Nhìn chung viêm là một phản ứng bảo vệ của cơ thể, giúp cho cơ thể chống lại các tác nhân gây viêm.. Bên cạnh các tác dụng chống viêm đa dạng và hiệu quả, chúng vẫn chứa đựng những yếu t
Trang 1LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH VIÊM
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ ##4)
Người hướng dẫn : ThS Lê Thị Diễm Hồng
GS TS Nguyễn Xuân Thắng
Nơi thực hiện : Bộ môn Hoá Sinh
Trường đại học Dược Hà Nội
Thời gian thực hiện : 2/2004 - 5/2004
Trang 2M 9 ể j r
,<‘/m nẢiêm ếê mơn Ịtâố ámÁ ýuỀỜnp %€Ù ềwc %€&te 3fàb nơi nà ýAỈP 9ĩê ịyhi
Qbiễm yÍM nỹ ỹ iầ n ỹ niên /hì m ơn /lũ á ámÁ <ànỹ tồn í/lê các iầ ầ ỹ Cũ áứ) đ ã
aừíýt đĩi lơi ầortỹ buốt <ỊÚa hình ầoc ừìỷi nà n^iên cứa /ĩ/ioa ầoc.
'J J ỉìi x in ỹ ử i ũti, cẩm ổn đến các, tíià/ỷ, cơ /ù ỈỈPỖỈP, ỔĨP, Ị$ỈP cm tỹ tồn
th ê các cán /mì cơnỹ n /m n m ên &Ơ m ân ầơ á tin h A ư ĩĩnỹ đ a i Aoc dbiứtc
■nổi ' Aí/tữn<f Hỹưừì lu/m <jiúỷ) đõ ità lao điều ẳtơn ừ& 'HÂM cềm ừii ầmiy (ỊMÍ
Aì/nÁ tím ’< ■ u y/liêm
k/m cãrtty x in ểđụ tỏ lồ n ỹ cở/m ổn đến cÂa m e, rtÁữnỹ nyi ti m ân, ifà ếan /m đ ã luơn {tíìt iỹ niên c ổ IM nà ỹiúýi, đ ĩỉ ừìi {/t <my yư ú faZi iÁ /loe fu/< tíầ hồn tíừ ii v/ì luân năn fs f n<ỷ/ùêý>
Trang 4MỤC LỤC
Đặt vấn đ ề 1
Chương 1: Tổng quan 3
1.1 Quá trình viêm 3
1.2 Enzym được sử dụng làm thuốc chống viêm 6
1.3 Dược liệu chống viêm 7
Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 11
2.1 Nguyên liệu 11
2.2 Súc vật thí nghiệm 12
2.3 Thiết bị, dụng cụ 12
2.4 Hoá chất thí nghiệm 12
2.5 Phương pháp nghiên cứu 13
Chương 3: Thực nghiệm và kết quả 17
3.1 Ảnh hưởng của dịch chiết ílavonoid núc nác toàn phần đối với hoạt tính của a-chymotrypsin 17
3.2 Kết quả thử tác dụng chống viêm cấp của ílavonoid núc nác toàn phần trên in vivo 21
Chương 4: Bàn luận 25
Kết luận và đề xuất 28
Tài liệu tham khảo 30
Trang 5ĐẶT VÂN ĐỂ
Viêm là quá trình bệnh lý rất phổ biến, vì có vô số yếu tố cụ thể có thể gây viêm và bất cứ cơ quan nào cũng có thể bị viêm Nhìn chung viêm là một phản ứng bảo vệ của cơ thể, giúp cho cơ thể chống lại các tác nhân gây viêm Tuy nhiên, nếu viêm nặng và kéo dài sẽ dẫn đến rối loạn chức năng của các cơ quan,
bộ phận của cơ thể, gây nhiều ảnh hưởng xấu, có khi gây nguy hiểm đến tính mạng của người bệnh Vì vậy việc phát huy tác dụng bảo vệ và ngăn ngừa các yếu tố có hại của viêm là rất cần thiết và quan trọng
