khảo sát sự lưu hành của vi khuẩn e coli sinh beta lactamase phổ rộng trên gà khỏe tại một số trại gà thuộc huyện mỹ tú tỉnh sóc trăng

Vi khuẩn đề kháng kháng sinh làm giới hạn khả năng điều trị nhiễm trùng, lây truyền qua nhiều thế hệ, hơn thế nữa, các chủng vi khuẩn không gây bệnh nhưng đề kháng kháng sinh hay đa đề k

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

HUỲNH NGỌC HUYỀN

Luận văn tốt nghiệp Ngành: BÁC SĨ THÚ Y

KHẢO SÁT SỰ LƯU HÀNH CỦA VI KHUẨN E coli

SINH BETA LACTAMASE PHỔ RỘNG TRÊN

GÀ KHỎE TẠI MỘT SỐ TRẠI GÀ THUỘC HUYỆN MỸ TÚ TỈNH SÓC TRĂNG

Cần Thơ, 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

Luận văn tốt nghiệp Ngành BÁC SĨ THÚ Y Tên đề tài

MSSV: 3103025 Lớp: CN10Y4A1 – K36

Cần Thơ, 2014

KHẢO SÁT SỰ LƯU HÀNH CỦA VI KHUẨN E coli

SINH BETA LACTAMASE PHỔ RỘNG TRÊN

GÀ KHỎE TẠI MỘT SỐ TRẠI GÀ THUỘC HUYỆN MỸ TÚ TỈNH SÓC TRĂNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

Đề tài: “Khảo sát sự lưu hành của vi khuẩn E coli sinh beta lactamase phổ

rộng trên gà khỏe một số trại gà thuộc huyện Mỹ Tú tỉnh Sóc Trăng”, do sinh viên Huỳnh Ngọc Huyền thực hiện tại Bộ môn Thú Y, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ Từ tháng 8/2014 đến tháng 12/2014

Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014 Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014

Huỳnh Ngọc Trang

Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014

Duyệt Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn trường Đại học Cần Thơ, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Bộ môn Thú y cùng tất cả thầy cô đã tận tâm dạy dỗ truyền đạt những tri thức khoa học và kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt quá trình rèn luyện và học tập tại trường

Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn đến cô Bùi Thị Lê Minh và cô Huỳnh Ngọc Trang

đã tạo điều kiện tốt nhất, tận tình giúp đỡ và hướng dẫn để tôi hoàn thành luận văn Cảm ơn các anh chị cao học đã nhiệt tình hỗ trợ giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong suốt quá trình làm bài

Xin cảm ơn gia đình, bạn bè tất cả những người đã luôn bên tôi, giúp đỡ tôi hết mình những lúc khó khăn để tôi hoàn thành tốt

Một lần nữa xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người

là 59,1%, 9,1% và 13,64%, không phát hiện Escherichia coli sinh ESBL trên thịt Thử nghiệm kháng sinh đồ 46 chủng Escherichia coli sinh ESBL nhạy cảm với amikacin 100%, fosfomycin 95,65% và doxycylin 84,78% Đề kháng cao với ampicillin 100%, cefuroxime 95,65%, cefaclor, gentamycin, streptomycin, trimethoprim-sulfamethoxazole 97,83%, kanamycin 78,26%, ofloxacin 93,48%, norfloxacin 91,3% Các chủng Escherichia coli ESBL cùng lúc đề kháng từ 3 đến

11 loại kháng sinh là 100% (46/46) với 11 kiểu hình đa kháng Trong đó kháng cùng lúc 3 loại kháng sinh chiếm 2,17%, kháng 7 loại chiếm 6,52%, kháng 8 loại 17,39%, kháng 9 loại 30,44%, kháng 10 loại 32,61%, kháng 11 loại 10,87%

MỤC LỤC

TRANG TỰA i

TRANG DUYỆT …ii

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM LƯỢC iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH BẢNG viii

DANH SÁCH HÌNH ix

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 2

2.1 Vi khuẩn Escherichia coli 2

2.1.1 Đặc điểm hình thái 2

2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy 2

2.1.3 Đặc tính sinh hóa 3

2.1.4 Sức đề kháng và tính gây bệnh 4

2.2 Kháng sinh nhóm beta- lactam 5

2.2.1 Phân loại kháng sinh nhóm beta-lactam 5

2.2.2 Cơ chế tác động của kháng sinh nhóm beta- lactam 5

2.2.3 Cơ chế đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh 5

2.3 Men beta- lactamase phổ rộng 6

2.3.1 Đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli sinh ESBL 6

2.3.2 Phương pháp phát hiện vi khuẩn E coli sinh ESBL 6

2.4 Những nghiên cứu vi khuẩn E coli sinh ESBL trên thế giới 8

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 11

3.1 Phương tiện nghiên cứu 11

3.1.1 Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu 11

3.1.2 Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm 11

3.2 Phương pháp nghiên cứu 11

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu 11

3.2.2 Phân lập vi khuẩn E coli sinh ESBL 12

3.2.3 Phương pháp làm kháng sinh đồ 14

3.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 15

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn E coli sinh ESBL trên gà ở huyện Mỹ Tú tỉnh Sóc Trăng 16

