thử nghiệm hiệu quả phòng và trị bệnh viêm gan do virus của kháng thể igy trên vịt con

3.3 Bố trí thí nghiệm thử nghiệm hiệu quả phòng bệnh viêm gan vịt type I bằng kháng thể IgY 27 3.4 Bố trí thí nghiệm thử nghiệm hiệu quả trị bệnh viêm gan vịt type I của kháng thể IgY 28

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THỂ IgY TRÊN VỊT CON

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

PGS.TS HỒ THỊ VIỆT THU NGUYỄN THANH XUÂN

MSSV: 3103002

LỚP: THÚ Y – K36

Cần Thơ, 12/2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

đến tháng 12/2014

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014 Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014

Duyệt bộ môn Duyệt giáo viên hướng dẫn

PGS.TS Hồ Thị Việt Thu

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014

Duyệt khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Cha, mẹ và gia đình đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt quá trình học tập cũng như luận văn này

Cô Hồ Thị Việt Thu đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn

Anh Lê Trần Hoài Khanh, anh Phạm Công Uẩn đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt luận văn

Thầy Lê Hoàng Sĩ, cố vấn học tập, đã tận tình chỉ dạy và giúp đở tôi trong suốt những năm học vừa qua

Quý thầy cô trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là thầy cô bộ môn Thú y, khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng đã tận tình giảng dạy và truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức quý báu trong suốt những năm học vừa qua

Các bạn sinh viên lớp Thú y khóa 36 đã luôn gắn bó, cùng tôi vượt qua khó khăn để hoàn thành khóa học này

Xin gửi lời chúc đến quý thầy cô, người thân và bạn bè được dồi dào sức khỏe, thành công trong công tác và hạnh phúc trong cuộc sống

Nguyễn Thanh Xuân

MỤC LỤC

Trang tựa i

Trang duyệt ii

LỜI CẢM ƠN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix

TÓM LƯỢC x

Chương 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 2: CƠ SỞ LÝ LUẬN 2

2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh viêm gan do virus ở vịt trên thế giới và trong nước 2

2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 2

2.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 2

2.2 Căn bệnh học 4

2.2.1 Phân loại 4

2.2.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc của virus viêm gan vịt 4

2.2.3 Đặc tính nuôi cấy của virus 5

2.2.4 Sức đề kháng của virus viêm gan vịt 6

2.2.5 Đặc tính kháng nguyên của virus viêm gan vịt 7

2.3 Truyền nhiễm học 7

2.3.1 Loài mắc bệnh 7

2.3.2 Đường lây lan 7

2.4 Cơ chế sinh bệnh 8

2.5 Triệu chứng và bệnh tích 8

2.5.1 Triệu chứng 8

2.5.2 Bệnh tích 9

2.6 Chẩn đoán bệnh viêm gan vịt do virus 11

2.6.1 Chẩn đoán lâm sàng và bệnh tích 11

2.6.2 Chẩn đoán virus học 11

2.6.3 Chẩn đoán huyết thanh học 11

2.6.4 Chẩn đoán phân biệt 12

2.7 Phòng bệnh 12

2.7.1 Phòng bệnh bằng vệ sinh thú y 12

2.7.2 Phòng bằng vaccine 12

2.8 Trị bệnh 13

2.9 Miễn dịch chống virus viêm gan vịt 14

2.9.1 Miễn dịch thụ động 14

2.9.2 Miễn dịch chủ động 14

2.10 Vai trò của kháng thể 15

2.10.1 Liên kết với kháng nguyên 15

2.10.2 Hoạt hóa tế bào miễn dịch 15

2.11 Kháng thể IgY 17

2.11.1 Sơ lược về IgY 17

2.11.2 Ưu điểm của IgY 18

2.11.3 Đặc tính của IgY 18

2.11.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu IgY 20

Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 21

3.1 Nội dung thí nghiệm 21

3.2 Phương tiện thí nghiệm 21

3.2.1 Thời gian và địa điểm 21

3.2.2 Đối tượng thí nghiệm 21

3.2.3 Dụng cụ, hóa chất và sinh phẩm 21

3.3 Phương pháp thí nghiệm 22

3.3.1 Chuẩn độ và xác định liều gây chết 50% vịt con thí nghiệm của DHV type I 22

3.3.2 Thí nghiệm xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt

(PD50: protection dose 50%) của kháng thể IgY

bằng phản ứng trung hòa trên phôi vịt 12 ngày tuổi 24

3.3.3 Thử nghiệm hiệu quả phòng bệnh viêm gan vịt do virus type I bằng kháng thể IgY 26

3.3.4 Thử nghiệm hiệu quả trị bệnh viêm gan vịt do virus type I của kháng thể IgY 27

3.3.5 Thống kê và xử lý số liệu 28

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Kết quả xác định liều gây chết 50% trên vịt thí nghiệm 29

4.2 Kết quả xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt 12 ngày tuổi của kháng thể IgY 30

4.3 Kết quả xác định hiệu quả phòng bệnh viêm gan vịt type I của kháng thể IgY 31

4.3.1 So sánh hiệu quả phòng bệnh viêm gan vịt type I của kháng thể IgY theo đường cấp 31

4.3.2 So sánh hiệu quả phòng bệnh viêm gan vịt type I của kháng thể IgY theo liều cấp 32

4.4 Kết quả xác định hiệu quả trị bệnh viêm gan vịt type I của kháng thể IgY 33

4.4.1 So sánh hiệu quả trị bệnh viêm gan vịt type I của kháng thể IgY theo thời điểm cấp 33

4.4.2 So sánh hiệu quả trị bệnh viêm gan vịt type I của kháng thể IgY theo liều cấp 34

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Đề nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

Phụ chương 41

3.3 Bố trí thí nghiệm thử nghiệm hiệu quả phòng bệnh viêm

gan vịt type I bằng kháng thể IgY

27

3.4 Bố trí thí nghiệm thử nghiệm hiệu quả trị bệnh viêm gan vịt

type I của kháng thể IgY

28

4.2 Số phôi vịt chết qua các hiệu giá kháng thể trung hòa 30

4.3 Tỷ lệ bảo hộ vịt khi sử dụng kháng thể IgY để phòng bệnh

viêm gan vịt theo đường cấp

31

4.4 Tỷ lệ bảo hộ vịt khi sử dụng kháng thể IgY để phòng bệnh

viêm gan vịt theo liều cấp

32

4.5 Tỷ lệ bảo hộ vịt khi sử dụng kháng thể IgY để trị bệnh viêm

gan vịt theo thời điểm cấp

33

4.6 Tỷ lệ bảo hộ vịt khi sử dụng kháng thể IgY để trị bệnh viêm

gan vịt theo liều cấp

34

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DHAV-3 Duck hepatitis virus type III Virus viêm gan vịt type III ELISA Enzyme-Linked

ImmunoSorbent Assay

Phản ứng miễn dịch gắn men

Fab Fragment antigen binding Phần nhận biết kháng nguyên

Fc Fragment crystal Tiểu phần có khả năng kết tinh SPF Specific – pathogen – free Không có mầm bệnh đặc hiệu OIE Office international epizooties Tổ chức thú y thế giới

LD50 Lethal dose 50% Liều gây chết 50%

PD50 Protection dose 50% Liều bảo hộ 50%

IgY Egg yolk immunoglobulin Globulin miễn dịch từ lòng đỏ

trứng IgG Immunoglobulin G Globulin miễn dịch lớp G IgA Immunoglobulin A Globulin miễn dịch lớp A IgM Immunoglobulin M Globulin miễn dịch lớp M IgE Immunoglobulin E Globulin miễn dịch lớp E IgD Immunoglobulin D Globulin miễn dịch lớp D RNA Ribonucleic acid

