thực hiện tiêu bản mô động vật thận, niệu quản, bàng quang, niệu đạo, động mạch, tĩnh mạch trên thỏ

TÓM LƢỢC Đề tài “Thực hiện tiêu bản mô động vật: thận, niệu quản, bàng quang, niệu đạo, động mạch, tĩnh mạch trên thỏ” được thực hiện nhằm mục đích tạo ra tiêu bản vi thể đối với từng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN THỊ ANH THƯ

THỰC HIỆN TIÊU BẢN MÔ ĐỘNG VẬT: THẬN, NIỆU QUẢN, BÀNG QUANG, NIỆU ĐẠO, ĐỘNG MẠCH, TĨNH MẠCH TRÊN

THỎ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH: THÚ Y

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN THỊ ANH THƯ

THỰC HIỆN TIÊU BẢN MÔ ĐỘNG VẬT: THẬN, NIỆU QUẢN, BÀNG QUANG, NIỆU ĐẠO, ĐỘNG MẠCH, TĨNH MẠCH TRÊN

THỎ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH: THÚ Y

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths LÊ HOÀNG SĨ

2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

Đề tài: “Thực hiện tiêu bản mô động vật: thận, niệu quản, bàng

quang, niệu đạo, động mạch, tĩnh mạch trên thỏ”, do sinh viên Nguyễn Thị

Anh Thư lớp Thú Y Khóa 36 thực hiện tại Phòng thí nghiệm mô học thuộc Bộ môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học

Cần Thơ từ tháng 05 năm 2014 đến tháng 09 năm 2014

Cần Thơ, ngày …tháng … năm … Cần Thơ, ngày… tháng … năm … Duyệt Bộ môn Cán bộ hướng dẫn

Lê Hoàng Sĩ

Cần Thơ, ngày … tháng … năm … Duyệt Khoa Nông Nghiệp & SHƯD

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy Lê Hoàng Sĩ và Thầy Trần Hiền Nhơn đã tận tâm, tận lực quan tâm, động viên, hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Chân thành biết ơn và xin khắc ghi những kiến thức, kinh nghiệm quý báu mà thầy cô bộ môn Thú Y và tất cả thầy cô trong trường Đại Học Cần Thơ

đã truyền dạy cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ và nhiệt tình giúp đỡ tôi những lúc khó khăn nhất

Cuối cùng, tôi xin kính chúc quý thầy cô, gia đình, bạn bè luôn dồi dào sức khỏe và đạt nhiều thành công hơn nữa trong công tác và cuộc sống

Xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC

Trang duyệt i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục hình v

Tóm lược vi

Chương 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 2: CƠ SỞ LÝ LUẬN 2

2.1 Một số khái niệm về mô học 2

2.1.1 Mô học 2

2.1.2 Tế bào 2

2.1.3 Mô 2

2.1.3.1 Biểu mô 2

2.1.3.2 Tổ chức liên kết 4

2.1.3.3 Tổ chức cơ 4

2.1.3.4 Tổ chức thần kinh 4

2.2 Tổng quan cấu tạo vi thể 4

2.2.1 Thận 4

2.2.2 Niệu quản 7

2.2.3 Bàng quang 7

2.2.4 Niệu đạo 8

2.2.5 Động mạch 8

2.2.5.1 Động mạch lớn (động mạch chun hay động mạch đàn hồi) 9

2.2.5.2 Động mạch trung bình (động mạch cơ) 9

2.2.5.3 Động mạch nhỏ 9

2.2.6 Tĩnh mạch 10

2.2.6.1 Tĩnh mạch lớn 10

2.2.6.2 Tĩnh mạch trung bình 10

2.2.6.3 Tĩnh mạch nhỏ 11

2.3 Khái quát về phương pháp thực hiện tiêu bản vi thể 11

2.3.1 Lấy mẫu 11

2.3.2 Cố định 12

2.3.3 Khử nước 13

2.3.4 Tẩm dung môi trung gian của paraffin 13

2.3.5 Tẩm paraffin 13

2.3.6 Đúc khuôn 13

2.3.7 Cắt lát mỏng 14

2.3.8 Tải tiêu bản lên lame 14

2.3.9 Nhuộm kép Hematoxylin-Eosin Y 14

2.3.9.1 Sự nhuộm màu tăng, giảm dần 14

2.3.9.2 Sự nhuộm màu nối tiếp, đồng thời 15

2.3.9.3 Nhuộm màu trực tiếp, gián tiếp 15

Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Phương tiện 16

3.1.1 Địa điểm thực hiện 16

3.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị, hoá chất 16

3.1.2.1 Dụng cụ 16

3.1.2.2 Hoá chất 16

3.2 Phương pháp tiến hành 17

3.2.1 Lấy mẫu 17

3.2.2 Cố định mẫu 17

3.2.3 Lấy mẫu nhỏ 17

3.2.4 Rửa mẫu 17

3.2.5 Khử nước 17

3.2.6 Tẩm dung môi trung gian 18

3.2.7 Tẩm paraffin 18

3.2.8 Đúc khuôn 19

3.2.9 Cắt mẫu 19

3.2.10 Tải – hấp mẫu 19

3.2.11 Nhuộm mẫu 20

3.2.12 Dán lamelle – dán nhãn 20

3.2.12.1 Cố định mẫu bằng keo Canada Balsam 20

3.2.12.2 Dán nhãn 21

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Thận 23

4.2 Niệu quản 25

4.3 Bàng quang 26

4.4 Niệu đạo 27

4.5 Động mạch 28

4.6 Tĩnh mạch 29

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32

5.1 Kết luận 32

5.2 Đề nghị 32

Tài liệu tham khảo 33

Phụ chương 34

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Cấu tạo hiển vi của đường dẫn niệu 6