Việc nghiên cứu và ứng dụng các thuốc chống viêm có cấu trúc steroid, thuốc chống viêm phi steroid nhằm hạn chế quá trình viêm đã đáp ứng được yêu cầu đó Các thuốc này đa phần có nguồn gốc hoá dược, đã được sử dụng nhiều năm nay Bên cạnh các tác dụng chống viêm đa dạng và hiệu quả, chúng vẫn chứa đựng những yếu tố bất lợi đối với cơ thể như gây suy giảm miễn dịch, xốp xương, kích thích đường tiêu hoá, ảnh hưởng tới quá trình đông máu, tạo m áu
Do vậy, xu hướng sử dụng các thuốc chống viêm chứa enzym như protease nhằm khắc phục những nhược điểm của các thuốc chống viêm có nguồn gốc hóa dược ngày càng phổ biến
Bên cạnh đó, các hoạt chất chiết xuất từ dược liệu cũng có tiềm năng to lớn với việc nghiên cứu thuốc chống viêm Nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng chống viêm của dược liệu cho thấy nhóm hoạt chất xuất hiện nhiều trong các dược liệu có khả năng chống viêm là các ílavonoid Cây núc nác là dược liệu có thành phần chính là hỗn hợp các ílavonoid với hàm lượng khá cao Trên cơ sở đó
chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu tác dụng chống viêm của cây núc nác ( Oroxỵlum
indicum Vent Bignoniaceae) và thử tác dụng chống viêm khi kết hợp núc nác với
Trang 6Đê tài được thực hiện nhằm một sô mục tiêu sau:
1 Bước đầu tìm hiểu tác dụng núc nác đối với a-chymotrypsin trên in vitro.
2 Tìm hiểu tác dụng chống viêm của núc nác khi kết hợp với a-chymotrypsin
trên in vivo.
2
Trang 71.1.2 Nguyên nhân gây viêm
1.1.2.1 Nguyên nhân bên ngoài.
- Cơ học: từ sây sát nhẹ đến chấn thương nặng gây phá huỷ tế bào và mô, làm phóng thích ra các chất gây viêm nội sinh
-V ậ t lý: nhiệt độ quá cao hay quá thấp làm thoái hoá protid tế bào gây tổn thương enzym; tia xạ (UV, tia X) do tạo ra các gốc oxy tự do gây phá huỷ một enzym oxy hóa, còn gây tổn thương AND
- Hoá học: các acid, kiềm mạnh, các chất hoá học khác (thuốc trừ sâu, các độc
tố ) gây huỷ hoại tế bào hoặc phong bế các hệ enzym chủ yếu
- Sinh học: là nguyên nhân phổ biến nhất, gồm virut, vi khuẩn, ký sinh trùng, nấm [2, 202]
1.1.2.2 Nguyên nhân bên trong.
- Hoại tử tổ chức, xuất huyết, tắc mạch, rối loạn thần kinh dinh dưỡng
- Hình thành phức hợp miễn dịch, sự thay đổi nội sinh chất giao bào [8, 6-8]
1.1.3 Phân loại viêm.
❖ Theo nguyên nhân: Viêm nhiễm trùng và viêm vô trùng
❖ Theo vị trí: Viêm nông, viêm sâu, viêm ngoài, viêm trong
♦♦♦ Theo thành phần dịch rỉ viêm: Viêm thanh dịch, viêm tơ huyết, viêm mủ
Trang 8❖ Theo tính chất:
- Viêm đặc hiệu: Thường là viêm mãn tính do phản ứng kháng nguyên kháng thể
- Viêm không đặc hiệu: Thường là viêm cấp [2, 203]
