khảo sát hiệu quả của interferon alpha và gamma gà biểu hiện trên hệ thống pichia pastoris trong phòng bệnh viêm gan do virus type i trên vịt con

KHẢO SÁT HIỆU QUẢ CỦA INTERFERON ALPHA VÀ GAMMA GÀ BIỂU HIỆN TRÊN HỆ THỐNG PICHIA PASTORIS TRONG PHÒNG BỆNH VIÊM GAN DO VIRUS TYPE I TRÊN VỊT CON TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NG

KHẢO SÁT HIỆU QUẢ CỦA INTERFERON ALPHA VÀ GAMMA GÀ BIỂU HIỆN TRÊN HỆ

THỐNG PICHIA PASTORIS TRONG PHÒNG

BỆNH VIÊM GAN DO VIRUS TYPE I TRÊN

VỊT CON

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

ĐOÀN THỊ BÍCH TRÂM

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH THÚ Y

Cần Thơ, 2014

i

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÖ Y

  

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

HIỆU QUẢ CỦA CHICKEN INTERFERON

ALPHA VÀ CHICKEN INTERFERON

GAMMA BIỂU HIỆN TRÊN HỆ THỐNG

PICHIA PASTORIS TRONG PHÕNG BỆNH

VIÊM GAN DO VIRUS TYPE 1 TRÊN VỊT CON

Sinh viên thực hiện:

ĐOÀN THỊ BÍCH TRÂM

MSSV: 3103067 LỚP: THÚ Y – K36 Cán bộ hướng dẫn:

PGS.TS HỒ THỊ VIỆT THU

ii

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÖ Y   

Đề tài: Hiệu quả của chicken interferon alpha và chicken interferon gama

biểu hiện trên hệ thống Pichia pastoris trong phòng bệnh viêm gan do virus

type 1 trên vịt con Do sinh viên Đoàn Thị Bích Trâm thực hiện tại Cần Thơ từ tháng 08/2014 đến tháng 12/2014

Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2014 Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2014

Duyệt Bộ môn Duyệt Giáo viên hướng dẫn

HỒ THỊ VIỆT THU

Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2014

Duyệt khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

iii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công

bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây

Cần thơ, ngày … tháng … năm 2014

Tác giả luận văn

Đoàn Thị Bích Trâm

iv

LỜI CẢM TẠ

Xin kính dâng lên ông bà, cha mẹ lòng biết ơn sâu sắc và quý trọng nhất, những người luôn cố gắng tạo điều kiện để tôi thực hiện hoài bão của mình Xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

Cô Hồ Thị Việt Thu đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này

Thầy Lê Hoàng Sĩ – Cố vấn học tập đã tận tình chỉ dạy và giúp đỡ tôi trong suốt 5 năm học vừa qua

Quý thầy, cô Trường Đại Học Cần Thơ, đặc biệt là các thầy, cô thuộc Bộ Môn Chăn Nuôi và Bộ Môn Thú Y khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tại trường

Chị Nguyễn Minh Thùy và anh Lê Trần Hoài Khanh đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Chị Nguyễn Thị Thanh Giang (Trung tâm viện Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh) đã hết lòng giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Các bạn trong và ngoài lớp Thú Y K36 đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình học tập cũng như trong cuộc sống

Xin kính gởi tới quý thầy, cô, người thân lời chúc sức khỏe, thành công

và xin nhận nơi tôi lòng biết ơn sâu sắc

Xin gởi đến bạn bè tôi lời chúc sức khỏe và lời chúc thành công trên con đường sự nghiệp tương lai

Cuối cùng tôi xin cảm ơn chân thành đến Hội Đồng Giám Khảo đã dành thời gian đọc, xem xét và đóng góp ý kiến quý báo cho luận văn của tôi

Đoàn Thị Bích Trâm

v

TÓM TẮT

Đề tài: “Hiệu quả của chicken interferon alpha và chicken interferon gama biểu hiện trên hệ thống Pichia pastoris trong phòng bệnh viêm gan do virus type 1 trên vịt con” được tiến hành từ tháng 08/2014 đến tháng 12/2014 tại Trại nghiên cứu và thực nghiệm Nông nghiệp, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ Nghiên cứu được thực hiện nhằm khảo sát hiệu quả của interferon alpha gà và interferon gamma gà biểu hiện trên hệ thống Pichia pastoris trong phòng bệnh viêm gan vịt do virus type 1 trên vịt con Hiệu quả phòng bệnh của sinh phẩm được thực hiện qua 5 thí nghiệm: Xác định liều gây chết 50% vịt thí nghiệm (LD 50 ) bằng cách cho vịt uống 0,2ml dịch virus viêm gan vịt type 1 (DHV-1) từ nồng độ 10 0

đến 10 -6 Dùng interferon alpha gà tái tổ hợp (rChIFN-α) và interferon gamma gà tái tổ hợp (rChIFN-γ) với liều 100µg/0,1ml/con để đánh giá độ an toàn Thử hoạt tính kháng virus của rChIFN-α và rChIFN-γ riêng rẽ bằng cách dùng 0,1ml rChIFN-α và rChIFN-γ với liều lần lượt là 10µg, 50µg và 100µg và kết hợp với liều 100µg +1µg, 100µg +10µg, 50µg +1µg, 50µg +10µg sau 24h gây nhiễm virus Khảo sát liều thích hợp dùng trong phòng DHV-1 của rChIFNs bằng cách cho vịt nhỏ mắt, mũi 0,1ml/con rChIFN-α kết hợp với rChIFN-γ với liều 100µg +1µg và 100µg +10µg Sử dụng dịch rChIFNs liên tiếp trong 3 ngày, mỗi ngày 1 liều, sau đó gây nhiễm DHV-1

Kết quả thí nghiệm xác định sử dụng 0,2ml DHV-1 với liều 10 3 LD 50 gây chết 50% vịt con thí nghiệm Sử dụng sinh phẩm rChIFNs với liều bằng hoặc thấp hơn 100µg/0,1ml/con thì an toàn cho vịt Sử dụng rChIFNs làm giảm tỷ

lệ bệnh và tỷ lệ chết của vịt thí nghiệm so với đối chứng dương, đồng thời khi

sử dụng dịch rChIFNs làm tăng hiệu giá kháng thể của vịt Sử dụng rChIFN-α

ở liều 50μg và 100μg làm giảm tỷ lệ vịt bệnh và chết mạnh hơn so với sử dụng các liều 10μg rChIFN-α và rChIFN-γ Mặc khác, sử dụng kết hợp rChIFN-α với rChIFN-γ mang lại hiệu quả kháng virus cao hơn khi sử dụng riêng rẽ từng loại rChIFNs, trong đó dùng liều kết hợp 100µg rChIFN-α +1µg rChIFN-γ và 100µg rChIFN-α +10µg rChIFN-γ làm giảm tỷ lệ bệnh và chết cao hơn so với các liều còn lại Đặc biệt, khi sử dụng 2 liều kết hợp 100µg rChIFN-α +1µg rChIFN-γ và 100µg rChIFN-α +10µgrChIFN-γ trong phòng bệnh viêm gan vịt do virus type 1 không những làm giảm tỷ lệ vịt bệnh và chết

mà còn giúp cải thiện tăng trọng, làm tăng hiệu giá kháng thể kháng virus DHV-1 của vịt

