ảnh hưởng nồng độ benzyl adenin (ba) lên sự tạo chồi từ tử diệp và đỉnh sinh trưởng dưa hấu tứ bội (citrullus vulgaris schard.)

Ts Lâm Ngọc Phương TÓM LƯỢC Tạo chồi từ đỉnh sinh trưởng và tử diệp là phương pháp nhân giống vô tính hiện nay tạo ra số lượng chồi nhiều và nồng độ Benzyl Adenin BA là yếu tố quyết địn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP  SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN THỊ THÚY LIỄU

ẢNH HƯỞNG NỒNG ĐỘ BENZYL ADENIN (BA) LÊN SỰ TẠO CHỒI TỪ TỬ DIỆP VÀ ĐỈNH SINH TRƯỞNG DƯA HẤU TỨ BỘI (Citrullus vulgaris Schard.)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH NÔNG HỌC

Cần Thơ, 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP  SINH HỌC ỨNG DỤNG

ẢNH HƯỞNG NỒNG ĐỘ BENZYL ADENIN (BA) LÊN SỰ TẠO CHỒI TỪ TỬ DIỆP VÀ ĐỈNH SINH TRƯỞNG DƯA HẤU TỨ BỘI (Citrullus vulgaris Schard.)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH NÔNG HỌC

Cán bộ hướng dẫn:

PGs.Ts Lâm Ngọc Phương

Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Thị Thúy Liễu

MSSV: C1201041

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Đại học

Ngành Nông Học

Tên đề tài:

ẢNH HƯỞNG NỒNG ĐỘ BENZYL ADENIN (BA) LÊN SỰ TẠO CHỒI TỪ TỬ DIỆP VÀ ĐỈNH SINH TRƯỞNG DƯA HẤU TỨ BỘI (Citrullus vulgaris Schard.)

Cán bộ hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

PGs.Ts Lâm Ngọc Phương Nguyễn Thị Thúy Liễu

MSSV: C1201041

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp thuận luận văn tốt nghiệp Đại học, Ngành Nông Học với đề tài:

ẢNH HƯỞNG NỒNG ĐỘ BENZYL ADENIN (BA) LÊN SỰ TẠO CHỒI TỪ TỬ DIỆP VÀ ĐỈNH SINH TRƯỞNG

DƯA HẤU TỨ BỘI (Citrullus vulgaris Schard.)

Do sinh viên Nguyễn Thị Thúy Liễu thực hiện

Kính trình lên Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014 Cán bộ hướng dẫn

PGs Ts Lâm Ngọc Phương

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp thuận luận văn tốt nghiệp Đại học,

Ngành Nông Học với đề tài:

ẢNH HƯỞNG NỒNG ĐỘ BENZYL ADENIN (BA) LÊN SỰ TẠO CHỒI TỪ TỬ DIỆP VÀ ĐỈNH SINH TRƯỞNG

DƯA HẤU TỨ BỘI (Citrullus vulgaris Schard.)

Do sinh viên Nguyễn Thị Thúy Liễu thực hiện và bảo vệ trước hội đồng

Ý kiến của Hội Đồng chấm luận văn tốt nghiệp:

Luận văn tốt nghiệp được Hội Đồng đánh giá ở mức: Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014 Hội đồng

DUYỆT KHOA Trưởng Khoa Nông Nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thúy Liễu

QUÁ TRÌNH HỌC TẬP



I LÝ LỊCH SƠ LƯỢC

Nơi sinh: Long Điền B, Chợ Mới, An Giang

Địa chỉ thường trú: Ấp Long Thành, Xã Long Điền B, Huyện Chợ Mới, Tỉnh

An Giang

Email: lieuc1201041@student.ctu.edu.vn

II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP

1 Trung học phổ thông:

Thời gian đào tạo: từ tháng 9/2006 đến tháng 5/2009

Trường: Trung học phổ thông Châu Văn Liêm

2 Tốt nghiệp Cao Đẳng:

Thời gian đào tạo: tử năm 2009 đến 2012

Trường: Cao Đẳng Kinh Tế - Kỹ Thuật Cần Thơ

Chuyên ngành: Nông Học

Địa chỉ: Số 9, đường Cách Mạng Tháng Tám, Q Ninh Kiều, TP Cần Thơ

Ngày tháng năm 2014

Người khai

CẢM TẠ

Trong thời gian học tập và rèn luyện tại Trường Đại Học Cần Thơ, em đã được quí thầy cô truyền đạt rất nhiều kiến thức, kinh nghiệm quý báu Đây sẽ là vốn sống vô cùng quan trọng giúp đỡ em trong quá trình làm việc và công tác về sau

Kính dâng

 Cha, mẹ đấng sinh thành đã cho con hình hài và hết lòng yêu thương, dạy dỗ và nuôi nấng con khôn lớn, nên người

Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc

 PGs.Ts Lâm Ngọc Phương người đã tận tình hướng dẫn tôi trong việc nghiên cứu và hoàn thành Luận văn tốt nghiệp này

 Ths Ngô Phương Ngọc đã hết lòng chỉ bảo tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này

 Thầy Huỳnh Kỳ và thầy Nguyễn Phước Đằng, cố vấn học tập đã hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Xin chân thành cảm ơn

Cô Phan Thị Hồng Nhung, cô Lê Minh Lý và quí thầy cô đang công tác tại bộ môn Sinh lý-Sinh hoá Cảm ơn chị Truyền, chị Ngân đã nhiệt tình chỉ dẫn tôi trong quá trình thực hiện luận văn Cảm ơn bạn Đại Phú, Kim Duyên, Thị Tuyền, Hoàng Sơn, Minh Hương, Văn Hải, Hữu Nghĩa đã giúp đỡ và ủng hộ tinh thần tôi rất nhiều trong suốt qua trình học tập tại trường

Thân gửi

Các bạn lớp Nông Học liên thông khóa 38 lời chúc sức khỏe, thành công, thành đạt trong tương lai

NGUYỄN THỊ THÚY LIỄU, 2014 “Ảnh hưởng của nồng độ Benzyl Adenin (BA)

lên sự tạo chồi từ tử diệp và đỉnh sinh trưởng dưa hấu tứ bội (Citrullus vulgaris

Schard.)” Luận văn tốt nghiệp Đại học-Ngành Nông Học, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGs Ts Lâm Ngọc Phương

TÓM LƯỢC

Tạo chồi từ đỉnh sinh trưởng và tử diệp là phương pháp nhân giống vô tính hiện nay tạo ra số lượng chồi nhiều và nồng độ Benzyl Adenin (BA) là yếu tố quyết định

số lượng chồi trong quá trình nuôi cấy vì vậy đề tài “Ảnh hưởng của nồng độ

Benzyl Adenin (BA) lên sự tạo chồi từ tử diệp và đỉnh sinh trưởng dưa hấu tứ

bội (Citrullus vulgaris Schard.)” được thực hiện nhằm tìm được nồng độ BA thích hợp cho sự tạo chồi dưa hấu tứ bội từ đỉnh sinh trưởng và tử diệp trong điều kiện nuôi cấy mô, làm tiền đề cho việc nghiên cứu, góp phần vào công tác lai tạo dưa hấu không hạt và sản xuất cây tứ bội làm giống Đề tài gồm 2 thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn ngẫu nhiên 2 nhân tố, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 3 keo, mỗi keo cấy 4 mẫu Kết quả thí nghiệm cho thấy: (1) Ở thí nghiệm 1 kết quả cho thấy sử dụng tử diệp dưa hấu tứ bội của 2 giống Thành Longtb và Hoàng Longtb nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung BA 2 mg/l cho tỉ lệ mẫu tạo chồi tốt nhất đạt 54,17%

và số chồi gia tăng nhiều nhất 3,2 chồi, không có sự khác biệt giữa 2 giống dưa hấu Thành Longtb và Hoàng Longtb (2) Ở thí nghiệm 2 cho thấy sử dụng đỉnh sinh trưởng giống dưa hấu tứ bội Thành Longtb và Hoàng Longtb nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/l để tạo chồi sẽ cho số chồi gia tăng nhiều nhất đạt 9,73 chồi, giữa 2 giống Thành Longtb và Hoàng Longtb không khác biệt