4.2 Kết quả sự hiện diện E.coli sinh ESBL trên cơ quan phủ tạng và phân 17

4.3 Kết quả khảo sát tính nhạy cảm của vi khuẩn E coli đối với một số loại kháng sinh 19

4.4 Kết quả đa kháng của vi khuẩn E coli sinh ESBL đối với một số loại kháng sinh 21

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 23

5.1 Kết luận 23

5.2 Đề nghị 23

TÀI LIỆU THAM KHẢO 24

PHỤ CHƯƠNG 27

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ

CSLI Clinical and Laboratory Standards Institute

ESBL Extended spectrum beta lactamase

EMB Eosin Methylene Blue

IMViC Indole, Methy Red, Voges prokauer, Citrate

DANH SÁCH BẢNG

3.1 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E coli 12

3.2 Tiêu chuẩn phân tích kết quả đường kính vô khuẩn của kháng

sinh (CLSI, 2014)

15

4.1 Tỉ lệ vi khuẩn E coli ESBL trên gà khỏe ở huyện Mỹ Tú 16

4.2 Tỉ lệ dương tính E coli ESBL trên cơ quan gan, thịt, phổi và

mẫu phân

17

4.3 Tỉ lệ kháng của vi khuẩn E coli ESBL 19

4.4 Tỉ lệ đa kháng và kiều kháng của vi khuẩn E coli ESBL với

kháng sinh của vi khuẩn E coli ESBL

21

DANH SÁCH HÌNH

1 Vi khuẩn E coli dưới kính hiển vi (X=10µm) 2

2 Vi khuẩn E coli trên môi trường MC 12

4 Quy trình phân lập vi khuẩn E coli ESBL 13

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi nói chung và ngành chăn nuôi gà công nghiệp nói riêng đang khẳng định vai trò hết sức quan trọng vào sự tăng trưởng chung của đất nước, chiếm tỷ trọng cao trong cơ cấu kinh tế nông nghiệp Chăn nuôi gà công nghiệp không chỉ dừng lại ở tập quán sản xuất đơn thuần, mà ngày càng được người chăn nuôi chú ý đầu tư, áp dụng tiến bộ khoa học vào sản xuất để nâng cao năng suất, chất lượng

Sóc Trăng là tỉnh có nhiều tiềm năng lợi thế về điều kiện tự nhiên, kinh tế phù hợp

để phát triển chăn nuôi gà công nghiệp Theo kết quả điều tra chăn nuôi thời điểm 1/4/2013 toàn tỉnh có 4,06 triệu con gia cầm, trong đó, đàn gà hiện có 2,7 triệu con, chiếm 68,28% tổng đàn gia cầm, tăng 6,66% so với cùng thời điểm năm trước (Hoàng Thọ, 2013) Tuy nhiên, việc phát triển nhanh chóng đồng thời cũng làm tăng nguy cơ lây lan dịch bệnh, ảnh hưởng không nhỏ tới năng suất và hiệu quả chăn nuôi Theo Hồ Thị Việt Thu (2012), hầu hết các loài gia cầm ở mọi lứa tuổi

đều mẫn cảm với vi khuẩn E coli Trong các bệnh nhiễm trùng trên gà thì E.coli là

bệnh phổ biến nhất, xảy ra ở mức độ ngày càng tăng và có thể trở thành một vấn nạn trong ngành công nghiệp chăn nuôi gia cầm (Võ Thị Trà An, 2012)

Để đối phó với dịch bệnh do E coli gây ra thì kháng sinh là lựa chọn hàng đầu và

đã đem lại nhiều thành công trong điều trị Tuy nhiên, việc sử dụng rộng rãi kháng

sinh đã vô tình tạo ra áp lực chọn lọc để vi khuẩn E coli có khả năng kháng lại một

số loại kháng sinh bằng cách sinh men beta- lactam Những đối tượng vật nuôi có

áp lực sử dụng kháng sinh nhiều như gà thì vi khuẩn gây bệnh hiện diện trên gà càng có khả năng kháng với kháng sinh cao hơn vi khuẩn hiện diện trên các loại vật nuôi khác Vi khuẩn đề kháng kháng sinh làm giới hạn khả năng điều trị nhiễm trùng, lây truyền qua nhiều thế hệ, hơn thế nữa, các chủng vi khuẩn không gây bệnh nhưng đề kháng kháng sinh hay đa đề kháng còn là nơi tồn trữ tính kháng thuốc để truyền cho những vi khuẩn gây bệnh khác (Võ Thị Trà An, 2007) Hiện tượng

kháng thuốc của E coli ở gia cầm là do kháng sinh được bổ sung thường xuyên vào

thức ăn và nước uống để phòng trị bệnh, cũng như việc sử dụng kháng sinh không hợp lí trong chăn nuôi không theo khuyến cáo (Đỗ Võ Anh Khoa và Lưu Hữu Mãnh, 2012)