Kết quả thí nghiệm đã chứng minh rChIFN-α và rChIFN-γ có tiềm năng trong việc phòng bệnh viêm gan do virus type 1 trên vịt con

vi

MỤC LỤC

TRANG PHỤ BÌA i

TRANG KÝ DUYỆT ii

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM TẠ iv

TÓM TẮT v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ix

DANH SÁCH BẢNG xi

DANH SÁCH HÌNH xii

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Interferon 3

2.1.1 Sơ lược về interferon 3

2.1.2 Phân loại interferon 4

2.1.3 Vai trò interferon 4

2.1.4 Cơ chế hoạt động của interferon 5

2.2 Interferon gà 7

2.2.1 Phân loại interferon gà 7

2.2.2 Interferon alpha gà 8

2.2.3 Interferon gamma gà 8

2.3 Sự biểu hiện của ChIFN-α và ChIFN-γ trên hệ thống Pichia pastoris 9

2.4 Các nghiên cứu sử dụng rChIFN- α và rChIFN-γ 10

2.4.1 Nghiên cứu ngoài nước 11

2.4.2 Nghiên cứu trong nước 11

2.5 Bệnh viêm gan do virus ở vịt 12

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trong ngoài nước 12

2.5.1.1 Nghiên cứu ngoài nước 12

2.5.1.2 Nghiên cứu trong nước 13

vii

2.5.2 Căn bệnh 13

2.5.2.1 Đặc điểm hình thái 13

2.5.2.2 Đặc tính sinh học của virus 14

2.5.2.3 Sức đề kháng 14

2.5.3 Truyền nhiễm học 14

2.5.3.1 Loài mắc bệnh 14

2.5.3.2 Phương thức truyền lây 15

2.5.3.3 Cơ chế sinh bệnh 15

2.5.3.4 Triệu chứng 15

2.5.3.5 Bệnh tích 16

2.5.3.6 Chẩn đoán 17

2.5.3.7 Phòng bệnh 18

2.5.3.8 Điều trị 19

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 20

3.1 Nội dung và phương pháp thí nghiệm 20

3.2 Phương tiện thí nghiệm 20

3.2.1 Thời gian và địa điểm 20

3.2.2 Vật liệu thí nghiệm 20

3.3 Phương pháp thí nghiệm 21

3.3.1 Chuẩn bị chuồng nuôi 21

3.3.2 Bố trí thí nghiệm 21

3.3.2.1 Chuẩn độ và xác định liều gây chết 50% vịt của DHV-1 trên vịt con 21

3.3.2.2 Đánh giá độ an toàn của rChIFN-α và rChIFN-γ trên vịt con 23

3.3.2.3 Khảo sát hoạt tính kháng virus của rChIFN-α và rChIFN-γ trên vịt con 23

3.3.2.4 Khảo sát hoạt tính kháng virus khi dùng liều kết hợp rChIFN-α với rChIFN-γ trên vịt con 25

viii

3.3.2.5 Đánh giá hiệu quả phòng bệnh viêm gan vịt do virus type 1 khi dùng

liều kết hợp rChIFN-α với rChIFN-γ trên vịt con 27

3.4 Phản ứng trung hòa 29

3.5 Thống kê và xử lí số liệu 30

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 Kết quả xác định nồng độ liều gây chết 50% vịt (LD50) của DHV-1 trên vịt con 31

4.2 Kết quả đánh giá độ an toàn của rChIFN-α và rChIFN-γ ở liều nhỏ mắt, mũi 100µg/con vịt 32

4.3 Kết quả thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng DHV-1 của rChIFN-α và rChIFN-γ trên vịt con 32

4.3.1 Kết quả theo dõi vịt mắc bệnh và chết ở thí nghiệm 32

4.3.2 Kết quả kiểm tra kháng thể đặc hiệu kháng DHV-1 33

4.4 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng DHV-1 của rChIFN-α kết hợp với rChIFN-γ trên vịt con 34

4.4.1 Kết quả theo dõi vịt mắc bệnh và chết ở thí nghiệm 34

4.4.2 Kết quả kiểm tra kháng thể đặc hiệu kháng DHV-1 36

4.5 Kết quả khảo sát liều thích hợp trong phòng bệnh viêm gan vịt do DHV-1 của rChIFN-α kết hợp rChIFN-γ trên vịt con 37

4.5.1 Kết quả theo dõi vịt mắc bệnh và chết ở thí nghiệm 37

4.5.2 Kết quả theo dõi tăng trọng của vịt trước và sau khi thí nghiệm 38

4.5.3 Kết quả kiểm tra kháng thể đặc hiệu kháng DHV-1 ở vịt 1 tuần tuổi và vịt 3 tuần tuổi 39

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

Phụ chương Xử lý số liệu 47

Chicken interferon Cell line derived from kidney cells of the African green mokey

Duck hepatitis A virus Duck hepatitis virus Deoxyribonucleic acid Duck embryo liver Đối chứng

Escherichia coli

Infectious bursal diease virus Interferon regulatory factor Inteferon

Interferon gamma receptor Units

Lethal dose 50%

Mammalian interferon Major histocompatibility complex

Minimum essential medium Messenger ribonucleic acid Newcastle diease virus Natural killer

Tế bào gan phôi vịt

Virus gây bệnh Gumboro Thụ thể interferon gắn vào Cảm nhiễm tố

Yếu tố điều hòa cảm nhiễm tố Đơn vị quốc tế

Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm

Interferon ở loài hữu nhũ Phức hợp tương thích mô hóa học

Môi trường nuôi cấy tế bào RNA thông tin

Virus gây bệnh Newcastle

Tế bào giết tự nhiên

Hệ thống nấm men Interferon gà tái tổ hợp Interferon alpha gà tái tổ hợp

rChIFN-γ trên vịt con……… 24 3.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng DHV-1 của rChIFN-α kết

hợp rChIFN-γ trên vịt con……… 26 3.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát liều thích hợp phòng bệnh viêm gan vịt do

virus type 1 của rChIFN-α kết hợp với rChIFN-γ trên vịt con………

28 4.1 Tỷ lệ vịt chết ở các nồng độ pha loãng dịch DHV-1 khi dùng riêng rẽ

từng loại rChIFN……… 31 4.2 Tỷ lệ vịt mắc bệnh và chết ở các nghiệm thức khi dùng riêng rẽ

từng loại rChIFN….……… 33 4.3 Kết quả kiểm tra kháng thể đặc hiệu kháng DHV-1 khi dùng liều kết

hợp rChIFN-α với rChIFN-γ ……… 34 4.4 Tỷ lệ vịt mắc bệnh và chết khi dùng rChIFN-α kết hợp với rChIFN-γ 35 4.5 Kết quả kiểm tra kháng thể đặc hiệu kháng DHV-1 khi dùng

rChIFN-α kết hợp với rChIFN-γ ……… 36 4.6 Tỷ lệ vịt mắc bệnh và chết khi dùng rChIFN-α kết hợp với rChIFN-γ

trong phòng bệnh viêm gan vịt do virus type 1……… 37 4.7 Kết quả tăng trọng của vịt vào các thời điểm 0, 8, 14 và 21 ngày…… 38 4.8 Kết quả kiểm tra kháng thể đặc hiệu kháng DHV-1 ở vịt 1 tuần tuổi

và 3 tuần tuổi………

39

xii

DANH SÁCH HÌNH

Hình Tên hình Trang

2.1

2.2

2.3

2.4

2.5

2.6

Cấu trúc interferon người………3

Cơ chế kháng virus cảm ứng bởi interferon……… 6

Đáp ứng kháng virus của interferon……… 7

Cấu trúc tinh thể interferon gamma gà……… 8

Vịt chết tư thế ngoẹo đầu……… 16

Gan sưng to, nhạt màu, xuất huyết…… ……….…….16

1

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi vịt ngày càng phát triển với quy mô lớn, mang tính chuyên môn hóa cao Tuy nhiên, bệnh truyền nhiễm là một vấn đề đáng quan tâm bởi tính nguy hiểm và ảnh hưởng tiêu cực của bệnh đến vật nuôi cũng như lợi nhuận kinh tế trong chăn nuôi Bệnh viêm gan do virus ở vịt là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây lan nhanh, do nhiều loại virus gây ra với 3 type khác nhau: type 1, type 2 và type 3 Trong đó, virus viêm gan vịt type 1 có độc lực cao nhất (OIE, 2008) Bệnh chủ yếu xảy ra ở vịt con từ 1-3 tuần tuổi với tỷ lệ chết từ 50-95%, có khi 100% (Hồ Thị Việt Thu

và Nguyễn Đức Hiền, 2012)

