăn ngừa sâu răng Những ngiên cứu gần đây thấy rằng xylitol có thể làm giảm tỷ lệ mắc bệnh sâu răng tới 83% Trong khi đó saccharose không có tác dụng này

Từ những kết quả nghiên cứu trên, người ta dần dần đưa xylitol vào các sản phẩm để phòng chống sâu răng và các bệnh răng miệng như: kem đánh răng, kẹo cao su, nước súc miệng

Xvỉitoỉ với bênh đái tháo đường [41

Xylitol là một chất trung gian bình thường trong chuyển hóa glucid và được chuyển hóa trong cơ thể qua con đường pentose và acid uronic Lượng xylitol từ bên ngoài đưa vào cơ thể được chuyển hóa không phụ thuộc vào insulin và không làm tăng lượng đường trong máu, xylitol có hiệu lực cung cấp năng lượng cho cơ thể kể cả trong trường hợp rối loạn chuyển hóa glucid Ngoài ra, xylitol còn có tác dụng chống gây ceton huyết rất mạnh

Do đó xylitol được dùng làm chất làm ngọt trong thực phẩm cho những người mắc bệnh đái tháo đường Không những thế, xylitol còn cải thiện các rối loạn chuyển hóa glucid và cung cấp năng lượng cho cơ thể

Một số chế phẩm có chứa xylitol dùng cho bệnh đái tháo đường:

Klinit (Nhật Bản)

Dung dịch tiêm truyền xylitol đóng:

- Lọ 500 ml dung dịch 5 và 10 %

- Ống tiêm 20 ml dung dịch 10, 20 và 50 %.

Xvlitol với bênh viêm tai gịữa ở_trẻ_ em 151

Một tác dụng khác của xylitol là giúp ngăn ngừa và điều trị bệnh viêm tai giữa ở trẻ em Có tới một nửa số trẻ sơ sinh năm thứ nhất mắc phải bệnh này và có tới 30% trẻ hơn ba tuổi mắc bệnh ít nhất một lần Trẻ mắc bệnh này thường có triệu chứng cáu kỉnh, biếng ăn, sốt, hôn mê Một số triệu chứng ít gặp hơn đó là hiện tượng trớ, nôn và đi ngoài Di chứng nguy hiểm

là trẻ có thể bị giảm và mất thính lực Streptococcus pneumonie là vi sinh vật chủ yếu gây nên bệnh này sau đó là phải kể đến Hemophilus influenza Các

vi sinh vật ít phổ biến khác bao gồm Escheria coli, Klebsiella pneumoniae,

Pseudomonas aeruginossa và Proteus Thông thường trẻ mắc bệnh người ta

thường sử dụng các kháng sinh để điều trị như ampicillin, amoxicillin, erythromycin , hỗn hợp trimethoprim và sulfamethoxazole (Bactrim ).Khi sử dụng các kháng sinh này ngoài việc gây tác dụng phụ vơi trẻ em còn có nguy cơ gặp phải vấn đế kháng kháng sinh do một số vi khuẩn có khả năng sinh enzyme [3 -lactamase

Các nghiên cứu gần đây ở trẻ nhỏ cho thấy xylitol có vai trò trong việc

ngăn ngừa và điều trị bệnh viêm tai giữa ở trẻ em Xylitol có tác dụng ức chế

sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh, điển hình là Streptococcus

pneumonie Việc sử dụng xylitol không chỉ tránh được vấn đề kháng kháng

sinh mà còn tránh được các phản ứng phụ thường gặp phải khi sử dụng

kháng sinh như phát ban, tiêu chảy, tưa lưỡi do Candida.

Ngoài những ứng dụng điển hình trên, một sổ tài liệu còn cho rằng

xylitol có vai trò trong việc ngăn chặn sự phát triển của Helicobacter pylori,

tác nhân gây bệnh viêm loét dạ dày Xylitol cũng được chứng minh là có vai trò ngăn ngừa bệnh loãng xương ở người già và phụ nữ thông qua quá trình tăng cường hấp thu calci ở thành ruột.