Từ khóa: Tử diệp, Đỉnh sinh trưởng, Tạo chồi dưa hấu tứ bội, dưa hấu tứ bôi

Chương 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

1.1 Sơ lược về dưa hấu 2

1.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật 3

1.2.5 Hiện tượng thừa nước của dưa hấu trong nuôi cấy 9

mô

1.3 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô 10

1.4 Các nghiên cứu về tạo chồi và nhân chồi nuôi cấy mô 10

1.4.1 Các nghiên cứu về tạo chồi và nhân chồi từ đỉnh

Chương 2 PHƯƠNG TIỆN - PHƯƠNG PHÁP 12

2.1 Thời gian thực hiện 12

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

3.1 Ảnh hưởng nồng độ Benzyl Adenin (BA) lên sự tạo chồi từ tử diệp của hai giống dưa hấu tứ bội Thành Long tb và Hoàng Long tb

17

3.1.1 Tỷ lệ mẫu tử diệp sống 17

3.2 Ảnh hưởng nồng độ Benzyl Adenin (BA) lên sự tạo

chồi từ đỉnh sinh trưởng của hai giống dưa hấu tứ bội Thành Long tb và Hoàng Long tb

3.1 Tỉ lệ sống (%) của mẫu tử diệp 2 giống dưa hấu tứ bội Thành

Longtb và Hoàng Longtb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong

môi trường có nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 7 NSKC

17

3.2 Tỉ lệ (%) tử diệp tạo mô sẹo của 2 giống dưa hấu tứ bội Thành

Longtb và Hoàng Longtb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong

môi trường có nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 14 NSKC

18

và Hoàng Longtb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong môi

trường có nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 21 NSKC

19

Hoàng Longtb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong môi trường

có nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 7 NSKC

20

Hoàng Longtb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong môi trường

có nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 14 NSKC

21

Hoàng Longtb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong môi trường

có nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 21 NSKC

22

Hoàng Longtb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong môi trường

có nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 28 NSKC

22

và Hoàng Longtb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong môi

trường có nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 7 NSKC

23

và Hoàng Longtb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong môi 24

trường có nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 14 NSKC

và Hoàng Longtb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong môi

trường có nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 21 NSKC

25

và Hoàng Longtb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong môi trường có nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 28 NSKC

25

và Hoàng Longtb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong môi trường nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 21 NSKC

27

Hoàng Longtb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong môi trường nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 28 NSKC

28

và Hoàng Longtb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong môi trường nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 35 NSKC

29

bội Thành Longtb và Hoàng Longtb nuôi cấy trong môi trường nồng

độ BA khác nhau ở thời điểm 21 NSKC

30

bội Thành Longtb và Hoàng Longtb nuôi cấy trong môi trường nồng

độ BA khác nhau ở thời điểm 28 NSKC

30

bội Thành Longtb và Hoàng Longtb nuôi cấy trong môi trường nồng

độ BA khác nhau ở thời điểm 35 NSKC

31

Longtb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong môi trường nồng độ

BA khác nhau ở thời điểm 21 NSKC

32

Longtb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong môi trường nồng độ

BA khác nhau ở thời điểm 28 NSKC

33

và Hoàng Longtb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong môi trường nồng độ

BA khác nhau ở thời điểm 35 NSKC

34

3.21 Số chồi gia tăng từ đỉnh sinh trưởng của 2 giống dưa hấu tứ bội

Thành Longtb và Hoàng Longtb nuôi cấy trong môi trường có nồng

độ BA khác nhau ở thời điểm 7 NSKC

35

3.22 Số chồi gia tăng từ đỉnh sinh trưởng của 2 giống dưa hấu tứ bội

Thành Longtb và Hoàng Longtb nuôi cấy trong môi trường có nồng

độ BA khác nhau ở thời điểm 14 NSKC

36

3.23 Số chồi gia tăng từ đỉnh sinh trưởng của 2 giống dưa hấu tứ bội

Thành Longtb và Hoàng Longtb nuôi cấy trong môi trường có nồng

độ BA khác nhau ở thời điểm 21 NSKC

37

3.24 Số chồi gia tăng từ đỉnh sinh trưởng của 2 giống dưa hấu tứ bội

Thành Longtb và Hoàng Longtb nuôi cấy trong môi trường có nồng

độ BA khác nhau ở thời điểm 28 NSKC

37

Longtb được tạo chồi từ đỉnh sinh trưởng nuôi cấy trong môi trường

có nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 7 NSKC

39

Longtb được tạo chồi từ đỉnh sinh trưởng nuôi cấy trong môi trường

có nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 14 NSKC

40

Longtb được tạo chồi từ đỉnh sinh trưởng nuôi cấy trong môi trường

có nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 21 NSKC

40

Longtb được tạo chồi từ đỉnh sinh trưởng nuôi cấy trong môi trường

có nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 28 NSKC

41

3.29 Chiều cao chồi gia tăng (cm) được tạo thành từ đỉnh sinh trưởng

của 2 giống dưa hấu tứ bội Thành Longtb và Hoàng Longtb nuôi cấy trong môi trường có nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 7 NSKC

42

3.30 Bảng 3.30: Chiều cao chồi gia tăng (cm) được tạo thành từ đỉnh

sinh trưởng của 2 giống dưa hấu tứ bội Thành Longtb và Hoàng

điểm 14 NSKC

43

3.31 Chiều cao chồi gia tăng (cm) được tạo thành từ đỉnh sinh trưởng

của 2 giống dưa hấu tứ bội Thành Longtb và Hoàng Longtb nuôi cấy trong môi trường có nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 21 NSKC

43

3.32 Chiều cao chồi gia tăng (cm) được tạo thành từ đỉnh sinh trưởng

của 2 giống dưa hấu tứ bội Thành Longtb và Hoàng Longtb nuôi cấy trong môi trường có nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 28 NSKC

44

DANH SÁCH HÌNH

3.5 Chồi dưa hấu tứ bội được tạo chồi từ tử diệp Hoàng Longtb (A) và

Thành Longtb (B) với nồng độ BA 1 mg/l sau 35 ngày nuôi cấy

32

cấy mô

34

chồi từ đỉnh sinh trưởng 28 NSKC ở BA 0 mg/l (A), 1 mg/l (B)

và 2 mg/l (C)

38

chồi từ đỉnh sinh trưởng 28 NSKC ở BA 0 mg/l (A), 1 mg/l (B)

và 2 mg/l (C)

38

3.9 Số lá gia tăng dưa hấu tứ bội Thành Longtb được tạo chồi từ đỉnh

sinh trưởng 28 NSKC ở BA 1mg/l (A), 0 mg/l (B) và 2 mg/l (C)

41

3.10 Chiều cao chồi gia tăng dưa hấu tứ bội Thành Longtb được tạo

chồi từ đỉnh sinh trưởng 28 NSKC ở BA 0mg/l (A), 1 mg/l (B) và

2 mg/l (C)

45

3.11 Chiều cao chồi gia tăng dưa hấu tứ bội Hoàng Longtb được tạo

chồi từ đỉnh sinh trưởng 28 NSKC ở BA 0 mg/l (A), 1 mg/l (B)

và 2 mg/l (C)

45

MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam, dưa hấu được biết đến từ thời vua Hùng Vương thứ mười tám và gắn liền với câu chuyện cổ Mai An Tiêm Trong ngày Tết của Việt Nam dưa hấu được xem là biểu tượng của sự an khang thịnh vượng, ruột dưa hấu màu đỏ tượng trưng cho tài lộc, mai mắn và màu xanh vỏ dưa ẩn chứa niềm vui hạnh phúc bên trong Cho đến nay, dưa hấu được xem là loại trái cây không thể thiếu vào ngày Tết

cổ truyền của dân tộc (Phạm Hồng Cúc, 2002) Dưa hấu giàu carbohydrate, muối khoáng và vitamin, chủ yếu dùng để ăn tươi, dưa hấu chứa 90% là nước (Tạ Thu Cúc, 2005) do đó sự góp mặt của dưa hấu trong bữa ăn hằng ngày sẽ trở nên hấp dẫn và đầy đủ dinh dưỡng cho cơ thể và cũng là một loại trái cây lý tưởng để giải khát trong những ngày hè nóng bức từ đó dưa hấu trở thành loại trái cây được ưa chuộng ở nhiều nước trên thế giới