Hiểu rõ được đặc tính cũng như thiệt hại của một bệnh có căn nguyên là virus nên việc phòng bệnh được đặt lên hàng đầu Hiện nay, trên thị trường có một số loại vaccine nhược độc và vô hoạt cùng các loại kháng thể để đối phó với bệnh Tuy nhiên do đặc tính của virus này dễ dàng thích ứng với môi trường cũng như một số vấn đề trong sự biến chủng nên đã làm giảm hiệu quả

của các loại vaccine, kháng thể (Đoàn Thị Thanh Hương et al., 2013)

Từ thực tế trên, việc sử dụng interferon (IFN) là một lựa chọn hữu hiệu cho công tác phòng chống bệnh do virus IFN là một cytokine tự nhiên do tế bào tiết ra, bao gồm 3 type: type 1, type 2 và type 3 Trong đó IFN type 1 đóng vai trò quan trọng trong việc kháng virus, ngăn cản sự nhân lên của virus Song theo đó, IFN type 2 ức chế quá trình tái sinh virus ngay tại chỗ và hạn chế sự lan tràn của virus (Trần Ngọc Bích và Hồ Thị Việt Thu, 2012) Đồng thời, nó đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện tăng trọng của đàn gia cầm (Lowenthal, 1997) Hiện nay, trung tâm công nghệ sinh học Thành phố

Hồ Chí Minh đã nghiên cứu thành công chế phẩm ChIFN-α và ChIFN-γ, sử

dụng nấm men Pichia pastoris làm hệ thống biểu hiện Nhận thấy, interferon

gamma gà có cấu trúc tương đồng với interferon gamma vịt xấp xỉ 80%

2

Mục tiêu đề tài:

Khảo sát tính an toàn của rChIFN-α và rChIFN-γ trên vịt con

Khảo sát hiệu quả của rChIFN-α và rChIFN-γ trong phòng bệnh viêm gan do virus type 1 trên vịt con

3

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Interferon

2.1.1 Sơ lược về interferon

Interferon là một nhóm các protein tự nhiên được sản xuất bởi các tế bào của hệ miễn dịch ở hầu hết các động vật nhằm chống lại các tác nhân ngoại lai như virus, vi khuẩn, kí sinh trùng và tế bào ung thư IFN thuộc một lớp lớn của glycoprotein được biết đến với cái tên cytokine (chất hoạt hóa tế bào) Chúng đóng vai trò quan trọng trong cửa ngõ miễn dịch của cơ thể IFN là một phần của hệ thống miễn dịch không đặc hiệu và được kích hoạt bởi giai đoạn đầu của quá trình cảm nhiễm trước khi hệ miễn dịch đặc hiệu có thời gian để phản ứng

Interferon được tế bào sản xuất ra khi tế bào cảm thụ với virus, chất này

có đặc tính ức chế mọi hoạt động của mRNA, dẫn đến ức chế sự sinh sản của virus Điều này được nhận thấy bởi Alick Isaacs và Jean Lindenam (1957) khi gây nhiễm virus cúm sống vào phôi gà đang phát triển mà trước đó đã nhiễm virus cúm bất hoạt bằng nhiệt thì virus mới không thể nhân lên được Nếu nghiền phôi bằng hỗn dịch rồi đem tiêm truyền vào phôi gà khác thì cũng ngăn cản sự nhân lên của virus trong phôi gà

Hình 2.1 Cấu trúc interferon người

(http://en.wikipedia.org/wiki/Interferon)

4

2.1.2 Phân loại interferron

Căn cứ vào thụ thể mà interferon được truyền qua, người ta chia interferon làm 3 type: type 1, type 2 và type 3 (Nguyễn Văn Nguyên và Nguyễn Quốc Bình, 2012)

Type 1: bao gồm IFN-α, IFN-β, IFN-δ, IFN-κ, IFN-ω và IFN-ε, IFN-τ và limitin Tất cả các IFN type 1 gắn vào 1 phức hợp thụ thể đặc biệt ở bề mặt tế bào được biết đến như là thụ thể IFN-α bao gồm IFN-α1 và IFN-α2 IFN-α, IFN-β và IFN-ω được sản sinh từ tế bào khi có sự xâm nhiễm của virus hoặc

vi khuẩn

Type 2: gồm IFN-γ hay còn gọi là IFN miễn dịch IFN này gắn vào thụ thể IFNGR IFN-γ là một glycoprotein bao gồm 2 chuỗi giống nhau với trọng lượng phân tử là 21kD và 24kD Chúng được tạo ra do sự kích thích phân bào

và kháng nguyên IFN-γ được tổng hợp ít nhất bởi 3 kiểu tế bào của hệ thống miễn dịch: tế bào CD4, tế bào diệt tự nhiên (NK), tế bào CD8 Đối với IFN-γ, chúng không có vai trò kháng virus mạnh như IFN-α, nhưng chúng có vai trò rất quan trọng trong điều hòa miễn dịch, đặc biệt là trong việc hoạt hóa đại thực bào, biểu hiện kháng nguyên phù hợp với tổ chức chính lớp II và tác động đến đáp ứng viêm tại chỗ

Type 3: bao gồm IFN-λ1, IFN-λ2, IFN-λ3, IFN-λ4 IFN type 3 thông tin qua một phức hợp thụ thể bao gồm IL10R2 và IFNLR1 Có một số nghiên cứu cho rằng IFN-λ có tiềm năng trong việc điều trị các bệnh do virus và bệnh ung thư (Donnelly and Kotenko, 2010)

2.1.3 Vai trò của interferon

Interferon đóng vai trò là hàng rào bảo vệ đầu tiên của cơ thể chống lại virus và tế bào ung thư Ngoài ra, IFN còn giữ vị trí quan trọng trong việc điều hòa miễn dịch của cơ thể

Kháng virus là hoạt tính nổi bật nhất của IFN-α Chúng cảm ứng tế bào sản sinh ra protein khởi đầu dịch mã, phá hủy RNA thông tin của virus và ức chế sự nhân lên của virus Đã có nhiều nghiên cứu về một số bệnh như viêm não Nhật Bản, cúm, sốt xuất huyết,…để xác định vai trò kháng virus của IFN Các nghiên cứu này nhận thấy vào những ngày đầu khi mới xuất hiện bệnh, với đặc tính hình thành tại chỗ và nhanh chóng trước cả kháng thể đặc hiệu, IFN đã xuất hiện trong máu Tiếp theo, hàm lượng IFN tăng dần và tỉ lệ nghịch với hàm lượng virus trong máu cho đến khi virus giảm đến dưới ngưỡng bệnh thì bệnh được đẩy lùi (Phạm Văn Ty, 2005)

5

Ngoài chức năng kháng virus, IFN còn đóng vai trò quan trọng trong việc chống lại khối ung thư IFN làm trì hoãn sự phân chia của các tế bào ung thư bằng việc ngăn cản sự phân bào Mặc khác, nó còn làm giảm khả năng tự bảo vệ của các tế bào ung thư đối với hệ miễn dịch của cơ thể Đồng thời, tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể Vì vậy, IFN đã có thể ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư một cách hữu hiệu như ung thư bạch cầu tế bào tua, u hạch ở trẻ,…(Phạm Văn Ty, 2005)

IFN ảnh hưởng đến nhiều chức năng miễn dịch của cơ thể IFN có thể hoạt hóa hay ức chế chức năng miễn dịch tế bào hay dịch thể tùy thuộc vào nồng độ của tác nhân cảm ứng (virus, tế bào ung thư,…) Hoạt tính của tế bào

NK cũng như hoạt tính diệt và ức chế sự phát triển của khối u có thể được tăng lên đáng kể nhờ IFN-α và IFN-γ Ngoài ra, IFN-γ có tác dụng tăng cường sự biểu hiện của glycoprotein MHCII trên bề mặt tế bào đại thực bào, tăng cường quá trình trình diện kháng nguyên của quá trình này Nó thúc đẩy biệt hóa tế bào T, tế bào B, hoạt hóa tế bào NK, nội mạc huyết quản, bạch cầu đa nhân trung tính (Nguyễn Văn Nguyên và Nguyễn Quốc Bình, 2012)

Sự kết hợp giữa ChIFN-α và ChIFN-γ giúp làm tăng hiệu quả kháng virus gấp 100 lần so với sử dụng từng loại riêng rẽ Điều này có ý nghĩa quan

trọng trong việc phòng trị các bệnh do virus của gia cầm (Sekellick et al.,

1994)