CPE Cytopathic effect Bệnh tích tế bào

PBS Phosphat buffered saline Dung dịch đệm phosphate

TÓM LƢỢC

Đề tài “Thử nghiệm hiệu quả phòng và trị bệnh viêm gan do virus của kháng thể IgY trên vịt con” được tiến hành từ tháng 06/2014 đến tháng

12/2014, nhằm khảo sát khả năng phòng và trị bệnh viêm gan vịt do virus type

I của kháng thể lòng đỏ trứng IgY trên vịt con Qua thời gian nghiên cứu chúng tôi ghi nhận được kết quả như sau:

Kháng thể IgY có tác dụng trong việc phòng bệnh viêm gan vịt type I Tỷ

lệ bảo hộ vịt khi sử dụng kháng thể với liều 10 PD50 là 80%, 30 PD50 là 85%

và cao nhất là 95% khi ta sử dụng liều 50 PD50 để phòng bệnh viêm gan vịt type I Tuy nhiên, sự sai khác này không có ý nghĩa thống kê Tỷ lệ bảo hộ vịt của kháng thể K.T.V (Hanvet) là 70% Tỷ lệ bảo hộ vịt khi ta sử dụng liều 50

PD50 là 95%, cao hơn so với sản phẩm K.T.V (Hanvet) và sự sai khác này là

có ý nghĩa thống kê Kháng thể được tiêm vào cơ ức cho tỷ lệ bảo hộ cao hơn (93,3%) khi ta cấp kháng thể bằng đường uống (80%) Tuy nhiên, không có sự sai khác về tỷ lệ bảo hộ vịt khi được cấp kháng thể qua những đường khác nhau

Kháng thể IgY có hiệu quả trong việc trị bệnh viêm gan vịt do virus type

I Tỷ lệ bảo hộ vịt khi sử dụng liều 10 PD50 là 80%, tỷ lệ bảo hộ đạt 90% khi ta cấp kháng thể IgY với liều 50 PD50 Tỷ lệ bảo hộ thấp nhất là 60% khi ta sử dụng kháng thể K.T.V (Hanvet) Sự sai khác giữa các nghiệm thức sử dụng liều kháng thể 10 PD50, 30 PD50 và 50 PD50 là không có ý nghĩa thống kê Tỷ

lệ bảo hộ vịt khi sử dụng kháng thể IgY với liều 50 PD50 là cao hơn so với kháng thể K.T.V (Hanvet) và sự sai khác này là có ý nghĩa thống kê Tác dụng trị bệnh của kháng thể theo thời điểm cấp (sau 6h, sau 12h) đều đạt 86,6% Như vậy, kháng thể IgY có tác dụng cao trong việc phòng và trị bệnh viêm gan vịt do virus Hiệu quả phòng bệnh viêm gan vịt type I của kháng thể IgY đạt 95% khi ta sử dụng liều 50 PD50 và 93,3% khi ta cấp kháng thể qua đường tiêm bắp Hiệu quả trị bệnh viêm gan vịt type I của kháng thể IgY đạt 90% khi sử dụng với liều 50 PD50 và 86,6% khi ta cấp kháng thể sau 6h và 12h công cường độc bằng chủng virus viêm gan vịt type I subtype 3 Hiệu quả phòng và trị bệnh của kháng thể IgY cao hơn của sản phẩm K.T.V (Hanvet)

Tỷ lệ bảo hộ của kháng thể K.T.V trong phòng bệnh là 70% và trong việc trị bệnh là 60%

Chương 1: ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, chăn nuôi gia cầm đang có những bước tiến mạnh mẽ đặc biệt

là ngành chăn nuôi vịt Hiện Việt Nam có đàn thủy cầm lớn thứ hai thế giới với trên 80 triệu con Trong đó, đồng bằng sông Hồng chiếm 26,68%, đồng bằng sông Cửu Long chiếm 32,19% và khu vục Tây Bắc chiếm 2,17% trong tổng đàn thủy cầm của Việt Nam Hằng năm, số vịt tăng bình quân 7% với sản lượng thịt hơi trên 280.000 tấn, sản lượng trứng đạt 2 tỷ quả Chăn nuôi gia cầm được chủ trương phát triển do ưu điểm là thu hồi vốn nhanh, hiệu quả kinh tế cao góp phần đẩy nhanh công cuộc đổi mới đất nước trong thời kỳ hiện nay

Tuy nhiên, dịch bệnh đang là mối nguy hại lớn trên đàn vịt, ngày càng có nhiều chủng virus khác nhau với khả năng biến dị cao đã và đang ảnh hưởng trực tiếp lên đàn vịt Trong đó có bệnh viêm gan vịt do virus, được xem là căn bệnh vô cùng nguy hiểm đe doạ đàn vịt gây thiệt hại nghiêm trọng cho người chăn nuôi Theo Hồ Thị Việt Thu (2012), bệnh viêm gan do virus ở vịt là bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây lan nhanh do nhiều type virus khác nhau là virus viêm gan vịt type I, type II, type III Bệnh xảy ra chủ yếu ở vịt con từ mới nở đến 6 tuần tuổi với các bệnh tích đặc trưng như gan sưng, nhạt màu và xuất huyết

Do tính chất nguy hiểm của bệnh, nhiều sản phẩm kháng thể và vaccine

đã được nghiên cứu sản xuất và đưa vào ứng dụng thực tế trong phòng và trị bệnh viêm gan vịt Tuy nhiên, dịch bệnh vẫn xảy ra và là mối lo ngại cho người chăn nuôi vịt cũng như các chuyên gia trong ngành Trước tình hình đó, phòng thí nghiệm virus học, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ đã nghiên cứu và tạo ra kháng thể kháng virus viêm gan vịt bằng phương pháp tách chiết kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà sau khi

đã gây miễn dịch trên gà mẹ bằng chủng virus viêm gan vịt type I subtype 3

Để khảo sát khả năng phòng và trị bệnh của chế phẩm, chúng tôi tiến hành đề

tài: “Thử nghiệm hiệu quả phòng và trị bệnh viêm gan do virus của kháng thể IgY trên vịt con” với các mục tiêu sau:

- Xác định được khả năng phòng bệnh viêm gan vịt do virus của kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà

- Xác định được khả năng trị bệnh viêm gan vịt do virus của kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà

Chương 2: CƠ SỞ LÝ LUẬN

2.1 Tình hình nghiên cứu bệnh viêm gan do virus ở vịt trên thế giới và trong nước

2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 1945, lần đầu tiên một ổ dịch bệnh trên vịt con với bệnh tích gan sưng to, xuất huyết được ghi nhận bởi Levine và Hofstad Sau đó, Levine và Fabricant (1949) đã nghiên cứu kỹ về nguyên nhân và tính chất bệnh trên vịt ở đảo Long Island và New York, Mỹ Đến năm 1950, Levine và Fabricant đã chính thức phân lập được virus viêm gan vịt type I bằng phương pháp nuôi cấy trên phôi gà

Năm 1965 tại Norflok, Anh, việc tiêm phòng bằng vaccine viêm gan vịt type I đã được thực hiện, tuy nhiên bệnh viêm gan trên vịt vẫn xãy ra Sau đó, bằng phương pháp bảo hộ chéo trên vịt con Asplin đã phân lập được virus viêm gan vịt type II (Asplin, 1965)

