khảo sát sự đề kháng của vi khuẩn escherichia coli đối với kháng sinh nhóm beta lactam phổ rộng trên gà thả vườn tại hai trại thuộc huyện mỏ cày bắc tỉnh bến tre

KHẢO SÁT SỰ ĐỀ KHÁNG CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI ĐỐI VỚI KHÁNG SINH NHÓM BETA-LACTAM PHỔ RỘNG TRÊN GÀ THẢ VƯỜN TẠI HAI TRẠI THUỘC HUYỆN MỎ CÀY BẮC TỈNH BẾN TRE Luận văn tốt nghiệp Ng

KHẢO SÁT SỰ ĐỀ KHÁNG CỦA VI KHUẨN

ESCHERICHIA COLI ĐỐI VỚI KHÁNG SINH NHÓM

BETA-LACTAM PHỔ RỘNG TRÊN GÀ THẢ VƯỜN TẠI HAI TRẠI THUỘC HUYỆN MỎ CÀY BẮC TỈNH BẾN TRE

Luận văn tốt nghiệp Ngành: BÁC SĨ THÚ Y

Cần Thơ, 2015

KHẢO SÁT SỰ ĐỀ KHÁNG CỦA VI KHUẨN

ESCHERICHIA COLI ĐỐI VỚI KHÁNG SINH NHÓM

BETA-LACTAM PHỔ RỘNG TRÊN GÀ THẢ VƯỜN TẠI HAI TRẠI THUỘC HUYỆN MỎ CÀY BẮC TỈNH BẾN TRE

MSSV: 3102992 Lớp: CN10Y4A1 – K36

Cần Thơ, 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

Đề tài: “Khảo sát sự đề kháng của vi khuẩn Escherichia coli đối với kháng

sinh nhóm Beta - lactam phổ rộng trên gà thả vườn tại hai trại thuộc huyện

Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến Tre”, do sinh viên Võ Thị Mai Trang thực hiện tại phòng

thí nghiệm vệ sinh thực phẩm, Bộ môn Thú Y, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học

Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ Từ tháng 8/2014 đến tháng 11/2014

TS Lý Thị Liên Khai

Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2015

Duyệt Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

LỜI CÁM ƠN

Nhớ lại ngày đầu tiên khi tôi đặt chân lên giảng đường đại học, có biết bao ngỡ ngàng, vui sướng với nhiều ước mơ hoài bão Hôm nay, ước mơ đó đã thành sự thật, ngoài sự nổ lực không ngừng của bản thân, còn có nguồn động viên và dạy bảo tận tình của cha mẹ, thầy cô và bạn bè, để giờ đây tôi ngồi viết bài hoàn thành luận văn tốt nghiệp Tôi không biết nói gì hơn ngoài lời biết ơn chân thành nhất gửi đến những người đã quan tâm lo lắng và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua Tôi xin thành kính dâng lên lời biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, người không quãng khó khăn vất vả lo cho tôi ăn học thành tài được như ngày hôm nay

Tôi xin hết lòng ghi nhớ công ơn cô Lý Thị Liên Khai, người đã dành cả đời của

mình cho sự nghiệp trồng người, cô đã hết lòng quan tâm, lo lắng, chỉ bảo và là nguồn động viên cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn! Quý thầy cô Bộ môn Thú Y và Bộ môn Chăn Nuôi đã

truyền đạt cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm quý báu, lẫn nhận thức xã hội trong quá trình học tập tại trường Ban Giám Hiệu trường Đại Học Cần Thơ, Ban Chủ Nhiệm Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, các chú bảo vệ và các cô trong thư viện khoa Nông Nghiệp đã tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Cám ơn các anh thú y xã Phú Sơn, Phú Mỹ và các cô, chú chủ trại gà huyện Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến Tre Cùng tất cả các anh chị cao học K19, 20, các bạn dược thú

y 36, thú y 36, các em thú y 38, chăn nuôi thú y 38 đã luôn động viên, chia sẽ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối lời tôi xin kính chúc tất cả mọi người thật nhiều sức khỏe và gặt hái được nhiều thành công trong cuộc sống!

Võ Thị Mai Trang

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CHỮ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT ĐẦY ĐỦ

Mục lục

Trang tựa i

Trang duyệt ii

Lời cảm ơn iii

Danh mục chữ viết tắt iv

Mục lục v

Danh mục bảng – Sơ đồ vii

Danh mục hình ix

Tóm lược x

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÍ LUẬN 3

2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước về sự đề kháng của vi khuẩn E coli đối với kháng sinh nhóm β-lactam phổ rộng trên gà 3

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Escherichia coli 3

2.3 Tình trạng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli trên gà 8

2.4 Vài nét lịch sử phát hiện enzyme beta-lactamase phổ rộng (Extended-spectrum beta-lactamase, ESBL) 10

2.5 Đặc điểm phân loại enzyme beta-lactamase phổ rộng (Extended-spectrum beta-lactamase, ESBL) 11

2.6 Tính đề kháng của vi khuẩn E coli đối với kháng sinh nhóm -lactam phổ rộng… 12

2.7 Bệnh Escherichia coli trên gà 13

2.8 Kháng sinh 18

2.8.1 Phân loại 18

2.8.2 Cơ chế tác động của kháng sinh 21

2.8.3 Nhóm β-lactams và các chất ức chế β-lactamase 21

2.8.4 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn 23

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 Phương tiện nghiên cứu 25

3.1.1 Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu 25

3.1.2 Hóa chất và môi trường 25

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ, máy móc 25

3.2 Phương pháp nghiên cứu 25

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu 25

3.2.2 Phương pháp định lượng vi khuẩn E coli trong phân gà khỏe và gà bệnh… 26

3.2.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn E coli kháng kháng sinh và vi khuẩn E coli sinh enzyme β-lactamase phổ rộng (ESBL) trên gà 29

3.2.4 Phương pháp xác định sự đề kháng của vi khuẩn E coli đối với kháng sinh nhóm β-lactam phổ rộng (ESBL) trên gà 31

3.2.5 Phương pháp xử lí số liệu 33

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

4.1 Tổng quan về địa điểm lấy mẫu thực hiện đề tài tại hai trại gà thả vườn thuộc huyện Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến Tre 34

4.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ gà bệnh tiêu chảy chết do nghi nhiễm vi khuẩn E coli tại hai trại thuộc huyện Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến Tre 37

4.3 Kết quả phân lập vi khuẩn E coli trên mẫu phân nguyên của gà khỏe và gà bệnh tại hai trại thuộc huyện Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến Tre 39

4.4 Kết quả phân lập vi khuẩn E coli sinh enzyme β-lactamase phổ rộng (ESBL) trên gà tại hai trại thuộc huyện Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến Tre 40

4.5 Kết quả kiểm tra sự đề kháng và đa kháng của vi khuẩn E coli sinh enzyme -lactam phổ rộng (ESBL) trên gà tại hai trại thuộc huyện Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến Tre 46

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50

5.1 Kết luận 50

5.2 Đề nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ CHƯƠNG 55

DANH MỤC BẢNG – SƠ ĐỒ

(1980) và Bush – Jacoby – Medeiros (1985)

12

2014)

33

4.3 Tỷ lệ gà bệnh tiêu chảy chết do nghi nhiễm vi khuẩn E coli tại

hai trại

37

4.4 Tỷ lệ gà bệnh tiêu chảy chết do nghi nhiễm vi khuẩn E coli

theo tuần tuổi tại hai trại

38

phân nguyên của gà khỏe và gà bệnh tại 2 trại

39

bệnh tại hai trại

41

tuổi tại hai trại

42

gà bệnh tiêu chảy tại hai trại

43

Sơ đồ Tên sơ đồ Trang

3.2 Qui trình phân lập vi khuẩn E coli kháng kháng sinh và vi

khuẩn E coli sinh enzyme β-lactamase phổ rộng

30

DANH MỤC HÌNH

TÓM LƢỢC

Ngành chăn nuôi gà thả vườn hiện đang phổ biến tại huyện Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến Tre và những thiệt hại do trực khuẩn gây Escherichia coli gây tiêu chảy trên gà là không thể tránh khỏi, E coli có khả năng sản sinh các enzyme β-lactamase phổ rộng (extended-spectrum beta-lactamase, ESBL), chính là tác nhân giúp vi khuẩn

E coli kháng lại các tác động của kháng sinh nhóm β-lactam làm cho việc điều trị bệnh do trực khuẩn E coli ngày càng trở nên khó khăn, gây thiệt hại nghiêm trọng cho nhà chăn nuôi Qua khảo sát hai trại gà thả vườn huyện Mỏ Cày Bắc ghi nhận được 149/ 2.000 con gà bệnh tiêu chảy chết do nghi nhiễm vi khuẩn E coli chiếm

tỷ lệ 7,45%, tập trung ở tuần tuổi từ 1- 4, trong đó gà 1 tuần tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất (4,25%) Với phương pháp định đượng vi khuẩn E coli theo TCVN 7924:

2008 thì mật độ vi khuẩn E coli trong phân gà khỏe là 10 7

(CFU/ml) và có khả năng gây bệnh khi mật độ tăng (10 8 CFU/ml) Bằng phương pháp đĩa đôi kết hợp

để xác định sự đề kháng của vi khuẩn E coli đối với kháng sinh nhóm -lactam trên 72 con gà (36 con khỏe và 36 con bệnh) tại hai trại với kết quả: Tỷ lệ nhiễm

E coli sinh ESBL là 52,80%; trong đó gà giai đoạn 4 tuần tuổi có tỷ lệ nhiễm E coli sinh ESBL cao nhất (83,30%), tuần 2 (33,30%), tuần 1 (41,70%); tỷ lệ hiện diện E coli sinh ESBL trên gà bệnh (69,9%) cao hơn gà khỏe (36,10%); trên bệnh phẩm thì mẫu phân chiếm tỷ lệ cao nhất (55,60%) kế đến là thịt (22,20%) và phổi (7,40%) Vi khuẩn E coli sinh ESBL đã đề kháng cao với nhóm -lactam (66,70%)

và nhóm cephalosporin (60%) Vi khuẩn E coli sinh ESBl đa kháng với 5 loại kháng sinh với cùng kiểu hình đa kháng là ampicillin, cefaclor, cefuroxime, cefotaxime và trimethoprim/ sulfamethoxazol và kháng lại 8 loại kháng sinh với 4 kiểu hình đa kháng chiếm tỷ lệ cao nhất (39%) Sự đa kháng của vi khuẩn E coli sinh ESBL ta thấy được thực trạng rằng vi khuẩn E coli đa kháng với nhiều loại kháng sinh và với nhiều kiểu hình đa kháng ngày càng đa dạng và phức tạp Với kháng sinh amikacin, ceftazidime/ clavulanic acid và ceftazidime vẫn còn hiệu quả trong điều trị tại hai trại gà thả vườn huyện Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến Tre