Hình 2.2 : Sự khác nhau giữa động mạch và tĩnh mạch 10

Hình 3.1: Một số dụng cụ và hoá chất thí nghiệm 16

Hình 3.2: Quy trình nhuộm mẫu 20

Hình 4.1: Tiêu bản vi thể miền vỏ thận cắt dọc (X40) 23

Hình 4.2: Tiêu bản vi thể miền vỏ thận cắt dọc (X10) 23

Hình 4.3: Tiêu bản vi thể của miền tuỷ thận cắt dọc (X40) 24

Hình 4.4: Tiêu bản vi thể niệu quản cắt ngang (X10) 25

Hình 4.5: Tiêu bản vi thể của niệu quản cắt ngang (X40) 25

Hình 4.6: Tiêu bản vi thể của bàng quang (X10) 26

Hình 4.7: Tiêu bản vi thể biểu mô bàng quang (X40) 26

Hình 4.8: Tiêu bản vi thể niệu đạo phần dương vật (X10) 27

Hình 4.9: Tiêu bản vi thể lớp niêm mạc niệu đạo phần dương vật (X40) 27

Hình 4.10: Tiêu bản vi thể động mạch lớn cắt ngang (X40) 28

Hình 4.11: Tiêu bản vi thể động mạch nhỏ cắt ngang (X40) 28

Hình 4.12: Tiêu bản vi thể tĩnh mạch (X40) 29

TÓM LƢỢC

Đề tài “Thực hiện tiêu bản mô động vật: thận, niệu quản, bàng

quang, niệu đạo, động mạch, tĩnh mạch trên thỏ” được thực hiện nhằm

mục đích tạo ra tiêu bản vi thể đối với từng loại tổ chức đã nêu; đồng thời là nguồn tư liệu cho học tập, nghiên cứu, giảng dạy; cung cấp thêm kiến thức về phương pháp thực hiện và khảo sát tiêu bản vi thể ở mô bình thường Đây cũng là nguồn thông tin cơ bản giúp cho việc nghiên cứu cấu tạo vi thể ở mô bệnh và mở rộng nghiên cứu sang một số lĩnh vực liên quan Bằng phương pháp thực hiện tiêu bản mô cắt lát và nhuộm kép với Hematoxylin và Eosin Y, những tiêu bản này được tạo ra và có thể quan sát được ở mức cấu tạo tế bào Trong thời gian từ tháng 05 đến tháng 09 năm 2014, tại phòng thí nghiệm Mô học thuộc bộ môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ, cùng với trang thiết bị và hóa chất cần thiết, đã có 337 tiêu bản được thực hiện Trong đó chọn ra 193 tiêu bản hoàn chỉnh Qua đó rút ra được những bài học kinh nghiệm trong việc thực hiện tiêu bản vi thể cùng một

số đặc điểm riêng trên từng mẫu so với quy trình chung và hoàn thành được mục tiêu đề ra

Chương 1: ĐẶT VẤN ĐỀ

Cơ thể động vật là một thể thống nhất và hoàn chỉnh Bất kỳ cấu tạo nào

cũng đều đảm nhận chức năng nhất định Ngược lại, bất kỳ chức năng nào cũng đều do một hoặc một số cấu tạo thực hiện để phù hợp với điều kiện sống Trong lĩnh vực thú y, để tìm hiểu mức độ thiệt hại, tổn thương khi mắc bệnh, cơ chế sinh bệnh,… của một loại bệnh nào đó trên cơ thể vật nuôi thì việc khảo sát ở mức độ tế bào là thực sự cần thiết Do đó, để có thể khảo sát được mô bệnh, thì ta phải nắm rõ được cấu trúc, hình thái, cách sắp xếp những

tế bào để hình thành mô lúc bình thường của cơ thể sinh vật

Đồng thời, tiêu bản mô cũng là nguồn tư liệu để phục vụ cho nghiên cứu, học tập và giảng dạy

Từ những lý do trên và được sự phân công của bộ môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ, đề tài:

“Thực hiện tiêu bản mô động vật: thận, niệu quản, bàng quang, niệu đạo,

động mạch, tĩnh mạch trên thỏ” được thực hiện

Chương 2: CƠ SỞ LÝ LUẬN

2.1 MỘT SỐ KHÁI NIỆM VỀ MÔ HỌC

2.1.1 Mô học

Là khoa học về cấu tạo hiển vi và siêu hiển vi của tất cả các cơ quan, bộ

máy trong cơ thể động vật

Cấu tạo chung của biểu mô

- Biểu mô gồm một hay nhiều lớp tế bào xếp khít nhau

- Dưới lớp biểu mô là lớp màng đáy

- Dưới lớp màng đáy là tổ chức liên kết mềm

- Biểu mô hiện diện ở hai mặt khô và ướt của cơ thể

Nhiệm vụ

- Biểu mô bảo vệ cơ thể hay bộ máy không bị tác động của ngoại cảnh làm tổn thương Khi bị tổn thương, chúng có thể hàn gắn và phát triển lại được

- Biểu mô phủ của một số cơ quan có khả năng hấp thu một số chất như: biểu mô ruột, biểu mô bàng quang,…