Năm 1969 tại Long Island, Mỹ, bệnh viêm gan vịt đã xảy ra trên đàn vịt

đã được tiêm phòng bằng vaccine viêm gan vịt type I Bệnh xảy ra nhẹ hơn, với tỷ lệ chết trên vịt con hiếm khi hơn 30% (Toth, 1969) Năm 1979, Haider

và Calnek đã phân lập được chủng virus gây bệnh và đặt tên là virus viêm gan vịt type III

Kim et al (2007), đã phát hiện một hệ gen mới và genotype mới khi

phân tích và so sánh với các chủng virus viêm gan vịt type I đã có

Kim et al (2009), nghiên cứu chế tạo vaccine nhược độc viêm gan vịt từ

chủng virus viêm gan vịt thuộc genotype 3 phân lập được bằng cách tiêm truyền 100 lần qua phôi gà SPF Kết quả cho thấy, virus viêm gan vịt nhược độc an toàn cho vịt 1 ngày tuổi và có hiệu quả bảo hộ tốt

2.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Bệnh viêm gan vịt đã được ghi nhận tại Việt Nam vào năm 1978 nhưng vẫn chưa phân lập được mầm bệnh (Trần Minh Châu và Lê Thu Hồng, 1985) Năm 1983, Trần Minh Châu và cộng sự đã phân lập được virus viêm gan vịt cường độc tại một ổ dịch ở Phú Xuyên–Hà Tây Kết quả phân lập trên phôi vịt 12 ngày tuổi được ghi nhận như sau: virus gây chết phôi 100%, thời gian chết phôi từ 48-96 giờ, phôi có bệnh tích xuất huyết Qua nuôi cấy trên phôi

gà, chủng virus này yếu đi, không gây bệnh cho vịt con (Trần Minh Châu và cộng sự, 1985) Cũng trong năm 1985, Trần Minh Châu và cộng sự đã xây

dựng qui trình sản xuất vaccine từ 3 chủng virus vaccine viêm gan vịt nhược độc: TN (Hunggari), E52 (Pháp) và VN (Việt Nam) Theo tác giả thì cả 3 chủng virus vaccine đều an toàn và có hiệu lực sử dụng khi miễn dịch cho vịt con rồi thử thách với chủng virus cường độc thì bảo hộ được 70%–100% vịt con (Trần Minh Châu và cộng sự, 1989)

Năm 1984, Lê Thanh Hòa và cộng sự đã nghiên cứu đặc tính sinh học của virus vaccine viêm gan vịt nhược độc chủng TN của Asplin và ứng dụng quy trình sản xuất vaccine của Hunggari vào Việt Nam Theo báo cáo của tác giả, vaccine đạt các chỉ tiêu an toàn và có hiệu lực khi sử dụng

Nguyễn Văn Cảnh và cộng sự (2001), đã nghiên cứu về những biến đổi bệnh lý viêm gan vịt do virus nhằm mục đích đưa ra một phương pháp chẩn đoán chính xác bệnh Kết quả được báo cáo như sau: bệnh tích điển hình về đại thể chủ yếu là gan viêm, xuất huyết, hoại tử chiếm tỷ lệ 79,66%-100%, bệnh tích vi thể điển hình ở gan có tế bào viêm dạng đơn nhân, xuất huyết, hoại tử, tăng sinh ống dẫn mật với tỷ lệ là 100%

Nguyễn Đức Lưu và Vũ Như Quán (2002), đã nghiên cứu ứng dụng của kháng thể kháng virus viêm gan vịt để phòng trị bệnh Và Tháng 8 năm 2001 Công ty Han–Vet đã chế tạo được sản phẩm kháng thể viêm gan vịt

Một nghiên cứu về bệnh viêm gan vịt do virus trên các đàn vịt nuôi ở 10 huyện thuộc 4 tỉnh Hà Nội, Hưng Yên, Hà Tây, Bắc Ninh cho biết tỷ lệ vịt chết rất cao 45.23% ở vịt 1-7 ngày tuổi, 34.4% ở vịt 8-21 ngày tuổi, 18.9% ở vịt 22-42 ngày tuổi (Nguyễn Phục Hưng, 2004)

Năm 2007, Bùi Thanh Khiết đã nghiên cứu qui trình sản xuất vaccine viêm gan vịt từ chủng virus vaccine nhược độc DH-EG-2000 và ứng dụng phòng bệnh, can thiệp vào thực tế sản xuất

Đoàn Thị Thanh Hương và cộng sự (2009), nghiên cứu đặc tính phân tử của virus vaccine viêm gan vịt bằng việc khảo sát chuỗi gen kháng nguyên VP1 của virus

Năm 2010, bằng phương pháp giám định phân tử từ một ổ dịch ở Đồng Nai Đoàn Thị Thanh Hương và cộng sự đã phát hiện được virus viêm gan vịt thuộc subtype 3 (DHVA-3) Và đến năm 2011, nhóm tác giả trên đã giãi mã được toàn bộ hệ gen của virus và xác định được vị trí phân loại của virus

2.2 Căn bệnh học

2.2.1 Phân loại

Bệnh viêm gan do virus ở vịt là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do nhiều

loại virus gây ra với nhiều type khác nhau: type I, type II, type III

 Viêm gan type I là RNA virus thuộc họ Piconaviridae, kích thước khoảng 20-40 nm, không ngưng kết hồng cầu

 Type II do Asplin phân lập năm 1965, đó là một astrovirus Virus type II chủ yếu được ghi nhận ở châu Âu

 Type III do Toth phân lập năm 1969, là một picornavirus nhưng không có mối quan hệ với virus viêm gan vịt type I

Cho đến nay, theo tổ chức dịch tễ thế giới OIE (2010), bệnh viêm gan vịt

do virus viêm gan type I xảy ra khắp nơi trên thế giới, còn bệnh viêm gan vịt gây ra bởi virus viêm gan vịt type II chỉ xảy ra ở nước Anh và type III chỉ mới được công bố ở Mỹ

2.2.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc của virus viêm gan vịt

Virus viêm gan vịt có kích thước rất nhỏ, xuyên qua màng lọc Beckefeld

và Seitz (Levine và Fabricant, 1950)

Theo Reuss (1959) dưới kính hiển vi điện tử virus là những hạt tròn, bề mặt xù xì, không có vỏ bọc, kích thước từ 20-40nm, gồm 32 capsomere

Hình 2.1 cấu trúc không gian của Picornavirus

(Nguồn: http.expasy.org/viralzone/all_by_species/33.html)

Hệ gen của virus viêm gan vịt chứa acid ribonucleic (RNA) sợi đơn dương có độ dài khoảng 7600-7700 nucleotide và đuôi poly A gồm 18 nucleotide ở đầu 3’, chứa duy nhất một khung đọc mở ORF ( open reading frame) mã hóa cho một protein chung (polyprotein) Protein này, sau khi tổng

hợp trải qua nhiều lần phân cắt để tạo nên các protein sản phẩm độc lập

(Tseng et al, 2007)

Các protein VP1, VP2 và VP3 nằm ngay trên bề mặt kháng nguyên; còn protein VP4 lặn sâu vào bên trong