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, ngành chăn nuôi gà thả vườn hiện đang phổ biến tại huyện Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến Tre và những thiệt hại do bệnh truyền nhiễm trong đó có bệnh trực khuẩn

Escherichia coli là không thể tránh khỏi Bệnh xảy ra ở gà mọi lứa tuổi, làm giảm

tỷ lệ ấp nở, giảm tỷ lệ đẻ, giảm tăng trọng, làm tăng tỷ lệ chết, tăng chi phí sản xuất (Barnes and Gross, 1997) Việc sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh này là

một trong những biện pháp quan trọng nhất để làm giảm tỷ lệ chết Tuy nhiên, E

coli phân lập từ gia cầm có khả năng kháng với một hoặc nhiều loại kháng sinh,

đặc biệt là đối với những loại kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi

(Blanco et al, 1997) Trong đó, kháng sinh nhóm β-lactam, đặc biệt là các

cephalosporin thế hệ III bắt đầu được sử dụng rộng rãi do kháng sinh trong nhóm này có phổ kháng khuẩn rất rộng, chúng lại có đặc tính dược học tốt, dễ hấp thu và

phân bố đều khắp các mô trong cơ thể (Bùi Thị Tho, 2003) E coli là vi khuẩn có

khả năng tăng sức kháng nhanh nhất (Bùi Thị Tho, 2003) Theo nghiên cứu của

Carissa et al, (2013) phân lập từ 159 mẫu phân gà tây (n = 48), gà thịt (n = 96) và

gà thả vườn (n = 15) tại Owerri, Nigeria thì tỷ lệ nhiễm E coli sinh enzyme

beta-lactamase phổ rộng (ESBL) là 22,2% từ phân gà thịt và gà tây, trên phân gà thả

vườn không tìm thấy sự hiện diện vi khuẩn E coli sinh ESBL Theo Trương Hà

Thái và ctv (2009), kết quả kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh của một số

chủng E coli phân lập từ gà bệnh (n = 50 chủng) thì E coli kháng lại với tỷ lệ cao: Nalidixic acid – 100%, ampicillin – 52% Theo như các nghiên cứu trên thì E

coli có khả năng kháng kháng sinh cũng như việc E coli có khả năng sản sinh các

enzyme β-lactamase phổ rộng (extended-spectrum beta-lactamase, ESBL), chính là

tác nhân giúp vi khuẩn E coli kháng lại các tác động của kháng sinh nhóm lactam làm cho việc điều trị bệnh trực khuẩn E.coli ngày càng trở nên khó khăn,

β-gây thiệt hại nghiêm trọng cho nhà chăn nuôi

Bên cạnh đó, thịt gà thả vườn là một sản phẩm thực phẩm ngon mà nhu cầu của người tiêu dùng ngày càng cao nhưng ngày nay đề kháng kháng sinh đã và đang trở thành nguy cơ đối với sức khỏe mọi người, vi khuẩn và gene kháng thuốc của

vi khuẩn nhanh chóng lan truyền khắp mọi nơi, cả bệnh viện và cộng đồng Theo

Smith et al, (1974, 1976, 1977, 1978, 1980) đã nghiên cứu trong nhiều năm và đi đến kết luận: “Các chủng E coli là nguồn cung cấp chủ yếu về tính kháng kháng

sinh lan truyền trong các chủng vi khuẩn có ở đường tiêu hóa ở người và gia súc” (trích dẫn bởi Bùi Thị Tho, 2003) Theo Nguyễn Lân Dũng và ctv (2007) thì các

phân tử DNA tái tổ hợp hoạt động in vivo có thể gây nên những sự rủi ro sinh học, nếu chúng tồn tại trong vi sinh vật như E coli sống trong đường ruột người và có

thể trao đổi thông tin di truyền với các vi khuẩn khác, chúng có thể phổ biến rộng rãi trong quần thể người, vi khuẩn, thực vật, hoặc động vật với những hậu quả

không thể lường trước được, đặc biệt là việc kiến trúc các plasmid mới của vi

khuẩn, nếu không được điều khiển một cách thận trọng sẽ có thể đưa gene kháng

kháng sinh hoặc gene tạo thành độc tố vào các chủng vi khuẩn mà trước đó chúng

không có Vì thế ngoài việc phòng và trị bệnh do E coli gây ra trên gà trở nên khó

khăn thì việc ảnh hưởng đến sức khỏe con người cũng vô cùng quan trọng Tuy

nhiên, chưa có nghiên cứu nào vể sự đề kháng của vi khuẩn E coli đối với kháng

sinh nhóm β-lactam trên gà thả vườn tại huyện Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến Tre

Xuất phát từ tình hình thực tế trên và được sự phân công của Bộ môn Thú Y, Khoa

Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ, tôi tiến hành thực

hiện đề tài “Khảo sát sự đề kháng của vi khuẩn Escherichia coli đối với kháng

sinh nhóm beta-lactam phổ rộng trên gà thả vườn tại hai trại thuộc huyện Mỏ

Cày Bắc tỉnh Bến Tre”

Mục tiêu của đề tài

- Khảo sát tỷ lệ gà bệnh tiêu chảy chết do nghi nhiễm E coli tại hai trại gà

thả vườn, thuộc huyện Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến Tre

- Xác định tỷ lệ nhiễm E coli sinh enzyme β-lactamase phổ rộng trên gà

bệnh và gà khỏe tại hai trại gà thả vườn thuộc huyện Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến

Tre

- Xác định sự đề kháng và đa kháng của vi khuẩn E coli sinh enzyme

β-lactamase phổ rộng trên gà bệnh và gà khỏe tại hai trại gà thả vườn thuộc

huyện Mỏ Cày Bắc tỉnh Bến Tre

CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN

2.3 Tình hình nghiên cứu ngoài nước về sự đề kháng của vi khuẩn E coli đối

với kháng sinh nhóm β-lactam phổ rộng trên gà

Brinas et al, (2003) các gene mã hóa CMY-2, CTX-M-14 và SHV-12 β-lactamase

đã được phát hiện trong 3 của 5 chủng E coli ESBL từ phân gà khỏe cho thấy sức

đề kháng hay giảm tính nhạy cảm với nhóm cephalosporins phổ rộng Một sự đột biến A-42 tại vùng promoter (vùng gene khởi động) của gene AmpC đã được phát

hiện trong 2 chủng khác Có 3 trong 5 chủng E coli ESBL (60%) đề kháng lại

nalidixic acid, ciprofloxacin, tetracycline và trimethoprim/ sulfamethoxazole Tất

cả 5 chủng đều rất nhạy cảm (100%) với amikacin và fosfomycin

Smet et al, (2008) điều tra sự đa dạng β-lactamase và phân lớp C của vi khuẩn

E coli trên gà thịt tại Bỉ, tổng cộng có 295 mẫu E coli ESBL từ 489 mẫu gà thịt

lấy từ 5 trại khác nhau tại Bỉ, trong đó phát hiện các gene như sau: TEM-52 (13,2%), TEM-106 (2%), CTX-M-1 (27,4%), CTX-M-2 (7,8%), CTX-M-14 (5,9%) và CTX-M-15 (2%) Phân lớp C phát hiện được là CMY-2 (49%)

Bortolaia et al, (2010) cho thấy rằng vi khuẩn E coli sinh ESBL phân lập được từ

5 trại gà thịt tại Ý, thì đề kháng cao với tetracycline (94%), nalidixic acid (83%),

đề kháng trung bình với trimethoprim kết hợp sulfonamide (55%), sulfonamide (39%), trimethoprim (22%) và không thấy mẫu nào kháng với amikacin, colistin

và imipenem

Randall et al, (2010) khảo sát tỷ lệ nhiễm ESBL có mang gene CTX-M trên gà

thịt và gà tây tại Vương quốc Anh từ năm 2006 đến 2009 với 388 mẫu phân gà thịt

từ 22 lò giết mổ gia cầm và 442 đàn gà tây khảo sát trong 1 năm với kết quả có 54,5% tại lò giết mổ, 3,6% từ phân gà thịt, 5,2% từ các trại gà tây nuôi lấy thịt và 6,9% từ các trại gà tây giống

Carissa et al, (2013) phân lập từ 159 mẫu phân gà tây (n = 48), gà thịt (n = 96) và

gà thả vườn (n = 15) tại Owerri, Nigeria thì tỷ lệ nhiễm ESBL là 22,2% từ phân gà thịt và gà tây, trên phân gà thả vườn không tìm thấy sự hiện diện vi khuẩn ESBL

2.5 Tổng quan về vi khuẩn Escherichia coli

Giới thiệu về E coli

Trực khuẩn ruột già Escherichia coli còn có tên là Bacterium coli commune,

Bacillus, Colicommunis được Escherich phân lập năm 1885 từ phân trẻ em Escherichia thường xuất hiện rất sớm ở đường ruột người và động vật sơ sinh (sau

khi đẻ hai giờ) chúng thường ở phần sau của ruột, ít khi ở dạ dày hay ruột non Trong nhiều trường hợp còn tìm thấy ở niêm mạc nhiều bộ phận khác trong cơ thể

Từ ruột, Escherichia coli theo phân ra đất, nước Tìm chỉ số E coli trong một

nguồn nước cho phép ta kết luận nước đó có nhiễm phân hay không và là một

trong những cơ sở để nói rằng nước đó tốt hay xấu Escherchia coli là nguyên

nhân gây ra một số bệnh ở người và động vật (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997)

Đặc điểm hình thái

Hình 2.1 Trực khuẩn E coli dưới kính hiển vi quang học x100

(http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/labs/microbiology/gram_stain/Gram_stain_images/index_gram_stain_images.html)

E coli là một trực khuẩn hình gậy ngắn, kích thước 2 – 3 x 0,6μ (hình 1) Trong cơ

thể có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ đôi khi xếp thành chuỗi ngắn Có khi trong môi trường nuôi cấy thấy có những trực khuẩn dài 4 - 8μ, những loại này

thường gặp trong canh khuẩn già Phần lớn E coli di động do có long ở xung

quanh than, nhưng một số không thấy di động Vi khuẩn không sinh nha bào, có thể có giáp mô (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997)