Dưa hấu ăn rất ngon nhưng chứa rất nhiều hạt làm cản trở trong lúc ăn Trên thế giới có nhiều giống dưa hấu không hạt đã được lai tạo với hình dáng, hương vị, màu sắc đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng Để lai tạo được giống dưa hấu tam bội không hạt cần có cây dưa hấu tứ bội làm mẹ và cây nhị bội làm cha Việc nghiên cứu tạo ra các dòng dưa hấu tứ bội được thực hiện thành công từ khoa Nông Nghiệp

và Sinh học ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ Tuy nhiên, trái dưa hấu tứ bội có

số hạt rất ít, tỷ lệ nẩy mầm của hạt tứ bội thấp Để khắc phục những hạn chế trên của dưa hấu tứ bội, nuôi cấy mô thực vật là một công cụ đắc lực để nhân nhanh cây dưa hấu tứ bội với số lượng lớn

Đề tài “Ảnh hưởng nồng độ Benzyl Adenin (BA) lên sự tạo chồi từ đỉnh sinh

trưởng và tử diệp dưa hấu tứ bội (Citrullus vulgaris Schrad.)” được thực hiện

nhằm xác định nồng độ Benzyl adenin (BA) thích hợp cho sự tạo chồi dưa hấu tứ bội làm tiền đề cho việc nghiên cứu quy trình tạo cây dưa hấu tứ bội hoàn chỉnh phục vụ cho công tác lai tạo dưa hấu không hạt

CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về cây dưa hấu

1.1.1 Nguồn gốc

Dưa hấu có tên khoa học là Citrullus vulgaris Schrad, tên tiếng anh là

Watermelon, thuộc họ bầu bí Cucurbitaceae Dưa hấu có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới khô và nóng của Châu Phi và đã được canh tác rộng rãi trong vùng Địa Trung Hải cách đây hơn 3.000 năm Dưa hấu được đưa từ Ấn Độ sang Trung Quốc cách đây 2500 năm Ở Việt Nam, dưa hấu được trồng từ đời vua Hùng Vương thứ 18 và cho đến nay dưa hấu được xem là loại trái cây không thể thiếu vào ngày Tết cổ truyền của dận tộc (Phạm Hồng Cúc, 2002)

1.1.2 Phân bố

Dưa hấu có nguồn gốc ở châu Phi, vùng thung lũng sông Nile, thích nghi khí hậu khô ráo, ấm áp (25-30oC), ánh nắng đầy đủ giúp dưa trổ nhiều bông cái và cho trái chín sớm, năng suất cao (Võ Văn Chi, 2005; Amstrong, 2006) Hiện nay, cây dưa hấu được trồng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới như: Hoa Kỳ, Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan, Bungari… thậm chí lễ hội dưa hấu còn được tổ chức hàng năm ở

Hoa Kỳ (Bang Arkansas) và ở Salmanovo (Bungari)

Ở Việt Nam, những vùng trồng dưa hấu truyền thống như Nghệ An, Quãng Ngãi, Tiền Giang, Long An, thường cung cấp lượng hàng lớn để tiêu dùng nội địa Ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, trong vài năm gần đây, dưa hấu được trồng quanh năm Dưa hấu mùa mưa được trồng nhiều nhất ở Tiền Giang, Long An chiếm hàng nghìn hecta, là những nơi có truyền thống trồng dưa hấu Tết, còn dưa hấu Xuân Hè được trồng nhiều ở Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ (Tạ Thu Cúc, 2005) Cây dưa hấu hiện được trồng rất phổ biến trong mùa nắng ở đồng bằng sông Cửu Long, thường

là trồng luân canh trên nền đất lúa, rất đa dạng về chủng loại và sản lượng tập trung vào dịp tết Nguyên Đán mặc dầu vẫn có dưa hấu quanh năm (Trần Thị Ba, 2001)

1.1.3 Giá trị dinh dưỡng

Dưa hấu chứa rất nhiều chất lycopene chứa khoảng 36-78 μg/g là hợp chất cung cấp màu đỏ cho trái Chất này qua nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy có tác dụng tốt để chống lại bệnh về tim mạch và ung thư đặc biệt là ung thư tuyến tiền liệt

(Perkins và ctv., 2000) Dưa hấu ngoài tác dụng giải nhiệt còn cung cấp năng lượng

đáng kể và một lượng lớn vitamin A, vitamin C Ngoài ra dưa hấu còn một số tác dụng trong việc hỗ trợ điều trị bệnh: có khả năng ngăn chặn sự lắng đọng của cholesterol trên thành mạch, chống xơ vữa động mạch, cao huyết áp, giúp da mịn màng, giải cảm, giải say rượu… (Trần Huyên Thảo, 2007)

1.1.4 Tạo dưa hấu tứ bội

Để tạo dưa hấu tứ bội, người ta dùng dung dịch loãng colchicine 0,2-0,4% nhỏ lên chồi của dưa hấu con vào buổi sáng và chiều trong vòng từ 4-6 ngày Ở Đài Loan, người ta xử lý bằng colchicine 0,2% vào mầm sinh trưởng cây 2n ở thời kỳ cây có 2 lá mầm, thời gian xử lý lúc 10 giờ sáng và liên tục trong 4 ngày Chất colchicine có tác dụng làm xáo trộn sự phân chia của tế bào, ngăn cản sự phân li nhiễm sắc thể về 2 cực của giai đoạn tiến kì, đưa đến việc không thành lập vách ngăn ở giai đoạn hậu kì Kết quả chỉ có một tế bào với số nhiễm sắc thể trong nhân gấp đôi tạo thành tế bào tứ bội Dưa hấu tứ bội (4n=44) với kích thước tế bào lớn hơn, thân mập và dài hơn, ít phân nhánh, lá dày và rộng, trái và hạt kích thước lớn hơn cây nhị bội (Hồ Thúy Diễm, 2005)

Kihara là người khởi xướng nghiên cứu về dưa hấu không hạt và đã tạo ra được dòng dưa hấu tứ bội là vật liệu quan trọng để tạo ra dưa hấu không hạt vào năm

1951 Chopra và Swaminathan (1960) đã xử lý thành công tạo ra dưa hấu đa bội bằng cách nhỏ giọt colchicine một giờ mỗi ngày, liên tiếp 4 ngày

1.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô thực vật là khoa học nghiên cứu sự phát triển những tế bào hay mô cây được tách ra từ cây mẹ trên môi trường nhân tạo Từ đó bảo tồn chúng hay nhân nhanh chúng để ứng dụng trong nhiều lĩnh vực thực tiễn (Edwin, 1993)

Trong nuôi cấy mô thực vật, kỹ thuật vi nhân giống được sử dụng với mục đích chính là nhân những dòng cây thành số lượng lớn, nhằm nhân các cá thể có sẵn với một mảnh thực vật đặt vào môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng Cơ sở sinh học của phương pháp này là phát triển các mầm chồi trên các mảnh thân cây qua nuôi cấy hay tạo chồi bất định trên các mẫu cây (Lâm Ngọc Phương, 2001) Bằng kỹ thuật này, người ta có thể đạt một tốc độ nhân giống rất lớn, thu được những cây con giống hệt với cây mẹ Đặc biệt, có thể được khai thác để chọn giống dòng Tốc độ nhân giống được gia tăng nhanh nên rất quan trọng đối với các loại thực vật có khả năng nhân giống vô tính chậm trong thiên nhiên, hoặc đối với các cây dị giao tử được nhân giống từ hạt Người ta cũng có thể sử dụng kỹ thuật này cho phép nhân nhanh những loài cây quí hiếm (Lâm Ngọc Phương, 2001)