Mỹ Tú là một trong những huyện thuộc tỉnh Sóc Trăng tập trung nhiều cơ sở chăn nuôi gà công nghiệp qui mô lớn Tuy nhiên chưa có những nghiên cứu về tỉ lệ

E coli sinh ESBL trên những trang trại gà của huyện, do đó “Khảo sát sự lưu

hành của vi khuẩn E coli sinh beta- lactamase phổ rộng trên gà khỏe tại một

số trại gà thuộc huyện Mỹ Tú tỉnh Sóc Trăng” được thực hiện

CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN

2.1 Vi khuẩn Escherichia coli

Vi khuẩn Escherichia coli (E coli) lần đầu tiên phân lập từ phân trẻ em bị tiêu chảy

năm 1885 và đặt theo tên của bác sĩ nhi khoa Đức

Vi khuẩn E coli thuộc chi Escherichia họ Anterobacteriaceae, họ vi khuẩn thường

trực ở trong ruột, chiếm tới 80% các vi khuẩn hiếu khí vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực đường tiêu hoá, vừa là vi khuẩn gây nhiều bệnh ở đường ruột và ở các

cơ quan khác (Lê Văn Tạo, 1997) Theo Hồ Thị Việt Thu (2012), E coli được thải

qua phân với số lượng lớn, hầu hết các loài gia cầm đều mẫn cảm với vi khuẩn

E coli

Theo P J Quinn et al (1994), E coli có nhiều trong ruột của động vật ăn thịt, ăn

tạp hơn là động vật ăn cỏ, sống vài tuần đến vài tháng trong bụi, phân, nước, ngoài

tự nhiên

Các loài E coli hiện diện rộng rãi trong môi trường bị ô nhiễm phân hay chất thải

hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường Gần đây người ta còn chứng

minh được rằng E coli cũng hiện diện ở những vùng nước ấm, không bị ô nhiễm chất hữu cơ Các dòng E coli gây bệnh gây ra các triệu chứng rối loạn đường tiêu

hóa (Trần Minh Tùng, 2010)

2.1.1 Đặc điểm hình thái

E coli là trực khuẩn ngắn, Gram âm, có hình dạng đồng nhất và không hình thành

nha bào Kích thước trung bình từ 2 – 3µm x 0,6µm, phần lớn E coli di động và có

lông roi quanh thân (Hồ Thị Việt Thu, 2012) Vi khuẩn bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẩm ở hai đầu, khoảng giữa nhạt hơn Nếu cố định bằng axit

osmic rồi quan sát dưới kính hiển vi thấy tế bào E coli có nhân đó là một khối nằm

trong nguyên chất màu sáng (Nguyễn Như Thanh, 1997).

Hình 1 Vi khuẩn E coli dưới kính hiển vi (X=10µm)

http://bacteriainphotos.com/

2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy

E coli là trực khuẩn yếm khí và hiếu khí tùy tiện, có thể sống được ở nhiệt độ từ 5-

400C, nhiệt độ thích hợp là 370C, pH thích hợp là 7,2- 7,4 phát triển được ở pH 5,5-

8,0 (Lưu Hữu Mãnh, 2010)

Theo Nguyễn Ngọc Hải, (2012) E coli phát triển dễ dàng trên môi trường nuôi cấy

thông thường ở 370C Trên môi trường MacConkey, Endo, EMB (Eosin Methylen

Blue) E coli hình thành nên khuẩn lạc điển hình có thể phân biệt với các vi khuẩn

khác

Trên môi trường MacConkey, vi khuẩn lên men đường lactose và hình thành những khuẩn lạc màu đỏ hồng, tròn, bóng, không nhầy Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đỏ có ánh kim hoặc không có ánh kim trên môi trường Endo, khuẩn lạc có màu đen tím trên môi trường EMB (Lê Văn Việt Mẫn, 2006)

Môi trường Mueller-Hinton Agar là môi trường trong, dùng cho thử nghiệm tính nhạy cảm của vi sinh vật với kháng sinh Môi trường cũng thường được dùng để thử nghiệm sự thuỷ phân tinh bột

Môi trường NA (Nutrient Agar) thường được dùng làm môi trường lưu giữ chủng sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính từ 2 – 3 mm Nuôi lâu khuẩn lạc gần nâu nhạt và phát triển rộng ra

2.1.3 Đặc tính sinh hóa

E coli có khả năng lên men đường fructoz, glucose, levulo, galactoz, lactose,

mantose, mannitol, xylose, glycerol, rhamnose, sorbitol và arabinose Hầu hết các

chủng vi khuẩn E coli đều lên men đường lactose nhanh và sinh hơi, đây là một đặc điểm quan trọng để phân biệt vi khuẩn E coli và Sallmonella E coli không lên men dextrin, glycogen, inositol, salisin, ít khi lên men inulin, pectin E coli không sinh