Môi trường nước thịt vi khuẩn phát triển tốt, môi trường rất đục có cặn màu tro nhạt lắng xuống đáy, đôi khi có màu xám nhạt trên mặt môi trường, môi trường có màu phân thối (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997)

Trên môi trường MC (Mac conkey agar) vi khuẩn E coli to, tròn, đều màu hồng nhạt mặt khuẩn lạc hơi lồi, kích thước 2 – 3 mm (Nguyễn Vĩnh Phước, 1970)

Trên môi trường EMB (Eosin Methylene Blue) khuẩn lạc tròn, hơi lồi, bong, màu thẫm tím, có ánh kim (Nguyễn Vĩnh Phước, 1970)

Vi khuẩn E coli được định danh bằng các phản ứng sinh hóa qua các môi trường

KIA (Kliler Iron Agar), Simmons Citrate, VP (Voges – Proskauer), MR (Methyl Red), LIM (Lysine Indole Motility Medium)

Sử dụng lysine, sinh indole, không sinh H2S

Phản ứng MR (Methyl Red) dương tính, VP (Voges – Proskauer) âm tính, phản ứng Citrate âm tính, không sử dụng ure (Nguyễn Vĩnh Phước, 1970)

Cấu trúc kháng nguyên

Cấu trúc kháng nguyên của E coli rất phức tạp, có đủ ba loại kháng nguyên: O, H

và K Kháng nguyên K cũng có nhiều loại L, A, B nên có nhiều type huyết thanh khác nhau

Kháng nguyên O

Kháng nguyên O còn được gọi là kháng nguyên thân, kháng nguyên bề mặt, đây là kháng nguyên của vách tế bào, cấu tạo bởi polysaccharide Nó được tìm thấy trên các khuan lạc dạng S và chịu được nhiêt độ 100°C trong 2 giờ, không bị cồn phá hủy

Mỗi type vi khuẩn có 1 kháng nguyên O riêng, chúng có những yếu tố khác nhau ghi bằng số I, II, III, IV, (Nguyễn Như Thanh, 1997)

Kháng nguyên H

Kháng nguyên H còn gọi là kháng nguyên lông, có tính chịu nhiệt cao, được cấu tạo bởi protein Tuy nhiên khi đun sôi 100°C trong 2 giờ 30 phút thì tính kháng nguyên, khả năng ngưng kết, kết hợp của kháng nguyên đều bị hủy Các nhóm

kháng nguyên O khác nhau của vi khuần E coli đều có một loại type kháng

nguyên H và được biểu thị bằng số 1, 2, 3, 4

Kháng nguyên K

Kháng nguyên K còn gọi là kháng nguyên vỏ, kháng nguyên màng tế bào được cấu tạo bởi polysaccharide hoặc protein Loại này chỉ có ở một số vi khuấn đường ruột Những chủng có kháng nguyên L và B thường không chịu nhiệt và không tìm

thấy giáp mô

Hiện nay có 80 loại kháng nguyên K đã được biết đến và được chia làm 3 loại ký hiệu là L, A và B Kháng nguyên L ngăn không cho hiện tượng ngưng kết O của vi khuần sống xảy ra, kém chịu nhiệt, kháng nguyên L bị phá hủy ở nhiệt đô 100°C trong 1 giờ, kháng nguyên mất khả năng ngưng kết, kết tủa và không giữ được tính kháng nguyên (Nguyễn Như Thanh, 1997)

Kháng nguyên A là kháng nguyên vỏ chịu nhiệt, không bị phá hủy khi đun sôi ở 100°C trong 2 giờ 30 phút nên vẫn giữ được khả năng ngưng kết, kết tủa và tính kháng nguyên vẫn còn

Kháng nguyên B thì ít thấy, ở 100°C trong vòng 1 giờ chỉ mất tính kháng nguyên

và vẫn giữ được khả năng ngưng kết và kết tủa Kháng nguyên này rất đặc hiệu cho các type trong nhóm trực khuần đường ruột

Mặc dù trong tự nhiên trực khuần đường ruột có nhiều serotype, nhưng chỉ một phần nhỏ trong số đó được xác định là mầm gây ra các bệnh đường dạ dày ruột

Dựa vào cấu tạo kháng nguyên O, E.coli được chia làm nhiều nhóm, căn cứ vào cấu tạo kháng nguyên O, K, H, E.coli lại chia làm nhiều type, mỗi type đều được

ghi thứ tự các yếu tố kháng nguyên O, K, H Trong số 28 type huyết thanh phổ biến có 8 chủng gây bệnh là: O111B4, O86B7, O55B5, O26B6, O127B8 (Mỹ), O128B12 (Anh), 408 và 145 (Nguyễn Như Thanh, 1997)

Kháng nguyên F (kháng nguyên bám dính)

Hầu hết các E coli gây bệnh đều sản sinh một hoặc nhiều yếu tố bám dính, chúng

bám vào các cơ quan cảm thụ đặc hiệu trên tế bào biểu mô của màng nhày và những lớp tế bào kế cận Những yếu tố bám dính này là phần phụ có dạng lông kéo dài từ vách tế bào vi khuẩn và được cấu tạo từ các tiểu đơn vị protein, trong nhiều trường hợp, chúng hoạt động như một giá đỡ cho protein bám vào đầu các sợi vi nhung Yếu tố bám dính được phân lập bằng phản ứng huyết thanh học hay bằng các cơ quan cảm nhận đặc hiệu, cơ quan cảm nhận đặc hiệu này làm ngưng kết hồng cầu của nhiều loài gia súc khác nhau Cách đặt tên cho các yếu tố bám dính rất khác nhau Mỗi loại kháng nguyên bám dính có các yếu tố quyết định kháng nguyên tương ứng, phù hợp với cấu trúc điểm tiếp nhận trên bề mặt của tế bào biểu

mô nhung mao ruột non của từng loại động vật hoặc từng lứa tuổi động vật

Sức đề kháng

Cũng như các loại vi khuẩn không sinh nha bào khác, E coli không chịu được

nhiệt độ đun 550C trong 1 giờ, 600C trong 30 phút, đun sôi 1000C chết ngay Các chất sát trùng thong thường axit phenic, biclorua thủy ngân, focmon, hydroperoxit

10/00 diệt vi khuẩn sau 5 phút Tuy nhiên, ở môi trường bên ngoài, các chủng

E coli độc tố có thể tồn tại đến 4 tháng (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997)

Tính gây bệnh

Phần lớn các vi khuẩn E coli không có ảnh hưởng gì đáng kể đến sức khỏe Nhưng có một số E coli có thể gây bệnh, và các vi khuẩn này có thể tựu trung vào

6 nhóm sau đây: DAEC (Diffusely adhering E coli), EHEC (Enterohemorrhagic

E coli), EPEC (Enteropathogenic E coli), ETEC (Enterotoxigenic E coli), EIEC

(Enteroinvasive E coli), và EAEC (Enteroaggregative E coli) (Nataro and Kaper,

1998)

Tùy vào địa phương và độ tuổi, các vi khuẩn trên đây có những ảnh hưởng khác nhau đến bệnh tiêu chảy Chẳng hạn như ETEC là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tiêu chảy ở trẻ em các nước đang phát triển (như nước ta) nhưng không phải là yếu tố chính gây tiêu chảy ở trẻ em các nước phương Tây

ETEC (Enterotoxigenic E coli) là nhóm vi khuẩn thường xuyên khu trú trong ruột

người và động vật và gây bệnh ở thú sơ sinh (Gyles, 1986) ETEC có khả năng sinh độc tố ruột (enterotoxin), độc tố gồm 2 loại: Độc tố chịu nhiệt (heat-stable enterotoxin = ST) và độc tố kém chịu nhiệt (heat-labile enterotoxin = LT) (Smith

và Gyles, 1970)

EIEC (Enteroinvasive E coli) là nhóm không có khả năng tạo độc tố (enterotoxin)

như ETEC nhưng chúng có khả năng phát triển mạnh và gây bênh rất nguy hiểm

giống như Shigella Chúng thường gây đau bụng, sốt, ói mữa và tiêu chảy không

máu (Taylor, 1988)

EPEC (Enteropathogenic E coli) không có khả năng tạo ra độc tố hay khả năng

xâm nhập như ETEC hay EIEC Nhóm này gây tiêu chảy cho người, đặc biệt là gây tiêu chảy cho trẻ em (Levine, 1987)

EHEC (Enterohemorrhagic E coli) là nhóm có khả năng tạo độc tố Verotoxin

giống với độc tố Shiga - Chất độc do nhà khoa học K Shiga tìm ra, nên có tên gọi chung là chất độc giống Shiga (Shiga - like toxin) Độc tố này ở dạng biến thể 2e (Stx2e), gây ra các bệnh tích cho mao mạch ruột, mô dưới da và não, dẫn tới triệu chứng phù đầu và thần kinh (Bertschinger, 1999)

EAEC (Enteroaggregative E coli) có khả năng sản sinh ra yếu tố bám dính và xâm

nhập vào tế bào niêm mạc ruột ( Nguyễn Thanh Bảo, 2005)

DAEC (Diffusely adhering E coli) người ta biết rất ít về dịch tể học và lâm sàng

của bệnh do DAEC Trong một nghiên cứu trên những đứa trẻ ở bệnh viện giữa độ tuổi từ 1 tháng đến 14 tuổi đa số những bệnh nhân nhiễm DAEC đều bị ói mữa

E coli có sẵn trong ruột của động vật nhưng chỉ tác động gây bệnh khi sức đề

kháng của con vật giảm sút (do chăm sóc, nuôi dưỡng, thời tiết, thức ăn, )

Bệnh do trực khuẩn E coli có thể xảy ra như một bệnh truyền nhiễm kế phát trên

cơ sở thiếu vitamin và mắc các bệnh virus và ký sinh trùng

E coli thường gây bệnh cho súc vật mới đẻ từ 2-3 ngày hoặc 4-8 ngày Người ta

gọi Colibacillosis là một bệnh đường ruột của ngựa, bê, cừu, lợn và gia cầm non

do E coli gây ra

Cần biết rằng type E coli gây bệnh sau khi duy trì một thời gian trong một cơ sở chăn nuôi sẽ được thay thế bằng một type E coli gây bệnh khác sau này Colibacillosis của bê mới đẻ từ 2-12 ngày thường do một số type E coli sau:

O78B; O55B5; O15; O86B7; O8; O9A; O35B4; O137

Bệnh thể hiện bằng các triệu chứng sốt cao (410C hoặc hơn) đi tháo dạ, phân lúc đầu vàng đặc sệt, mùi chua, sau chuyển màu trắng xám, hôi thối, dính máu, bê đi tiêu nhiều lần và rặn nhiều

Ở gia cầm (gà, vịt, bồ câu) thường đi tháo dạ, phân xanh lá cây rất hôi thối, có khi

có hiện tượng viêm kết mạc mắt, viêm cuống phổi, viêm phổi, viêm niêm mạc mũi làm gia cầm thở khó

Ở lợn con cũng có triệu chứng giống bê, bệnh có thể lây cho cả ổ thậm chí từ ổ này sang ổ khác Ở động vật lớn, vi khuẩn có thể gây một số bệnh như viêm phúc mạc, viêm gan, thận, bàng quang, túi mật, buồng vú, khớp xương

Ở người, đặc biệt là trẻ em dưới một tuổi vi khuẩn có thể gây viêm dạ dày ruột và gây nhiễm độc, viêm túi mật, bàng quang, đường niệu sinh dục và viêm não, đôi khi gây nhiễm khuẩn huyết trầm trọng

Trong phòng thí nghiệm: Tiêm vi khuẩn vào dưới da cho chuột bạch, chuột lang, thỏ có thể gây viêm cục bộ, nếu tiêm với liều lớn có thể gây bại huyết, giết chết con vật (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997)

2.4 Tình trạng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli trên gà

Vi khuẩn E coli có khả năng tăng sức kháng đối với kháng sinh nhanh nhất (Bùi

Thị Tho, 2003) Đây là vấn đề cấp bách cần được nghiên cứu để tìm ra loại kháng

sinh mẫn cảm dùng trong điều trị các bệnh xảy ra do E coli

Hiện tượng đa kháng của E coli tăng rất nhanh Năm 1976, đã phát hiện 17,5% chủng E coli kháng với 2 loại thuốc và 6,3% đa kháng với 3 loại thuốc, không có

chủng nào đa kháng một lúc với 4; 5; 6 hay 7 loại thuốc Hiện nay kiểm tra, thấy tỷ

lệ E coli đa kháng với 3; 4 loại thuốc là phổ biến nhất Đặc biệt đã xuất hiện

chủng E coli đa kháng một lúc với 5, 6 hay 7 loại thuốc với tỷ lệ tương ứng:

E coli có khả năng kháng chéo và các thuốc kháng chéo là những thuốc mà E coli

này chưa hề được tiếp xúc tong quá trình sống Những cá thể có khả năng phát

sinh đột biến của E coli chỉ khoảng 10-7

(cứ 10.000.000 cá thể sẽ có một cá thể có khả năng phát sinh đột biến tự nhiên) Vi khuẩn phân chia tế bào mỗi lần 40 phút, như vậy cứ 22 giờ mỗi tế bào đột biến sẽ có 109

đời con (Bùi Thị Tho, 2003)

Van den Bogaard et al, (2001) khảo sát tỷ lệ kháng kháng sinh của E coli từ phân

gà tây, gà thịt và gà thả vườn trong đó gà tây kháng cao với amoxycillin (87%), oxytetracycline (87%), trimethoprim (85%), neomycin (81%), kháng trung bình với flumequine (66%); gà thịt kháng cao với amoxycillin (82%), trimethoprim (80%), kháng trung bình với oxytetracycline (78%), neomycin (72%), flumequine (64%); riêng gà thả vườn thì kháng trung bình với oxytetracycline (61%), amoxicillin (57%) Ngoài ra tỷ lệ đa kháng kháng sinh của gà tây (n = 43) có 14 mẫu kháng 5 loại kháng sinh (32%), gà thịt (n = 45) có 10 mẫu kháng 5 loại kháng sinh (23%) và gà thả vườn (n = 42) thì có 9 mẫu kháng 5 loại kháng sinh (22%) Theo Trương Hà Thái và ctv (2009), kết quả kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh

của một số chủng E coli phân lập từ gà bệnh (n = 50 chủng) thì 84,0% các chủng

E coli mẫn cảm với enrofloxacin; 82,0% với colistin; 70,0% với norfloxacin Một

số kháng sinh bị chủng E coli kháng lại với tỷ lệ cao: Nalidixic acid – 100%;

streptomycin – 84%, trimethoprim/sulphamethoxazole – 68%; neomycin và ampicillin – 52%; kanamycin – 48%; ciprofloxacin – 42%; gentamycin – 28%

Theo Tô Liên Thu (2004), kiểm tra khả năng kháng thuốc của vi khuẩn E coli và

Salmonella phân lập từ thịt gà nuôi công nghiệp và thịt lợn ở một số tỉnh thuộc

đồng bằng Bắc bộ bằng phương pháp kháng sinh đồ, kết quả cho thấy: Các chủng

E coli và Salmonella phân lập từ thịt gà kháng lại các loại kháng sinh thông

thường như streptomycin, ampicillin, tetracycline, cloramphenicol với tỷ lệ cao Các chủng phân lập từ thịt lợn có tỷ lệ đề kháng với các loại kháng sinh thấp hơn

so với vi khuẩn phân lập được từ thịt gà Nhiều chủng E coli và Salmonella có đặc

tính đa kháng, có những chủng kháng lại 8 loại kháng sinh Một số loại kháng sinh

như gentamycin, neomycin, norfloxacin còn nhạy cảm cao với E coli và

Salmonella phân lập được

Theo Lưu Hữu Mãnh và Đỗ Võ Anh Khoa (2012), nghiên cứu trên gà Ross 308

cho rằng vi khuẩn E coli mẫn cảm cao nhất đối với ceftriaxone (97,73%) kế đến là

cefotaxime (95,45%), colistin (93,18%), amoxicillin (81,82%) và cephalexin (72,73%) bên cạnh đó vi khuẩn này cũng đề kháng cao với kháng sinh bactrim (90%)

Nguyễn Thị Liên Hương và ctv (2009), kết quả xác định khả năng mẫn cảm kháng

sinh của các chủng E coli phân lập được cho thấy: Chỉ duy nhất ceftriaxone còn

có khả năng mẫn cảm mạnh (100%) với các chủng được kiểm tra Các kháng sinh

có tỷ lệ kháng cao (>80%) là tretracycline, sulfamethoxazole/trimethoprim, apramycin, ceftiofur và streptomycin

2.1 Vài nét về lịch sử phát hiện enzyme beta-lactamase phổ rộng spectrum beta-lactamase, ESBL)

(Extended-Vào năm 1963 tại Athens Hy Lạp từ máu một bệnh nhân tên là Temoneira người ta

phân lập được chủng E coli kháng ampicillin có sinh loại β-lactamase và lấy luôn

tên bệnh nhân đặt tên cho này là TEM-1

Năm 1965 cũng ở nơi đây từ E coli người ta phát hiện ra TEM-2 là do TEM-1

biến đổi một amino aicd Nhờ TEM-1 và TEM-2 đã làm cho vi khuẩn Gram âm kháng lại penicillin, ampicillin và cephalosporin thế hệ 1 trong một thời gian dài

sau đó, như các thong báo về N gonorrhoeae kháng penicillins, H influenzae và

Shigella spp đề kháng kháng sinh vào những năm 1971 – 1973 ở Châu Á và nhiều

nơi trên thế giới

Cho đến năm 1974 chủng K pneumoniae có gene mã hóa β-lactamase trên

plasmid được phát hiện, này có nhiều thay đổi về amino aicd so với TEM-1 và TEM-2 nên được đặt tên là SHV-1 (Sulphyryl Variable), như vậy vi khuẩn đã có TEM-1, TEM-2 và SHV-1 nên các penicillins và cephalosporin thế hệ 1 đã bị kháng lại rất nhiều

Đầu những năm 1980 thì các kháng sinh β-lactam phổ rộng như cephalosporins thế

hệ thứ 2, thế hệ thứ 3 và các monobactams được đưa vào điều trị các vi khuẩn kháng thuốc Sư ra đời các kháng sinh β-lactams mới này đặc biệt là cephalosporins thế hệ 3, đã là thành công lớn của khoa học trong cuộc chiến đấu dài lâu với vi khuẩn gây bệnh có TEM-1, TEM-2 và SHV-1 Nhưng rồi một loại β-lactamase có khả năng phân hủy các cephalosporins thế hệ 2, cephalosporins thế

hệ 3 và monobactams, có nguồn gốc do TEM-1, TEM-2 và SHV-1 đột biến thay đổi một số amino aicd gọi là ESBL đã xuất hiện

Năm 1983 ở Đức đã phát hiện chủng K ozaenae sinh β-lactamase phân hủy

cefotaxime được đặt tên là SHV-2, đây là trường hợp đầu tiên sinh ESBL được ghi

nhận Năm 1984 đến năm 1987 tại Pháp đã phát hiện chủng K pneumoniae có gene mã hóa ESBL trên plasmid kháng cefotaixme đặt tên là CTX-1 Cũng vào những năm 1986 ở Nhật Bản Masumato và năm 1989 ở Đức Bauernfein phát hiện

E coli sinh ESBL kháng cefotaxime không phải TEM và SHV nên đặc tên là

CTX-M-1 Đáng ngại là CTX-M có khả năng phân hủy hầu hết cephalosporins thế

hệ 3 (Paterson and Bonomo, 2005)

2.2 Đặc điểm phân loại enzyme beta-lactamase phổ rộng (Extended-spectrum beta-lactamase, ESBL)

Hiện nay các nghiên cứu trên thế giới đã biết đến trên 200 loại ESBL Có hai hệ thống phân loại chính được thống nhất sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới Hệ thống phân loại của Amlber R P và hệ thống phân loại của các nhóm tác giả Bush Karen, Jacoby G A và Medeior A A gọi tắt là hệ thống phân loại Bush-Jacoby-Medeior