2.2.3 Đặc tính nuôi cấy của virus

Virus viêm gan vịt là loại ký sinh nội bào tuyệt đối Để gây bệnh, cần sử dụng huyễn dịch các cơ quan của vịt con chết do viêm gan vịt (gan, phổi, thận…) đã được xử lý bằng kháng sinh Có thể cấy chuyển virus viêm gan vịt trên động vật cảm thụ, trên phôi trứng và trên môi trường tế bào (Trần Thị Lan Hương, 2007)

2.2.3.1 Nuôi cấy trên phôi trứng

Virus có thể nuôi cấy trên nhiều phôi gia cầm

Trên phôi vịt: Tiêm virus viêm gan vịt vào xoang niệu mô của phôi vịt 10-14 ngày tuổi Sau khi gây nhiễm 24-72h, phôi chết với bệnh tích như phôi còi cọc, xuất huyết dưới da đặc biệt là ở vùng đầu, bụng, chân, phôi phù, gan sưng có màu đỏ hoặc hơi vàng, có thể có điểm hoại tử Những phôi chết muộn, nước xoang niệu mô có màu xanh nhạt và có bệnh tích rõ hơn Ở phôi vịt bị nhiễm virus viêm gan thường thấy nước ối có màu xanh và gan xanh-đen, những bệnh tích này ít thấy ở phôi gà (Trần Thị Lan Hương, 2007)

Trên phôi ngỗng: Virus viêm gan vịt cũng có khả năng nhân lên trên phôi ngỗng và gây chết phôi sau khi cấy virus vào xoang niệu mô 2-3 ngày (Nguyễn Đường, 1990)

Trên phôi gà: Tiêm virus viêm gan vịt vào xoang niệu mô của phôi gà

9-10 ngày tuổi Phôi chết có bệnh tích còi cọc, phù phôi, xuất huyết dưới da

2.2.3.2 Nuôi cấy trên môi trường tế bào

Virus viêm gan vịt type I có khả năng nhân lên trên nhiều loại tế bào như

tế bào xơ phôi vịt, tế bào xơ phôi gà, thận phôi vịt, thận phôi gà, gan phôi vịt,

thận phôi ngỗng…

Sau khi gây nhiễm thấy hàm lượng virus tăng dần và sau một vài lần hoặc nhiều lần cấy truyền trên tế bào thì thấy virus hủy hoại tế bào với biểu hiện nhân bị co tròn, nguyên sinh chất đặc lại tạo không bào, tế bào vỡ ra rồi chết Căn cứ vào đó ta có thể đánh giá hiệu giá virus (Lê Thanh Hoà, 2002)

2.2.3.3 Nuôi cấy trên động vật cảm thụ

Virus viêm gan vịt type I phát triển tốt trên vịt con dưới 7 ngày tuổi Sau 2-4 ngày nung bệnh, vịt thể hiện triệu chứng: mệt mỏi nghiêm trọng, nằm một

chổ, đầu ngoẹo ra đằng sau hay về một bên, co giật toàn thân rồi chết

Huyễn dịch bệnh phẩm chứa virus viêm gan vịt được tiêm dưới da, tiêm bắp, cho uống hoặc nhỏ mũi cho vịt Trong vòng 18-48 giờ sau khi gây nhiễm, thường dưới 24 giờ vịt thí nghiệm có biểu hiện triệu chứng và bệnh tích đặc trưng của bệnh Khi mổ khám quan sát bệnh tích đặc trưng ở gan thấy: gan sưng nhũn, dễ bị nát khi ấn nhẹ, trên mặt gan có những điểm xuất huyết, đôi khi có những điểm hoại tử màu trắng xen kẽ Quan sát những biến đổi vi thể trên gan thấy tổ chức gan viêm tụ máu, tăng sinh ống mật, các mạch máu bị sưng, các tế bào gan bị tích mỡ (Trần Thị Lan Hương, 2007)

Virus không có khả năng nhân lên ở các loài động vật khác như thỏ, chuột lang, chuột bạch, chó…

2.2.4 Sức đề kháng của virus viêm gan vịt

Virus viêm gan vịt có sức đề kháng cao, không bị bất hoạt khi xữ lý bằng ether, chloroform Trong điều kiện môi trường khắc nghiệt, virus có khả năng sống sót trong thời gian dài Virus có khả năng tồn tại lâu bên ngoài môi trường Trong rơm lót chuồng, trong thức ăn, nước uống, virus có khả năng tồn tại từ 10 đến 40 ngày Virus tương đối ổn định ở nhiệt độ thấp nhưng bị bất hoạt ở nhiệt độ cao Ở 40

C tồn tại được 2 năm Ở 500C trong 1h không ảnh hưởng đến hoạt lực virus, nhưng phần lớn virus bị vô hoạt ở 560

C trong 30 phút Ở nhiệt độ 370

C, virus viêm gan vịt tồn tại được 21 ngày, khi cho virus tác dụng với dung dịch formalin 0,01% thì virus viêm gan vịt vẫn tồn tại được trong 8h Virus bị vô hoạt hoàn toàn bởi formaldehyde 1% hay NaOH 1% trong 3h, chloramin 3% trong 5h Ở nhiệt độ -200C virus tồn tại được khoảng

2.2.5 Đặc tính kháng nguyên của virus viêm gan vịt

Theo Asplin (1965), tính kháng nguyên của virus luôn thay đổi, virus viêm gan vịt không làm ngưng kết hồng cầu gà, vịt, thỏ, cừu Huyết thanh của vịt

nhiễm virus khỏi bệnh có khả năng trung hòa virus viêm gan vịt

Không có trung hòa chéo giữa virus viêm gan vịt với huyết thanh kháng virus viêm gan của người và chó

2.3 Truyền nhiễm học

2.3.1 Loài mắc bệnh

Theo Nguyễn Xuân Bình (1995), bệnh viêm gan vịt do virus viêm gan vịt type I gây ra chỉ xảy ra trên vịt con, với tỷ lệ mắc bệnh có thể lên đến 100%, tỷ lệ chết tùy theo lứa tuổi: vịt dưới 1 tuần tuổi tỷ lệ chết đến 95%, 1-3 tuần tuổi tỷ lệ chết 50%, đối với vịt 4-5 tuần tuổi tỷ lệ chết không đáng kể Theo OIE (2010), virus viêm gan vịt type I gây bệnh chủ yếu trên vịt con dưới 6 tuần tuổi, nhạy cảm nhất là vịt dưới 3 tuần tuổi Vịt trưởng thành không

có biểu hiện lâm sàng, cũng như giảm sản lượng trứng khi bị nhiễm virus Ngoài ra, virus có thể gây bệnh cho ngan, ngỗng Vịt trưởng thành và các loài gia cầm khác không mắc bệnh Một số loài vịt hoang dã như le le, vịt trời

là những loài vật mang trùng, những loài vật này khi di cư có thể mang virus

đi xa hàng kilomet, chúng bài thải virus theo phân vào nguồn nước và làm lan truyền bệnh

Trong ổ dịch lưu hành, vịt bệnh, vịt khỏi bệnh mang trùng chính là nguyên nhân trực tiếp làm dịch phát sinh Thời gian mang trùng của vịt rất dài, vịt khỏi bệnh và vịt đã nhiễm virus có thể mang virus từ 8-10 tuần, có khi lâu hơn