- Biểu mô phủ các tuyến tiết ra một số chất giúp cho quá trình sinh trưởng, phát dục và trao đổi của cơ thể Đó là biểu mô tuyến nội tiết và tuyến ngoại tiết

Phân loại biểu mô

Dựa vào chức năng và cấu trúc, người ta chia biểu mô làm hai loại là

biểu mô phủ và biểu mô tuyến

Biểu mô phủ: là những biểu mô lót mặt ngoài cơ thể hoặc phủ các xoang

tự nhiên trong cơ thể Ví dụ: Thành các ống tiêu hoá, ống tiết niệu…

Dựa vào số hàng tế bào kể từ màng đáy và hình dạng tế bào ở lớp trên cùng mà người ta chia biểu mô thành:

Biểu mô phủ đơn

+ Biểu mô phủ đơn lát: là lớp tế bào hình lát, dẹt, xếp sát vào nhau Rìa

tế bào có dạng răng cưa Nhân tròn nằm giữa tế bào và nằm nổi lên bề mặt biểu mô

+ Biểu mô phủ đơn hộp: là lớp tế bào có dạng hình hộp Nhân tròn to và nằm giữa tế bào

+ Biểu mô phủ đơn trụ: là lớp các tế bào hình trụ hay hình ống xếp xít nhau Ranh giới giữa các tế bào rõ Nhân tế bào hình tròn hoặc hình thoi nằm giữa hay thiên về cực đáy tế bào

Biểu mô phủ kép: có nhiều lớp tế bào, đươc chia thành:

+ Biểu mô phủ kép lát: có nhiều lớp tế bào dẹt, xếp chồng chất lên nhau Lớp tế bào trên cùng có hình lát dẹt Càng sâu hơn là những tế bào đa giác hay hình hộp Nhân nằm giữa tế bào Đôi khi lớp trên cùng hoá sừng

+ Biểu mô phủ kép trụ: lớp trên cùng có hình trụ, ở tầng sâu hơn có dạng hình hộp, đa giác, hình thoi… Nhân thiên về cực đáy tế bào

+ Biểu mô phủ kép trụ giả: chỉ có một lớp tế bào nhưng có một số tế bào không lên đến bề mặt biểu mô, nhân nằm ở đáy tế bào Những tế bào còn lại nhô lên trên bề mặt biểu mô, nhân nằm ở trên Do đó, khi nhìn vào tiêu bản giống như có hai hàng tế bào

+ Biểu mô phủ kép biến dị: có lớp tế bào trên cùng rất to, có thể giãn nở được Tế bào bên dưới hình đa giác

Biểu mô tuyến: là những tập đoàn tế bào chuyên hoá cao để thích nghi

với chức năng chế tiết và bài xuất

+ Tuyến đơn bào: chỉ có một tế bào tạo thành, mang cả hai nhiệm vụ chế tiết và bài xuất

+ Tuyến đa bào: do nhiều tế bào hợp lại tạo thành tuyến, có cấu trúc phức tạp, to nhỏ khác nhau Căn cứ vào tuyến có ống dẫn hay không có ống dẫn, người ta phân biệt:

Tuyến ngoại tiết: có ống dẫn chất tiết ra ngoài hay vào các xoang, ống thông với bên ngoài Tuyến ngoại tiết gồm: tuyến túi, tuyến ống, tuyến đơn, tuyến tạp

Tuyến nội tiết: chỉ có các tế bào chuyên làm nhiệm vụ chế tiết, không có

các vi huyết quản vào máu Các mao mạch tạo thành lưới chung quanh tuyến Tuyến nội tiết gồm: tuyến tản mác, tuyến túi, tuyến lưới

2.1.3.2 Tổ chức liên kết

Gồm ba thành phần: tế bào, chất gian bào, những sợi liên kết

Ngoài chức năng chống đỡ, mô liên kết còn có chức năng dự trữ, bảo vệ, vận chuyển các chất, sửa chữa và hàn gắn vết thương (Lâm Thị Thu Hương, 2005)

2.2 TỔNG QUAN VỀ CẤU TẠO VI THỂ

2.2.1 Thận

Thận là cơ quan bài tiết chủ yếu của cơ thể, hình hạt đậu, nằm hai bên cột sống, được bao bọc bên ngoài bởi một lớp tổ chức liên kết xen lẫn sợi đàn hồi Bên trong là nhu mô

Thận gồm hai miền: miền vỏ và miền tuỷ

Miền vỏ nhìn qua kính hiển vi có màu hồng với những hạt lấm chấm đỏ

Miền vỏ gồm các cột thận (hay trụ Bertin) là phần nhu mô chen giữa các tháp thận (tháp Malpighi) Các tháp Ferrein (phần tia tuỷ) như các lưỡi lê nhô từ đáy tháp thận tới bao thận Mỗi tháp thận có khoảng 300-500 tháp Ferrein Ở giữa các tháp Ferrein (tia tuỷ) là mê đạo

Miền tuỷ màu vàng, có nhiều khía Miền này có nhiều tháp Malpighi lớn (6-10 tháp), đỉnh tháp hướng vào bể thận, đáy quay về bề cong của thận (miền vỏ) Trên thận còn có vùng lõm gọi là rốn thận; có động mạch, tĩnh mạch và niệu quản thông với bể thận