H2S, không tan chảy gellatin, không phân hủy đạm, hoàn nguyên nitrate thành nitrite (Nguyễn Như Thanh, 1997)

Theo Nguyễn Ngọc Hải (2011) để khẳng định E coli với vi khuẩn đường ruột khác,

người ta thường sử dụng thử nghiệm IMViC với các phản ứng:

Môi trường Trypton Water dùng để kiểm tra tính sinh indole của vi khuẩn, môi

trường có tryptophan, E coli nhờ có tryptophan sẽ ly giải tryptophan thành indole

khi nhỏ thuốc thử Kowacs vào nếu trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng đỏ thì phản ứng dương tính và ngược lại nếu trên bề mặt môi trường không xuất hiện vòng

đỏ thì indole âm tính

Môi trường VP dùng để kiểm tra tính di động và tính sinh aceton của vi khuẩn Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm đục môi trường Ngược lại, vi khuẩn không có khả năng di động thì chỉ thấy vi khuẩn mọc theo đường kim cấy, môi trường xung quanh trong Sau khi nhỏ thuốc thử VP1, VP2 vào nếu trên bề mặt môi trường có vòng đỏ thì chứng tỏ vi khuẩn có khả năng sinh aceton Ngược lại, nếu trên bề mặt môi trường không xuất hiện vòng đỏ thì vi khuẩn không có khả năng sinh aceton Tùy loại enzyme vi khuẩn có được mà quá trình lên men glucose sẽ cho ra sản phẩm cuối cùng khác nhau, một trong số đó là aceton sẽ tạo phức hợp màu đỏ với naphthol và KOH

Môi trường MR dùng để kiểm tra tính sử dụng đường của vi khuẩn Nhỏ lên bề mặt môi trường ít giọt thuốc thử Methel Red, phản ứng dương tính sẽ có vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trường và ngược lại

Môi trường Simmon Citrat Agar dùng để kiểm tra khả năng sử dụng citrate thay nguồn cacbon của vi khuẩn Trên môi trường này, vi khuẩn cho kết quả dương tính khi màu của môi trường chuyển từ xanh lục sang xanh dương và âm tính khi môi trường vẫn giữ màu xanh lá cây Trong môi trường simmon nguồn cacbon duy nhất

là citrate, vi khuẩn sử dụng citrate sẽ kiềm hóa môi trường làm môi trường đổi từ

xanh lục sang xanh lơ E coli không có khả năng sử dụng citrate như nguồn carbon

duy nhất, môi trường không đổi màu

2.1.4 Sức đề kháng và tính gây bệnh

E coli bị diệt ở 550C trong 1 giờ, 600

C trong 15 - 30 phút, các chất sát trùng như

acid phenic, formol có thể bị diệt trong 5 phút Đề kháng với sự sấy khô, 95% E

coli bị diệt ở nhiệt độ đông lạnh trong 2 giờ (Lê Văn Tạo, 2006)

Cấu trúc kháng nguyên của E coli gồm kháng nguyên thân O (somatic), kháng

nguyên lông H (flagellar), kháng nguyên vỏ K (capsular):

Kháng nguyên O (kháng nguyên thân) được phân bố trong vách tế bào bao gồm hỗn hợp lipid – polysaccharide – protein, lipid xác định độc tính colitoxin, polysaccharid xác định tính đặc thù của huyết thanh và protein mang tính kháng nguyên (Đoàn Ngọc Tuấn, 2006)

Kháng nguyên K (kháng nguyên vỏ bọc) kháng nguyên giáp mô K (capsular

antigen) giúp E coli bám vào tế bào biểu mô trước khi xâm lấn đường tiêu hóa hay

đường tiết niệu

Kháng nguyên H (kháng nguyên lông) cấu tạo bởi protein và có tính chất không chịu nhiệt khi kháng nguyên H gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết H Có ý nghĩa trong xác định giống loài vi khuẩn (Đoàn Ngọc Tuấn, 2006) Độc tố gồm có hai loại: nội độc tố và ngoại độc tố, ngoại độc tố gồm hai loại: loại chịu nhiệt Stabile toxin (ST) và loại không chịu nhiệt Labile toxin (LT)

Nội độc tố: gồm 2 loại Enterotoxin LT: không bền với nhiệt độ, LT gây hoạt hoá adennylcylase trong tế bào biểu mô ruột, làm tăng lượng AMP (adenosine monophosphate) vòng, ức chế tái hấp thụ Na+, hậu quả cuối cùng là tiêu chảy mất nước Enterotoxin ST: bền với nhiệt gồm STa và STb không có tính kháng nguyên

ST tác động lên ruột bằng sự hoạt hoá emzyme guaylate cyclate làm tăng GMP (guanosine monophosphate) vòng dẫn đến kích thích bài tiết nước muối gây tiêu chảy

Tính gây bệnh của E coli được chia thành 2 loại: Trong đường ruột và ngoài đường ruột Trong đường ruột gồm có ETEC (Enterotoxigenic E coli), EIEC