Trong đàn vịt bệnh, virus viêm gan vịt type I lây lan rất nhanh từ vịt bệnh sang vịt khỏe, tỷ lệ nhiễm có thể lên đến 100% Tuy nhiên theo Asplin (1958), virus không truyền lây qua trứng, vịt con được ấp nở từ những đàn vịt

mẹ nhiễm virus viêm gan vịt type I vẫn phát triển bình thường

Theo Asplin (1961), virus có thể lây lan đến các nơi xa hơn do loài chim hoang dã mang virus viêm gan vịt từ vùng này bay sang vùng khác Ngoài ra, chuột cống nâu cũng có thể là nguồn vật chủ dự trữ virus viêm gan vịt Virus xâm nhập vào cơ thể chuột cống nâu, tồn tại trong cơ thể khoảng 35 ngày, và sau đó được bài thải ra bên ngoài trong khoảng thời gian 18-22 ngày sau khi nhiễm

2.4 Cơ chế sinh bệnh

Virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc đường tiêu hóa, hô hấp hoặc qua vết thương rồi vào máu Theo máu, virus đến các cơ quan nội tạng đặc biệt là gan, đây là cơ quan thích hợp nhất đối với virus Quá trình được biểu hiện qua hai giai đoạn:

Giai đoạn 1: virus gây rối loạn trao đổi chất ở gan, do quá trình trao đổi

mở ở gan đặc biệt là quá trình trao đổi cholesterol bị đình trệ làm cho lượng glycogen trong gan giảm thấp nhưng lượng lipid lại tăng cao Vì thế vịt con thiếu năng lượng dẫn đến sức đề kháng bị giảm sút

Giai đoạn 2: Là giai đoạn virus trực tiếp phá hoại tế bào gan, tế bào nội

mô huyết quản ở gan, gây ra xuất huyết đặc trưng Virus nhân lên trong tế bào gan, nhất là tế bào thuộc hệ võng mạc nội mô như tế bào Kuffer Khi kiểm tra thấy tổ chức gan bị phá hoại, cơ thể không được giải độc làm cho con vật chết

do ngộ độc (Bùi Thanh Khiết, 2007)

2.5 Triệu chứng và bệnh tích

2.5.1 Triệu chứng

Thời gian nung bệnh từ 1-5 ngày, đôi khi kéo dài 8-13 ngày Thời gian nung bệnh phụ thuộc vào độc lực của virus, liều lượng và phương pháp gây bệnh cũng như tình trạng cơ thể

Triệu chứng đầu tiên xuất hiện sau 1-2h mắc bệnh, gây chứng xanh tím niêm mạc, rối loạn vận động, co giật, vịt chỉ ngồi, sau đó nằm la liệt, nghiêng sườn và nằm ngửa, chân thẳng dọc theo thân, đầu quặt ngửa lên lưng hoặc ngoẹo sang bên sườn và vịt con thường chết ở tư thế này Đây là một trong những dấu hiệu đặc trưng của bệnh

Trong trường hợp bệnh kéo dài, có thể do kế phát của vi khuẩn salmonella, vịt bệnh ủ rủ cao độ và chết (Hồ Thị Việt Thu, Nguyễn Đức Hiền, 2012)

Bệnh kéo dài 2-3 ngày và có thể kéo dài hơn Khi đã xuất hiện triệu chứng thì vịt bệnh ít khi khỏi và phần lớn là bị chết Những con ốm không có

triệu chứng lâm sàng sau khi khỏi bệnh sẽ hình thành kháng thể trong máu (Lê Minh Trí và cs, 1999)

Bệnh viêm gan vịt do virus có tỷ lệ chết biến động từ vài phần trăm đến 90% Vịt mắc bệnh do virus viêm gan vịt type I gây ra thường xảy ra đột ngột, thời gian nung bệnh ngắn trong vòng 24h Vịt chết tập trung vào ngày thứ 2-3-

4 sau khi mắc bệnh, tỷ lệ chết cao có khi lên đến 100% (Lê Minh Chí và cs, 1999)

Trên bề mặt gan có hiện tượng xuất huyết lan rộng, không có ranh giới Các nốt xuất huyết bằng đầu đinh ghim, màu đỏ, đôi khi nhỏ li ti lan tràn khắp

bề mặt gan, các nốt xuất huyết cũng có thể quan sát được ở mặt dưới của gan Bên cạnh các điểm xuất huyết còn thấy những đám tụ máu đỏ, hoặc những đám màu vàng nhạt do tổ chức gan bị thoái hóa (Hồ Thị Việt Thu, Nguyễn Đức Hiền, 2012) Trong gan có thể gặp các ổ hoại tử do bệnh viêm gan kế

phát phó thương hàn Lách có thể bị sưng, thận tụ máu hoặc lấm tấm xuất huyết (Nguyễn Văn Cảm và cs, 2001)

Ngoài bệnh tích ở gan, còn có các bệnh tích thường gặp là: cơ tim nhợt nhạt (giống như luộc chín), màng bao tim và túi khí bị viêm, thận tụ huyết nhẹ, lách hơi sưng (Hồ Thị Việt Thu, Nguyễn Đức Hiền, 2012)

Hình 2.3 Gan vịt bị xuất huyết

(http://www.merckmanuals.com/vet/poultry/duck_viral_hepatitis/overview_of_duck_

viral_hepatitis.html)

Bệnh tích vi thể:

Trường hợp vịt bị bệnh ở thể cấp tính, sau khi nhiễm 24h thấy tế bào gan

bị thoái hóa, hoại tử, trong tế bào có các tiểu phần virus

Biến đổi vi thể của bệnh thường xuất hiện ở gan và đại não Gan có những đám tế bào bị hoại tử, ống mật viêm tăng sinh quanh mạch và viêm tăng sinh mô thần kinh đệm, lúc đầu là những bạch cầu có hạt sau đó là tế bào lympho và các tương bào Ở vịt con không chết có sự tái sinh của các tế bào nhu mô gan Sự tổn thương của tế bào gan ở vịt con mắc bệnh viêm gan do virus giống những tổn thương như ở viêm gan của người (Bùi Thị Cúc, 2002)

Quan sát biến đổi vi thể ở gà 10 ngày tuổi chết do nhiễm virus viêm gan vịt type I thấy tế bào hạt của nhiều cơ quan tăng sinh, gan có các điểm hoại tử, tăng sinh ống mật, phù dưới da, không quan sát thấy các thể bao hàm trong tế bào Khi tiến hành làm tiêu bản vi thể thấy tế bào gan bị biến đổi, các tế bào gan sắp xếp lộn xộn, các vi huyết quản xuyên tâm giản rộng chứa hồng cầu và

tế bào viêm Có hiện tượng xuất huyết tràn lan trong nhu mô gan Tế bào lympho tăng sinh mạnh, có thể tập trung thành từng đám lớn hoặc rãi rác xen

kẻ với những tế bào gan Một số tế bào gan mất đi phần nguyên sinh chất, chỉ còn lại nhân, một số tế bào bị thoái hóa mỡ và thoái hóa không bào (Nguyễn

Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương, 2004)

Virus viêm gan vịt được tiêm vào xoang niệu mô phôi vịt 10-14 ngày tuổi Sau khi tiêm 24-72h phôi chết có biểu hiện xuất huyết dưới da, gan xuất huyết và có nhiều điểm hoại tử

2.6 Chẩn đoán bệnh viêm gan vịt do virus

2.6.1 Chẩn đoán lâm sàng và bệnh tích

Bệnh xảy ra trên đàn vịt con, xuất huyết đột ngột, tỷ lệ nhiễm cao Vịt ủ

rũ cao độ, rối loạn vận động, chết ở tư thế đặc trưng, hai chân duỗi thẳng, đầu ngoẹo lên lưng