1.2.1 Lịch sử nuôi cấy mô

Năm 1838, Schleiden và Schwann đã đề xướng thuyết tế bào “Các tế bào đã phân hóa đều mang thông tin di truyền có trong tế bào đầu tiên, đó là trứng đã thụ tinh, và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể” (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Năm 1902, Haberlandt, nhà thực vật học người Đức, là người đầu tiên đưa lý thuyết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm Tuy nhiên, ông đã thất bại vì nuôi cấy các tế bào đã phân hóa tách từ một số cây một lá mầm, đối tượng rất khó nuôi cấy, hơn nữa ông đã dùng các tế bào đã mất khả năng tạo chồi Sau đó dựa trên quan điểm của Haberlandt, các nhà khoa học đã thực hiện thành công kỹ thuật nuôi cấy mô (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Thành công trong lĩnh vực nuôi cấy mô còn được đánh dấu bằng việc chọn lọc được các môi trường nuôi cấy phù hợp: Vacin & Went (1949), Nitsch (1951), White (1954), Murashige & Skoog (1962)… (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

1.2.2 Kỹ thuật nhân giống nuối cấy mô

Theo Debergh và Zimmerman (1992), thì quá trình vi nhân giống được chia làm

4 giai đoạn (không kể giai đoạn 0), mỗi giai đoạn đòi hỏi những điều kiện nuôi cấy thay đổi khác nhau về môi trường cấy, chế độ nhiệt hoặc ánh sáng (Lâm Ngọc

Phương, 2010)

+ Giai đoạn 0: Chuẩn bị mẫu cấy (cây cha mẹ)

Đây là giai đoạn cải thiện điều kiện sinh lý và vệ sinh cây mẹ, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho sự thành công của các giai đoạn sau

+ Giai đoạn 1: Khử trùng mẫu cấy

Mẫu cấy được khử vô trùng để đạt được độ sạch cần thiết và cho tỉ lệ sống cao trước khi thực hiện các thao tác cấy Kết quả có thể thu được là các chồi thân lớn lên, hoặc các chồi thân ra rễ, hoặc còn là một mô sẹo

Phương pháp vô trùng mẫu cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm khuẩn Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mẫu cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt

mô cấy

+ Giai đoạn 2: Nhân chồi

Toàn bộ quá trình nhân giống nuôi cấy mô xét cho cùng chỉ nhằm mục đích tạo ra

hệ số nhân cao nhất (Nguyễn Xuân Linh, 1998) Mục đích của giai đọan này là tạo được số lượng cây con theo ý muốn, thường kéo dài khoảng 4-5 tuần Mẫu cấy được cấy chuyền nhiều lần cho đến khi đạt được số lượng cây con như mong muốn

Có nhiều phương pháp khác nhau để nhân các đơn vị mẫu lên như cảm ứng các chồi

bất định hoặc tạo chồi mới; kích thích sự khởi đầu của các chồi nách (Boxus và ctv.,

1995)

+ Giai đoạn 3a: Kéo dài chồi

Môi trường dùng để kéo dài chồi thường không sử dụng cytokinin hoặc sử dụng với một lượng yếu hơn so với giai đoạn 2 Nồng độ của chất điều hòa sinh trưởng, đặc biệt là cytokinin, cần thiết để kích thích tạo mầm chồi bất định, ức chế sự kéo dài của chồi Do đó, khi đặt mẫu cấy vào trong môi trường kích thích tạo chồi thì đôi khi cần thiết phải chuyển chúng sang môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng hoặc môi trường có nồng độ cytokinin giảm để các mầm chồi sinh trưởng

+ Giai đoạn 3b: Kích thích rễ và tiền thuần dưỡng

Mục đích của giai đoạn này là tạo cây con phát triển đầy đủ rễ, thân, lá có khả năng thực hiện quang hợp và sống sót mà không cần cung cấp nguồn carbohydrate nhân tạo

+ Giai đoạn 4: Sự thuần dưỡng

Cây con hoàn chỉnh được lấy ra khỏi môi trường nuôi cấy mô và trồng vào giá thể nơi vườn ươm (George, 1993) Đây là giai đoạn giúp cây con thích nghi dần với điều kiện môi trường tự nhiên và giảm thiểu sự chết cây con Trong giai đoạn này cây con thường có tỷ lệ chết rất cao do cấu trúc giải phẫu của cây nuôi cấy mô không thích ứng kịp với điều kiện tự nhiên, và do sự thay đổi đột ngột của điều kiện môi trường Vì vậy cần quan tâm đến tình trạng cây con khi chuyển ra vườn ươm và các yếu tố về môi trường như nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng,… (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

1.2.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng quyết định sự sinh trưởng và phát triển của mô và tế bào thực vật trong quá trình nuôi cấy (Nguyễn Bảo Toàn, 2010) Thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy Môi trường còn thay đổi tùy theo sự phát triển, phân hóa của mô cấy, tùy theo mục đích của người nghiên cứu muốn duy trì ở dạng mô sẹo, tạo rễ, tạo

mầm hay muốn tạo chồi cây hoàn chỉnh (Nguyễn Văn Uyển và ctv., 1984)

Theo Nguyễn Đức Thành (2000), các thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy gồm: khoáng đa lượng - vi lượng, nguồn cacbon, vitamin, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, thạch,… Ngoài ra người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (aminoacid, EDTA…) và một số chất có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men… (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002)

 Khoáng đa-vi lượng

Nhu cầu khoáng của mô tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên Các chất khoáng được thành lập trong môi trường cơ bản có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy Có nhiều môi trường khoáng cơ bản đã được thiết lập cho nuôi cấy mô tùy theo mục đích và đối

tượng nghiên cứu (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006) Nhưng phổ biến nhất vẫn là môi

trường MS (Murashige và Skoog, 1962) (George, 1996)

Theo Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn (2005), khoáng đa lượng rất cần cho cây,

có ảnh hưởng rất tốt cho sự hấp thu của mô cấy và không gây độc Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là Nitrogen (N), Phospho (P), Potassium (K), Magnesium (Mg), calcium (Ca), Lưu huỳnh (S) Khoáng vi lượng là những nguyên tố mà cây trồng cần rất ít nhưng không thể thiếu cho sinh trưởng và phát triển bình thường Các vi lượng thường thêm vào môi trường là Iode (I), Bo (B), Mangan (Mn), Kẽm (Zn), Đồng (Cu), Molipden (Mo), Cobalt (Co), Sắt (Fe)

Theo Nguyễn Văn Uyển (1993) trong nuôi cấy mô thường sử dụng sắt vi lượng ở dạng phức hợp chelate (Fe-EDTA) Ở dạng này sắt không bị kết tủa mà phóng thích

từ từ vào môi trường nuôi cấy theo nhu cầu của mô thực vật

 Nguồn carbon

Mô và tế bào thực vật nuôi cấy nuôi cấy mô sống chủ yếu theo phương thức dị

dưỡng nên việc đưa đường vào môi trường nuôi cấy làm nguồn carbon cung cấp

năng lượng chủ yếu trong nuôi cấy nhiều loài thực vật (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006) Hai dạng đường thường gặp nhất trong nuôi cấy nuôi cấy mô là glucose và sucrose,

trong đó sucrose được sử dụng phổ biến hơn (Nguyễn Đức Lượng, 2001) Tùy theo mục đích nuôi cấy, nồng độ sử dụng từ 1-6%, đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường Nếu hàm lượng đường cao, mô nuôi cấy khó hút được nước, còn hàm lượng đường thấp là một trong những nguyên nhân gây ra hiện tượng thủy tinh

thể (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006)

Thạch (Agar)