Hệ thống phân loại theo Amlber

Amlber chia các β-lactamase thành 4 lớp: A, B, C và D, dựa trên các có sự giống nhau về các amino acid Trong đó các lớp A, C, D chỉ có serin trong cấu trúc ở vị trí khởi động nên gọi là các serin-β-lactamase , còn có lớp B do có Metallo ở vị trí khởi động trong cấu trúc và các ion Zn nên gọi là các Metallo-β-lactamase, một số β-lactamase lớp A và D được gọi là ESBL

Hệ thống phân loại theo Bush – Jacoby – Medeior

Cơ sỏ của hệ thống phân loại này là dựa vào các yếu tố sau:

- Khả năng hoạt động của hay gọi là phổ tác dụng của đối với các kháng sinh

- Tầm ảnh hưởng của đối với các chất ức chế β-lactamase lactamase (thường dùng

là clavulanic aicd) ở các mức khác nhau như bị ức chế, giảm ức chế hay kháng chất ức chế

-Vị trí mã hóa gene ESBL nằm trên NST hay trên plasmid

-Loài vi khuẩn sinh ESBL thuộc nhóm thường gặp hay hiếm gặp

Hệ thống phân loại này chia β-lactamase ra 4 nhóm chính: 1, 2, 3, 4 Trong đó nhóm chính 2 được chia thành 8 nhóm phụ: 2a, 2b, 2be, 2br, 2c, 2d, 2e và 2f (Dẫn liệu của Nguyễn Sâm, 2009)

Bảng 2.1 Tóm tắt hệ thống phân loại β-lactamase và ESBL theo Amlber (1980) và Bush – Jacoby – Medeiros (1995)

cephalosporins phổ rộng, bị ức chế bởi clavulanic

các β-lactams, bị ức chế bởi EDTA

nhiễm sắc thể, thỉnh thoảng trên plasmid, không bị

ức chế bởi clavulanic acid

- Khi đã đề kháng kháng sinh do ESBL sẽ có sự thay thế kháng sinh điều trị mới dẫn tới đột biến cảm ứng tạo gene đề kháng kháng sinh các nhóm kháng sinh thay thế nhiều hơn các vi khuẩn thong thường

- Vi khuẩn sinh ESBL còn có khả năng đề kháng chéo với các nhóm kháng sinh khác

Như vậy, nhìn tự sự phát hiện cũng như đặc điểm phân loại và cơ chế đề kháng kháng sinh thì bản chất của vi khuẩn sinh ESBL có các đặc điểm sau:

- Gene mã hóa ESBL nằm trên plasmide do dột biến từ các gene sinh lactamase cổ điển như TEM-1, SHV-1

beta ESBL sinh ra do đột biến cảm ứng từ việc sử dụng các cephalosporin phổ rộng thế hệ 3

2.6 Bệnh Escherichia coli trên gà

Theo Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền (2012), bệnh truyền nhiễm nhiều loài gia cầm với triệu chứng cục bộ hoặc toàn thân do chủng có tính gây bệnh, đặc biệt

bệnh gây tổn thất nghiêm trọng ở thể nhiễm trùng huyết Vi khuẩn E coli hiện

diện thường xuyên trong đường ruột và được thải qua phân với số lượng lớn Bệnh

có thể lây qua đường tiêu hóa, qua vết thương ngoài da, qua niêm mạc bị tổn thương, ngoài ra bệnh còn có thể lây qua trứng Tất cả các lứa tuổi của gia cầm đều mẫn cảm với bệnh, nhưng ở gia cầm non đều có tính mẫn cảm cao và bệnh thường nghiêm trọng hơn

Bệnh thường xảy ra ở giai đoạn gà con và hay nhiễm kế phát ngay sau bệnh CRD (bệnh hô hấp mãn tính) Vì vậy có nhiều thể bệnh khác nhau Tỷ lệ bệnh và chết tùy thuộc vào từng vùng, từng trại có biện pháp phòng và vệ sinh khác nhau Truyền lây qua trứng do cơ thể mẹ bị nhiễm bệnh, qua vỏ trứng do bị nhiễm bẩn từ phân hoặc môi trường chuồng trại bị nhiễm trùng, qua đương hô hấp do ga bị bệnh CRD làm cho niêm mạc phế quản bị tổn thương, vi khuẩn xâm nhập qua vết thương vào cơ thể, qua thức ăn nước uống bị nhiễm trùng (Nguyễn Xuân Bình và ctv, 2005)

Triệu chứng và bệnh tích (Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012)

Viêm rốn hoặc nhiễm trùng túi lòng đỏ

Bệnh viêm rốn bởi E coli là do trứng bị nhiễm vi khuẩn từ phân Ngoài ra, bệnh

viêm rốn cũng có thể do gà con lây nhiễm từ vòi trứng hoặc buồng trứng nhiễm

E coli ở gà mẹ.Bình thường, có khoảng 0,5 – 6% trứng gia cầm khỏe có chứa

E coli, 26,5% gà mái nhiễm E coli đẻ trứng có vi khuẩn E coli và khoảng 70% gà

con mắc “bệnh mềm nhũn ở gà con” có chứa E coli trong noãn hoàng Tuy nhiên

đường lây nhiễm qua phân vẫn là cách lây truyền quan trọng nhất.Trứng bị nhiễm

có thể chết phôi, phôi chết thường xảy ra ở giai đoạn cuối trước khi nở, một số trường hợp gà con chết ngay lúc nở hoặc sau khi nở Tỷ lệ nhiễm bệnh tăng từ khi gia cầm mới nở ra đến 6 ngày tuổi Những gia cầm còn sống sót bị còi cọt đến 3 tuần tuổi Những chủng thuộc serotype O1a: K1: H7 gây tử vong cao ở gà con 1 ngày tuổi với triệu chứng viêm cuống rốn Trường hợp gia cầm sống trên 4 ngày tuổi bệnh tích thường thấy là viêm màng ngoài tim, túi lòng đỏ không tiêu, giảm tăng trọng Bệnh tích vi thể: Thành túi noãn hoàng bị phù, lớp tế bào bị viêm có nhiều bạc cầu trung tính và đại thực bào, lớp tế bào khổng lồ, vùng bạch cầu trung tính hoại tử và các cụm vi khuẩn

Viêm tế bào

Viêm tế bào hiếm có trong động vật hữu nhũ nhưng phổ biến ở loài gia cầm Viêm

tế bào do nhiều nguyên nhân nhưng E coli là nguyên nhân của hầu hết trường hợp

ở gà, viêm tế bào do E coli là do sự viêm tổ chức mô liên kết dưới da Bệnh

thường xảy ra ở gà thịt Viêm tế bào ở gà tây thì thường không liên quan đến

nhiễm khuẩn E coli

Hội chứng sưng đầu

Là thể viêm tế bào cấp tính hay bán cấp tính bao gốm viêm mắt và những vùng xung quanh hốc mắt hoặc những mô lien kết dưới da đầu Vi khuẩn gây bệnh tiết

ra dịch viêm, dịch viêm tích tụ lại ở lớp sâu dưới da, bệnh E coli thường hay kế

phát bởi các virus gây bệnh ở đường hô hấp như trên bệnh viêm phổi do virus, bệnh viêm phế quản truyền nhiễm Bệnh càng nặng khi nồng độ NH3 trong môi trường càng cao Viêm kết mạc mắt, viêm xoang vùng đầu, làm cho vũng đầu sưng lên Bệnh tích vi thể bao gồm viêm có sự thẩm xuất của bạch cầu trung tính và fibrin, kể cả những bạch cầu trung tính có hạt ở xoang xương sọ, tai giữa và da vùng mặt Viêm kết mạc mắt có sự thẩm xuất của tế bao lâm ba, viêm khí quản có thể quan sát được nhiều đám vi khuẩn

Bệnh viêm ống dẫn trứng cấp tính

Bệnh thường lây qua giao phối Đây là thể bệnh cấp tính và thường gây chết ở các đàn gà tây giống trong một thời gian ngắn sau khi thụ tinh Đặc trưng bởi hiện tượng viêm ống dẫn trứng, viêm ổ khớp, viêm phúc mạc, trứng rớt trong xoang bụng và được bao bọc xung quanh bởi chất bã đậu, những niêm mạc bi tổn thương

bị dày lên đáng kể, loét bị bao phủ bởi màng giả, màng casein hoại tử dẫn đến tắt phần dưới của ống dẫn trứng Tỷ lệ gà hao hụt có thể lên đến 81% do chết hoặc loại thải, năng xuất trứng giảm và có rất nhiều trứng không đạt tiêu chuẩn do kích thước nhỏ

Bệnh viêm vòi trứng, viêm phúc mạc

Bệnh làm giảm năng xuất trứng và gây chết lẻ tẻ ở gà mái Bệnh này là một trong những nguyên nhân gây chết ở gà đẻ thương phẩm và gà giống, hay ở một số loài gia cầm khác như vịt, ngỗng Viêm vòi trứng kéo dài làm tích tụ các dịch tiết casein đọng lại trong xoang bụng giống như lòng đỏ trứng cô đặc, trứng có thể bị tắt lại trong ống dẫn trứng Do đó, bệnh này được gọi tên là viêm phúc mạc trứng Ngoài ra, gà còn có hiện tượng viêm phúc mạc do lòng đỏ rơi trong xoang bụng Trong trường hợp bệnh kéo dài, ống dẫn trứng dài ra đáng kể, thành ống dẫn trứng dày lên, có rất nhiều chất casein bao xung quanh trứng tạo thành lớp mùi hôi Bệnh tích vi thể: Sự tích tụ nhiều đám bạch cầu trung tính ở biểu mô và chất dịch casein trong lòng ống dẫn trứng, đồng thời cớ thể quan sát được nhiều đám vi khuẩn

Bệnh viêm dịch hoàn và các tuyến phụ

Bệnh xảy ra ở gà trống do giao phối với gà mái bị nhiễm E coli thể viêm vòi

trứng Bệnh tích thường thấy là dịch hoàn sưng, cứng, viêm, có hình dạng bất

* Thể nhiễm trùng huyết do viêm đường hô hấp

Thường kế phát sau các bệnh đường hô hấp như bệnh hô hấp mạn tính (CRD), viêm phế quản (IBD), Newcastle Bệnh tích thường thấy ở khí quản, phổi, túi khí Viêm túi khí là bệnh tích phổ biến nhất, túi khí dày và đục, có nhiều chất dịch casein trên bề mặt của đường hô hấp Ngoài ra, ở một số gia cầm cũng có thể thấy

viêm phổi, viêm màng phổi Hầu hết gia cầm chết sau khoảng 5 ngày nhiễm bệnh, trong trường họp kéo dài gia cầm thường kém ăn, gầy còm, suy nhược rồi chết