Thận được cấu tạo bởi những đơn vị chức năng là ống sinh niệu hay còn gọi là đơn vị ống thận Chúng tập trung và xếp chồng chất lên nhau Mỗi ống sinh niệu dài khoảng 50 mm, nằm cả trong miền vỏ và miền tuỷ Số lượng ống sinh niệu thay đổi tuỳ loại gia súc, ở thỏ có khoảng 285 ống sinh niệu trên hai quả thận Xen kẽ các ống sinh niệu là tổ chức kẽ

Mỗi đơn vị thận gồm hai phần: tiểu thể thận (tiểu thể Malpighi) và phần thân ống

Tiểu thể Malpighi (tiểu thể thận) là một túi hình cầu, đường kính

khoảng 120 µ, bên trong xen kẽ những đơn vị thận có mô liên kết chứa nhiều mạch máu, mạch bạch huyết và dây thần kinh

Tiểu thể Malpighi bao gồm: tiểu cầu thận và xoang Bowman

Tiểu cầu thận: là đoạn đầu tiên của ống sinh niệu, có tiểu động mạch đi vào và tiểu động mạch đi ra Chúng đi kèm nhau để xuyên qua vỏ Bowman ở tại cực mạch quản Động mạch đi vào phân thành 4-5 nhánh, từ mỗi nhánh phân chia nhỏ ra thành một lưới mao mạch để nối với nhánh tương ứng với động mạch đi ra Đường kính động mạch vào lớn hơn đường kính động mạch

đi ra Mỗi lưới mao mạch được bọc ngoài bởi màng đáy chung Chùm các nhánh mạch quản gọi là cầu mao quản

Xoang Bowman: là túi bao quanh tiểu cầu thận, gồm hai lớp lá thành (lá ngoài) và lá tạng (lá trong) Lá tạng nằm sát cầu mao quản, là những tế bào

có nhánh (podocytes) bám vào màng đáy bao quanh cầu mao quản Lá thành bao ở ngoài có biểu mô là tế bào đơn lát, lót ngoài bởi màng đáy Ở cực niệu, biểu mô này nối tiếp với biểu mô đơn hộp của ống lượn gần Giữa lá thành và

lá tạng là xoang Bowman chứa nước tiểu đầu, sau đó đổ vào ống lượn gần tại cực niệu

Thân ống: gồm ống lượn gần, quai Henlé xuống, quai Henlé lên, ống

lượn xa, ống góp, ống Bellini (ống nhú)

Ống lượn gần là đoạn dài nhất của ống sinh niệu, đường kính khoảng 50-60 µ, nối với tiểu thể Malpighi, uốn khúc nhiều vòng xung quanh tiểu thể cùng với ống lượn xa Cấu tạo tế bào thành ống là biểu mô phủ đơn hộp, có khi hình tháp; bào tương có hạt ái toan nhỏ Nhân tế bào trơn, sáng nằm giữa

tế bào Cực đỉnh tế bào có lông hút có tác dụng hút nước, glucid và muối Phía cực đáy trong bào tương có những que nhỏ, song song với trục sinh lý gọi là que Heidenhein (là những tiểu vật dựng đứng có tác dụng lớn trong việc trao đổi chất, màng bào tương xen vào giữa tiểu vật nên khi nhuộm ăn màu tạo thành que, phía trên tiểu vật có bộ máy Golgi)

Quai Henlé xuống: đoạn nhỏ dài 4-10 mm, đường kính 10-17 µ, nối tiếp ống lượn gần, đâm thẳng vào miền tuỷ, đường kính thắt nhỏ lại Cấu tạo tế bào biểu mô đơn lát, nhân tế bào tròn, nổi lồi vào trong lòng ống

Hình 2.1: Cấu tạo hiển vi của đường dẫn niệu Quai Henlé lên: khi quai Henlé xuống đến miền tuỷ rồi quay trở lại miền vỏ bằng một đoạn có đường kính tương đối lớn hơn khoảng 25-40 µ và dài khoảng 9 mm gọi là quai Henlé lên Cấu tạo biểu mô đơn hộp, đỉnh không

có lông hút; bào tương có nhiều hạt ái toan; đám tế bào có nhiều tiểu vật và riboxom hình que ngắn Càng xa miền tuỷ tế bào thành ống càng nhiều Nhiệm

vụ là điều chỉnh lượng nước tiểu

Ống lượn xa: tiếp theo ống Henlé lên, uốn lượn quanh tiểu thể Malpighi, dài 4,5-5 mm, đường kính 35-53 µ Cấu tạo tế bào biểu mô đơn hộp,

tế bào xếp dày; bào tương sáng, có hạt ái toan, đáy tế bào có hình que cực đỉnh, có một ít lông hút ngắn Nhiệm vụ kiểm soát khối lượng, thành phần, nồng độ nước tiểu

Ống góp: tương đối thẳng đi xuống trong tháp Ferrein và tháp Malpighi, nó tiếp nhận nhiều các ống lượn xa, các đơn vị ống thân khác rồi đổ vào bể thận Cấu tạo biểu mô đơn hộp, tương đối thấp, thể tích lớn; bào tương sáng, nhân tròn nằm ở giữa Gồm hai loại tế bào: tế bào sáng ít vi nhung, ít tiểu vật; tế bào sẫm nhiều vi nhung, nhiều tiểu vật Nhiệm vụ hấp thu nước, làm đặc nước tiểu