1.1.4 Tình hình sản xuất xylitol

♦♦♦ Sản xuất xylitol bằng phương pháp tổng hợp hóa học [8 ], [9], [11], [12] Sản xuất xylitol bằng phương pháp tổng hợp hóa học dựa trên sự thủy phân D- xylose hoặc hemicellulose bằng acid sulíuric trong nồi hấp áp lực ở nhiệt độ 135°c, trong 2 - 5 giờ Xylitol và các carbon hydrat khác được khửhóa thành polyol trong đó khoảng 60% là xylitol Ngoài xylitol còn có các loại đường khác như: arabinose, mannose, galactose, glucose

Sơ đồ sản xuất của xylitol:

Vc h 2 o h

c- X y lito l

Trong patent cấp năm 1976 (US Patent # 3980719) Sud-Chemie AG, Munich, CHLB Đức đã miêu tả quá trình tổng hợp xylitol bằng cách thuỷ

phân hemicellulose tạo dung dịch chứa xylose và acid acetic Dung dịch sau

đó được xử lý bằng chất hấp phụ để loại bỏ protein, tannin và pectin Dung dịch sau khi làm sạch được cô đặc trong chân không tạo syrup quánh và hầu như không chứa nước nên cũng loại bỏ được toàn bộ acid acetic Syrup sau

đó được hoà trong nước và pH giữ ở mức 6 ,5-7,5 Dung dịch chứa xylose được hydro hoá bằng cách sử dụng xúc tác raney nickel Xylitol tạo thành được thu hồi sau phản ứng

Một patent khác (US patent #4008285), đăng ký từ Phần Lan năm 1997 miêu tả phương pháp sản xuất xylitol ở quy mô thương mại bằng cách thuỷ phân các nguyên liệu chứa nhiều hemicellulose bằng acid Quá trình này khác với quá trình trên trong bước xử lý dịch thuỷ phân Các muối vô cơ, các chất bẩn hữu cơ và các chất mầu loại bằng bằng nhựa trao đổi ion và than hoạt tính Dung dịch sau đó được chạy bằng kỹ thuật sắc ký trao đổi ion thu được các phân đoạn xylose có độ tinh khiết cao Sản phẩm sau đó được hydro hoá với sự có mặt của xúc tác và một lần nữa được tinh khiết bằng sắc

ký trao đổi ion để thu hồi xylitol

Ngoài ra, xylitol còn có thể được sản xuất theo một số cách sau đây:

+ Sản xuất xylitol từ bã mía

Viện nghiên cứu Đường Đài Loan đã nghiên cứu khả năng ứng dụng thương mại quá trình sản xuất xylitol từ bã mía Trong quá trình sản xuất, bã mía được loại bỏ ruột xốp và nghiền nhỏ tới kích thước dưới l,5cm Bã được rửa kỹ để loại bỏ chất khoáng và làm khô tới độ ẩm 1 0 %, hàm lượng tro duới 1 % Acid HC1 được chứng minh là ưu việt hơn acid H2S04 trong thuỷ phân Hỗn hợp bã mía và HC1 được khuấy trong bể khuấy sau đó được chuyển bằng vít nạp tới nồi hấp quay Hỗn hợp được thuỷ phân và gia nhiệt bằng hơi ở 100 - 125°c trong thời gian 40 - 75 phút Bước xử lý này nhằm thuỷ phân hemicellulose trong mẫu thành xylose

Đầu ra của nồi hơi (hỗn hợp acid và bã mía) được thuỷ phân tiếp trên băng sàng Nước nóng (100°C) được phun để rửa bã Dịch rửa được thu hồi bằng khay đáy nhọn đặt dưới băng sàng Dịch chứa 17 - 20% xylose được

sử dụng để hydro hoá thành xylitol Bã sau thuỷ phân được loại nước bằng máy ép vít quay và được sử dụng làm giấy

+ Sản xuất xylitol từ acid xylonic:

Heikkila năm 1999 đã đề xuất ra một phương pháp sản xuất xylitol từ acid xylonic Acid xylonic được khử hóa trong nồi hấp áp lực 3 giờ ở nhiệt

độ 110°c và áp suất 13 kPa với sự có mặt của ruthenium và carbon Thành phần của dịch trước và sau khử hóa được ghi trong bảng 5

Bảng 5 Thành phần của dịch trước và sau khử hóa từ acid xylonic

Thành phần Trước khi khử

(% trên sản phẩm khô)