2.1.4 Cơ chế hoạt động của interferon

Ở gà cũng như các loài hữu nhũ, IFN-α có tính kháng virus mạnh hơn IFN-γ Khi tế bào bị xâm nhập nhập bởi virus hoặc các tác nhân cảm ứng khác, IFN sẽ được hình thành sau vài giờ hay trễ nhất là 1 ngày sau đó

Tác dụng của interferon được hình thành theo cơ chế nâng cao hiệu quả của đáp ứng miễn dịch bằng cách tăng sự biểu hiện của các phân tử MHCI trên

bề mặt các tế bào bị nhiễm virus Vì thế, các interferon sẽ làm tăng cơ hội cho các tế bào T gây độc tế bào nhận biết và tiêu diệt các tế bào bị nhiễm Ngoài

ra, IFN còn có tác dụng diệt virus trực tiếp bằng việc làm thoái hóa RNA thông tin của virus và ức chế quá trình sinh tổng hợp protein Từ đó, làm ngăn

cản sự xâm nhiễm của virus vào tế bào mới (Landolfo et al., 1995)

6

Tác dụng interferon ức chế sự nhân lên của virus được lý giải như sau: khi bị nhiễm virus, các tế bào có khả năng tổng hợp interferon và tiết nó vào dịch thể ngoại bào Tại đó, interferon sẽ gắn kết với các thụ cảm quan đặc hiệu

lên các tế bào kề bên chưa bị nhiễm virus Có ít nhất là 2 gene được giải

phóng trong tế bào khi có mặt của interferon và chúng cho phép tổng hợp 2 enzyme mới Enzyme thứ nhất là protein kinase được hoạt hóa bởi sợi đôi RNA, sẽ xúc tác quá trình photphoryl hóa của một protein của ribosom và làm bất hoạt eIF-2 – một yếu tố khởi đầu dịch mã của virus làm ức chế tổng hợp protein Enzyme thứ 2 là 2,5-oligoadenylat synthetas (OASE) cũng được hoạt hóa bởi sợi đôi RNA, sẽ xúc tác phân cắt ATP tạo oligoadenylat (2,5A), tiếp đến hoạt hóa enzyme ribonuclease nội bào (RNAse) phá hủy mRNA của virus

và do đó cũng ức chế luôn quá trình tổng hợp protein của virus Kết quả là tạo nên một vòng các tế bào không bị nhiễm virus xung quanh vị trí mà virus xâm nhập và nhờ đó làm hạn chế quá trình lây lan của virus

Hình 2.2 Cơ chế kháng virus cảm ứng bởi interferon

(Landolfo et al., 1995)

Bên cạnh đó, trong đáp ứng kháng virus thì IFN không chỉ thể hiện ở tế bào không bị nhiễm virus mà còn cảm ứng quá trình apoptosis (sự chết của tế bào theo lập trình-programmed cell death) trên tế bào bị nhiễm virus (Tanaka

et al., 1998) Người ta cũng đã chứng minh được rằng các enzyme đã được mô

tả ở trên có tác dụng ức chế sự phân chia tế bào cũng như ức chế sự tái tạo của virus Interferon cũng có thề điều chỉnh hoạt động của tế bào khác như các tế bào diệt tự nhiên

7

Hình 2.3 Đáp ứng kháng virus của interferon

(Tanaka el al., 1998)

Hoạt động chống khối u của IFN-α được biểu hiện trực tiếp và gián tiếp

Về việc biểu hiện trực tiếp được giải thích như sau: IFN-α ngăn cản sự phân chia của tế bào khối u bằng cách làm tăng độ dài phân chia tế bào Tham gia vào cơ chế này là 2,5-OASE Hơn nữa, IFN-α còn làm mất các chất trao đổi thiết yếu Chẳng hạn, IFN-α ức chế sự cảm ứng enzyme ornithine decarboxylase, do đó làm giảm sinh tổng hợp putrescin và các polyamine thiết yếu khác IFN-α có tác động chống khối u gián tiếp qua tế bào lympho Tc và đáp ứng miễn dịch tế bào vật chủ IFN-α điều hòa sự biểu hiện của kháng nguyên bề mặt tế bào để đại thực bào và các tế bào lympho Tc nhận biết và giết tế bào khối u hiệu quả hơn Đáp ứng miễn dịch tế bào được tăng cường sẽ đáp ứng sản xuất kháng thể càng nhiều, khi đó tế bài khối u cũng bị phân giải càng nhiều (Tompkin,1999)

2.2 Interferon gà

2.2.1 Phân loại interferon gà

Cũng như IFN của các loài khác, IFN gà bao gồm 2 type chính: type 1 (ChIFN-α và ChIFN-β) và type 2 (ChIFN-γ) với chức năng và cơ chế hoạt động khác nhau

Interferon gà type 1: bao gồm ChIFN-α và ChIFN-β ChIFN đầu tiên

được tạo dòng thành công là ChIFN type I, với nguồn gene từ thư viện cDNA

của các tế bào xơ phôi gà ChIFN tái tổ hợp này được sản xuất khi tế bào bị nhiễm virus và có khả năng kháng virus cao hơn ChIFN tự nhiên Mặc khác, ChIFN-α có hoạt tính kháng virus cao gấp 20 lần so với ChIFN-β

Interferon gà type 2: bao gồm ChIFN-γ ChIFN type 2 đầu tiên được tạo dòng từ thư viện cDNA của các tế bào T được hoạt hóa và các đại thực bào

8

của gà ChIFN-γ có tác dụng cảm ứng sự biểu hiện MHCII trên bề mặt các đại thực bào và các loại tế bào trình diện kháng nguyên khác ở gà (Steimle, 1994)

2.2.2 Interferon alpha gà

Nghiên cứu về tạo dòng, biểu hiện và phân tích trình tự ChIFN-α lần đầu

tiên được công bố vào năm 1994 Gene ChIFN-α không có intron, mã hóa cho

1 protein dài 193 amino acid, trong đó đoạn peptid tín hiệu dài 31 amino acid

và protein trưởng thành có chiều dài 162 amino acid với khối lượng phân tử là

18,96 kDa (Sekellick et al., 1994)

ChIFN-α được sản xuất khi cơ thể gà phản ứng lại sư xâm nhiễm của virus và được sản xuất bởi nhiều loại tế bào khác nhau ChIFN-α ức chế sự tăng sinh của virus bằng cách kích thích tế bào phân hủy RNA virus, ức chế quá trình tổng hợp protein và tăng apoptosis của tế bào nhiễm virus (trích dẫn

Võ Thị Minh Tâm et al., 2014) Mặc khác, nghiên cứu của Yang et al (2013)

nhận định rằng ChIFN-α có hoạt tính kháng virus mạnh hơn ChIFN-γ về việc

ức chế sự sao chép của virus ở bệnh viêm miệng mụn nước, Newcastle và cúm gia cầm

2.2.3 Interferon gamma gà

Nghiên cứu tạo dòng thành công gene mã hóa cho ChIFN-γ và biểu hiện

IFN này trên hệ thống tế bào COS Kết quả cho thấy: cDNA của ChIFN-γ mã hóa cho một protein dài 164 amino acid chứa vùng tín hiệu chứa 19 amino acid và ChIFN-γ trưởng thành dài 145 amino acid, tương ứng với trọng lượng phân tử 16,8 kDa ChIFN-γ được sản xuất từ tế bào T được hoạt hóa và các đại thực bào Mặc khác, qua kết quả so sánh trình tự acid amin thì ChIFN-γ tương

đồng 32% với MaIFN-γ và 15% với ChIFN-α (Digby et al., 1995)

Hình 2.4 Cấu trúc tinh thể của interferon gamma

( http://www.creativebiomart.net/description_6862_8.htm )

9

ChIFN-γ có khả năng cảm ứng tổng hợp protein gắn kết guanylate guanylate-binding protein) và cảm ứng tổng hợp các yếu tố điều hòa IFN (IRF-1 –IRF regulatory factor 1) trên các tế bào đích Đồng thời, ChIFN-γ có tác dụng cảm ứng sự biểu hiện kháng nguyên MHCII trên bề mặt các đại thực