Ống Bellini: tiếp sau ống góp, nằm trong tháp Malpighi, thuộc miền tuỷ

do các ống góp đổ vào tạo thành ống to, đường kính 60 µ trở lên, có cấu tạo biểu mô phủ đơn trụ Khi tiến gần bể thận, chúng biến thành biểu mô kép biến

dị

2.2.2 Niệu quản

Niệu quản là một ống nối tiếp với bể thận, dẫn nước tiểu đi ra từ bể thận

đổ vào bàng quang, được chia thành ba đoạn: đoạn bụng, đoạn hông, đoạn chậu Thành niệu quản gồm ba lớp:

Lớp niêm mạc: có cấu tạo biểu mô kép biến dị, có 5-6 lớp tế bào Biểu

mô gấp nếp làm cho lòng ống có dạng hình sao trên cùng có lớp tế bào màng láng (lớp tế bào to, bào tương đặc có nhiệm vụ chống thấm nước tiểu trở lại) Phía dưới là tổ chức liên kết thưa có nhiều sợi keo và sợi chun

Lớp cơ: cơ trơn chạy dọc phía trong, cơ vòng ở ngoài Gần đến bàng quang thì có ba lớp: cơ dọc trong, cơ vòng ở giữa và cơ dọc ngoài Nhiệm vụ

co bóp, đẩy nước tiểu từ thận đổ vào bàng quang

Lớp ngoài: là tổ chức liên kết chứa nhiều thần kinh và mạch quản dạng lưới

2.2.3 Bàng quang

Là túi tròn dài chứa nước tiểu từ niệu quản đổ vào, đầu trước to, đầu sau thon nhỏ, cổ bàng quang nối tiếp với niệu đạo qua cơ thắt niệu đạo – cổ bàng quang

Cấu tạo vi thể từ trong ra ngoài của bàng quang:

Lớp niêm mạc: có nhiều nếp gấp có khả năng co giãn cao, cấu tạo là biểu

mô phủ kép biến dị, bên trong có lớp tế bào màng láng Mỗi tế bào thường có hai nhân phủ kín kể cả khi bàng quang căng nước, kế là lớp tế bào hình thoi vuông góc lớp trên, phía dưới là lớp tế bào đa giác

Lớp đệm là tổ chức liên kết có nhiều sợi keo, ít sợi chun Dưới lớp đệm

là tầng cơ nêm mỏng Hạ niêm mạc là tổ chức liên kết thưa

Lớp cơ: gồm ba lớp cơ trơn là cơ dọc bên trong, cơ vòng ở giữa, cơ dọc bên ngoài Lớp giữa dày và liên tục, giữa các lớp không có tổ chức liên kết, các sợi cơ đi chéo làm các lớp nối chặt với nhau

Cổ bàng quang có cơ vòng bàng quang, cấu tạo bởi những bó cơ lớn Cơ vòng ngoài là cơ vân có tác dụng duy trì trương lực co thắt và đóng lỗ thông giữa bàng quang và ống thoát tiểu Cơ vòng trong là cơ trơn có tác dụng tống nước tiểu ra xuống niệu đạo

Lớp ngoài có cấu tạo là tổ chức liên kết

Phần trong xoang chậu: gồm có bốn lớp

Lớp niêm mạc có cấu tạo tế bào là biểu mô kép biến dị, có nhiều kẽ Lớp đệm có sợi keo và nhiều huyết quản

Lớp huyết quản (lớp hải miên) dày mỏng khác nhau, chứa nhiều đám rối tĩnh mạch, kẽ tĩnh mạch có nhiều sợi cơ trơn

Lớp tuyến: khác nhau tuỳ loại gia súc, đoạn sát bàng quang chứa tuyến tiền liệt

Lớp ngoài có tổ chức liên kết, gần vùng tuyến tiền liệt, lớp ngoài là tầng

cơ trơn mỏng, ngoài cơ trơn là lớp cơ vân niệu đạo và màng trắng

Phần dương vật: có ba lớp

Lớp niêm mạc cấu tạo là biểu mô phủ kép biến dị, gần ra ngoài là biểu

mô phủ kép lát

Lớp đệm dày mỏng không đều

Lớp hải miên có nhiều vách ngăn do tổ chức liên kết, huyết quản và sợi chun tạo thành, trên vách ngăn có nhiều sợi cơ trơn chạy dọc Kẽ chứa đầy máu và tạo thành đám rối tĩnh mạch phía dưới niêm mạc

Lớp màng trắng là lớp tổ chức liên kết bao quanh lớp hải miên

Ở gia súc cái

Niệu đạo ngắn và có ba lớp:

Lớp niêm mạc có cấu tạo biểu mô kép biến dị

Lớp đệm có nhiều sợi chun và nang kín lâm ba Lớp hải miên có nhiều tĩnh mạch tạo thành xoang hải miên

Lớp cơ rất dày, gồm hai lớp cơ trơn, lớp vòng bên trong, lớp dọc bên ngoài Gần niệu đạo lớp cơ này biến mất, phía ngoài lớp cơ trơn là lớp cơ vân rất dày

sắp xếp thành từng lớp và tuỳ tỷ lệ mô cơ, mô đàn hồi người ta phân loại động mạch ra ba loại: động mạch lớn, động mạch trung bình, động mạch nhỏ

2.2.5.1 Động mạch lớn (động mạch chun hay động mạch đàn hồi)

Động mạch lớn là những động mạch như động mạch chủ, động mạch đùi, động mạch dưới đòn Dưới mắt thường, chúng thường có màu vàng vì có nhiều sợi đàn hồi

Thành động mạch lớn gồm ba lớp: lớp trong, lớp giữa, lớp ngoài

Lớp áo trong: gồm lớp nội mạc có cấu tạo biểu mô phủ đơn lát; dưới nội mạc là lớp mô liên kết, chứa ít tế bào hình sao và sợi chun