1.1.4 Các phản ứng xẩy ra trong quá trình viêm.
1.1.4.1 Các phản ứng chính tại ổ viêm.
♦ Phản ứng tuần hoàn:
Phản ứng này xẩy ra rất sớm sau tổn thương và phát triển ở mức độ khác nhau,
phụ thuộc vào sự trầm trọng của tổn thương và theo mọt trình tự như sau:
> Co mạch chớp nhoáng xuất hiện ở các tiểu động mạch, xẩy ra ngay khi có tác nhân kích thích, do hưng phấn thần kinh co mạch và các cơ trơn bị kích thích
> Sau khi co mạch chớp nhoáng ở các tiểu động mạch là hiện tượng giãn mạch Đầu tiên là giãn các tiểu động mạch rồi mao mạch và các tiểu tĩnh mạch dẫn đến tăng tuần hoàn tại chỗ nhằm cung cấp năng lượng cho hoạt động tại ổ viêm và đưa nhiều bạch cầu tới ổ viêm làm nhiệm vụ bảo vệ [8, 53]
> Phản ứng tuần hoàn quá mạnh trên dẫn đến các rối loạn nghiêm trọng như giãn mạch cực độ, dòng máu chảy chậm dần, gây tăng tính thấm thành mạch làm thoát dịch rỉ viêm giàu protein vào các mô quanh huyết quản [2, 204]
♦ Phản ứng tê bào:
Phản ứng tế bào là phản ứng cơ bản nhất phản ánh khả năng bảo vệ của cơ thểchống viêm, và trong các phản ứng này bạch cầu đóng vai trò quan trọng nhất.Hoạt động của bạch cầu tại ổ viêm gồm hai hiện tượng xẩy ra kế tiếp nhau
> Bạch cầu thoát mạch
Khi dòng bạch cầu chảy chậm, bạch cầu tách ra khỏi dòng trục lăn chậm theo vách mao mạch và tiểu tĩnh mạch rồi dừng lại ở một điểm gọi là vách
4
Trang 9tụ hạch cầu Dưới tác dụng của chất trung gian hoá học như: interleukin- l(EL-l), yếu tố giãn mạch protacyclin, yếu tố giãn cơ nguồn gốc nội mô, bạch cầu tăng khả năng bám dính vào các tế bào nội mô [15, 351-354]
> Thực bào và mất hạt:
Thực bào là hiện tượng bạch cầu nuốt và tiêu huỷ đối tượng thực bào.Tại ổ viêm, các bạch cầu được hoạt hoá và khi được hoạt hoá, khả năng thực bào của chúng tăng lên rõ rệt [8, 68-69]
1.1.5 Các chất trung gian hoá học tham gia vào quá trình viêm.
Sau tác động ban đầu của viêm, nhiều chất trung gian hoá học được giải phóng ra, duy trì và khuyếch đại phản ứng viêm Những chất này có nguồn gốc huyết tương, tê bào và tổn thương mô Các chất trung gian hoá học gồm có:
• Các amin hoạt mạch
Histamin được giải phóng ra do sự mất hạt của các dưỡng bào khi đáp ứng vớicác kích thích: Tổn thương vật lý (chấn thương, bỏng), phản ứng miễn dịchgắn kháng thể với dưỡng bào, các đoạn của bổ thể dược gọi là các độc tố gây phản vệ, các protein giải phóng histamin xuất phát từ các bạch cầu, các cytocin Histamin gây giãn các tiểu động mạch và tăng tính thấm thành mạch của các tiểu tĩnh mạch Serotonin giải phóng từ tiểu cầu bị kích thích khi kết dính với sợi tạo keo, phức hợp kháng nguyên-kháng thể, yếu tố hoạt hoá tiểu cầu Nồng độ serotonin tăng trong máu khi viêm Serotonin có tác động tương
tự như histamin [8, 82-83]
• Các protease của huyết tương
Hệ thống bổ thể, trong đó đặc biệt có C5a và C3a làm tăng tính thấm thành mạch và gây giãn mạch, chủ yếu do giải phóng histamin bởi các dưỡng bào [8, 84-85]
Trang 101.1.6 Các thuốc chống viêm.