(GBP-bào và các loại tế (GBP-bào khác ở gà (Janardhana et al., 2007)

Tuy nhiên, ChIFN-γ thể hiện khả năng kháng virus kém hơn so với

ChIFN-α (Song et al., 1997) Nghiên cứu cho thấy, ChIFN-γ không có khả

năng ngăn chặn quá trình cảm ứng gây phá vỡ cấu trúc tế bào chủ của virus

sau khi xâm nhập (Weining et al., 1996)

2.3 Sự biểu hiện ChIFN-α và ChIFN-γ trên hệ thống Pichia pastoris Tạo dòng nấm men Pichia pastoris

Pichia pastoris là hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp nhiều triển vọng

vì biểu hiện protein dạng tiết, dễ nuôi cấy, có thể nâng cấp lên quy mô sản xuất công nghiệp và giá thành sản xuất thấp Do đó, việc tạo được dòng nấm

men P pastoris biểu hiện ChIFNs sẽ mở ra triển vọng sản xuất được các

protein này với giá thành hợp lý, phục vụ cho ngành chăn nuôi gia cầm

Quá trình tạo dòng nấm men P pastoris biểu hiện ổn định ChIFN-α và ChIFN-γ được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất Tóm tắt quá trình

này như sau: plasmid pPIC9K tái tổ hợp mang gene mã hóa cho ChIFN-α và

ChIFN-γ được cắt mở vòng bằng SalI và được điện biến nạp vào P pastoris, các dòng nấm men mang gen mục tiêu được sàng lọc trên môi trường các dòng

P pastoris tái tổ hợp có mang gene mục tiêu được nuôi cấy liên tục trên môi

trường YPD Pichia chứa G418 với nồng độ tăng dần (2, 4, 6, 8, 10 mg/ml) nhằm tìm ra các dòng có mang nhiều bản sao của gen mục tiêu trong bộ gen (Võ Thị Minh Tâm et al., 2014)

Ƣu điểm của hệ thống nấm men Pichia pastoris

Pichia pastoris là hệ thống biểu hiện ChIFN đang được ứng dụng gần

đây với nhiều tiềm năng lớn trong việc sản xuất protein bởi nhiều ưu điểm vượt trội

Hệ thống P pastoris có tính bền vững qua nhiều thế hệ tế bào do vector tái tổ hợp mang gene mục tiêu có thể được sát nhập vào bộ gen nấm men theo

cơ chế tái tổ hợp tương đồng giữa DNA plasmid và vùng trình tự tương đồng

trên bộ gene theo 2 cách: gắn chèn vector vào bộ gene nấm men hoặc thay thế

gene, loại bỏ hoàn toàn gene AOX1 trong bộ gene nấm men Số lượng bản

sao của gene mục tiêu sát nhập vào bộ gene chủng chủ nấm men có thể là một

trong các yếu tố giúp gia tăng mức độ biểu hiện ChIFN Hơn nữa, ChIFN

10

được tiết ra ngoài môi trường ở dạng có hoạt tính Do đó, quá trình thu nhận, tinh chế ChIFN dễ dàng hơn so với ChIFN được biểu hiện ở dạng nội bào trên

các hệ thống khác (Vương Cát Khánh et al., 2014)

So với hệ thống P cerevisidae, P pastoris có thể phát triển mật độ

ChIFN cao hơn gấp nhiều lần Từ đó hệ thống tạo một lượng sinh khối rất lớn

trong quá trình lên men với thao tác đơn giản (Ngô Thị Kim Hằng et al., 2012) Đồng thời, P pastoris sử dụng methanol làm chất cảm ứng Đây là một

hóa chất rẻ tiền Vì vậy, hệ thống không những được ứng dụng trong nghiên cứu mà còn có thể được sử dụng để sản xuất ChIFN với quy mô công nghiệp

Sự biểu hiện ChIFN-α và ChIFN-γ trên hệ thống Pichia pastoris

Sự biểu hiện của ChIFN-α và ChIFN-γ trong dịch nuôi cấy P pastoris đã

được xác định bằng SDS-PAGE Hoạt tính sinh học của ChIFN-α tái tổ hợp được xác định trên mô hình nguyên bào sợi phôi gà gây nhiễm virus IBDV và NDV Khi gây nhiễm tế bào với virus IBDV, tỷ lệ tế bào sống ở lô xử lý với ChIFN-α liều 1,6 μg/ml là 79-88% trong khi tỷ lệ tế bào sống ở lô đối chứng

âm là 33-34% Khi gây nhiễm tế bào với virus NDV, tỷ lệ tế bào sống ở lô xử

lý với ChIFN-α liều 1,6 μg/ml là 81-90%, cao hơn đáng kể tỷ lệ tế bào sống ở

lô đối chứng là 27-32% Như vậy, protein tái tổ hợp ChIFN-α và ChIFN-γ đã

được biểu hiện thành công trên hệ thống P pastoris và ChIFN-α có hoạt tính kích thích tế bào kháng virus IBDV và NDV (Võ Thị Minh Tâm et al., 2014)

2.4 Các nghiên cứu sử dụng rChIFN-α và rChIFN-γ

2.4.1 Nghiên cứu ngoài nước

Sekelick el al.(1994) là người đầu tiên tạo ra interferon gà tái tổ hợp từ

E coli Sản phẩm dịch mã ban đầu của RNA thông tin của interferon alpha gà

tái tổ hợp có 193 acid amin IFN gà trưởng thành có khoảng 162 acid amin với trọng lượng phân tử 19kDa

Năm 1997, Lowenthal xác định hoạt tính in vitro của ChIFN-γ trên gà con 7 ngày tuổi bị nhiễm Eimeria bằng cách tiêm vào ổ bụng 5.000 IU/ngày

Kết quả cho thấy, so với nhóm đối chứng không được tiêm ChIFN-γ, khối lượng gà của nhóm thí nghiệm tăng đều, không có triệu chứng sụt giảm khối lượng do tác động xâm nhiễm của virus

Thử nghiệm hoạt tính của rChIFN-α đối với bệnh Newcastle trên gà

trong suốt 11 ngày được thực hiện bởi Marcus et al vào năm 1999 Gà được

thử nghiệm điều trị bằng dịch rChIFN-α với nồng độ 1.000-2.000 UI/ml Kết quả cho thấy sinh phẩm làm giảm các triệu chứng bệnh, đồng thời tránh được tình trạng lây lan và bùng phát bệnh Trong cùng năm, nghiên cứu của Plachy

11

cho rằng ở liều 100 IU/ml, ChIFN-α ức chế được sự tăng sinh khối u do virus

Rous sarcoma gây ra

Hoạt tính của rChIFN được thử nghiệm trong điều kiện in vivo và được đánh giá là có hiệu quả trong việc chống lại virus gây viêm phế quản ở gia cầm ChIFN-α ức chế sự nhân lên của virus trong tế bào thận gà ở liều tác động 100 IU/ml/con với tỷ lệ 50% Mặc khác, nghiên cứu cho rằng ChIFN-α

có thể bảo vệ được tế bào bằng cách tiêm tĩnh mạch hoặc cho uống ChIFN-α

trước 1 ngày gây nhiễm virus và mỗi 5 ngày sau đó (Pie et al., 2001) Cùng thời điểm, nghiên cứu của Jarosinski et al nhận định ChIFN-α làm giảm đáng

kể sự nhân lên của virus Marek khi cho gà uống ChIFN-α với liều 2.000 IU/ml

Năm 2008, Song et al nghiên cứu tạo ra rChIFN-α biểu hiện trong rau

diếp Sản phẩm ban đầu cho thấy tính khả quan trong hoạt tính sinh học qua thử nghiệm ức chế bệnh tích tế bào và sự nhân lên của virus gây viêm miệng cho mụn nước trên tế bào CEF Kết quả cho thấy rChIFN-α có khả năng cảm ứng hoạt tính kháng virus của tế bào