Lớp phiến chun dày gồm những phiến chun nén chặt với nhau dạng dợn sóng xen với lớp cơ vòng Lớp phiến chun trong thường khó quan sát ở những động mạch lớn vì bắt màu tương tự những phiến sợi chun ở lớp áo giữa

Lớp áo giữa: động mạch càng lớn lớp này càng dày Gồm nhiều phiến chun xếp đồng tâm xen giữa với những lớp cơ vòng và tổ chức liên kết Động mạch càng lớn, những phiến chun càng chiếm ưu thế tạo thành lớp giới hạn ngoài Những tế bào cơ trơn có tác dụng làm co giãn những phiến sợi chun Lớp áo ngoài: là tổ chức liên kết chứa sợi keo, sợi chun chạy dọc theo chiều dài động mạch Ngoài ra còn có mạch máu và các sợi thần kinh

2.2.5.2 Động mạch trung bình (động mạch cơ)

Cũng gồm ba lớp như động mạch lớn, nhưng có một số khác biệt:

Lớp áo trong: cấu tạo biểu mô đơn lát Lớp tổ chức liên kết có phiến chun mỏng xen kẽ với cơ trơn Lớp phiến chun trong thấy rất rõ ở động mạch trung bình

Lớp áo giữa: gồm thành phần cơ trơn chiếm ưu thế xen với phiến chun mỏng và lớp phiến chun mỏng giới hạn ngoài

Lớp áo ngoài: là tổ chức liên kết

Lớp áo giữa: cấu tạo hoàn toàn là các sợi cơ trơn

Lớp áo ngoài: lớp tổ chức liên kết mỏng

Hình 2.2: Sự khác nhau giữa động mạch và tĩnh mạch

2.2.6 Tĩnh mạch

Tĩnh mạch dẫn máu từ lưới mao mạch đổ về tim Tĩnh mạch thường có lòng rộng, thành mạch mỏng hơn động mạch cùng cỡ, các phiến chun hướng vòng kém phát triển Vách tĩnh mạch có nhiều sợi keo, ít sợi cơ và sợi chun hơn ở động mạch Ngoài ra, tĩnh mạch còn có van tĩnh mạch

2.2.6.1 Tĩnh mạch lớn

Ở những tĩnh mạch lớn (tĩnh mạch chi hoặc thân) chịu đựng một áp suất lớn nên thành tĩnh mạch chắc chắn và cũng có ba lớp như ở động mạch

Lớp áo trong: khá phát triển nhưng mỏng hơn động mạch, chỉ có một lớp

tế bào nội mạc cấu tạo bởi biểu mô đơn lát, có cấu tạo đặc biệt là những van mỏng; lớp tổ chức liên kết mỏng, không có lớp chun trong

Lớp áo giữa: tương đối mỏng, chỉ có vài lớp cơ trơn xen lẫn với mô liên kết và sợi chun Sợi cơ có thể chạy vòng hoặc chạy dọc hoặc cả hai tuỳ loại tĩnh mạch (tĩnh mạch cửa, tĩnh mạch đùi )

Lớp áo ngoài: dày nhất so với áo trong và áo giữa, cấu tạo bởi tổ chức liên kết, chứa nhiều mạch máu Áo ngoài có nhiệm vụ làm bền thành tĩnh mạch và ngăn ngừa sự giãn tĩnh mạch

2.2.6.2 Tĩnh mạch trung bình

Phần lớn tĩnh mạch trong cơ thể là tĩnh mạch trung bình Lớp áo trong thường có lớp dưới nội mạc khá mỏng, đôi khi biến mất Áo ngoài rất phát triển Tĩnh mạch thường có van bên trong là những nếp gấp hình bán nguyệt,

do lớp áo trong và một lớp tổ chức liên kết tạo thành, đôi khi có cả sợi cơ trơn

Tĩnh mạch

Động mạch

Van tĩnh mạch ngăn máu chảy ngược chiều và tránh cho tĩnh mạch chịu trọng lượng của cả cột máu

2.2.6.3 Tĩnh mạch nhỏ

Tĩnh mạch nhỏ thành rất mỏng Áo ngoài tương đối dày hơn các lớp áo kia Áo giữa chứa một vài sợi cơ trơn, có khả năng co rút Những tĩnh mạch nhỏ (xương, màng não tuỷ, gan, lách ) đều không có lớp áo giữa

2.3 KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN TIÊU BẢN VI THỂ

Kính hiển vi là một phương tiện không thể thiếu trong nghiên cứu tổ chức học và tiêu bản có độ dày thích hợp cho phép quan sát được mẫu dưới kính hiển vi

Có nhiều phương pháp làm tiêu bản nghiên cứu: phương pháp xem tươi, phương pháp thực hiện tiêu bản cố định và nhuộm màu Trong các phương pháp trên, phương pháp thực hiện tiêu bản cố định và nhuộm màu là phương pháp phổ biến dùng trong xét nghiệm mẫu so với mẫu đối chứng

Phương pháp thực hiện tiêu bản cố định và nhuộm màu

Thực hiện tiêu bản vi thể cố định bằng phương pháp tiêu bản cắt lát và nhuộm kép bằng Hematoxylin và Eosin Y Phương pháp này tạo được những lát cắt mỏng, trong suốt của mô và cơ quan; cho phép quan sát dưới kính hiển

vi Tiêu bản sẽ được nhuộm bằng các thuốc nhuộm đặc hiệu Các phần của tiêu bản có màu sắc khác nhau giúp cho việc quan sát được dễ dàng