(Enteroinvasive E coli), EPEC (Enteropathogenic E coli), EHEC

(Enterohemorrhagic E coli), EAEC (Enteroaggregative E coli), DAEC (Diffusely adhering E coli) Ngoài đường ruột gồm MAEC (Meningitidis-associated E coli), UPEC (Uropathogenic E coli)

2.2 Kháng sinh nhóm beta- lactam

Tất cả các kháng sinh nhóm beta- lactam đều có vòng beta- lactam trong cấu trúc phân tử Vòng beta- lactam có cấu trúc không gian hóa học 4 cạnh gồm 3 nguyên tử

C và một nguyên tử N

2.2.1 Phân loại kháng sinh nhóm beta-lactam

Theo Huỳnh Kim Diệu (2012) kháng sinh beta-lactam gồm các nhóm: penam, penem, cephem và monobactam và nhóm ức chế men beta-lactamase không có hoạt tính kháng khuẩn dùng phối hợp với các beta-lactams để có tác động trên beta-lactamase Đặc điểm chung của nhóm này là có một vòng beta-lactam Nhóm beta-lactams được sử dụng rộng rãi vì có phổ kháng khuẩn đa dạng và ít độc tính

Một số kháng sinh thuộc nhóm penicillin: benzyl penicillin, phenoxypenicillin, ampicillin, amoxicillin

Phân nhóm cephalosporins gồm có:

Cephalosporin I: cefalotin, cefazolin, cefaclor, cephalexin

Cephalosporin II: cefamendol, cefuroxim, cefoxitin

Cephalosporin III: cefotaxim, cefixim, ceftriaxone, cefpodoxim, ceftiazidim

2.2.2 Cơ chế tác động của kháng sinh nhóm beta- lactam

Các kháng sinh nhóm beta- lactam ức chế sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn bằng cách can thiệp vào các enzyme transpeptidase có vai trò trong sự tạo các liên kết của chuỗi peptidoglycan Các enzyme này liên kết với 1 nhóm protein gọi là PBP (penicillin – binding protein) nằm ở bên ngoài màng nguyên sinh chất Như vậy, điểm tác động của kháng sinh nhóm beta- lactam chính là PBP Mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một kháng sinh trong nhóm này tùy thuộc vào mức độ gắn kết với PBP, khả năng xâm nhập vào tế bào và khả năng kháng được các enzyme beta- lactam Beta- lactam không chỉ ức chế những kết nối cuối cùng của peptidoglycan trong tiến trình tổng hợp thành vi khuẩn mà còn gây tiết lipoteichoic acid tạo phản ứng tự ly giải của vi khuẩn do sự hư hỏng peptidoglycan

Beta - lactam có tác động sát khuẩn phụ thuộc thời gian, nghĩa là phải đảm bảo rằng trong thời gian trị liệu nồng độ kháng sinh trong huyết tương hoặc mô bào đạt trên MIC Tuy nhiên, do beta- lactam chỉ tác động lên vi khuẩn trong giai đoạn tăng trưởng (giai đoạn tổng hợp thành), ở nồng độ quá cao trên mức nồng độ sát khuẩn tốt nhất sẽ gây hiệu ứng Eagle (hiệu ứng ngược), nghĩa là giảm khả năng sát khuẩn Đây là một khái niệm quan trọng để tránh sử dụng quá liều kháng sinh nhóm này (Võ Thị Trà An, 2010)

2.2.3 Cơ chế đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh

Theo Võ Thị Trà An, (2010) vi khuẩn kháng kháng sinh nhờ vào các cơ chế chủ yếu sau: sản xuất enzym làm vô hoạt kháng sinh; tạo ra enzym thay thế enzym mà kháng sinh tác động vào; đột biến hoặc sửa đổi ở điểm tiếp nhận làm giảm gắn kết của kháng sinh với điểm tiếp nhận; giảm hấp thu kháng sinh vào tế bào vi khuẩn, đẩy kháng sinh ra ngoài bằng bơm thoát dòng làm nồng độ kháng sinh trong tế bào

giảm Khi gen kháng thuốc của vi khuẩn nằm trên nhiễm sắc thể thì sẽ có khả năng bảo tồn sự đề kháng Ngược lại khi yếu tố di truyền nằm trên plasmid nhất là plasmid tiếp hợp, vi khuẩn sẽ có khả năng truyền sự đề kháng này cho vi khuẩn khác của cùng loài hay khác loài Từ đó sự kháng kháng sinh tăng dần lên trong

quần thể vi khuẩn

2.3 Men beta- lactamase phổ rộng

Men beta- lactamase phổ rộng (ESBL) được tìm thấy lần đầu tiên năm 1983 tại

Đức, thường gặp trong các chủng vi khuẩn đường ruột đặc biệt là E coli, khi các

chủng vi khuẩn sinh ESBL thì đồng nghĩa với việc chúng kháng lại rất nhiều các kháng sinh, đặc biệt là nhóm cephaslosporin Đây là trở ngại thực sự trong điều trị nhiễm trùng trực khuẩn Gram âm (Nguyễn Tuấn Minh, 2008)