Trong một nghiên cứu mới đây, Jiang et al (2011) đã so sánh khả năng

bảo vệ tế bào của rChIFN-α trên tế bào sơ phôi sơ cấp của gà, vịt và gà tây trước khi gây nhiễm với virus H1N1 và virus H5N9 Với việc xử lí trước với 1.000 UI/ml rChIFN-α trong 18 giờ, rChIFN-α đã làm giảm đáng kể sự nhân lên của virus trong 2 loại tế bào xơ phôi của gà và gà tây, mức độ giảm ít hơn

ở tế bào phôi vịt Cụ thể là sự tăng sinh của virus giảm xấp xỉ 200 lần trên tế bào gà và gà tây, khoảng 30 lần trên tế bào vịt sau 48 giờ gây nhiễm Các số liệu này được chứng tỏ rằng rChIFN-α có thể làm giảm sự nhân lên của virus

và có hoạt tính sinh học trên các loài gia cầm khác

2.4.2 Nghiên cứu trong nước

Năm 2000, Việt Nam phối hợp với các nhà khoa học Ucraina đã sản xuất thử thành công IFN-α tại viện vaccine Nha Trang theo công nghệ dùng phage

của E coli làm vector, do đó việc chiết IFN dễ dàng hơn (Phạm Văn Ty,

2005)

Viện vaccine Nha Trang bắt đầu nghiên cứu sản xuất thuốc nhỏ mũi làm

từ interferon để phòng chống bệnh cúm, các bệnh truyền nhiễm đường hô hấp

do virus vào năm 2003 Hiện nay, ở nước ta lưu hành nhiều loại thuốc sản xuất

từ interferon với tên biệt dược như: Alpha feron (JeJang- Hàn Quốc), Superferon (Viện vaccine Việt Nam),…

12

Cho đến năm 2010, Nguyễn Ngọc Ẩn et al đã thử hoạt tính kháng virus

in vitro của rChIFN-α trên vỏ bào tử Bacillus subtilis Kết quả thử nghiệm cho

thấy rChIFN-α có khả năng kháng IBDV và NDV tùy thuộc vào liều Hoạt tính kháng virus thề hiện sự ức chế tạo ổ hoại tử trên môi trường tế bào CEF

Nghiên cứu hiệu quả phòng bệnh của bào tử Bacillus subtilis biểu hiện

interferon alpha trong phòng bệnh Gumboro cho gà được thực hiện trên giống

gà 3 tuần tuổi Kết quả cho thấy ChIFNα- B subtilis có khả năng phòng bệnh Gumboro với tỷ lệ bảo hộ là 77,08% cao hơn so với tỷ lệ bảo hộ bởi ChIFN-α

là 66,67% và so với đối chứng B subtilis (12,50%) Nghiên cứu chứng minh ChIFNα- B subtilis có tiềm năng trong việc phòng bệnh Gumboro trên gà (Hồ Thị Việt Thu, 2012)

2.5 Bệnh viêm gan vịt do virus

Bệnh viêm gan vịt do virus là bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây lan nhanh

do nhiều loại virus Có 3 type virus gây bệnh: type 1, type 2 và type 3, trong

đó type 1 là phổ biến nhất Bệnh chủ yếu xảy ra ở vịt con mới nở đến 6 tuần tuổi với bệnh tích đặc trưng là gan sưng, nhạt màu, xuất huyết

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.5.1.1 Tình hình ngoài nước

Năm 1945, Levine và Hofstad lần đầu tiên phát hiện một ổ dịch bệnh trên vịt con, vịt chết nhanh sau khi có biểu hiện triệu chứng, bệnh tích đặc trưng là gan sưng to và có các điểm xuất huyết Tuy nhiên, mầm bệnh chưa được phân lập Đến mùa xuân năm 1949, Levine và Fabricant đã theo dõi một bệnh trên đàn vịt Bắc Kinh trắng tại Long Island và New York, Mỹ Bệnh lây lan rất nhanh với tỉ lệ chết lên đến 95% đối với những trại mắc bệnh nặng và giảm dần đến khi tỷ lệ mắc bệnh chỉ còn 15% Theo thống kê, tổng số vịt chết lên đến 750.000 con (Woolcock and Fabricant, 1997)

Cho đến năm 1968, bệnh viêm gan vịt do virus type 1 có mặt hầu hết ở các nước trên thế giới, trong đó có một số nước châu Á như Trung Quốc, Hàn Quốc,…Trong cùng năm, Toth đã quan sát thấy bệnh viêm gan ở đàn vịt con

đã được miễn dịch đối với bệnh viêm gan do virus type 1 Ông đã phân lập được loại virus đó khác với type 1 và type 2 và đặt tên cho loại virus đó là virus viêm gan vịt type 3 Bệnh do loại virus này chỉ xảy ra ở Mỹ (Woolcock and Fabricant, 1997)

Hiện nay, virus viêm gan vịt type 1 được phân loại gồm 3 genotype: genotype 1 (DHAV-1), genotype 2 (DHAV-2) và genotype 3 (DHAV -3) (OIE, 2010) Trong đó phổ biến nhất là DHAV-1 DHAV-3 được công bố lần

13

lượt tại Hàn Quốc và Trung Quốc, DHAV-2 mới chỉ phát hiện duy nhất tại Đài Loan Mặc khác, các genotype của virus viêm gan vịt có sự khác biệt hoàn toàn về huyết thanh học cũng như về tính kháng nguyên (OIE, 2010)

2.5.1.2 Tình hình trong nước

Cho đến năm 1983, một chủng virus viêm gan tại một trại ở Hà Sơn Bình

đã được phân lập bởi Trần Minh Châu et al Qua nuôi cấy trên phôi gà chủng

virus này yếu đi, không gây bệnh cho vịt con và có khả năng tạo được sức đề kháng với bệnh cho vịt con

Năm 2001, Nguyễn Hữu Vũ et al cũng phát hiện bệnh viêm gan vịt do

virus xảy ra ở Thái Bình và các tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long gây tổn thất rất lớn Đồng thời, bệnh cũng xảy ra ở Nông Cống (Thanh Hóa) với tỷ lệ chết cao, có khi lên đến 100% trong vòng 5 ngày, xóa sổ nhiều đàn vịt từ điều tra của Lê Văn Tạo Chỉ trong vòng 1 năm, số vịt con chết vì bệnh viêm gan vịt lên đến hàng chục nghìn con, gây tổn thất không nhỏ cho ngành chăn nuôi vịt nói riêng và ngành chăn nuôi gia cầm nói chung (Nguyễn Đức Lưu và Vũ Như Quán, 2002)

Năm 2011, Đoàn Thị Thanh Hương báo cáo phát hiện và giải mã hoàn toàn trình tự gen của virus DHAV-3 phân lập được ở Đồng Nai, Việt Nam Cho đến năm 2013, qua điều tra các mẫu bệnh phẩm thu thập được từ các đàn vịt mắc bệnh viêm gan vịt tại tỉnh Ninh Thuận, một chủng virus được phân lập

và qua kết quả phân tích phả hệ nguồn gốc đã khẳng định chủng virus này thuộc genotype 3, cùng loại với chủng virus viêm gan vịt của Hàn Quốc và Trung Quốc, đặc biệt có quan hệ gần gũi nhất với chủng B-N của Trung Quốc Qua điều tra 300 mẫu bệnh phẩm từ vịt nghi mắc bệnh viêm gan do virus được thu thập tại 4 tỉnh Ninh Thuận, Khánh Hòa, Phú Yên và Bình Định đã xác định được tỉ lệ nhiễm virus viêm gan vịt trung bình trong các mẫu bệnh phẩm là 65, 67% Trong đó, nhóm tuổi vịt nhiễm virus cao nhất là dưới 1 tuần tuổi với tỉ lệ là 88,46%, kế đến là vịt từ 1 đến 3 tuần tuổi (72,41%), thấp nhất

ở nhóm vịt từ 3 đến 6 tuần tuổi (30,00%) (Phạm Hùng et al., 2014)