Tiêu bản vi thể cố định được thực hiện theo phương pháp này phải trải qua nhiều giai đoạn Cần phải thưc hiện tốt các giai đoạn trong quy trình mới đảm bảo thu được tiêu bản có chất lượng

2.3.1 Lấy mẫu

Là bước đầu tiên, có mục đích là lấy mô, cơ quan ở cơ thể sống hay đã chết và phải tuân thủ một số nguyên tắc:

- Mẫu lấy được phải tươi

- Động tác lấy mẫu phải nhẹ nhàng, tránh gây biến đổi do tác nhân cơ học

- Không dùng kẹp phẫu tích kẹp vào vùng cần nghiên cứu, không bóp mạnh, không rửa mẫu

- Khi cắt phải dùng dao sắc và cắt theo một hướng (đối với những mẫu lớn)

- Khi cắt xong phải cố định ngay trong hoá chất để tránh hiện tượng hoại

tử sau khi chết của tế bào

2.3.2 Cố định

Cố định để làm chết tế bào nhưng vẫn giữ được trong tình trạng giống như còn sống Công tác cố định tốt khi tế bào giữ được hình dáng, thành phần cấu tạo như khi còn sống và không làm xuất hiện những chi tiết mới

Việc chọn thuốc cố định và phương pháp cố định phụ thuộc vào bản chất của mô cần cố định, mục đích cần nghiên cứu, tính chất thuốc cố định

Thời gian cố định phụ thuộc vào từng loại mô và từng loại thuốc dùng để

cố định Nguyên tắc kéo dài thời gian cố định tốt hơn là rút ngắn (trừ một số thuốc cố định làm giòn mô)

Việc rửa mô sau khi cố định có tầm quan trọng lớn Nguyên tắc sau khi

cố định phải làm cho mô mất chất cố định càng sớm càng tốt, vì những chất cố định có ảnh hưởng đến việc nhuộm và bảo tồn tiêu bản Các chất cố định khác nhau có cách rửa mô khác nhau Có thể rửa ngang với thời gian cố định nếu rửa bằng nước Các dụng dịch cố định có chrome được rửa bằng dung dịch Iod

Nguyên tắc cố định mẫu

- Mẫu phải được cố định ngay sau khi lấy

- Không được làm dập, nát mẫu

- Mẫu không được cắt quá dày

- Dung dịch dùng để cố định phải đạt đúng nồng độ, thể tích dung dịch

cố định gấp 30-60 lần thể tích mẫu

- Thời gian cố định thích hợp 48-72 giờ

2.3.3 Khử nước

Phải khử nước vì paraffin không tan trong nước Vì vậy paraffin không

thể ngấm vào khối mẫu còn nước

Mục đích của việc khử nước là rút hết nước trong mẫu ra mà không làm

mô hoặc tế bào bị thay đổi về cấu tạo và vị trí Mẫu sau khi cố định được rửa nước Sau đó chuyển sang ngâm trong cồn 700 Mẫu sẽ được tiếp tục ngâm trong cồn có nồng độ cao dần đến cồn nguyên chất Thời gian khử nước tuỳ theo độ dày của mẫu

Dung dịch để khử nước là etylic, metylic, butylic, aceton

Muốn biết một mẫu đã khử hết nước, ta cho xylene vào lọ đựng mẫu đã rút cồn Nếu xylene vẫn trong chứng tỏ sự khử nước tốt Nếu xylene có hơi vẩn đục (màu trắng sữa) thì phải khử nước lại bằng cồn tuyệt đối

2.3.4 Tẩm dung môi trung gian của paraffin

Mục đích là dùng một dung môi của paraffin để đẩy cồn trong mô sau khi rút hết nước ra (vì paraffin cũng không tan trong cồn Dung dịch được sử dụng phải vừa hoà tan trong cồn vừa hoà tan trong paraffin Nên chuyển mẫu dần qua 2-3 lọ dung môi Thời gian ngâm mẫu thay đổi tuỳ theo loại mô và khối lượng mẫu

Các dung môi thường dùng là benzene, toluene, xylene, chloroform

2.3.5 Tẩm paraffin

Trước hết cần chọn loại paraffin tốt và thích hợp Paraffin chỉ có thể ngấm vào mẫu và loại xylen ra khi nó ở trạng thái lỏng Người ta khử dung môi trung gian bằng cách chuyển mẫu lần lượt vào những lọ paraffin tinh khiết

ở dạng lỏng

Thời gian tẩm lâu hay mau tuỳ vào kích thước và tính chất của mẫu: nếu mẫu nhỏ và lỏng lẽo thì tẩm 2-3 giờ, nếu mẫu to và cứng thì tẩm 24-36 giờ Mục đích của việc tẩm paraffin là làm cho mẫu và paraffin liên kết với nhau thành một khối thống nhất Nhờ vậy có thể cắt mẫu thành những lát mỏng theo mục đích nghiên cứu

2.3.6 Đúc khuôn

Đổ paraffin lỏng vào khuôn kim loại Nhúng ngay mẫu vào paraffin đang lỏng Dùng kẹp đã được làm nóng để định hướng mẫu theo ý muốn Sau vài phút, paraffin sẽ đông đặc lại và giữ mẫu ở nguyên vị trí Khi lớp vỏ ngoài paraffin đã đủ đông cứng, làm ướt cả khuôn vào trong bát đựng nước lạnh và chú ý không làm rạn, vỡ màng mỏng paraffin bên trên Khoảng 20-30 phút sau paraffin sẽ cứng lại và thuần nhất toàn bộ Cần tránh làm lạnh ngay khi