Sau khi khử (% trên sản phẩm khô)

+Sản xuất xylitol từ acid gluconic:

Acid gluconic có nhiều trong vỏ quả hạnh Acid gluconic được decarboxyl hóa bằng natrihypoclorid trong 45 phút ở 55°c để tạo thành arabinose Arabinose dưới tác dụng của raney nickel sẽ bị khử thành arabitol Arabitol được đồng phân hóa thành xylitol ở pH = 9 và nhiệt độ 170°c Xylitol được tách ra bằng phương pháp sắc ký cột Hiệu suất của quá trình đạt cao nhất là 77%

+ sắc ký tinh chế xylitol.

Dịch thủy phân được cho vào cột sắc ký Sau khi chạy thu được dịch chứa khoảng 34% xylitol Người ta quay vòng dịch sắc kí cho đến khi thu được dịch chứa khoảng 50 đến 75% xylitol và không nhiều hơn 5% xylose Xylitol được kết tinh từ dịch đậm đặc ở nhiệt độ 5 °c trong hơn 2 giờ Người

ta tiếp tục quá trình như trên cho đến khi dịch thủy phân không chứa nhiều hơn 0 ,1 % xylose

♦♦♦ sản xuất xylitol bằng phơngpháp vi sinh [6 ], [7], [11], [13]

Cũng tương tự như phương pháp tổng hợp hóa học, xylitol được sản xuất

từ nguyên liệu là xylose nhờ enzyme D - xylose reductase Trong tế bào vi sinh vật, quá trình chuyển hóa xylose thành xylitol diễn ra theo sơ đồ sau:

Chú thích: XR : D - xylose reductase

Một số sinh vật có chứa enzyme D - xylose reductase nên có thể chuyển xylose thành xylitol như: các loại nấm sợi, một số nấm men:

Candida pelliculosa, c boidinic, c guilliermondii, c tropicalis Ngoài ra,

các chủng Saccharomyces, Debaryomyces, Trichosporon, Cryptococcus,

Kloeckera, Torulopsis, Rhodotorula, Hansenula, Kluyveromyces,

Ambrosiozyma và Torula cũng đang được nghiên cứu để sản xuất xylitol.

Một số loại vi khuẩn cũng có thể sản xuất ra xylitol như: Enterobacter

liquỷaciens, Corynebacterium sp., Mycobacterium smegmatis Con đường

sản xuất xylitol nhờ các vi sinh vật đang được nghiên cứu để thay thế phương pháp tổng hợp hóa học vì nó tận dụng được các nguồn nguyên liệu

rẻ tiền và không qua nhiều công đoạn

NADP+ xylitol

1f NADH+H D-xylulose

Các yếu tốảnh hưởng đến sinh tổng ỈÌƠD xỵUtol

+ Ảnh hưởng của xylose và glucose đến sự chuyển hóa xylose thành xylitol

^ Ảnh hưởng của nồng độ xylose:

Năm 1992, Horitsu đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ D - xylose

trong môi trường nuôi cấy Candida tropicalis Nồng độ D - xylose biến đổi

từ 100 g/1 đến 300 g/1 và nhận thấy rằng để đạt xylitol cao nhất thì nồng độ D- xylitol là 172 g/1

Năm 1998, Rose cũng nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ D - xylose

ban đầu đến sự sinh tổng hợp xylitol của chủng Candida guilliermondii FTI

20037 thì nhận thấy rằng nồng độ D - xylose tốt nhất là 15 - 60 g/1.'

^ Ảnh hưởng của glucose:

Glucose không có ảnh hưởng rõ ràng đến sinh tổng hợp xylitol

Ảnh hưởng của các điều kiện khác đến sản xuất xylitol:

Thí nghiệm được nghiên cứu trên chủng Candida guilliermondii FTI

20037 Người ta thấy rằng: tuổi của giống, số lượng tế bào đưa vào nuôi cấy

và thành phần của dịch thủy phân ảnh hưởng đáng kể đến sự sản xuất xylitol

Số lượng tế bào đưa vào nuôi cấy và tuổi của giống lần lượt dao động trong khoảng 0,1 g/1 - 6,0 g/1 và 16 - 48h Để đạt được xylitol cao nhất thì

số lượng tế bào đưa vào nuôi cấy là 3 g/1 và độ tuổi của giống là 24h Khi

đó, năng suất mà xylitol đạt được là 0,74 g/g

Tinh chếxỵỊữol từ dịch ịên men

Để tinh chế xylitol từ dịch lên men có các phương pháp sau: dùng nhựa trao đổi ion, dùng than hoạt tính và phương pháp sắc ký cột