Mổ khám thấy gan bị sưng, xuất huyết, tim nhợt nhạt như tim luộc (Nguyễn Vĩnh Phước và cs, 1978)

2.6.2 Chẩn đoán virus học

Bệnh phẩm là gan, não của vịt pha với nước sinh lý thành nồng độ 20%,

xử lý kháng sinh diệt tạp khuẩn, lấy nước trong rồi gây nhiễm cho phôi: tiêm 0,2ml cho phôi gà 8-10 ngày tuổi hoặc phôi vịt 10-14 ngày tuổi Nếu bệnh phẩm có chứa virus thì phôi chết và có các bệnh tích đặc trưng trên phôi (Hồ Thị Việt Thu, Nguyễn Đức Hiền, 2012)

Gây bệnh cho vịt con: cho đến nay phương pháp nhạy và có độ tin cậy cao nhất là tiêm truyền bệnh phẩm cho vịt con 1-7 ngày tuổi

2.6.3 Chẩn đoán huyết thanh học

Người ta sử dụng phản ứng huyết thanh học để chuẩn độ virus hoặc đánh giá mức độ miễn dịch của vịt sau khi sử dụng vaccine hoặc điều tra dịch tể

Có thể dùng các xét nghiệm sau: phản ứng kết hợp bổ thể, phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch, phản ứng ELISA, phản ứng trung hòa

2.6.4 Chẩn đoán phân biệt

Bệnh phó thương hàn vịt: có thể xảy ra ở vịt con 1 ngày tuổi có triệu chứng tiêu chảy, co giật bất ngờ rồi chết, bệnh tích chủ yếu ở ruột, gan có điểm hoại tử màu trắng, quan sát bệnh tích thấy chưa tiêu hết lồng đỏ trứng ở vịt con, gan, lách, thận sưng, sung huyết, bệnh có thể phòng và trị bằng kháng sinh Vi khuẩn salmonella có thể nuôi cấy phân lập được trong phòng thí nghiệm trên các môi trường thạch thông thường

Bệnh dịch tả vịt: hai bệnh có triệu chứng giống nhau về tiêu chảy, lông

xù, khát nước Nhưng dịch tả vịt xảy ra trên cả vịt con và vịt lớn, vịt bệnh còn

có triệu chứng phù đầu, mí mắt sưng, chảy nước mắt Ngoài bệnh tích xuất huyết ở gan, vịt còn có bệnh tích đặc trưng là xuất huyết và viêm loét đường tiêu hóa (Hồ Thị Việt Thu, Nguyễn Đức Hiền, 2012)

Chứng nhiễm độc aflatoxin: Không có hiện tượng lây lan trong đàn, vịt

co giật, mệt mỏi, chết nhanh ở mọi lứa tuổi, khi thay đổi thức ăn thì bệnh giảm Bệnh tích chủ yếu là: xoang bụng và xoang bao tim tích nước, gan sưng

có màu nhợt nhạt, thận và lách xuất huyết

2.7 Phòng bệnh

2.7.1 Phòng bệnh bằng vệ sinh thú y

+ Khi chƣa có dịch

Chuồng trại chăn nuôi, dụng cụ chăn nuôi phải thường xuyên được tẩy

uế, sát trùng bằng formol 1% hoặc dung dịch NaOH 3%

Tại vùng an toàn dịch nên tự túc con giống, trứng, vịt con phải được mua

từ đàn bố mẹ khỏe mạnh Máy ấp phải được tiêu độc kỹ bằng xông hơi formol (Hồ Thị Việt Thu, Nguyễn Đức Hiền, 2012)

+ Vaccine nhƣợc độc

Virus cường độc dưới tác dụng của các yếu tố sinh học: tiêm truyền nhiều lần qua động vật ít cảm thụ, qua phôi thì độc lực của virus giảm đi Virus vẫn có khả năng nhân lên trong cơ thể vật chủ nhưng không gây bệnh nên được dùng để làm vaccine Nhiều nghiên cứu đã cho thấy các chủng virus viêm gan vịt cường độc sau khi đã cấy truyền qua phôi gà không còn khả năng gây bệnh cho vịt con nhưng virus vẫn nhân lên trong tế bào các mô, so với chủng virus viêm gan vịt cường độc thì mức độ nhân lên của virus này là thấp hơn (Hwang, 1965)

Bằng phương pháp giảm độc trên phôi đã tạo ra nhiều chủng virus viêm gan vịt nhược độc Hiện nay vaccine viêm gan vịt type I, loại dùng chủ yếu ở Châu Âu là loại đã được giảm độc sau 53-55 lần cấy truyền qua phôi gà 8-10 ngày tuổi, ở Mỹ là loại giảm độc sau 84-89 lần cấy truyền

+ Vaccine vô hoạt

Ngoài vaccine nhược độc còn có vaccine vô hoạt Vaccine viêm gan vịt

vô hoạt được sản xuất từ virus viêm gan vịt type I bằng cách nuôi cấy virus trên phôi gà, thu hoạch dịch phôi, vô hoạt bằng BEI (Binary Ethylenimine) (Woolcok, 2003) Bảo quản ở 40C trong thời gian 20 tháng vẫn giữ được hiệu lực của vaccine

Nghiên cứu hiệu lực của vaccine viêm gan vịt vô hoạt, các tác giả đều cho biết vaccine có khả năng tạo miễn dịch cao cho đàn vịt (Gough, 1981) Sử dụng 3 lần vaccine viêm gan vịt type I vô hoạt nhủ dầu cho đàn vịt giống sẽ tạo miễn dịch cho đàn vịt con

Hiện nay, trên thị trường Việt Nam đang sử dụng rộng rãi một loại vaccine nhược độc viêm gan vịt do Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương sản xuất Qua khảo sát sinh học phân tử hệ gen bước đầu cho thấy, chủng virus được sử dụng làm vaccine có nguồn gốc từ Hàn Quốc Ngoài ra, một chủng virus vaccine nhược độc khác của Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội cũng

đã được nghiên cứu đầy đủ về đặc tính sinh học (Nguyễn Phục Hưng, 2004; Nguyễn Bá Hiền, 2007), qui trình sản xuất (Bùi Thanh Khiết,2007; Nguyễn

Bá Hiên, 2007), đặc tính phân tử và đã được ứng dụng vào thực tế Kết quả nghiên cứu về sinh học phân tử cho thấy các loại vaccine sử dụng tại Việt Nam đều thuộc genotype I

2.8 Trị bệnh

Kháng sinh không có hiệu quả trong điều trị Khi có bệnh xảy ra cần loại thải ngay các vịt bệnh, sử dụng huyết thanh từ các vịt khỏi bệnh tiêm cho các

vịt khỏe còn lại với liều 0,5ml/con, hoặc có thể sử dụng kháng thể K.T.V (Hanvet) có bán sẳn trên thị trường

2.9 Miễn dịch chống virus viêm gan vịt

Khi đưa virus vào cơ thể kháng thể chưa hình thành ngay lập tức mà phải sau một thời gian tiềm tàng, dài hay ngắn phụ thuộc vào kháng nguyên chứa trong vaccine và sự xâm nhập của kháng nguyên vaccine lần đầu hay lần thứ

2, 3,…hàm lượng kháng thể tăng dần, đạt mức cao nhất sau 2-3 tuần rồi giảm dần và mất đi sau vài tháng hoặc vài năm