* Thể nhiễm trùng huyết do viêm ruột

Thể này thường phổ biến ở gà tây Bệnh thường kế phát sau những bệnh lí viêm ruột xuất huyết do virus Những gia cầm mắc bệnh vẫn có thể trạng tốt, diều vẫn chứa đầy thức ăn nước uống Bệnh lý đặc trưng là gan bị sung huyết sưng to, lách sung huyết Bệnh tích vi thể: Lách sung huyết có nhiều dịch protein trong xoang lách, hoại tử điểm và có nhiều đám vi khuẩn, có những cục máu đông nhỏ có fibrin trong xoang gan, thỉnh thoảng có thể thấy trong tiểu cầu thận

* Thể nhiễm trùng huyết sơ sinh

Gà con thường có biểu hiện bệnh từ 24 – 48 giờ sau khi nở, gà có thể chết, tỷ lệ chết có thể duy trì đến 2 – 3 tuần sau và có thể lên đến 10 – 20%, tỷ lệ còi cọc có thể lên đến 5% Những gia cầm không bị ảnh hưởng thì phát triển bình thường Bệnh lý bao gồm sung huyết ở phổi, màng thanh mạc bị ứ dịch, lách sưng, dạ dày tuyến và phổi có màu sậm Bệnh tích vi thể thường được ghi nhận là có nhiều vi khuẩn trong các mô bệnh, viêm đa màng thanh dịch có sự tích tụ fibrin và bạch cầu trung tính ở màng bao tim, màng phổi, túi khí, phúc mạc

* Thể viêm màng não

E coli ít khi định vi ở não Tuy nhiên, cũng có một số trường hợp viêm màng não,

viêm não có thể được ghi nhận ở một số gia cầm Bệnh tích viêm màng não có thể quan sát được sau khi mổ khám là có những vùng gần mạch máu bị mất màu, màng não dày và đục Bệnh tích vi thể có thể thấy là có sự hiện diện của bạch cầu trung tính và dịch tiết fibrin ở giai đoạn đầu, nếu kéo dài thì có bệnh tích u hạt ở màng não

* Thể viêm mắt

Gia cầm mắc bệnh này có bệnh tích mắt sưng, có nhiều fibrin, mờ, kéo mây đục, sau đó nhãn cầu nhăn và teo, có rất nhiều dịch tiết fibrin, bạch cầu trung tính và vi khuẩn hiện diện ở mắt Khi bệnh kéo dài các mô sẽ hoại tử trở thành những dạng u hạt, võng mạc bị bong tróc rồi teo lại, thủy tinh thể bị phân hủy

* Thể nhiễm trùng huyết cấp tính ở gà đẻ

Nhiễm trùng huyết do E coli thường rất phổ biến ở gia cầm con nhưng đôi khi

cũng có những trường hợp bệnh xảy ra ở gà và gà tây trưởng thành Bệnh thường xảy ra ở thời gian đầu đẻ trứng nhưng nó cũng có thể tiếp tục ở giai đoạn sau và cũng có thể lây lan cho những đàn gia cầm lớn hơn trong một trại Gia cầm thường

chết thình lình, tỷ lệ chết trong khoảng 5 – 10% Những bệnh tích đặc trưng rất giống với bệnh tích thể nhiễm trùng huyết

* Thể viêm xương khớp và viêm màng hoạt dịch

E coli thường định vị trong xương, các mô bao hoạt dịch do hậu quả của nhiễm

trùng huyết Gia cầm mắc bệnh có hiện tượng què từ mức độ nhẹ cho đến nặng, tăng trọng kém Bệnh có thể xảy ra ở nhiều vị trí khớp Vi khuẩn khu trú tại chỗ, đi theo mạch máu xâm nhập vào các xương đang phát triển gây ra hiện tượng viêm xương và tủy xương, viêm khớp và những mô mềm bao quanh khớp Những xương thường bị tổn thương là xương chày, xương cẳng chân, xương đùi, đốt sống vùng cổ ngực, xương cánh Viêm khớp hông – đùi, khớp gối, khớp cánh, viêm cột sống có thể dẫn đến liệt nhẹ rồi bại liệt, viêm gân khớp thường thấy ở xương ức

Có rất nhiều dịch viêm vùng dưới xương ức Gan sưng có màu xanh của mật

* Thể u hạt

Thường xảy ra ở gà và gà tây, đặc trưng là có nhiều hạt ở gan, manh tràng, tá tràng

và ở màng treo ruột nhưng không có hiện diện ở lách Thể này ít xảy ra, nhưng tỷ

lệ chết có thể lên đến 75% Bệnh tích vi thể là ở giai đoạn đầu của bệnh có sự kết

tụ của các tổ chức hoại tử và thường thấy nhiều nhất ở gan, có một ít bạch cầu

trung tính quan sát ở bên cạnh những vùng hoại tử và một số ít tế bào khổng lồ

Chẩn đoán (Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012)

Chẩn đoán lâm sàng

Dựa vào các đặc điểm triệu chứng bệnh tích như gan sưng có màu mật, viêm màng ngoài tim, viêm gan, có nhiều dịch màu hơi vàng ở túi khí, phúc mạc, viêm phổi, gan và lách hơi sưng, viêm ống dẫn trứng và viêm mắt, viêm khớp, viêm màng não Triệu chứng và bệnh tích rất phức tạp, khó phân biệt với bệnh thương hàn,

bệnh do Mycoplasma, bệnh do Pasteurella, bệnh do Clamydia Để chẩn đoán

chính xác cần phân lập mầm bệnh

Chẩn đoán vi khuẩn học

Cớ thể sử dụng các cơ quan nội tạng để phân lập vi trùng nhưng cần tránh ô nhiễm

E coli từ phân Tủy xương là bệnh phẩm thường được sử dụng nhất vì rất ít bị

nhiễm tạp khuẩn Có thể phân lập trên môi trường thạch MC (MacConkey), EMB (Eosin-methylene blue)

Phát hiện và định danh vi khuẩn bằng kĩ thuật PCR

Chẩn đoán huyết thanh học

Có thể phát hiện kháng thể từ các gia cầm bệnh bằng kĩ thuật ELISA hoặc xét nghiệm ngưng kết hồng cầu gián tiếp

Phòng bệnh (Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012)

Phòng bằng vaccine

Vaccine vô hoạt bao gồm các serotype O2:K1, O78:K80 được sản xuất trên thị trường thế giới cho thấy có hiệu quả trong phòng bệnh Vaccine này cần được sử dụng cho các đàn gia cầm giống để tạo miễn dịch thụ động cho gia cầm con, miễn dịch thụ động bảo vể gia cầm con ít nhất là 2 tuần Vaccine sống được sản xuất từ những chủng không gây bệnh ở trong tự nhiên (chủng BT-7), chủng này có hiệu quả trong việc phòng bệnh cho gà trên 14 ngày tuổi

độ úm cho gà con Gà cần được ăn uống đầy đủ sẽ có thể giảm tỷ lệ chết nếu bị

nhiễm E coli Cung cấp khẩu phần cao đạm với hàm lượng cao vitamin A, vitamin

E và selenium Cung cấp các tiêu hóa (Acidophilus lactobacillus hay Bacillus

subtilis) cho gia cầm giúp hạn chế sự định vị E coli trong đường ruột

Điều trị (Phạm Sỹ Lăng, 2002)

Vi khuẩn E coli có khả năng mẫn cảm với nhiều loại kháng sinh như ampicillin, clotetracycline, neomycin, gentamycin, ormethoprim-sulfadimethoxine, nalidixic acid, oxytetracycline, polymixin B, spectinomycin, streptomycin và các thuốc thuộc nhóm sulfamid Do vây, có thể dùng các loại thuốc trên để điều trị Gần đay nhất, kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolones cũng đã được đưa vào sử dụng rộng rãi tại Mỹ và một số nước khác Tuy nhiên, cũng phải tiến hành kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được trong phòng thí nghiệm để tìm ra loại kháng sinh thích hợp có thể dùng để điều trị, đồng thời cũng hạn chế hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn Liều lượng thuốc và đường đưa thuốc thích hợp cũng là các yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả sử dụng thuốc

+ Thuốc kháng sinh diệt khuẩn (bactericidial antibiotics): gồm những loại kháng sinh có cơ chế tác dụng đến khả năng tạo vách tế bào, sinh tổng hợp DNA và RNA giải phóng autolyza (Bùi Thị Tho, 2003)

Nhóm diệt khuẩn: Beta-lactams, aminoglycosides, polypeptides, quinolones, glycopeptides, fosfomycin, nitrofurans, rifamycins, imidazoles (Huỳnh Kim Diệu, 2012)

+ Thuốc kháng sinh kìm khuẩn (bacteriostatic antibiotics): gồm các thuốc ức chế sinh tổng hợp protein của vi khuẩn bằng cách gắn vào các hay các ribosome 30s, 50s và 70s (Bùi Thị Tho, 2003)

Nhóm kìm khuẩn: Macrolides, cyclines, lincosamides, phenicoles, fusidic acid, synergistines, sulfonamides, diaminopyrimidines (Huỳnh Kim Diệu, 2012)

Dựa vào phổ tác dụng kháng sinh

Nhóm có phổ tác dụng hẹp, chỉ tác dụng chủ yếu lên một loại hay một nhóm vi khuẩn nào đó: Penicilin cổ điển chỉ tác dụng lên vi khuân Gram (+), hay nhóm thuốc chỉ tác dụng với vi khuẩn Gram (-) như streptomycin

Nhóm kháng sinh có phổ tác dụng rộng, chúng có tác dụng với cả vi khuẩn Gram (+), Gram (-), Ricketsia, virus cỡ lớn, đơn bào: Chloramphenicol, tetracyclin Nhóm kháng sinh dùng ngoài hay các thuốc không hoặc ít hấp thu ở đường tiêu hóa Thuốc thuộc nhóm này thường độc, bao gồm các thuốc có tác dụng với vi khuẩn Gram (-) như: Baxitraxin, heliomycin, tác dụng với vi khuẩn Gram (+) như: Neomycin, polymycin

Nhóm kháng sinh chống lao: Rifamycin

Nhóm kháng sinh chống nấm như: Nystatin, grycefulvin, amphoterytin-B (Bùi Thị Tho, 2003)