Thạch được sử dụng làm chất đông cứng môi trường để làm giá thể cho môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Thạch là phức hợp polysaccharid tự nhiên được

trích từ tảo sống thuộc ngành Rhodophyta (Nguyễn Bảo Toàn, 2001) Tùy đối tượng

nuôi cấy mà hàm lượng thạch được sử dụng dao động từ 6-8 g/l (Nguyễn Xuân Linh, 1998) Nếu nồng độ thạch trong môi trường nuối cấy cao sẽ làm hạn chế sự phát triển của mô sẹo hay một bộ phận được nuôi cấy so với môi trường có ít hay không

có thạch vì thạch nhiều làm môi trường cứng lại, hạn chế trao đổi chất giữa môi trường và mô nuôi cấy (Edwin, 1993) Hàm lượng thạch cao trong môi trường nuôi

cấy sẽ hạn chế được hiện tượng thủy tinh thể Sử dụng 1,1-2% trong môi trường nuôi cấy cây a-ti-sô đã hạn chế gần như hoàn toàn hiện tượng thủy tinh thể (Debergh, 1983)

Các vitamin

Trong môi trường nuôi cấy đa số mô cấy chưa có cấu trúc tự tổng hợp lượng cần thiết nên phải bổ sung thêm vitamin từ môi trường bên ngoài vào (Lê Văn Hòa, 1997) Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamin (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxin (B6) và myo-inositol Trong đó thiamin là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) thường được dùng ở nồng độ là 0,1-10 mg/l (Bùi Bá Bổng, 1995) Myo-inositol có vai trò trong quá trình sinh tổng hợp thành tế bào (Nguyễn Xuân Linh, 1998) tham gia vào các quá trình dinh dưỡng khoáng, vận chuyển đường, trao đổi hydrocarbon, tích trữ vận chuyển và giải phóng auxin (Vũ

Văn Vụ và ctv., 2006)

pH

Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi cấy pH ảnh hưởng đến sự di chuyển của các ion và đối với hầu hết các môi trường nuôi cấy pH 5,5-6,0 trước khi khử trùng được xem là tối ưu pH môi trường cao hơn

sẽ làm cho môi trường rất rắn ngược lại pH thấp hơn giảm khả năng đông đặc của agar (Lê Văn Hoàng, 2008)

Chất điều hòa sinh trưởng

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là những chất có hoạt tính sinh học rất lớn, được tạo ra một lượng rất nhỏ để điều hòa các quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004) Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật, thành phần quan trọng nhất quyết định đến kết quả nuôi cấy là chất điều hòa sinh trưởng Chất điều hòa sinh trưởng thực vật có thể tác dụng lên mô nuôi cấy ở nồng độ rất thấp 10-9 Hiệu lực tác dụng của chúng rất khác nhau, tùy thuộc vào bản chất, nồng độ và từng loại tế bào (Phạm Đinh Thái, 1987) Hiện có hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng rộng rãi là auxin và cytokinin (Vũ Văn Vụ, 1999) Hầu hết các loài thực vật đều cần đến cytokinin để cảm ứng tạo chồi, trong khi auxin thì có vai trò ngược lại Một nồng độ cytokinin cao kết hợp với auxin thấp rất quan trọng trong sự tạo chồi

Cytokinin là nhóm phytohoocmon thứ ba được phát hiện sau auxin và gibberellin

Nó có hiệu quả đặc trưng nhất đối với thực vật là kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ, ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan của thực vật,

đặc biệt là sự phân hóa chồi (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006) Hiệu quả của cytokynin

được chú ý nhiều nhất là trong nuôi cấy mô thực vật Khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy chồi thì những hợp chất này sẽ phá vỡ trạng thái hưu miên của chồi ngọn

và kích thích sự hoạt động của các chồi bên (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Cytokinin thường được dùng để kích thích sinh trưởng và phát triển, phổ biến như BA, kinetin và 2-iP Hiệu quả của kích thích tố BA là rất đa dạng, vừa

có khả năng tạo chồi, nhân chồi và kéo dài chồi đồng thời với nồng độ thấp BA có

thể hỗ trợ sự thành lập rễ (Lee và ctv., 2003; Hashemloian và ctv., 2008) Một số

ghi nhận trong các nghiên cưu nhân chồi trong nuôi cấy mô cho rằng nếu tăng nồng

độ cytokinin sẽ nhận được nhiều chồi, tuy nhiên sẽ đẫn đến hiện tượng cây sinh trường bất thường, lá nhỏ, cong queo, mất diệp lục tố, người ta gọi hiện tượng này

là dư thừa nước (Debergh và ctv., 1981) Để giảm bớt hiện tượng này phải giảm

hàm lượng cytokinin trong môi trường cấy hoặc kết hợp với nhóm auxin (Compton

và ctv., 1993) Trong vi nhân giống dưa hấu tứ bội và nhị bội, môi trường MS bổ sung BA 1mg/l có hiệu quả cao cho việc hình thành chồi (Kapiel và ctv., 2005) Ở

dưa hấu sử dụng môi trường MS có bổ sung BA 1 mg/l cho hiệu quả tái sinh chồi

cao trong tái sinh chồi từ tử diệp (Compton và ctv., 1996; Akashivà ctv., 2005)

Hình 1.1: Công thức cấu tạo Benzyl Adenin (BA)

Nước dừa

Kết quả phân tích nước dừa từ non đến già cho thấy trong nước dừa có các amino acid tự do nồng độ đạt từ 191-685 ppm Ngoài ra, nước dừa còn có các amino acid liên kết, các acid hữu cơ, đường, myo-inositol, một số chất có hoạt tính như auxin, các cytokinin ở dạng glycoside (Nguyễn Đức Thành, 2000) Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010), diphenylurea (DPU) có hoạt tính giống như cytokinin là chất chính trong nước dừa Trong nuôi cấy mô, nước dừa thường được sử dụng với lượng 10-20% thể tích môi trường (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

1.2.4 Mẫu nuôi cấy

Tuổi và kích thước mô cấy có ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái của cây Các mảnh mô hay cơ quan đã trưởng thành thường chậm phân hóa, khó tạo ra các cơ quan mới như chồi hay rễ Do vây chúng có ít khả năng phân chia dù có tác động của các chất kích thích như auxin hay cytokinin Khả năng tạo chồi chồi cũng phụ

thuộc vào kích thước của mô, các mô cấy kể cả mô sẹo có kích thước quá nhỏ không thể đáp ứng môi trường nuôi cấy thường bị hóa nâu và không sống được (Torres, 1989)

1.2.5 Hiện tượng thừa nước của dưa hấu trong nuôi cấy mô

Những cây nuôi cấy mô thường bị ảnh hưởng bởi sự dư thừa của nhiều nhân tố

nuôi cấy dẫn đến rối loạn biến dưỡng và hình thái Trong đó hiện tượng thủy tinh thể là phổ biến hơn hết (Dương Tấn Nhựt, 2009) Hiện tượng này được quan sát trong sản suất và trong phòng thí nghiệm khoa học, đặc tính của cây thủy tinh thể là

sự thay đổi về màu sắc lá, lá trưởng thành thường mọng nước Cây thủy tinh thể thường chứa nhiều nước hơn bình thường và thiếu lớp sáp trên lá (Lâm Ngọc Phương, 2009) Hiện tượng thủy tinh thể là nguyên nhân chính làm tỉ lệ sống thấp của cây nuôi cấy mô khi sau khi đem ra vườn ươm (Dương Tấn Nhựt, 2009)

Trong nuôi cấy dưa hấu nuôi cấy mô, giảm hiện tượng thủy tinh thể bằng cách:

+ Giảm sự hút nước bằng cách tăng nồng độ đường

+ Tăng cường độ ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng

+ Sử dụng nắp nhựa có lỗ nhằm lằm tăng sự thoáng khí cho mẫu cấy và tăng hàm lượng agar khi pha môi trường (Lâm Ngọc Phương và Nguyễn Bảo Vệ, 2005)