Men beta- lactamase có thể được phân loại dựa vào khả năng thủy phân các cơ chất thuộc kháng sinh beta- lactam và mức độ bị ức chế bởi acid clavulanic, nhưng các đột biến đơn giản có thể làm thay đổi sự phân loại này Ví dụ TEM -1 là một penicillinase đơn giản và hoạt động của chúng có thể bị ức chế bởi acid clavulanic

và tazobactam Tuy nhiên, do đột biến điểm các enzyme TEM có phổ hoạt động rộng hơn dẫn đến sự đề kháng với cephalosporin thế hệ thứ 3 Sự bất hoạt của aztreonam, ceftazidime, cefotaxime hoặc ceftriaxone được xem là chỉ thị cho sự hiện diện của các men beta-lactamase có phổ rộng (Võ Thị Trà An, 2010)

2.3.1 Đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli sinh ESBL

Theo Nguyễn Sâm (2012) các vi khuẩn sinh ESBL thường đề kháng cao với nhiều nhóm kháng sinh, các nguyên nhân chính đang được ghi nhận đó là :

Các ESBL thường được mã hóa qua trung gian plasmide các gen đề kháng kháng sinh thường liên kết theo nhóm, dẫn đến gen đề kháng cùng bị đột biến với các kháng sinh nhóm khác Khi đã đề kháng kháng sinh do ESBL sẽ có sự thay thế kháng sinh điều trị mới dẫn tới tăng đột biến cảm ứng tạo gen đề kháng kháng sinh các nhóm kháng sinh thay thế nhiều hơn các vi khuẩn thông thường Vi khuẩn sinh ESBL còn có khả năng đề kháng chéo với các nhóm kháng sinh khác

Như vậy, nhìn từ lịch sử phát hiện cũng như các đặc điểm phân loại và cơ chế đề kháng kháng sinh thì bản chất của vi khuẩn sinh ESBL sẽ có những đặc điểm sau Gen mã hóa ESBL nằm trên plasmide do đột biến từ các gen beta- lactam cổ điển như TEM-1, SHV-1 ESBL sinh ra do đột biến cảm ứng từ việc sử dụng các cephalosporin phổ rộng thế hệ thứ 3 Vi khuẩn sinh ESBL kháng hầu hết kháng sinh beta- lactam kể cả cephalosporin thế hệ 3, 4 và aztreonam Kháng chéo kèm với các kháng sinh nhóm aminoglycosides, fluoroquinolones và nhiều kháng sinh khác Tuy nhiên, còn nhạy cảm với các beta- lactam kết hợp chất ức chế, nhạy cảm carbapenem, cephamicins, temocillin các nhóm kháng sinh có cấu trúc tương

tự nhau

2.3.2 Phương pháp phát hiện vi khuẩn E coli sinh ESBL

Theo Phạm Hùng Vân (2009), Tạ Văn Ngọc Đức (2007) được trích dẫn bởi Hà Vũ Minh Trang (2012), nguyên tắc chung để phát hiện vi khuẩn sinh men beta-

lactamase dựa trên chất ức chế men beta lactamase Một acid clavulanic kết hợp với một oxymino- cephalosphorin như ceftazidime, cefotaxim

Phương pháp xét nghiệm đĩa kết hợp (Combination Disk Test- CDT)

Phương pháp này dựa trên sự so sánh đường kính vòng vô khuẩn của đĩa kháng sinh oxymino- cephalosphorin khi không có và có kết hợp với acid clavulanic Hội đồng quốc gia về các tiêu chuẩn cận lâm sàng đề nghị dùng cả 2 loại kháng sinh cefotazim và ceftazidime cho xét nghiệm này Thêm 10µg acid clavulanic vào đĩa kháng sinh oxymino- cephalosphorin, nếu có sự gia tăng lớn hơn 5mm đường kính vòng vô khuẩn so với đĩa kháng sinh oxymino-cephalosphorin không có acid clavulanic thì xét nghiệm dương tính, xác nhận có sự sinh men ESBL của vi khuẩn Ngoài ra theo Nguyễn Sâm (2009), một số phương pháp khác như phương pháp ChromID ESBL agar, phương pháp E – test, phương pháp Vitek ESBL test, phương pháp Micro scan panels

ChromID ESBL agar

Môi trường chứa kháng sinh cefpodoxime và chất màu Chất màu được thêm vào để dễ dàng phát hiện các phản ứng do enzyme của vi khuẩn nếu có trong môi trường Vì vậy có thể đồng thời vừa định danh vi khuẩn vừa phát hiện vi khuẩn

đề kháng Nếu vi khuẩn sinh ESBL sẽ kháng với cefpodoxime và có khả năng phát triển trên môi trường ChromID ESBL tạo thành các khuẩn lạc có màu sắc khác nhau, đặc trưng cho một số loài vi khuẩn