1.1.6.1 Thuốc chống viêm steroid.
Là nhóm thuốc có cấu trúc giống với các hormon của tuyến vỏ thượng thận Cơ chế chống viêm là do ức chế enzym phospholipase A2 do đó ức chế sự tạo thành acid arachidonic từ màng phospholipid, dẫn tới ức chế tổng hợp prostaglandin Bầng thực nghiệm, đã xác định được rằng các thuốc chống viêm steroid làm ổn định màng lysosom nên ức chế sự giải phóng các enzym lysosom trong đó có phospholipase A2 [10, 632] Tuy nhiên trong sử dụng lâm sàng nhóm thuốc này bộc lộ khá nhiều tác dụng phụ như ức chế miễn dịch, xốp xương, hội chứng suy thượng thận khi ngừng thuốc, bệnh về cơ, giảm phát triển chiều cao ở trẻ em
1.1.6.2 Thuốc chông viêm phi steroid.
Thuốc có tác dụng chống viêm nhưng không có cấu trúc steroid, ngoài ra còn có tác dụng giảm đau ngoại vi và hạ nhiệt Cơ chế chống viêm của nhóm thuốc này là ức chế enzym cycloxygenase (COX), do đó làm giảm quá trình tổng hợp các prostaglandin và thromboxan từ acid arachiđonic Gần đây, người ta nhận thấy cycloxygenase có các isoenzym (COX1 và COX2) Sự tổng hợp cácprostaglandin là do vai trò của COX2 ở trạng thái sinh lý, COX1 tham gia vào tổng hợp prostaglandin E2 và prostaglandin I2 có vai trò sinh lý trong bảo vệ thận
và dạ dày Các thuốc chống viêm phi steroid không chọn lọc, ức chế cả COX1 gây ra các tác dụng phụ như loét dạ dày, suy thận, chảy máu kéo dài [14, 617- 655]
1.2 ENZYM ĐƯỢC s ử DỤNG LÀM THUỐC CHỐNG VIÊM
1.2.1 a-chymotrypsin.
a-chymotrypsin là enzym thuỷ phân protein, thu dược do hoạt hoá chymotrypsinogen chiết xuất từ tuỵ bò Hoạt tính của thuốc không ít hơn 5
6
Trang 11microkatal trong lmg a-chymotypsin ở dạng bột kết tinh hay bột vô định hình màu trắng hay trắng vàng, tan trong nước [12, 336].
ở dung dịch, a-chymotrypsin có hoạt tính mạnh nhất ở pH=8 Độ ổn định
tốt nhất ở pH=3 và hoạt tính bị ức chế có thể phục hồi được [16, 1689]
a-chymotrypsin có trọng lượng 21.600, cấu tạo bởi 3 chuỗi peptid, sô lượng acid amin là 241
Tác dụng thuỷ phân của a-chymotrypsin phụ thuộc vào trạng thái cơ chất, a-chymotrypsin chỉ thuỷ phân những protein đã bị biến tính mà không tác động tới các protein mà vẫn giữ được cấu trúc không gian từ bậc 2 trở lên [6, 15]
1.2.2 Tác dụng của a-chymotrypsin.
a-chymotrypsin thuỷ phân các kinin, được giải phóng bởi kininogen thông qua yếu tố Hageman a-chymotrypsin kìm hãm tiết chế leucotrien từ bạch cầu đơn nhân trung tính, a-chymotrypsin thuỷ phân íibrin, quá trình này được tăng cường bởi tác dụng của heparin, dextran sulíat trong dung dịch NaCl 0,1M
Ion Ca2+ đóng vai trò là chất ổn định cấu trúc và tăng cường hoạt tính thuỷ phân protein este hoá của a-chymotrypsin
a-chymotrypsin có tác dụng của một enzym phân giải protein, a- chymotrypsin được dùng uống, tiêm bắp hoặc dùng tại chỗ để chống viêm và điều trị một số chấn thương, với tính chất là một endopeptidase tuyến tuỵ Ngoài
ra còn được chỉ định trong các trường hợp chống phù nề, kháng viêm trong chấn thương, viêm nhiễm, dùng tại chỗ hoặc tiêm bắp trong các khoa: nội, tai mũi họng, phụ, ngoại, da liễu [10, 138]