^ Phương pháp dùng nhựa trao đổi ion

Xylitol có ái lực cao với nhựa trao đổi cation và có ái lực kém với nhựa trao đổi anion Người ta dùng cả nhựa trao đổi cation và anion để tinh chế

xylitol từ dịch lên men Nhưng do xylitol bị dính chặt vào bề mặt của nhựa trao đổi ion nên còn khoảng 40-55% xylitol không được tinh chế.

^ Phương pháp dùng than hoạt tính

Dịch lên men được xử lý bằng than hoạt tính với nồng độ 200g/l ở 80°c,

pH = 6 và trong thời gian 60 phút Màu sắc, protein có trong dịch thủy phân

và khoảng 20% xylitol sẽ bị than hoạt tính hấp phụ Dịch sau khi xử lý được lọc và kết tinh xylitol Tuy nhiên, do dịch nhớt nên khả năng kết tinh của xylitol rất khó Phải để trong 6 tuần ở -15°c thì xylitol mới có thể kết tinh

^ Phương pháp dùng sắc ký cột : Đã được đề cập trong phần sản xuất hoá học

Nhìn chung quá trình sản xuất xylitol ở thời điểm hiện tại vẫn chủ yếu dựa vào phương pháp hoá học với sự tham gia của hai quá trình đó là thuỷ phân xylan (là một thành phần của hemicellulose) sau đó hydro hoá xylose bằng phản ứng sử dụng xúc tác là Raney-nickel Điều kiện của phản ứng hydro hoá đòi hỏi nhiệt độ và áp suất cao Xu thế hiện nay là thay thế phản ứng này bằng xúc tác sinh học Quá trình này đã được thử nghiệm thành

công ở Hàn Quốc, Trung Quốc, Mỹ, Phần Lan Rất nhiều loại nấm men có

thể khử xylose thành xylitol với hiệu xuất khác nhau Chủng nấm men có khả năng chuyển hoá cao nhất hiện nay có thể đạt hiệu suất chuyển hoá là 80% và ở nồng độ 200g/l Phương pháp chuyển hoá xylose thành xylitol nhờ

vi sinh vật cũng là phương pháp được nghiên cứu trong đề tài này

Phần II THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Nguyên vật liệu

Hóa chất:

Xylitol (Đức); NAD (Nhật); Xylose (Đức); INT (2-(4-iodophenyl)-3-(4- nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium chloride - Nhật); Amoni sulíat (Trung Quốc); PMS (Phenazine methosulphat - Nhật); Cao nấm men (Difco); Acetonitril (Merk)

Các chủng nấm men được lấy từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghiệp Thực phẩm

Máy đo quang phổ

Máy so mầu microtiter plate

Máy HPLC

Tomy SS-325 (Nhật Bản)Sanyo (Nhật Bản)

Sanyo (Nhật Bản)Sanyo (Nhật Bản)Bioblock Scientiíic (Pháp)Shimadzu u v - 1650 PC (Nhật Bản)Anthos 2010

Thermo Finnigan (Italia)

Kính hiển vi Nikon Eclipse E600 (Nhật Bản)

2.1.3 Một sô môi trường sử dụng trong nghiên cứu

Môi trường nhân giống cấp 1 ( MT 1 ị:

2.2 Phương pháp nghiên cứu [1], [2], [3]

2.2.1 Phương pháp quan sát hình thái tê bào

Nấm men được nuôi cấy trên môi trường malt - glucose 2 °Bx trong vòng 7 ngày sau đó làm tiêu bản và quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính x40 và xioo Ảnh tế bào được chụp bằng phần mềm video capture thông qua camera kỹ thuật số sau đó được xử lý bằng phần mềm photoshop

2.2.2 Phương pháp định lượng xylitol.

Xylitol được định lượng bằng phương pháp enzyme và phương pháp sắc ký