1.2.6 Lợi và bất lợi của nuôi cấy mô

 Lợi ích

- Cây con tạo ra có đặc điểm di truyền giống cây mẹ

- Nhân giống từ các mẫu cấy rất nhỏ

- Tạo ra cây sạch bệnh

- Tạo ra số lượng cây nhiều trong thời gian ngắn

- Không lệ thuộc vào thời tiết hay mùa vụ

- Mẫu vật có thể dữ trữ lâu dài

- Không đòi hỏi diện tích nhiều như duy trì cây gốc ngoài đồng ruộng

- Không tốn chi phí lao động khi chăm sóc cây mẹ

 Bất lợi

- Chi phí đầu tư ban dầu khá tốn kém

- Để tồn tại trong in vitro, cây cần nhiều năng lượng cung cấp từ bên ngoài như

đường

- Cây in vitro có sức sống yếu hơn cây trồng bên ngoài trong giai đoạn đầu để cây

thích nghi (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

1.3 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô

Ngày nay ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và công nghệ sinh học có vai trò rất lớn trong chọn giống, cải tiến giống cây trồng và nhân giống hiện đại

Nuôi cấy mô đã được ứng dụng trên quy mô công nghiệp, nhân giống hàng loạt cây trồng, hoa cảnh có giá trị kinh tế cao và đóng góp lớn cho nền kinh tế

Nuôi cấy mô tạo ra nguồn cây giống phục vụ nghiên cứu, chọn tạo giống, giúp nhân nhanh các cây khó nhân giống bằng phương pháp thông thường

Nuôi cấy mô còn giúp bảo tồn nguồn cây giống, các gen quý hiếm bên cạnh việc tạo giống sạch bệnh và phục hồi giống nhiễm virus (Nguyễn Bảo Toàn, 2010) Kết hợp vi nhân giống với làm sạch virus, phục tráng các giống cây bị suy thoái Nuôi cấy mô còn giúp bảo tồn nguồn cây giống, các gen quý hiếm… (Lê Trần Bình, 1997); (Vũ Văn Vụ, 2006)

1.4 Các nghiên cứu về tạo chồi và nhân chồi nuôi cấy mô

1.4.1 Các nghiên cứu về tạo chồi và nhân chồi từ đỉnh sinh trưởng

Theo Nguyễn Thị Phương Thảo và ctv., (2010) sự có mặt BA trong môi trường

nuôi cấy đã làm tăng tỉ lệ mẫu tạo chồi và hệ số nhân chồi từ đỉnh sinh trưởng, môi trường chứa 1 mg/l BA là môi trường nhân nhanh thích hợp nhất đối với chồi đỉnh dưa hấu, với hệ số nhân 15,5 chồi/mẫu

Năm 1993, Micheal và cs., sử dụng BA, kinetin và TDZ để cảm ứng nhân nhanh chồi từ chồi đỉnh một số giống dưa hấu nhị bội và tứ bội Hệ số nhân đạt được cao nhất ở nồng độ 1M BA, hệ số này dao động từ 2,7-11,7 chồi/mẫu sau 4 tuần nuôi cấy tùy thuộc vào từng giống Mặt khác hệ số nhân ở nồng độ 1M BA cao gấp 1,5-2,8 lần so với công thức chứa kinetin và TDZ

Kết quả hệ số nhân chồi từ chồi đỉnh của 2 giống dưa hấu dưa hấu nhị bội SA100

và SA101 đạt số chồi cao nhất khi bổ sung vào môi trường 10 µM BA (đối với giống SA100) và 4,4 µM BA (giống SA101) với hệ số nhân đạt lần lượt là 28 và 23

chồi/mẫu sau 3 tuần nuôi cấy theo Tarek và ctv., (2008)

Theo Vũ Thị Lan và ctv., (2012), cũng đã tiến hành thí nghiệm nhân giống dứa Cayen (Ananas comosus L.) bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong môi

trường dịch thể (MS + 2,5% đường sucrose + 1,0 mg/l NAA + 2,0 mg/l BAP) phù hợp cho tạo protocorm và nhân chồi Hệ số nhân chồi rất cao đạt 5,50 lần sau 10 tuần

1.4.2 Các nghiên cứu về tạo chồi và nhân chồi từ tử diệp

Nuôi cấy mô từ tử diệp vị trí phát sinh chồi thường gặp khi tạo chồi mảnh tử diệp

là ngay rìa của vết cắt phía gần phôi (Gaba và ctv., 1999; Han và ctv., 2004), và

không phải tất cả chồi tạo chồi đều có thể nuôi cấy thành công, một số chồi biến

dạng sẽ chịu quá trình loại thải (Najla và ctv., 2007)

Cụm tế bào phân chia mạnh, có nguồn gốc từ lớp tế bào thứ hai thuộc phần biểu

bì 2n bao quanh phôi nhũ, nghĩa là đa số chồi tạo chồi là cây nhị bội (2n), trong khi

phần phôi nhũ là tam bội (3n) (Tabei và ctv., 1993; Gaba và ctv., 1999; Mendi và ctv., 2009) Vì vậy, những chồi tạo chồi sẽ giống nhau về mặt di truyền và giống hệt cây mẹ (Krug và ctv., 2005) Tuy nhiên theo Lee và ctv., (2003), đa số chồi tạo chồi

là cây nhị bội, nhưng tỷ lệ cây dạng thể khảm (nhị bội + tứ bội) và cây tứ bội cũng

là đáng kể, và tỷ lệ này sẽ tăng lên theo nồng độ BA được sử dụng Đây được xem như là phương pháp chọn lọc các dòng cây tứ bội thay cho việc xử lý bằng các hóa chất gây đa bội khác

Trên cây bí rợ, tạo chồi từ tử diệp hạt bí rợ 4 ngày sau khi nảy mầm in vitro và sử

dụng môi trường MS có bổ sung BA 1mg/l cho hiệu quả tạo chồi chồi cao, các chồi hầu hết là cây nhị bội và ở giai đoạn tạo rễ sử dụng BA 0,1 mg/l và 2 g/l than hoạt tính sẽ cho hiệu quả tạo rễ cao sau 2 tuần nuôi cấy (Lee và Chung, 2006)

Theo Krug và ctv., (2005) trên dưa hấu việc tạo chồi tử diệp từ nguồn hạt gieo in vitro với độ tuổi từ 3-5 ngày sau khi nẩy mầm là khá dễ dàng Nhưng có một điểm

quan trọng cần lưu ý là giữa vùng gần và vùng xa phôi hữu tính thường có phản ứng khác nhau, vùng gần sẽ thường cho hiệu quả tốt hơn và điều này cũng được Lee và

ctv., (2003) ghi nhận Tuy nhiên, trong nghiên cứu của Tarek và ctv., (2008) trên 2

giống dưa hấu nhị bội SA100 và SA101, số chồi/mẫu thu được cao nhất là 5 chồi từ

lá mầm trong môi trường chứa 10 µM BA

Bảng 1.1: Quy trình tạo chồi từ tử diệp áp dụng cho một số cây thuộc họ bầu-bí-dưa

(Lee và ctv., 2003)

Môi trường MS/2 bổ sung BA 0,1mg/l

Thuần dưỡng

Chuyển ra đồng

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Thời gian thực hiện

Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 5/2013 đến tháng 5/2014

2.2 Địa điểm

Thí nghiệm được thực hiện tại phòng nuôi cấy mô của Bộ môn Sinh lý-Sinh hóa, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ Điều kiện phòng nuôi cấy với nhiệt độ 26 2 0C, cường độ chiếu sáng 1500 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, trong giai đoạn gieo hạt mẫu thí nghiệm được đặt trong tủ tối

2.3 Phương tiện

2.3.1 Vật liệu và trang thiết bị

Vật liệu: Sử dụng hạt dưa hấu tứ bội dòng/giống Thành Longtb và Hoàng Longtbđược tạo thành từ phòng nuôi cấy mô của Bộ môn Sinh lý-Sinh hóa, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ

Trang thiết bị: Sử dụng trang thiết bị của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô như:

keo thủy tinh, dụng cụ pha môi trường (ca nhựa, ống đong, pipet…), nồi hấp thanh trùng, lò vi ba (Microwave), tủ sấy, tủ cấy, máy đo pH