Ưu điểm: dễ dàng tiến hành, giá thành rẻ dễ triển khai ở tất cả các cơ sở vi sinh lâm sàng có nuôi cấy vi khuẩn đặc biệt nhanh chóng sàng lọc các vi khuẩn đường ruột sinh ESBL đồng thời định danh sơ bộ được một số loài vi

khuẩn như E coli và K pneumoniae

Hạn chế: một số vi khuẩn kháng kháng sinh cefpodoxime không phải do sinh ESBL mà theo cơ chế khác hoặc sinh cephalosporinase, penicillinase có thể mọc trên môi trường này Một số vi khuẩn màu sắc khuẩn lạc không điển hình, không màu hoặc nhiều loài vi khuẩn có thể có màu sắc khuẩn lạc giống nhau Vi khuẩn sinh ESBL chậm hoặc yếu có thể không mọc trên môi truờng này sau 18 - 48h nuôi cấy

Phương pháp đĩa đôi (double disk diffusion test)

Các ESBL có khả năng phân hủy các cephalosporin phổ rộng nhưng bị ức chế bởi acid clavulanic, dẫn đến xuất hiện vùng ức chế vi khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh AMC và mở rộng vùng ức chế giao thoa giữa AMC với CAZ và CTX

Ưu điểm: phương pháp dễ thực hiện, rẻ tiền, độ nhạy và đặc hiệu cao > 95%

Nhược điểm: khó lựa chọn được khoảng cách tối ưu giữa 2 khoanh giấy ở từng vi khuẩn, âm tính giả với các ESBL hoạt tính thấp, không phát hiện được các

vi khuẩn P.aeruginosa và một số vi khuẩn có ESBL giảm ức chế acid

clavulanic thường gặp như ESBL type OXA-

Băng giấy E- test ESBL

ESBL bị ức chế bởi acid clavulanic nên E coli sinh ESBL sẽ có vùng ức chế

vi khuẩn ở phần chứa kháng sinh kết hợp acid clavulanic, phần còn lại không

có chất ức chế dẫn đến kháng sinh bị ESBL phân hủy nên vùng ức chế vi khuẩn nhỏ hơn hoặc không có vùng ức chế do vi khuẩn không bị kháng sinh ức chế hoặc chỉ bị

ức chế ở nồng độ kháng sinh cao Vi khuẩn sinh ESBL (+) sẽ có vùng ức chế hình ellip, hoặc phần kết thúc nồng độ MIC biến mất tạo thành bóng ellip hoặc vòng bị biến dạng của hình ellip và nồng độ MIC phía kháng sinh không kết hợp clavulanic acid tăng gấp ≥ 8 lần phần còn lại

Ưu điểm: dễ tiến hành, có độ nhạy và đặc hiệu cao tới 100%, đây cũng là phương pháp chính xác nhất hiện nay được dùng để khẳng định ESBL (+)

Nhược điểm: giá thành cao nên khó tiến hành rộng rãi Trong một số trường hợp phương pháp này cho kết quả không xác định do các trường hợp IRT enzyme (inhibitor resistant TEM) hoặc AmpC enzymes hoặc vi khuẩn kháng beta-lactam theo cơ chế khác

Vitek ESBL Card

Phương pháp này dùng card MIC có chứa cephalosporin nồng độ bắt đầu từ 0,5µg/ml trộn với acid clavulanic nồng độ 4µg/ml Kết quả nếu vi khuẩn có ESBL sẽ cho MIC cephalosporin ≥ 8µg/ml, phương pháp này có độ nhạy và đặc hiệu không cao lắm (khoảng 90%)

Micro scan panels

Tấm panel nhựa có 4 giếng chứa môi trường kháng sinh cephalosporin và cephalosporin/acid clavulanic, cấy vi khuẩn vào các giếng để tủ ấm 18-24h đọc kết quả, nếu ESBL (+) vi khuẩn sẽ không mọc ở giếng có cephalosporin kết hợp clavulanic acid

2.4 Những nghiên cứu vi khuẩn E coli sinh ESBL trên thế giới

Một nghiên cứu của Duru Carissa et al, 2013 được thực hiện tại Owerri, Nigeria, nhằm xác định sự hiện diện của E coli sinh ESBL từ các trang trại chăn nuôi gia

cầm bằng phương pháp đĩa kết hợp và thử nghiệm tính nhạy cảm của vi khuẩn đối

với kháng sinh Kết quả có 22,2% E coli ESBL từ 45 E coli dương tính phân lập

từ 159 mẫu phân của gà tây, gà giò và gà địa phương Các E coli ESBL phân lập từ

E coli hoàn toàn nhạy cảm với imipenem, nhưng kháng với cefepime, ceftriaxone,

nalidixic acid, cefotaxime, ceftazidime, ampicillin, trimethoprim và ticarcillin

sulphamethoxazole-Annemieke Smet et al, 2008, nghiên cứu sự đa dạng của ESBL và Class C beta-

lactame phân lập trên ổ nhớp gà từ các trại gà thịt tại Belgian Trong 489 mẫu có

295 mẫu dương tính với E coli, trong đó có 45% (133/295) E coli ESBL Ngoài ra, kết quả còn cho thấy các chủng vi khuẩn E coli ESBL kháng với: gentamycine