Dựa vào nguồn gốc

Kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật, xạ khuẩn

Nhóm kháng sinh có nguồn gốc hóa dược hay do con người tổng hợp nên (Bùi Thị Tho, 2003)

Dựa vào cơ chế tác dụng

+ Nhóm 1: Tác động lên thành tế bào của vi khuẩn (ức chế sự tổng hợp paptidoglycan): β-lactams, vacomycin, fosfomycin

+ Nhóm 2: Tác động lên màng tế bào chất vi khuẩn: Polypeptides làm tăng tính thấm của một số ion, mất đi tính thấm chọn lọc của màng

+ Nhóm 3: Tác động lên sự tổng hợp protein cần cho vi khuẩn: Aminoglycosides, phenicoles, cyclines, macrolides, lincosamides, fusidic acid

+ Nhóm 4: Tác động lên sự tổng hợp aicd nucleic của vi khuẩn: Quinolones, rifamycins, nitrofurans, imidazoles, sulfonamide, diaminopyrimidine (Huỳnh Kim Diệu, 2012)

Dựa vào cấu trúc hóa học

+ β-lactams: Penicilins, cephalosporin

spectinomycin, paromycin, tobramycin, framecetin

+ Polypeptides: Polymyxins (A, B, C, D), colistin (polymycin E)

+ Quinolones: Flumequine, roxoxacin, oxolinic acid, ofloxacin, norfloxacin

+ Glycopeptides: Vancomycin, teicoplanin

+ Fosfomycin (fosfocine)

+ Nitrofurans: Furazolidone

+ Imidazole: Metronidazole, ronidazole, tinidazole, dimetridazole

+ Rifamycins: Rifampin

+ Macrolides: Erythomycin, spiramycin, josamycin, tylosin, oleandomycin

+ Cyclines: Tetracycline, oxytetracycline, chlortetracycline, metacycline

+ Lincosamides: Lincomycin, clindamycin

+ Phenicoles: Chloramphenicol, thiamphenicol, florfenicol

+ Fuscidic acid (Fucidine)

+ Sulfonamides

+ Synergistines: Pristinamycin, virginiamycin

+ Diaminopirimidines: Trimethoprim, ormetoprim Ngoài ra còn nhiều nhóm khác: ionophores (monensin, salinomycin), pleuromutilin (tiamulin)… (Huỳnh Kim Diệu, 2012)

2.7.2 Cơ chế tác động của kháng sinh

2.7.3 Nhóm β-lactams và các chất ức chế β-lactamase

Theo Huỳnh Kim Diệu (2012), β-lactams gồm các nhóm: Penam, Penem, Cephem,

Monobactam và nhóm ức chế betalactamase không có hoạt tính kháng khuẩn dùng

phối hợp với các β-lactams để có tác động trên β-lactamase Đặc điểm chung của

các nhóm này là có một vòng beta-lactam Nhóm β-lactams đƣợc sử dụng rộng rãi

vì có phổ kháng khuẩn đa dạng và ít độc tính

Nhóm Penicillins (Penam)

+ Penicillin G và V: Sodium hoặc potassium penicillin G, procaine penicillin G, benzathyl penicillin, penicillin V

+ Penicillin A: Phổ kháng khuẩn giống Penicillin G, mở rộng them một số vi

khuẩn Gram (-): E coli, Salmonella, Shigella, Haemophilus influenza, Brucella,

Pasteurella Gồm có: Ampicillin (totapen), amoxicillin (clamoxin)

Hình 2.2 Cơ chế tác động của các nhóm kháng sinh chính

+ Penicillin M: Methicillin (kháng penicillinase, không kháng acid), oxacillin

(kháng acid và kháng penicillinase), cloxacillin (kháng acid và kháng penicillinase), dicloxacillin (kháng acid và kháng penicillinase)

Nhóm Cephalosporins

+ Cephalosporin I: Tác động trên Streptococcus, Staphylococcus, Haemophilus,

E coli, Salmonella, Shigella, Clostridium perfringens Gồm có: Cefalotin,

cefaclor, cefazolin, cefalexin

+ Cephalosporin II: Phổ kháng khuẩn như Cephalosporin I, nới rộng trên

Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas Gồm có: Cefamendol, cefoxitin,

Các chất ức chế β-lactamase (Bùi Thị Tho, 2003)

Clavulanic acid: Được lấy ra từ nấm Streptomyces clavuligerus Khi phối hợp với

các thuốc bị ức chế bởi β-lactamase với clavulanic acid, sulbactam: Amoxicillin hay các penicillin tổng hợp phổ rộng: Ampicillin, ticarcillin… Chất acyt-β-lactamase sẽ ức chế hoạt động của β-lactamase, do đó tác động của thuốc vẫn được bảo hành

Sulbactam: Thuốc có cơ chế cũng tương tự như clavulanic acid ức chế lactamase Sulbactam hay được sử dụng cùng với ampicillin

β-Carbapenem ( Imipenem): Thuốc có phổ kháng khuẩn rộng, hiệu lực cao trên tất cả các chủng gây bệnh kể cả vi khuẩn có khả năng sinh β-lactamase và vi khuẩn hoại

thư Pseudomonas spp Khi dùng thuốc cần thận trọng với các động vật bệnh thận

2.7.4 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn

Cơ chế đề kháng của vi khuẩn

Vi khuẩn tạo đề kháng với kháng sinh bằng cách: Biến đổi và vô hoạt kháng sinh với những của vi khuẩn; biến đổi điểm tác động của kháng sinh; làm giảm tính thấm của thành vi khuẩn; phát triển một kiểu biến dưỡng khác không bị ảnh hưởng

ức chế của kháng sinh (Huỳnh Kim Diệu, 2012)

Nguyên nhân đưa đến sự đề kháng của vi khuẩn

Do thích ứng, do di truyền (chuyển thể, chuyển nạp, giao phối), do sự đề kháng thuốc chéo (Huỳnh Kim Diệu, 2012)

Sự nảy sinh khả năng kháng thuốc của vi khuẩn là rất nhanh và ở diện rộng Trước đây điều này chỉ được giải thích bằng một cơ chế cổ truyền như đã được mô tả đối với các loài vi sinh vật và ký sinh trùng khác Đó là sự gia tăng về tần số gene kháng thuốc gây ra, do chọn lọc, rồi chuyền theo chiều dọc từ bố mẹ di truyền cho con cái Trong thực tế, sự nảy sinh khả năng kháng thuốc của vi khuẩn chủ yếu lại

do khả năng truyền gene kháng thuốc theo chiều ngang, giữa các vi khuẩn với nhau trong cùng một thế hệ, hoặc giữa các loài vi khuẩn khác họ với nhau (Bùi Thị Tho, 2003)

Theo Clower (1997), Cohen (1980), Jonhson (1994)… có 3 phương thức mà vi khuẩn có thể truyền gene kháng thuốc theo chiều ngang:

- Sự biến nạp: Một đoạn DNA được truyền từ tế bào cho sang một tế bào nhận khác

- Tải nạp: Sự truyền một đoạn DNA tử tế bào cho sang một tế bào nhận thong qua một thể thực khuẩn

- Sự tiếp hợp: Sự truyền một đoạn DNA từ tế bào này sang tế bào khác, có sự liên kết với nhau giống như sự giao phối của 2 tế bào Trong 3 phương thức trên, tiếp hợp được coi là quan trọng nhất

Sự truyền tính kháng thuốc bằng con đường tiếp hợp liên quan đến sự chuyển một bản copy giống hệt của plasmid từ tế bào này sang tế bào khác Plasmid là một vòng tròn DNA, nó hoạt động độc lập với nhiễm sắc thể của vi khuẩn Vai trò quan

Sơ đồ 2.1 Truyền các yếu tố kháng thuốc bằng con đường tiếp hợp

trọng của tiếp hợp là nhiều gene kháng thuốc cùng nằm trên một plasmid Chúng được gọi là những nhân tố R (factor R) (Bùi Thị Tho, 2003)

Sự truyền tính kháng thuốc đã được Smith (1970) chứng minh ở loại vi khuẩn

E coli và Salmonella trên đàn gà Nếu vi khuẩn E coli là vi khuẩn cho, mang yếu

tố R được thêm vào nước uống, sau đó cho thêm vào các dòng vi khuẩn E coli và

Salmonella typhimurium, cả 2 dòng này đều không mang nhân tố R Một thời gian,

ở dòng E coli thứ 2 và Salmonella typhimurium phân lập từ gà, người ta đều tìm

thấy nhân tố R trong chúng Hơn nữa, các thí nghiệm này được làm đối với gà thường xuyên nhận kháng sinh từ thức ăn thì tần số các tế bào nhận mang nhân tố

R tăng lên rất cao Các tế bào cho đều chứa nhân tố đặc trưng kháng với chính loại kháng sinh dùng trong thức ăn đã bổ sung đó Trong trường hợp này, chính chất kháng sinh đã hổ trợ cho các dòng vi khuẩn nhận nhân tố R tồn tại và phát triển (Bùi Thị Tho, 2003)

Vai trò quan trọng của sự lan truyền tính kháng giữa các cá thể trong cùng thế hệ (theo chiều ngang) nảy sinh, vì một số lượng lớn vi khuẩn có mặt ở môi trường bên trong và bên ngoài của động vật, con người luôn có cơ hội tiếp xúc với vi khuẩn kháng thuốc Việc sử dụng kháng sinh đã tạo ra một môi trường thích hợp cho sự sống còn của vi khuẩn mang nhân tố R Các dòng này, ngay sau đó hoạt động như một nguồn để cung cấp và lan truyền nhân tố R cho bất kì dòng vi khuẩn nào khác (bao gồm cả dòng vi khuẩn gây bệnh) Hiện tượng này hiện đang xảy ra thường xuyên, việc lan truyền một cách đáng kể bất kì một đoạn plasmid nào đều

có thể truyền theo chiều ngang (Bùi Thị Tho, 2003)

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu

- Thời gian thực hiện từ tháng 08 năm 2014 đến tháng 11 năm 2014

- Địa điểm lấy mẫu: Tại hai trại gà thả vườn thuộc huyện Mỏ Cày Bắc, tỉnh Bến Tre

Trại 1: Lê Minh Tiến, 299/60 ấp Phú Thạnh, xã Phú Mỹ, huyện Mỏ Cày Bắc, tỉnh Bến Tre