2.3.2 Hóa chất sử dụng

Hóa chất:

Khoáng đa lượng (NH4NO3, KNO3, KH2PO4, MgSO4 7H2O, CaCl2 2H2O)

Khoáng vi lượng (MnSO4 H2O, ZnSO4 4H2O, H3BO3, KI, Na2MoO4 2H2O

Chất điều hòa sinh trưởng: Benzyl adenin (BA)

Vitamin (thiamin, pyridoxin, acid nicotinic)

Các chất khác: Đường sucrose, agar, nước dừa

2.4.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Môi trường cơ bản theo công thức của Murashige và Skoog, 1962 (MS) có bổ sung các vitamin (thiamin, pyridoxin, acid nicotinic) 1 mg/l, myo-inositol 0,1 g/l, agar 6,5 g/l, đường sucrose 30 g/l, nước dừa 100 ml/l, chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng là BA Tùy theo từng thí nghiệm mà bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BA ở nồng độ khác nhau (0; 0,2; 0,5; 1 và 2 mg/l) pH môi trường được điều chỉnh về 5,7-5,8 trước khi nấu Môi trường được nấu bằng máy Microwave trong vòng 1 phút hoặc nấu bằng bếp điện từ trong vòng 10-15 phút cho tan hết agar Sau khi nấu xong rót môi trường vào các keo thủy tinh sạch đã chuẩn bị sẵn, rót môi trường có bổ sung BA ở các nồng độ 0; 0,5; 1 và 2 mg/l với thể tích 30 ml cho vào keo lùn dùng bọc ni lông bao kín miệng keo (bố trí thí nghiệm 2) Tiếp theo, rót môi trường BA 0,2 mg/l với thể tích 30 ml vào keo cao dùng cho môi trường cấy hạt, tương tự rót 40 ml môi trường BA 0; 1 và 2 mg/l vào keo cao dùng nắp nhựa đậy kín (bố trí thí nghiệm 1) Chuyển các keo môi trường vào nồi hấp thanh trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1 atm, trong 90 phút

2.4.3 Vô trùng mẫu cấy

Hạt dưa hấu sau khi tách khỏi trái được rửa sạch nhớt, sau đó chuyển vào tủ cấy khử trùng trong Chlorin 5% lắc đều trong 15 phút, rửa lại 2 lần bằng nước cất đã hấp thanh trùng, dùng gòn có thấm cồn và dao cấy để tách vỏ hạt, tiếp tục khử trùng qua HgCl2 1‰ (chú ý thêm vào 1 hoặc 2 giọt xà bông Sunlight lúc khử) trong 5 phút và rửa lại 4 hoặc 5 lần bằng nước cất đã hấp thanh trùng và tiến hành bố trí thí nghiệm

Sau khi khử trùng hạt, dùng dao, kẹp tiến hành cắt bỏ hai đầu tận cùng (một đầu chứa phần phôi hữu tính và một đầu rìa xa của tử diệp) và hai bên rìa của tử diệp, phần còn lại được cắt làm hai phần theo chiều ngang và cắt theo chiều dọc chia tử diệp thành 4 phần (Hình 2.1) và cấy vào keo thủy tinh lùn có chứa môi trường nuôi cấy nghiệm thức đã được chuẩn bị sẵn (cấy 4 mẫu cùng 1 keo)

 Các chỉ tiêu theo dõi

+ Tỷ lệ mẫu tử diệp sống (mẫu có màu xanh)

+ Tỷ lệ mẫu tử diệp tạo mô sẹo

+ Kích thước mô sẹo (chiều dài mô sẹo (cm) và chiều rộng mô sẹo (cm))

+ Tỷ lệ mô sẹo tạo chồi

+ Số chồi gia tăng (chồi có chiều cao >0,5 cm)

+ Số lá gia tăng (lá mở hoàn toàn, đường kính lá lớn hơn 0,3 cm)

Các chỉ tiêu được lấy định kì 7 ngày/lần (bắt đầu theo dõi sau khi cấy 7 ngày)

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng nồng độ Benzyl Adenin (BA) lên sự tạo chồi từ đỉnh sinh trưởng của hai giống dưa hấu tứ bội Thành Long tb và Hoàng Long tb

Thí nghiệm được bố trí theo thể thứchoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 3 keo, mỗi keo cấy 4 mẫu

Mục tiêu: Tìm nồng độ BA thích hợp cho sự tạo chồi từ đỉnh sinh trưởng của hai giống dưa hấu tứ bội Thành Longtb và Hoàng Longtb

Hình 2.1: Phương pháp cắt mẫu tử diệp diệp

Phôi

Mảnh 1

Mảnh 2 Mảnh 4

Mảnh 3

Hạt sau khi khử trùng, dùng kẹp đã vô trùng gấp hạt dưa cấy vào môi trường MS

có bổ sung BA 0,2 mg/l đã chuẩn bị sẵn, dùng keo quấn vòng nắp keo và chuyển mẫu vào tủ tối, sau 3 ngày hạt nảy mầm tiếp tục chuyển mẫu cấy ra ánh sáng Sau 7 ngày tiếp đó, hạt sẽ phát triển thành cây con chọn những cây con cao khoảng 4-5

cm, phát triển bình thường, không bị biến dạng, thừa nước, tiến hành thao tác cắt bỏ phần tử diệp và trục hạ diệp trên giấy cấy vô trùng, chừa phần đỉnh sinh trưởng khoảng 0,5 cm Cấy phần đỉnh sinh trưởng vào môi trường bố trí thí nghiệm đã chuẩn bị trước (cấy 4 mẫu vào cùng 1 keo) như mô tả ở Hình 2.2

Hình 2.2: Thao tác cắt cấy đỉnh sinh trưởng từ hạt dưa hấu tứ bội

A: Hạt dưa hấu tứ bội

B: Phôi sau khi tách bỏ vỏ

C: Hạt đã khử trùng và cấy vào môi trường MS+0,2 mg/l BA

D: Hạt dưa hấu nảy mầm sau 12 ngày cấy

E: Tiến hành cắt bỏ lá mầm và trục hạ diệp, phần đỉnh sinh trưởng khoảng dài 0,5 cm F: Cấy đỉnh sinh trưởng vào môi trường nghiệm thức để bố trí thí nghiệm

 Các chỉ tiêu theo dõi

+Chiều cao chồi gia tăng (tính từ gốc đỉnh sinh trưởng vị trí cao nhất)

+Số chồi gia tăng (chồi có chiều cao >0,5 cm)

+Số lá gia tăng (lá trưởng thành, mở hoàn toàn và lá >0,3 cm)

Chỉ tiêu ghi nhận 7 ngày/lần (bất đầu theo dõi sau khi cấy đỉnh sinh trưởng 7 ngày)

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng nồng độ Benzyl Adenin (BA) lên sự tạo chồi từ tử diệp của hai giống dưa hấu tứ bội Thành Long tb và Hoàng Long tb

3.1.1 Tỉ lệ mẫu tử diệp sống

Tỉ lệ sống của mẫu tử diệp được ghi nhận sau 7 ngày nuôi cấy khác biệt ở mức 5% cho thấy giống Thành Longtb có tỉ lệ mẫu tử diệp sống cao đạt 89,2% cao hơn so với giống Hoàng Longtb (Bảng 3.1)

Bên cạnh đó, nồng độ BA cũng ảnh hưởng đến tỉ lệ sống của mẫu tử diệp ở mức

ý nghĩa 5% Trong đó, nồng độ BA 2 mg/l đạt tỉ lệ mẫu sống cao 80,6% cao hơn so với các nghiệm thức còn lại

Tuy nhiên, không có sự tương tác giữa giống và nồng độ BA lên tỉ lệ sống của mẫu tử diệp sau 7 ngày cấy

Bảng 3.1: Tỉ lệ sống (%) của mẫu tử diệp 2 giống dưa hấu tứ bội Thành Long tb và Hoàng Long tb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong môi trường có nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 7 NSKC