2.5.2 Căn bệnh

2.5.2.1 Đặc điểm hình thái

Virus viêm gan type 1 là RNA virus thuộc họ Picornaviridae Virus này

có kích thước 20-40 nm và đặc biệt không gây ngưng kết hồng cầu Đây là loại virus không có vỏ ngoài với capside gồm 32 capsomere

14

Virus viêm gan vịt type 2 có đường kính từ 28-30 nm Đây là một

Astrovirus có đường kính từ 28-30 nm và có đặc tính kháng nguyên khác với Astrovirus của gà và gà tây Hiện nay được đặc tên là DastV – 1

Virus viêm gan vịt type 3 là một RNA virus có đường kính 30 nm Theo

OIE năm 2010, virus viêm gan vịt type 3 là một Astrovirus thuộc họ

astroviridae và được đặt tên là DAstV – 2 để phân biệt với virus viêm gan vịt

type 2 (DastV – 1)

2.5.2.2 Đặc tính sinh học của virus

Virus viêm gan vịt không gây ngưng kết hồng cầu gà, vịt, cừu, ngựa, chuột, rắn, heo,…Virus này không gây miễn dịch chéo với virus viêm gan vịt

ở người và virus dịch tả vịt (Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012) Virus không ngưng kết hồng cầu khỉ khi thí nghiệm ở pH 6,8 – 7, nhiệt

Virus bị bất hoạt hoàn toàn với chloramines 3% trong 5 giờ, formalin 0,2% trong 2 giờ, phenol 5% và dung dịch sodium hypochlorite trong 8 giờ Xét về nhiệt độ, virus viêm gan vịt bị bất hoạt ở 560C sau 30 phút, nhưng sau

23 giờ thì virus mới bị bất hoạt hoàn toàn (Nguyễn Đức Hiền, 2012)

2.6.3 Truyền nhiễm học

2.5.3.1 Loài mắc bệnh

Viêm gan vịt type 1 thường xảy ra trên vịt dưới 6 tuần tuổi, đặc biệt là đối với vịt con từ 1-3 tuần tuổi Vịt xiêm con và ngỗng dưới 6 tuần sẽ không mắc bệnh trong tự nhiên (OIE, 2010)

Một số loài vịt hoang dã như le le, vịt trời là những vật mang trùng, những động vật này khi di cư có thể mang virus đi xa hàng ngàn kilomet, chúng bài thải virus theo phân vào nguồn nước và làm lây lan bệnh (Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012)

15

2.5.3.2 Phương thức truyền lây

Bệnh có thể truyền lây qua đường tiêu hóa, hô hấp và vết thương ở da Vịt bệnh luôn bài xuất virus ra môi trường bên ngoài theo phân, nước mũi vào thức ăn, nước uống, chất độn chuồng, dụng cụ chăn nuôi, máy ấp,…lây nhiễm

sang vịt khác (Nguyễn Xuân Bình et al., 2005)

Virus có thể lây lan đến các nơi xa hơn do loài chim hoang dại mang virus viêm gan vịt từ vùng này bay sang vùng khác Ngoài ra, chuột cống nâu cũng có thể là nguồn vật chủ dự trữ virus viêm gan vịt type 1

Bệnh lây truyền dễ dàng qua đường tiêm bắp thịt và cho ăn virus phân lập từ trứng Thời kì ủ bệnh 24 giờ, gần như tất cả đều chết vào ngày thứ 4 Những vịt con khi tiêm truyền cũng bị lây và chết chậm hơn vịt được tiêm virus (Levine and Fabricant, 1957)

2.5.3.3 Cơ chế sinh bệnh

Virus xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hóa, đường hô hấp hoặc qua vết thương rồi vào máu Virus theo máu đến các phủ tạng, đặc biệt là ở gan Dưới tác động của virus, quá trình trao đổi chất ở gan bị rối loạn, lượng glycogen ở gan giảm thấp, lượng lipid tăng do quá trình trao đổi cholesterol bị đình trệ Do đó, vịt con mắc bệnh bị thiếu năng lượng và sức đề kháng bị giảm sút Sau đó, virus trực tiếp phá hoại tế bào gan và các tế bào nội mô huyết quản gây nên hoại tử và xuất huyết Tổ chức gan bị phá hoại, gan không giải độc được và con vật bị chết do bị ngộ độc (Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012)

2.5.3.4 Triệu chứng

Khi nhiễm virus type 1, bệnh thường thấy ở thể quá cấp và vịt con chết đột ngột trong vòng 1-2 giờ sau khi nhiễm Thời gian nung bệnh thường 1-2 ngày (Nguyễn Đức Lưu và Vũ Như Quán, 2002)

Vịt con lúc đầu nhiễm bệnh có biểu hiện đi đứng chậm chạp, thường không theo kịp đàn Sau một thời gian ngắn, vịt không đi lại được, nằm bẹp, nhắm mắt, bỏ ăn sã cánh, một số bị tiêu chảy Sau một vài giờ niêm mạc xanh tím, vịt bị co giật, nằm la liệt, nghiêng sườn hoặc nằm ngửa, chân duỗi thẳng, đầu ngoẹo sang sườn hoặc lên lưng Ngoài ra, vịt còn có thể rơi vào trạng thái hôn mê, mất điều hòa, vịt giảm cân và có những cơn co thắt trước khi chết

(Trần Thị Liên et al., 2005)

Đối với những bệnh ở thể mãn tính, vịt có thể bị nhiễm mầm bệnh kế

phát từ Salmonella, vịt bệnh ủ rũ cao độ và tiêu chảy

16

Hình 2.5 Vịt chết tƣ thế đầu ngoẹo ra sau

(Nguồn http://nanovet.com.vn/SiteIndex.aspx?Function=DetailsBenhDieuTri&Id=16) 2.5.3.5 Bệnh tích

Bệnh tích đại thể

Bệnh tích chủ yếu tập trung ở gan: gan viêm, sưng to, nhũn, dễ bị nát khi

ấn nhẹ Trên bề mặt gan có xuất huyết lấm tấm hay thành từng đám màu đỏ

sẫm hoặc đỏ tím (Nguyễn Văn Cảm et al., 2001) Các nốt xuất huyết cũng có

thể được quan sát ở mặt dưới của gan Bên cạnh các điểm xuất huyết còn thấy các điểm tụ máu đỏ hoặc những đám màu vàng nhạt do tổ chức gan bị thoái hóa

Ngoài bệnh tích gan còn thấy các bệnh tích thường gặp là: lách sưng phù, đôi khi xuất hiện những điểm trắng hoại tử Các mạch máu ở thận sung huyết

Cơ tim nhợt nhạt, màng bao tim và túi khí bị viêm, thận tụ huyết nhẹ, lách hơi sưng (Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012)

Hình 2.6 Gan sƣng to, nhạt màu, xuất huyết

(Nguồn http://www.merckmanuals.com)

17

Bệnh tích vi thể

Bệnh biến đổi chủ yếu là hoại tử tế bào gan và sự tăng các tế bào biểu

mô ống mật Có sự thay đổi mức độ viêm tế bào và xuất huyết xảy ra Các mức độ phản ứng viêm khác nhau, xuất hiện nhiều tế bào viêm đơn nhân ở quanh ống mật và tập trung thành từng đám ở nhu mô gan Hồng cầu thoát ra

ngoài mạch quản tràn lan với tỷ lệ lên đến 100% (Nguyễn Văn Cảm et al.,

2001) Mặc khác, theo nhận định của Levine (1972) thì sự tái sinh nhu mô gan được quan sát ở vịt con không chết

Chẩn đoán virus học

Bệnh phẩm là gan, não của vịt pha với nước sinh lý thành huyễn dịch 20%, xử lý bằng kháng sinh diệt tạp khuẩn, lấy nước trong rồi gây nhiễm cho phôi Tiêm 0,2 ml huyễn dịch vào xoang niệu mô hoặc màng CAM của phôi

gà 8-10 ngày tuổi hoặc phôi vịt 10-14 ngày tuổi Nếu huyễn dịch có chứa virus thì phôi chết Đối với phôi gà thì thường gây chết phôi sau 5-8 ngày tiêm và

phôi vịt từ 3-5 ngày sau khi tiêm (Trần Thị Liên et al., 2005) Mổ khám thấy

bệnh tích đặc trưng trên phôi như sau: phôi còi cọc, xuất huyết toàn thân, phù

nề ở bụng Gan của phôi có màu đỏ hoặc vàng, xuất huyết và hoại tử rất rõ Đối với phôi chết muộn hơn, dịch niệu có màu xanh lục