1.3 DƯỢC LIỆU CHỐNG VIÊM.
1.3.1 Vài nét về dược liệu chỏng viêm.
Trang 12Y học cổ truyền phương đông chẩn đoán và điều trị bệnh dựa theo thuyết
âm dương ngũ hành Theo quan điểm này thì bệnh tật là sự mất cân bằng giữa hai mặt đối lập trong cơ thể Mục đích của việc điều trị bệnh là lập lại cân bằng vốn
Flavonoid là nhóm hoạt chất thường gặp trong thực vật, gặp trong nhiều loại cây cỏ khác nhau Cho đến nay khoảng 3000 ílavonoid đã được xác định cấu trúc, phần lớn ílavonoid có mầu vàng hoặc xanh [9, 1]
Các ílavonoid có tác dụng sinh học được gọi là bioflavonoid Tác dụng sinh học của bioílavonoid rất đa dạng, trên nhiều cơ quan và hệ cơ quan khác nhau với hiệu quả rõ rệt Một số tác dụng của ílavonoid có thể kể đến là:
❖ Flavonoid có khả năng điều hoà làm giảm tính thấm thành mạch, chống lại hiện tượng thoát mạch ra khỏi lòng mạch
❖ Flavonoid có khả năng tiêu diệt gốc tự do Giả thiết cho rằng khi vào cơ thể ílavonoid tạo thành các gốc tự do bền vững ít hoạt động hơn các gốc tự do hình thành trong quá trình viêm, ung thư từ đó, các ílavonoid thể hiện chức năng chống viêm và bảo vệ tế bào gan Khả năng chống oxy hoá của ílavonoid chống lại quá trình huỷ hoại cấu trúc và chức năng gan, ngăn cản
Trang 13sự hoại tử mô và sự phân huỷ phospholipid màng tế bào, loại trừ các tác nhân gây độc hại, giảm quá trình peroxy màng tế bào.
❖ Flavonoid hoạt hoá enzym histamin và có khả năng ức chế giải phóng histamin, ức chê sự hình thành trung gian phản ứng dị ứng
❖ Với quá trình viêm, tlavonoid ức chế cyclogenase và 5-lypoxygenase, hạn chế quá trình tổng hợp các chất trung gian gây viêm như prostaglandin và leucotrien
❖ Nhiều ílavonoid làm giảm nhiễm trùng ở liều cao, làm mất hoạt tính virut nhờ cơ chế chống sao chép [9, 17]
1.3.2 Cây núc nác.
- Tên khoa học: Oroxylum inđicum(L.),Vent, họ chùm ớt Bignoniaceae
- Các tên khác: So đo thuyền, lên may, mộc hồ diệp, ung ca, nam hoàng bá, hoàng bá nam, thêu tầng chỉ
- Bộ phận dùng: Cây núc nác cho hai vị thuốc
+ Vỏ núc nác (Cortex Oroxyli): v ỏ thân phơi hay sấy khô của cây núc nác
+ Hạt núc nác (Semen Oroxyli): Hạt phơi hay sấy khô của cây núc nác
- Thành phần hoá học:
Vỏ núc nác chứa một lượng nhỏ alcaloid, tanin Thành phần chủ yếu là một số dẫn xuất ílavonoid ở dạng tự do hay heteroid Các ílavonoid thường gặplà:
+ Oroxylin A: Công thức phân tử là C6H120 5, cấu trúc 5-7 dihydroxy 6- methoxy ílavon, trọng lượng phân tử 284
Tinh thể màu vàng chanh, độ chảy 230-232°C Tan trong cồn, aceton, benzen nóng, kiềm, ether, acid acetic đặc
+ Baicain hay noroxylin: Công thức phân tử 5-6-7 trihydroxyílavon Trọng lượng phân tử là 270,2
Trang 14Tinh thể màu vàng, hình lăng trụ, độ chảy 254-255 °c Tan trong cồn, ether, aceton, acid acetic đặc, kiềm loãng, ít tan trong cloroíbrm và nitro benzen.+ Crycin: Công thức phân tử 5-7 dihydroxylavon, trọng lượng phân tử 254,23.