7,5%, kanamycine 4%, streptomycine 30,2%, trimethoprim 64,4%, tetracyline 48,1% Kiểm tra sự đa kháng: 4% kháng trên 8 loại kháng sinh, 76% kháng từ 1-2 kháng sinh và 5% kháng với 1 kháng sinh bổ sung

Kola et al, 2012 nghiên cứu tỷ lệ beta-lactamase ở vi khuẩn đường ruột trong thịt gà

Đức Nghiên cứu thực hiện trên 399 mẫu thịt gà lấy từ siêu thị, bốn cửa hàng thực

phẩm và cửa hàng bán thịt ở Berlin và Greifswald Kết quả tổng cộng có 185 chủng

ESBL phân lập được từ 175 mẫu Phần lớn các chủng E coli sinh ESBL và 73,0% các E coli ESBL kháng với tetracycline, 35,7% với trimoxazole và 7,6% với

ciprofloxacin

Nghiên cứu của Felix Reich et al, 2010 tại Đức, nghiên cứu phân tích trên 70 mẫu thân thịt và 51 mẫu manh tràng gà cho kết quả tương ứng 88,6% và 72,5% E coli

sinh ESBL

Nghiên cứu khác tại Bỉ của Garcia-Graells et al (2013), thực hiện trên 396 mẫu thịt

gia cầm để xác định tỉ lệ E coli dương tính với ESBL Kết quả 94,2% (374/396) dương tính với E coli và 42% (156/374) đề kháng với cefotaxime 273 chủng E

coli từ 156 mẫu thịt có E coli dương tính được xác định sự hiện diện E coli sinh

ESBL bằng phương pháp đĩa đôi kết quả có 80,6% (220/273) dương tính với ESBL, 18,3%(50/273) thuộc kiểu hình AmpC

Nghiên cứu của Ilse Overdevest et al, 2009 tại Hà Lan về gen E coli ESBL trên

người và gà Khảo sát trên 262 mẫu thịt tươi bao gồm 3 nhóm thịt chính: gà, bò, lợn, trong đó có 89 mẫu thịt gà, 85 mẫu thịt bò, 57 mẫu thịt heo Qua phân tích 89

mẫu thịt gà thì có 68 (76,8%) mẫu chứa E coli ESBL Kết quả giải trình tự gen mã

hóa men beta- lactamase phổ rộng trên người và gà có sự tương đồng

Nghiên cứu của Yuan et al, 2008 tại Hà Nam, Trung Quốc Thực hiện trên 51 mẫu bệnh phẩm gan gà lấy từ 14 trang trại Kết quả 60,8% (31/51) E coli sinh ESBL

Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ kháng với các loại kháng sinh: gentamycine

87,1%, amikacin 80,6%

Nghiên cứu của Leverstein- van Hall et al, 2011 trên 98 mẫu thịt gà bán lẻ tại 12

cửa hàng ở Utrecht, Hà Lan năm 2010 và 516 mẫu bệnh phẩm người từ 31 phòng thí nghiệm thu thập được trong khoảng thời gian 3 tháng trong năm 2009 Kết quả

có 94% mẫu thịt gà chứa E.coli ESBL và có 39% thuộc các kiểu gen được tìm thấy

ở người Những phát hiện này cho thấy việc truyền các gen E coli sinh ESBL từ gia

cầm sang người rất có thể thông qua chuổi thức ăn

Theo nghiên cứu của Gundogan et al, 2013, phân lập 75 mẫu từ thịt bê, đùi gà, sữa

tươi, phô mai và kem mỗi loại 15 mẫu ở Thổ Nhĩ Kì Kết quả 45 mẫu dương tính

với E coli, trong đó 100% (15) mẫu đùi gà dương tính với E coli, 9 mẫu thịt bê, 7 mẫu sữa tươi, 11 mẫu phô mai và 3 mẫu kem nhiễm E coli Trong 45 mẫu E coli phân lập có 20 (44,4%) dương tính với E coli ESBL Trong số 20 E coli ESBL có

10 (50%) là từ thịt đùi gà, 5 (25%) là từ thịt bê băm nhỏ, 2 (10%) từ phô mai, 2

(10%) từ sữa và 1 (5%) là từ các mẫu kem Tỉ lệ E coli ESBL phân lập trên đùi gà

nói riêng là 66,67%(10/15)

E coli phân lập kháng với ampicillin (100%), tetracycline (77,8%), cefotaxime

(33,3%), ciprofloxacin (31,1%), aztroenam (28,9%), ceftazidime (8,9%), ceftriaxone (8,9%), amoxcillin/acid clavulanic (6,7%), gentamicin (6,7%) và amikacin (4,4%)