Chẩn đoán huyết thanh học

Chẩn đoán huyết thanh học không hữu ích trong các đợt dịch viêm gan vịt type 1 cấp tính Tuy nhiên, các xét nghiệm huyết thanh học được sử dụng cho các mục đích khác như giám định virus, chuẩn độ hiệu giá kháng thể trung hòa virus sau tiêm vaccine hoặc được sử dụng cho các đợt khảo sát dịch tễ học (Nguyễn Đức Hiền, 2012)

18

Khi virus bị kháng thể đặc hiệu kết hợp sẽ không còn khả năng gây bệnh nên phản ứng kết hợp giữa virus với kháng thể được gọi là phản ứng trung hòa virus Người ta có thể dùng kháng huyết thanh liệu pháp (huyết thanh miễn dịch có chứa kháng thể đặc hiệu) để can thiệp vào ổ dịch do virus gây ra Lúc này sự trung hòa virus xảy ra ngay sau khi tiêm huyết thanh miễn dịch vào cơ thể và con vật không còn bị virus gây bệnh được nữa

Với mục đích chẩn đoán virus trong phòng thí nghiệm in vitro, người ta

có thể thực hiện phản ứng trung hòa virus trên phôi, trên động vật cảm thụ, và trên môi trường tế bào nuôi cấy Nguyên lý cơ bản của phản ứng trung hòa là trên đối tượng nuôi cấy (phôi, động vật cảm thụ, môi trường tế bào) virus sẽ nhân lên và gây bệnh tích cho các đối tượng trên, còn khi hỗn hợp virus với kháng thể đặc hiệu tương ứng, chúng sẽ bị trung hòa, không nhân lên được và không gây bệnh tích

2.6.3.7 Phòng bệnh

Phòng bệnh bằng vệ sinh

Sát trùng chuồng trại chăn nuôi, dụng cụ chăn nuôi thường xuyên bằng formol 1% hoặc NaOH 3% Nên tự túc con giống, trứng ấp từ đàn bố mẹ khỏe mạnh

Phải đảm bảo nguyên tắc chống bệnh nhằm cắt đứt một trong 3 khâu của quá trình sinh dịch

Tiêu hủy xác chết, cách ly vịt bệnh Chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi, môi trường xung quanh phải sát trùng kỹ càng Cấm vận chuyển mua bán vịt, trứng

để tránh lây lan Vịt bệnh phải được cách ly

Dùng kháng huyết thanh hoặc vaccine tiêm cho đàn vịt để loại những con đang nung bệnh và những con ốm, đồng thời tạo miễn dịch nhanh chóng cho những vịt chưa mắc bệnh

Với vịt sinh sản, tiêm vaccine tạo trạng thái miễn dịch cao để vịt mẹ truyền kháng thể cho vịt con qua trứng Tiến hành tiêm vaccine 2 lần cách nhau 4-6 tuần, mỗi lần 0,5-1ml vaccine vào bắp thịt Lần tiêm thứ 2 vào thời

Việc cho vịt uống interferon và bổ sung chất điện giải, chất giả độc gan như Sorpheron (1ml/1 lít nước) làm giảm tỉ lệ chết đáng kể Tiêm vaccine nhược độc giúp loại bỏ những vịt đang nung bệnh, những vịt mắc bệnh đồng thời tạo miễn dịch nhanh chóng

20

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Xác định liều gây chết 50% vịt con của DHV-1

Khảo sát tính an toàn của rChIFN-α và rChIFN-γ trên vịt con

Khảo sát tính kháng virus của rChIFN-α và rChIFN-γ riêng rẽ và kết hợp trên vịt con

3.2 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM

3.2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

Thời gian: từ tháng 08/2014 đến tháng 12/2014

Địa điểm: Trại chăn nuôi thực nghiệm và Phòng thí nghiệm virus học,

Bộ môn Thú Y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ

3.2.2 Vật liệu thí nghiệm

Đối tượng thí nghiệm

Trứng vịt có phôi được lấy từ đàn vịt bố mẹ nuôi chăn thả, khỏe mạnh, không tiêm ngừa vaccine viêm gan vịt do virus và không chứa kháng thể kháng virus viêm gan vịt type 1 Nguồn vịt được lấy từ hộ chăn nuôi tại ấp An Hương, xã Mỹ An, huyện Mang Thít, tỉnh Vĩnh Long do nơi đây chưa xảy ra bệnh viêm gan vịt do virus Trong đó, đàn vịt bố mẹ được lấy máu, kiểm tra kháng thể kháng DHV-1 qua phản ứng trung hòa virus và cho kết quả là không

có kháng thể kháng DHV-1 lưu hành

Trứng vịt từ đàn vịt bố mẹ đã kiểm tra là không có kháng thể kháng DHV-1 được đem về và ấp tại Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ Trong đó, vịt con thí nghiệm nở ra là là giống vịt Tàu, không bị nhiễm DHV-1 và không chứa kháng thể DHV-1 và đồng đều

nhau ở 1 ngày tuổi Tổng số lượng vịt thí nghiệm là 140 vịt con

21

Dụng cụ, thiết bị và môi trường

Dụng cụ: ống tiêm y tế, ống nghiệm vô trùng, giá đựng ống nghiệm, bình trữ lạnh, type đựng huyết thanh, đĩa 96 giếng, micropipet, dao mổ, kéo, đèn cồn, đĩa petri, lam, paraffin, găng tay, khẩu trang, bông gòn,…

Thiết bị: máy ấp trứng, tủ cấy vô trùng, máy ly tâm lạnh, tủ sấy autoclave, cân,

Môi trường: dung dịch PBS

Sinh phẩm

Dịch rChIFN-α và rChIFN-γ (Trung tâm công nghệ sinh học Thành phố

Hồ Chí Minh) được bảo quản lạnh ở nhiệt độ là -700

3.3.1 Chuẩn bị chuồng nuôi

Chuẩn bị chuồng nuôi: chuồng nuôi là dạng chuồng lồng, xung quanh bao bằng lưới chì, nền chuồng được lót bằng rơm khô Chuồng được phun thuốc sát trùng cẩn thận trước khi đưa vịt vào nuôi

Thức ăn: thức ăn nuôi vịt thí nghiệm là thức ăn hỗn hợp của công ty Anco

Quy trình chăm sóc: vịt con được nuôi úm trên chuồng, trang bị cho mỗi

ô chuồng 1 bóng đèn tròn 75W để ủ ấm Xung quanh khu vực nuôi phải được che chắn cẩn thận để tránh mưa tạt gió lùa

3.3.2 Bố trí thí nghiệm

3.3.2.1 Xác định nồng độ liều gây chết 50% vịt (LD 50 ) của DHV-1 trên vịt con

Chuẩn bị vịt con: sử dụng vịt con từ đàn bố mẹ khỏe mạnh chưa tiêm

phòng bệnh viêm gan vịt type 1 và không chứa kháng thể kháng virus viêm gan vịt type 1

22

Dung dịch: huyễn dịch virus viêm gan vịt type 1 được pha loãng với

dung dịch PBS thành những nồng độ lệch nhau 10 lần từ 100

đến 10-6

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên thông

qua 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 5 vịt con Tất cả các nghiệm thức được cho uống huyễn dịch virus đã chuẩn bị sẵn lần lượt từ nồng độ 100 đến 10-6

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm xác định LD 50 của DHV-1 trên vịt con

Trong thời gian theo dõi, vịt được chăm sóc, nuôi dưỡng tốt trong cùng một điều kiện nhất định Tiến hành quan sát và theo dõi vịt ở các nghiệm thức trong vòng 7 ngày Ghi nhận kết quả

Cách tính liều LD50: tính liều LD50 dựa vào phương pháp Biometry của Reed & Muench (1938)

L>50% – L<50%)0% – L<50%)

Dp =