Trại 2: Đinh Văn Chính, ấp Lăng Tây, xã Phú Sơn, huyện Mỏ Cày Bắc, tỉnh Bến Tre

- Địa điểm phân tích mẫu: Phòng thí nghiệm Vệ Sinh Thực Phẩm, Bộ Môn Thú Y, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ

- Đối tượng nghiên cứu: Mẫu vật thí nghiệm gồm các mẫu bệnh phẩm gan, thịt,

phổi, phân của gà bị tiêu chảy do nghi bị nhiễm E coli và mẫu phân gà khỏe tại

hai trại gà thả vườn thuộc huyện Mỏ Cày Bắc, tỉnh Bến Tre

3.1.2 Hóa chất và môi trường

Nước cất, cồn 700, 900, NaCl 0,9%, thuốc thử Kovac’s, Indole, Methyl Red (MR), Voges- Proskauer (VP; Eiken, Japan), K2HPO4, Glucose, Nutrient Agar (NA, Merk KgaA, Germany), Mac Conkey Agar (MC, Merk KgaA Germany),Kligler Iron Agar (KIA), Simmons’ Citrate Agar (Merck KgaA, Germany), Mueller Hinton Agar (MHA, Merk KgaA Germany)

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ, máy móc

Autoclave, microwave, micropipette, vortex, tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh, cân điện tử, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, ống nghiệm, ống đong, ống hút, bình nấu môi trường và một số dụng cụ khác

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu

- Lấy mẫu bệnh phẩm gà bệnh: Chọn ngẫu nhiên những con gà bi tiêu chảy do

nghi nhiễm E coli Tiến hành mổ lấy từng bệnh phẩm mỗi thứ lấy khoảng 25g và

lấy theo thứ tự thịt, gan, phổi và phân Ngoài ra lấy 1g phân gà bệnh để làm định lượng cho vào túi vô trùng có ghi ký hiệu, được bảo quản lạnh rồi đưa về phòng thí nghiệm phân tích

- Lấy mẫu phân gà khỏe: Dùng tampon vô trùng đưa vào trực tràng của gà để lấy phân rồi đưa ngay vào ống nghiệm vô trùng có chứa môi trường chuyên chở, và lấy 1g phân để làm định lượng cho vào túi vô trùng có ghi ký hiệu, mẫu được bảo quản lạnh rồi đưa về phòng thí nghiệm phân tích

3.2.2 Phương pháp định lượng vi khuẩn E coli trong phân gà khỏe và gà bệnh

Phương pháp định lượng vi khuẩn E coli được thực hiện theo TCVN 7924: 2008

Bước 1: Chuẩn bị 5 ống nghiệm có chứa 9ml nước muối sinh lí 0,9%

Bước 2: Cân 1g mẫu phân cho vào ống nghiệm đầu tiên rồi lắc đều trên vortex sao cho mẫu phân hòa tan đều ta được dung dịch pha loãng với nồng độ 10-1 Các nồng

độ pha loãng tiếp theo thực hiện bằng cách dùng micropipette hút 1ml dung dịch nồng độ trước đó cho vào ống nghiêm tiếp theo và như thế ta sẽ có các nồng độ tiếp theo là 10-2 – 10-5, đó là những nồng độ pha loãng cần thiết Chọn 2 độ pha loãng liên tiếp để nuôi cấy, phân lập sao cho trên mỗi đĩa có tổng số khuẩn lạc thu được có từ 15 – 300 khuẩn lạc

Bước 3: Sau khi chọn được hai nồng độ thích hợp sẽ tiến hành nuôi cấy E coli trên

môi trường MC Dùng micropipette hút 0,1 ml huyễn dịch từ ống nghiệm được chọn có nồng độ cần nuôi cấy thích hợp cho lên bề mặt đĩa môi trường MC, sau đó bằng phương pháp chan đĩa, chan đều cho đến khi bề mặt đĩa khô, mỗi nồng độ lập lại ở hai đĩa sau đó đem ủ ở 370C trong 24h

Nhận diện khuẩn lạc E coli: Trên môi trường MC khuẩn lạc E coli to, tròn đều,

hơi lồi,có màu hồng đậm Chọn 1 khuẩn lạc điển hình cấy trên môi trường NA đem ủ ở 370C trong 24h Thử sinh hóa để khẳng định là vi khuẩn E coli

Cách tính kết quả:

Đếm tất cả các khuẩn lạc đạt tiêu chuẩn xuất hiện trên các đĩa sau khi đem ủ ở các

nồng độ thích hợp rồi áp dụng công thức tính định lượng vi khuẩn E coli:

d n n

V

C X

)2

*21( 

Trong đó:

X số khuẩn lạc CFU/ml

V thể tích dung dịch pha loãng

n1 số đĩa được giữ lại ở nồng độ pha loãng thấp nhất

n2 số đĩa được giữ lại ở nồng độ pha loãng thấp tiếp theo

d hệ số pha loãng tương ứng với nồng độ pha loãng thấp nhất

Mẫu phân (1g)

Huyễn dịch vi khuẩn

Hút 0,1ml Chan trên môi trường MC

370C/24h Đếm khuẩn lạc

Chọn khuẩn lạc điển hình cấy trên môi trường NA

370C/24hKiểm tra đặc tính sinh hóa

KIA Indole VP Simmons’ Citrate MR

370C/24h

E coli dương tính

Sơ đồ 3.1 Qui trình định lượng vi khuẩn E coli (TCVN 7924: 2008)

Phương pháp kiểm tra đặc tính sinh hóa vi khuẩn E coli

Vi khuẩn E coli sau khi được tăng sinh trên môi trường NA, tiến hành kiểm tra

đặc tính sinh hóa của vi khuẩn trên các môi trường KIA, LIM, VP, MR-VP

và Simmons’ Citrat

Môi trường KIA dùng để kiểm tra sự lên đường glucose, lactose, sinh hơi và sinh

H2S của vi khuẩn Nếu vi khuẩn chỉ lên đường glucose thì phần thạch nghiêng của

môi trường có màu đỏ và phần thạch đứng có màu vàng Nếu lactose được sử dụng

thì cả hai phần thạch đứng và thạch nghiêng đều có màu vàng Sự sinh hơi được

ghi nhận bởi bọt khí hay sự bể, nứt của cột thạch Nếu vi khuẩn sản sinh H2S thì

môi trường sẽ có màu đen

Môi trường LIM dùng để kiểm tra tính sinh Indole của vi khuẩn Trên môi trường

này, sau khi nhỏ thuốc thử Kovacs’ vào nếu trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng

đỏ thì phản ứng dương tính và ngược lại nếu trên bề mặt môi trường không xuất

hiện vòng đỏ thì Indole âm tính

Môi trường VP dùng để kiểm tra tính di động và tính sinh aceton của vi khuẩn Vi

khuẩn có khả năng di động sẽ làm đục môi trường Ngược lại, vi khuẩn không có

khả năng di động thì chỉ thấy vi khuẩn mọc theo đường que cấy, môi trường xung quanh trong Trên môi trường VP, sau khi cho thuốc thử VP1, VP2 vào nếu

trên bề mặt môi trường có vòng đỏ thì chứng tỏ vi khuẩn có khả năng sinh aceton

Ngược lại, nếu trên bề mặt môi trường không xuất hiện vòng đỏ thì vi khuẩn

không có khả năng sinh aceton

Môi trường MR dùng để kiểm tra tính sử dụng đường của vi khuẩn Nhỏ lên bề

mặt môi trường vài giọt thuốc thử Methyl Red, phản ứng dương tính sẽ có vòng đỏ

xuất hiện trên bề mặt môi trường và ngược lại

Môi trường Simmons’ citrate dùng để kiểm tra khả năng sử dụng citrate thay

nguồn carbon của vi khuẩn Trên môi trường này, vi khuẩn cho kết quả dương tính

khi màu của môi trường chuyển từ xanh lục sang xanh dương

Bảng 3.1: Định danh vi khuẩn E coli bằng phản ứng sinh hóa

Vi khuẩn

Di động

Glucose Lactose H 2 S Indole MR VP Simmons’

3.2.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn E coli kháng kháng sinh và vi khuẩn

E coli sinh enzyme β-lactamase phổ rộng (ESBL) trên gà

Mẫu phân và bệnh phẩm đem về được ria cấy trực tiếp trên môi trường MC có bổ sung kháng sinh ceftazidime 2g/ml (Khan et al, 2008) rồi ủ ở 37oC trong 24 giờ

Chọn các khuẩn lạc E coli to, tròn đều, hơi lồi, màu hồng đậm Sau đó cấy trên môi trường NA sau 24h đem thử sinh hóa để khẳng định chính xác vi khuẩn E coli

và có mang gene đề kháng kháng sinh

Tiếp đó thực hiện phương pháp đĩa đôi kết hợp trên môi trường MHA (Mueller Hinton Agar): Phương pháp này được Jacoby và Han mô tả lần đầu tiên vào năm

1996 và xác định vi khuẩn E coli sinh β-lactamse phổ rộng theo tiêu chuẩn CLSI

2014

Phương pháp thực hiện: Chuyển khuẩn lạc có mang gene đề kháng kháng sinh từ

từ vào ống nghiệm chứa 2 – 3 ml nước muối sinh lí 0,9% đến khi dung dịch trong

CFU/ml) Chuẩn bị 2 đĩa chứa môi trường MHA, dùng que tampon vô trùng nhúng vào ống canh khuẩn đã chuẩn bị trước, ép lên thành ống nghiệm cho ráo bớt nước sau đó lấy ra dàn đều lên mặt thạch MHA Sau khi mặt thạch khô tiến hành đặt các khoanh giấy kháng sinh như sau: Đĩa thứ nhất đặt các khoanh giấy kháng sinh chứa ceftazidime 30μg và chứa ceftazidime 30μg/clavulanic acid 10μg, đĩa thứ 2 đặt các khoanh giấy kháng sinh chứa cefotaxime 30μg và cefotaxime 30μg và clavulanic acid 10μg Xong đem đĩa ủ ở 370C trong 24h, nếu có sự khác biệt hiệu

số giữa 2 đĩa lớn hơn 5mm thì khẳng định là vi khuẩn E coli sinh β-lactamase phổ

rộng

Hình 3.2 Sinh hóa khẳng định vi

khuẩn E coli Hình 3.1 Khuẩn lạc E coli trên môi

trường MC