Khi một kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể trước hết cơ thể bảo vệ mình bằng cơ chế đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu Tham gia vào cơ chế này có vai trò của da, niêm mạc, dịch tiết của các tuyến, đặc biệt là có vai trò của các tế bào làm nhiệm vụ thực bào Sau đó, cơ thể bảo vệ mình bằng cơ chế đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với hoạt động của các cơ quan, tế bào có thẩm quyền miễn dịch, tạo kháng thể đặc hiệu để loại trừ kháng nguyên (Nguyễn

Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương, 2004)

2.9.1 Miễn dịch thụ động

Ở gia cầm non hệ thống miễn dịch chưa phát triển hoàn thiện Ngay từ lúc mới sinh cơ thể chúng hoàn toàn không có khả năng chống lại các tác nhân gây bệnh một cách đặc hiệu Trạng thái miễn dịch chỉ có được sau khi cơ thể vịt mẹ có miễn dịch và truyền kháng thể đặc hiệu cho con non qua lòng đỏ trứng (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2004) Trong bệnh viêm gan vịt, miễn dịch thụ động của vịt con được nhận từ mẹ đã được nghiên cứu nhiều Việc tiêm nhắc lại vaccine cho vịt mẹ sẽ tạo được kháng thể thụ động tốt hơn cho vịt con Theo Asplin (1958), dùng virus viêm gan vịt type I nhược độc qua phôi gà, tiêm bắp cho vịt giống vào thời điểm 2-4 tuần trước khi lấy trứng đem ấp sẽ tạo được miễn dịch thụ động cho vịt con Ở vịt con hàm lượng kháng thể thụ động sẽ giảm dần trong 2 tuần sau khi nở Ở vịt mẹ hàm lượng kháng thể phải đạt hiệu giá 1/64 trong phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động hoặc 1/32 trong phản ứng trung hòa mới có thể bảo hộ cho vịt con khỏi mắc bệnh (Asplin, 1958)

2.9.2 Miễn dịch chủ động

Là loại miễn dịch thu được khi con vật bị mắc bệnh nhưng có đủ sức để chống lại bệnh và khỏi bệnh hoặc là miễn dịch mà vịt có được sau khi tiêm vaccine Những vịt sống sót sau khi mắc bệnh đều có miễn dịch chắc chắn với virus của type gây bệnh Tạo miễn dịch chủ động cho đàn vịt bằng cách sử dụng các loại vaccine nhược độc và vaccine vô hoạt Vaccine sau khi vào cơ

thể sẽ đi đến các cơ quan miễn dịch như hạch, lách, tổ chức lympho dưới niêm mạc và kích thích cơ thể sinh ra kháng thể đặc hiệu

Trong kháng thể dịch thể chống virus viêm gan vịt type I thì kháng thể 7S nhiều hơn kháng thể 19S Vịt được tiêm vaccine có thể tạo được miễn dịch chủ động chống lại bệnh Sử dụng vaccine nhược độc viêm gan vịt tiêm cho vịt 2-3 ngày tuổi và tiêm nhắc lại bằng vaccine vô hoạt vào thời điểm 22 tuần tuổi sẽ tạo được lượng lớn kháng thể trung hòa (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2004)

2.10 Vai trò của kháng thể

Trong hệ đáp ứng miễn dịch, kháng thể có 3 chức năng chính: liên kết với kháng nguyên, kích hoạt bổ thể và huy động các tế bào miễn dịch

(Campbell et al, 1995)

2.10.1 Liên kết với kháng nguyên

Các kháng thể có khả năng nhận diện và gắn một cách đặc hiệu với một

kháng nguyên tương ứng nhờ các vùng biến thiên (Campbell et al, 1995)

Một thí dụ để miêu tả lợi ích của kháng thể là trong phản ứng chống độc

tố vi khuẩn Kháng thể liên kết và trung hòa các độc tố, ngăn ngừa sự tương tác của chúng với các thụ thể tế bào Như vậy, các tế bào có thể tránh được các rối loạn do các độc tố gây ra

Tương tự như vậy, nhiều virus và vi khuẩn chỉ gây bệnh khi bám vào các

tế bào Vi khuẩn sử dụng các phân tử bám dính là protein adhesin, còn virus sở hữu các protein bám dính trên lớp vỏ của chúng Các kháng thể kháng adhesin

và kháng protein vỏ virus sẽ ngăn chặn các vi sinh vật này gắn vào các tế bào đích

2.10.2 Hoạt hóa tế bào miễn dịch

Sau khi tương tác với kháng nguyên ở đầu biến thiên (Fab), kháng thể có thể cố định trên các tế bào miễn dịch ở đầu hằng định (Fc) Những tương tác

này có tầm quan trọng đặc biệt trong đáp ứng miễn dịch (Campbell et al.,

1995) Như vậy, các kháng thể gắn với một virus hoặc một vi khuẩn có thể liên kết với đại thực bào và khởi động hiện tượng thực bào Các tế bào lympho

NK (Natural Killer) có thể thực hiện chức năng giải độc tế bào và ly giải các

vi khuẩn bị gắn kết với các kháng thể

Các lớp kháng thể được phân thành 5 lớp hay isotype, tùy theo cấu tạo của các domain hằng định của các chuỗi nặng, các chuỗi , , ,  và  lần

lượt tương ứng với các immunoglobulin (Ig) thuộc các lớp IgG, IgA, IgM, IgE, IgD

có chức năng hoạt hóa bổ thể

Hình 2.4 Cấu trúc của kháng thể

(Nguồn: http://vi.wikipedia.org/wiki/Kh%C3%A1ng_th%E1%BB%83)

2.10.2.2 IgA

IgA chiếm khoảng 15%–20% các immunoglobulin trong máu, nó chủ yếu tiết tại các mô niêm nhày Nó còn được tiết trong sữa, nước mắt và nước bọt Lớp immunoglobulin này trung hòa các tác nhân gây bệnh tại những nơi chúng được tiết ra, nó không hoạt hóa bổ thể, khả năng opsonine hóa cũng rất yếu Có hai loại IgA là IgA1 (90%) và IgA2 (10%)

2.10.2.3 IgM

IgM tạo nên các polymer do các immunoglobulin liên kết với nhau bằng các cầu nối đồng hóa trị disulfit, thường là các dạng pentamer hoặc hexamer Khối lượng phân tử của nó khá lớn, xấp xỉ 900 kDa, vì vậy IgM không có khả năng xuyên thấm, nó chỉ tồn tại một lượng nhỏ trong dịch kẽ, IgM rất “háu” kháng nguyên và rất hiệu quả trong việc hoạt hóa bổ thể

2.10.2.4 IgE

IgE là loại immunoglobulin monomer trong đó carbonhydrate chiếm tỷ lệ khá lớn Khối lượng phân tử của IgE là 190 kda IgE có trên màng bào tương của bạch cầu ái kiềm và tế bào mast ở mô liên kết IgE giữ một vai trò trong phản ứng quá mẫn cấp cũng như trong cơ chế miễn dịch chống ký sinh trùng Kháng thể loại IgE cũng có trong các dịch tiết, không hoạt hóa bổ thể và là immunoglobulin dễ bị hủy bởi nhiệt

2.10.2.5 IgD

IgD là loại immunoglobulin monomer chiếm chưa đầy 1% trên màng tế bào lympho B Chức năng của IgD chưa được hiểu biết đầy đủ, nó thường biểu hiện đồng thời với IgM và được xem như một marker của tế bào B trưởng thành nhưng chưa tiếp xúc kháng nguyên Có lẽ nó tham gia vào cơ chế biệt hóa của tế bào B thành tương bào và tế bào B ghi nhớ