Tinh thể màu vàng nhạt, chứa trong vỏ rễ, độ chảy 276°c Không tan trong nước, tan trong dung dịch kiềm, ít tan trong cồn, cloroííom và ether, có thể thăng hoa
+ Tetuin: Là Baicain kết hợp với glucose ở vị trí số 6
Tinh thể màu vàng nhạt, độ chảy 112°c
- Công dụng và liều dùng:
Vỏ núc nác chữa đi ngoài, kiết lị, chữa dị ứng
Liều dùng: Ngày 10-15 vỏ khô dưới dạng nước sắc thuốc [7, 726-728]
10
Trang 15CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1.2 Điều chế ílavonoid toàn phần.
Vỏ thân núc nác được chặt nhỏ, phơi khô ngoài nắng nhẹ, sấy khô 70-
80°c cho thật khô rồi xay nhỏ Bột dược liệu được chiết bằng cồn theo phương pháp ngấm kiệt Tập trung dịch chiết rồi thu hồi còn 1/10 thể tích Tiếp tục đun cách thuỷ, cho từ từ nước cất đun sôi làm loãng độ cồn Khi dung dịch trở nên vẩn đục, lấy ra để chỗ lạnh, ílavonoid sẽ tủa xuống Lọc qua phễu lọc hút chân không, rửa tủa hai lần bằng nước cất, sấy khô tủa ở 70°c thu được bột vàng nâu Tinh chế bằng cách hoà tan trong cồn (với lượng tối thiểu) đun cách thuỷ 15 phút cho tan hoàn toàn Tẩy mầu bằng than hoạt, đun cách thuỷ 15 phút, lọc nóng loại than hoạt trên phễu hút chân không, dịch lọc thu dược đun sôi cách thuỷ rồi làm loãng độ cồn bằng nước cất đun sôi cho đến khi xuất hiện tủa vàng, để qua đêm ở nhiệt độ lạnh Aavonoid sẽ tủa xuống Lọc tủa bằng phễu hút chân không, rửa tủa hai lần bằng nước cất, sấy khô ở 90-100°C cho đến khô, ta thu được bột mầu vàng đem thử tác dụng sinh học [4, 18]
Trang 162.1.3 a-chymotrypsin.
a-chymotrypsin dạng ống tiêm, mỗi ống chứa 5mg a-chymotrypsin/5ml- biệt dược hãng Leurquin, Italia
2.1.4 Cơ chất casein.
Casein hộp lOOg hoá chất của Hungary
Cân chính xác l,2g casein cho vào cốc có mỏ, thêm dung dịch đệm phosphat 0,03M (pH=7,5) vừa đủ lOOml Đun sôi cách thuỷ trong thời gian 60 phút, vừa đun vừa khuấy, lọc qua gạc, pH cuối cùng của dung dịch bằng 7,2
Chú ý: Dung dịch casein chỉ pha đủ dùng trong 1-2 ngày và phải được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi dùng phải lắc đều.
2.2 SÚC VẬT THÍ NGHIỆM
Chuột cống trắng đực và cái, nuôi trong cùng điều kiện, cân nặng từ 100- 130g Do trại chăn nuôi súc vật thí nghiệm Học viện 103 cung cấp
2.3 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ:
- Máy đo quang trung quốc 752
- Máy ly tâm, tủ lạnh, tủ sấy, thiết bị điều nhiệt
- Dụng cụ đo thể tích chân chuột
- Cân phân tích và cân kỹ thuật Sartorius
Trang 17♦ Tiến hành:
Pha loãng a-chymotrypsin trong dung dịch NaCl 0,9% đến độ pha loãng thích hợp
Tiến hành định lượng enzym theo bảng sau:
Bảng 2.1: T hể tích các thuốc thử đem dùng đ ể xác định hoạt tính enzym.
Lắc đều các ống, ủ ấm ở nhiệt độ 40°c trong thời gian theo dõi thích hợp Sau thời gian ủ cần thiết, thêm vào ống thử 2,5ml dung dịch acid tricloacetic 10%, lắc đều, để ở nhiệt độ phòng 10 phút Ly tâm các ống lấy tủa Thêm vào