3.1.2 Tỉ lệ mẫu tử diệp tạo mô sẹo

Sau 14 ngày nuôi cấy các mẫu tử diệp bất đầu hình thành mô sẹo ở vị trí vết cắt Bảng 3.2 cho thấy giống có ảnh hưởng đến tỉ lệ tạo mô sẹo của các mảnh tử diệp ở thời điểm 14 NSKC khác biệt ở mức ý nghĩa 5% Trong đó, các mảnh tử diệp giống Thành Longtb đạt tỉ lệ tạo mô sẹo cao nhất là 43,8% khác biệt so với giống Hoàng Longtb (32,1%)

Các mảnh tử diệp cho tỉ lệ tạo mô sẹo cao trong môi trường có nồng độ BA 1 mg/l và 2 mg/l lần lượt đạt 43,1% và 47,6% khác biệt thông kê ở mức ý nghĩa 1%

so với trong môi trường không được bổ sung BA nhưng không có sự khác biệt đối với môi trường bổ sung BA ở nồng độ 0,5 mg/l

Không có sự tương tác giữa 2 nhân tố giống và nồng độ BA về tỉ lệ mảnh tử diệp tạo mô sẹo ở thời điểm 14 NSKC

Bảng 3.2: Tỉ lệ (%) tử diệp tạo mô sẹo của 2 giống dưa hấu tứ bội Thành Long tb và Hoàng Long tb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong môi trường có nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 14 NSKC

Sau 21 ngày nuôi cấy tiếp theo các mảnh tử diệp tiếp tục tạo mô sẹo (Hình 3.1),

các mẫu tử diệp giống dưa hấu tứ bội Thành Longtb tạo mô sẹo tốt đạt tỉ lệ cao 62,5% khác biệt thống kê so với tỉ lệ tử diệp tạo mộ sẹo của giống Hoàng Longtb (45,4%) ở mức ý nghĩa 1% qua kết quả ghi nhận ở Bảng 3.3

Tỉ lệ tạo mô sẹo của mảnh tử diệp 21 NSKC cũng bị ảnh hưởng bởi nồng độ BA

ở mức ý nghĩa 1% Môi trường cho tỉ lệ tử diệp tạo mô sẹo cao khi được bổ sung

BA ở nồng độ BA 1 mg/l và BA 2 mg/l đạt tỉ lệ lần lượt là 66,7% và 58,3% khác biệt ý nghĩa thống kê so với môi trường có bổ sung BA ở nồng độ 0,5 mg/l và không bổ sung BA (0 mg/l)

Tuy nhiên, không có sự tương tác giữa nhân tố giống và nồng độ BA đến tỉ lệ tạo

mô sẹo của các mảnh tử diệp

Bảng 3.3: Tỉ lệ (%) tử diệp mô sẹo của 2 giống dưa hấu tứ bội Thành Long tb và Hoàng Long tb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong môi trường có nồng độ BA khác nhau ở thời điểm 21 NSKC

phản ứng tạo mô sẹo chính là quá trình phân hóa tế bào (Sun và ctv., 2000)

Về hình dạng thì khối mô sẹo có máu trắng, tương đối xốp và rời rạc, đây là một dạng mô sẹo rất khó để tái sinh chồi, điều này lý giải vì sao các tác giả đều cho rằng

sẽ rất khó khăn khi thực hiện quá trình tái sinh chồi gián tiếp cây dưa hấu từ khối

mô sẹo (Gurel và ctv., 2001; Akashi và ctv., 2005)

3.1.3 Kích thước mô sẹo

Quan sát mẫu cấy cho thấy sau 7 ngày nuôi cấy mảnh tử diệp bất đầu có màu xanh, phồng to ra và dầy lên như có sự hấp thu nước của các mảnh tử diệp từ môi

trường nuôi cấy, điều này cũng được Nguyễn Thị Phương Thảo và ctv., 2010 theo

dõi và quan sát trước đó

3.1.3.1 Chiều dài mô sẹo

Kết quả bảng 3.4, cho thấy giống không ảnh hưởng đến chiều dài của mô sẹo dưa hấu sau 7 ngày nuôi cấy

Tuy nhiên, chiều dài mô sẹo bị ảnh hưởng bởi nồng độ BA được bổ sung trong môi trường nuôi cấy ở mức ý nghĩa thống kê 5% Môi trường có bổ sung BA nồng

độ 2 mg/l có mô sẹo phát triển tốt đạt chiều dài dài nhất 1,03 cm khác biệt với các nghiệm thức còn lại

Có sự tương tác giữa giống và nồng độ BA đến chiều dài mô sẹo ở mức ý nghĩa 5% Qua phân tích thống kê thấy mô sẹo của giống Thành Longtb nuôi cấy trong môi trường bổ sung BA 2 mg/l có chiều dài dài nhất 1,17 cm khác biệt so với các nghiệm thức còn lại

Bảng 3.4: Chiều dài mô sẹo (cm) của 2 giống dưa hấu tứ bội Thành Long tb và Hoàng Long tb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong môi trường có nồng độ BA khác nhau

ở thời điểm 7 NSKC

Giống (A)

Nồng độ BA (mg/l) (B)

Trung bình (A)

Kết quả Bảng 3.5 cho thấy giống có ảnh hưởng đến chiều dài mô sẹo ở mức ý

với chiều dài của mô sẹo giống Thành Longtb sau 14 ngày nuôi cấy

Nồng độ BA cũng ảnh hưởng đến chiều dài mô sẹo ở thời điểm 14 NSKC ở mức

ý nghĩa 5% Chiều dài mô sẹo cấy trong môi trường có nồng độ BA 2 mg/l đạt 1,32

cm khác biệt với chiều dài mô sẹo cấy trong môi trường BA 0,5 mg/l và môi trường không có BA nhừng không khác biệt với nồng độ BA 1 mg/l (1,18 cm)

Không có sự tương tác giữa giống và nồng độ ảnh hưởng lên chiều dài mô sẹo 14 NSKC

Bảng 3.5: Chiều dài mô sẹo (cm) của 2 giống dưa hấu tứ bội Thành Long tb và Hoàng Long tb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong môi trường có nồng độ BA khác nhau

Qua 21 NSKC, nhân tố giống ảnh hưởng đến chiều dài mô sẹo mức ý nghĩa 5%

biệt ý nghĩa thống kê 5% so với chiều dài mô sẹo giống Thành Longtb (1,27 cm) (Bảng 3.6)

Chiều dài mô sẹo bị ảnh hưởng bởi nồng độ BA bổ sung trong môi trường nuôi cấy có sự khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% giữa các nghiệm thức Trong đó, chiều dài mô sẹo đạt 1,62 cm được nuôi cấy trong môi trường bổ sung BA 2 mg/l không khác biệt với môi trường có BA 1 mg/l nhưng khác biệt với nghiệm thức có

bổ sung BA thấp (0,5 mg/l) và không có BA (0 mg/l)

Chiều dài mô sẹo không bị ảnh hưởng bới nhân tố tương tác giữa giống và nồng độ

BA ở giai đoạn 21 NSKC

Bảng 3.6: Chiều dài mô sẹo (cm) của 2 giống dưa hấu tứ bội Thành Long tb và Hoàng Long tb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong môi trường có nồng độ BA khác nhau

Chiều dài sẹo bị ảnh hưởng bởi nhân tố BA ở mức ý nghĩa 5%, trong đó chiều dài của mô sẹo cấy trong môi trường có BA 2 mg/l và BA 1 mg/l có chiều dài dài hơn

mô sẹo của các nghiệm thức còn lại, chiều dài mô sẹo mẫu dưa hấu ở 2 nồng độ lần lượt đạt 1,95 cm và 1,73 cm

Vẫn không có sự ảnh hưởng tương tác của giống và nồng độ BA lên chiều cao

mô sẹo dưa hấu tứ bội

Bảng 3.7: Chiều dài mô sẹo (cm) của 2 giống dưa hấu tứ bội Thành Long tb và Hoàng Long tb được tạo chồi từ tử diệp nuôi cấy trong môi trường có nồng độ BA khác nhau