2.11 Kháng thể IgY

2.11.1 Sơ lƣợc về IgY

IgY là một globulin miễn dịch được mô tả lần đầu tiên vào năm 1893 khi Klemperer chủng ngừa gà để sản xuất kháng thể và phát hiện nồng độ kháng thể trong lòng đỏ trứng gà cũng tương đương trong máu Khi Klemperer phát hiện globulin miễn dịch gà vào cuối năm 1800, ông đã đặt tên chúng là IgG Sau đó, người ta đã đổi tên globulin miễn dịch này thành IgY không phải vì chúng được tìm thấy trong lòng đỏ mà vì chúng khác các globulin miễn dịch của động vật có vú (IgG) Hiện nay, IgY là lớp globulin miễn dịch chủ yếu ở các loài chim, bò sát, loài lưỡng thê và loài cá phổi

Ở loài chim đã tìm thấy 3 loại kháng thể: IgA, IgM và IgY IgA và IgM thì tương tự như IgA và IgM của loài hữu nhũ, riêng IgY là globulin miễn dịch chính có trong huyết thanh và lòng đỏ trứng IgY hình thành khoảng 75% tổng

Khi bị nhiễm vi sinh vật hoặc được gây miễn dịch, gà cũng tạo ra các kháng thể đặc hiệu chống các kháng nguyên bị nhiễm hoặc được gây miễn dịch Đặc biệt là các kháng thể IgY đặc hiệu không chỉ có trong máu gà mái

mà còn được chuyển sang lòng đỏ để thực hiện chức năng sinh lý bảo vệ phôi

và gà con Các kháng thể IgY đặc hiệu trong trứng gà có đặc tính bảo vệ giống như các kháng thể có trong máu gà mẹ

Kháng thể từ gà mẹ được truyền cho gà con vào giai đoạn cuối hình thành trứng, có vai trò rất quan trọng về chức năng miễn dịch liên quan đến sự suy giảm miễn dịch ở gà con và ảnh hưởng tới sức đề kháng các bệnh truyền nhiễm khác nhau Kháng thể IgA và IgM mẹ được hợp thành trong lòng trắng trứng dọc màng ối (Rose et a., 1974) IgY trong lòng đỏ tuần hoàn trong máu

gà con qua nội phôi bì của túi noãn hoàng (Patterson et al., 1962) Hàm lượng

kháng thể trong lòng trắng trứng thấp (IgA ~ 0,7 mg/ml, IgM ~ 0,15 mg/ml) trong khi ở lòng đỏ IgY có hàm lượng rất cao (8 – 25mg/ml)

Khả năng thu được lượng kháng thể IgY qua trứng gà cao gấp 18 lần so với thu kháng thể từ thỏ và không làm ảnh hưởng con vật (qua lấy máu) Mức tập trung kháng thể trong lòng đỏ trứng cao: 100mg/trứng x 20 trứng/ tháng tương đương 2g kháng thể/tháng/gà

2.11.2 Ƣu điểm của IgY

Ưu điểm vượt trội của phương pháp tạo kháng thể trên gà đó là kháng thể được thu hoạch từ trứng gà đẻ mỗi ngày chứ không phải từ máu gà

Theo Woolley và Landon (1995), lượng kháng thể IgY tạo ra khoảng 100-400mg cho mỗi trứng gà Mỗi năm một gà mái có thể đẻ từ 250-300 trứng, tổng sản lượng kháng thể thu được từ một con gà mái tương đương với lượng kháng thể thu được từ một con cừu hoặc một nửa con ngựa Vì thế gây miễn dịch cho gà mái và thu kháng thể đặc hiệu từ trứng gà được coi là phương pháp hiệu quả và giá rẻ để tạo ra các kháng thể đặc hiệu

2.11.3 Đặc tính của IgY

2.11.3.1 Đặc tính phân tử của IgY

Tương tự như IgG của loài hữu nhũ, nhưng phần Fc của IgY là vị trí có chức năng hiệu quả sinh học nhất với chuỗi 2 carbonhydrate trong khi IgG chỉ

có một

Hình 2.5 Cấu trúc của kháng thể IgG và IgY

(Nguồn: http://altweb.jhsph.edu/pubs/ecvam/ecvam21.html)

2.11.3.2 Đặc tính sinh hóa

Điểm đẳng điện của IgY thấp hơn IgG (Polson et al., 1980) trong dãy

5,7-7,6 còn IgG nằm giữa 6,1-8,5 Trong khi đó chuỗi Fc (phần kỵ nước nhất của phân tử kháng thể) của IgY thì lớn hơn của IgG, phân tử IgY kỵ nước hơn IgG

2.11.3.3 Tính bền của IgY

Bền với pH: hoạt tính IgY giảm ở pH = 3,5 hoặc thấp hơn và hầu như

hoàn toàn mất ở pH = 3 (Shimizu et al., 1988) Ở điều kiện kiềm tính, hoạt

tính của IgY không thay đổi ngay cả khi pH tăng đến 11 Dù vậy, nó vẫn bị

giảm ở pH = 12 hay cao hơn (Shimizu et al., 1988).

Bền với sự phân giải protein: IgY có tính đề kháng với trypsin hay chymotrysin tiêu hóa nhưng hơi nhạy cảm với pepsin tiêu hóa Theo Hatta (1993), hầu hết hoạt tính IgY bị mất theo đường tiêu hóa với pepsin, nhưng hoạt tính được duy trì mức 39% và 41% khi ủ với trypsin và chymotrypsin sau 8h

Bền với nhiệt và áp suất: IgY được dùng ấm ở các mức nhiệt khác nhau cho các giai đoạn khác nhau về thời gian Hoạt tính gắn kết của IgY với kháng

Hatta (1993) IgY bền với nhiệt độ 600

C – 700C Hoạt tính IgY giảm do sự làm nóng trong 15 phút ở 700

C hay cao hơn; IgY biến tính nhiều khi làm nóng ở nhiệt độ trên 750

C (Chang et al., 1999) IgY có tính bền với áp suất, IgY

không bị bất hoạt bởi áp suất 4000kg/cm2

này: lạnh khô không làm ảnh hưởng tới hoạt tính của IgY trừ khi lặp lại nhiều

lần (Shimizu et al., 1988) Dù vậy, Chansarker (1998) chỉ ra rằng sự đông hay

lạnh khô IgY gây hậu quả ở một số mất mát về hoạt tính gắn kết kháng nguyên

và giảm một cách đáng kể tính tan dưới điều kiện hàm lượng muối và protein cao

2.11.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu IgY

Theo Sarker và Hatta (2001), hiện nay trên thế giới bên cạnh các nghiên cứu tạo kháng thể gà chống các tác nhân nhiễm trùng và ứng dụng thành công trong điều trị bệnh thú y ở các loài như lợn, bò, chó, gà đã có một số nơi nghiên cứu chế tạo kháng thể gà kháng các tác nhân tiêu chảy ở người trong

đó có kháng rotavirus và E.coli (Kovacs-Nolan et al., 2004) Một số các

nghiên cứu về sử dụng IgY trong việc phòng và trị bệnh trong chăn nuôi thủy hải sản cũng đã được tiến hành Sử dụng kháng thể IgY chống vi khuẩn

Yershinia ruckeri trong phòng và điều trị bệnh nhiễm khuẩn máu trên cá hồi

cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh và chết của cá giảm khi cho ăn thức ăn có chứa kháng thể