Đặt lưỡi dao vào máy khoá thật chặt, chỉnh độ nghiêng của lưỡi dao khoảng 150

-290 so với mặt khối paraffin

Cắt mẫu: bắt đầu cắt mẫu ở độ dày từ 10-12 µm Sau khi dãy mẫu đã ổn định thì chỉnh lại độ dày khoảng 6-7 µm Nếu quá trình tẩm paraffin tốt, lưỡi dao sắc và nhiệt độ phòng cắt thích hợp các lát cắt sẽ dính vào nhau thành dãy băng

Tốc độ tay quay vừa phải, không quá nhanh, không quá chậm nhưng phải dứt khoát

2.3.8 Tải tiêu bản lên lame

Để tải tiêu bản lên lame dùng nhiều loại dung dịch gồm: nước cất, dung dịch lòng trắng trứng pha với glycerin theo tỉ lệ 1:1 Trước khi trải tiêu bản lên lame phải làm tiêu bản giãn ra bằng cách đặt dãy băng lên chậu nước nóng ấm (400C) Sau đó đưa lame xuống vớt tiêu bản được chọn Mẫu được mang đi hấp ở 600

C trong 30 phút

2.3.9 Nhuộm kép Hematoxylin-Eosin Y

Ở tế bào sống, các thành phần cấu tạo của tế bào và mô có chỉ số chiết quang gần giống nhau nên khó phân biệt dưới kính hiển vi quang học Vì vậy việc nhuộm màu làm cho các thành phần này bắt màu khác nhau, tạo được sự tương phản giúp ta dễ quan sát

Về phương diện mô học, người ta chia thuốc nhuộm thành ra hai nhóm: nhóm thuốc nhuộm tự nhiên và thuốc nhuộm nhân tạo

Thuốc nhuộm tự nhiên là những loại được chiết xuất từ động vật hoặc thực vật như Carmine hay Hematoxyline

Thuốc nhuộm nhân tạo được chia làm ba nhóm: các chất base, các chất acid, các chất màu trung tính

Có nhiều phương pháp nhuộm màu

2.3.9.1 Sự nhuộm màu tăng, giảm dần

Nhuộm màu tăng dần được tiến hành bằng cách ngâm tiêu bản trong dung dịch nhuộm màu cho đến lúc tiêu bản bắt màu vừa đủ Nhuộm màu giảm

dần là nhuộm cho đến khi tế bào hoặc mô bắt màu thật thẩm rồi sau đó tẩy màu ở tiêu bản cho đến khi màu vừa ý

2.3.9.2 Sự nhuộm màu nối tiếp, đồng thời

Nhuộm màu nối tiếp là phương pháp nhuộm tiêu bản bằng cách chuyển tiêu bản qua các dung dịch thuốc nhuộm theo một trình tự

Nhuộm màu đồng thời được thực hiện bằng cách pha tất cả các thuốc cần nhuộm thành một dung dịch và nhuộm màu một lần Chú ý các thuốc sử dụng phải phù hợp với nhau, không chống nhau, những thuốc tham gia vào dung dịch phải có tác dụng với bào tương và vào nhân cùng một thời gian

2.3.9.3 Nhuộm màu trực tiếp, gián tiếp

Nhuộm màu trực tiếp là phương pháp được tiến hành khi thuốc nhuộm

có khả năng trực tiếp nhuộm vào tế bào và mô, không cần phải qua khâu làm

ăn màu

Nhuộm màu gián tiếp được tiến hành bằng cách trước khi nhuộm phải ngâm tiêu bản vào dung dịch làm ăn màu, sau đó ngâm vào dung dịch thuốc nhuộm

2.3.9.4 Nhuộm màu khác

Một số thuốc nhuộm khi bắt màu tế bào và mô có màu khác với màu dung dịch thuốc nhuộm Ví dụ: Toluidin có màu xanh lơ, khi nhuộm sẽ cho màu đỏ, còn các cấu trúc khác màu xanh lơ

2.3.10 Dán lamelle

Chuẩn bị lamelle, keo Canada Balsam, kim mũi giáo, giấy thấm

Sau khi dùng cồn lau sạch màu dư trên tế bào cần phủ lamelle với keo để bảo quản tiêu bản Đồng thời, keo còn làm tăng tính chiết quang để quan sát tế bào dễ dàng hơn

Nhỏ giọt keo lên lame gần mẫu Đặt lamelle lên lame có mẫu với độ nghiêng khoảng 450 Sau đó hạ dần lamelle xuống tránh làm xuất hiện bọt khí

sẽ ảnh hưởng đến quá trình quan sát mẫu Thao tác dán lamelle cần thực hiện nhanh để tránh sự xâm nhập của hơi nước trong không khí vào mô Ấn nhẹ cho keo lan đều ra Dùng vải thấm xylene lau sạch keo bị lan ra ngoài lamelle Sau khi dán phải kiểm tra dưới kính hiển vi; xem độ dày mỏng, độ bắt màu của mẫu

Đánh số hiệu ghi thông tin về tiêu bản vi thể vừa hoàn thành

Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 PHƯƠNG TIỆN

3.1.1 Địa điểm thực hiện

Đề tài được thực hiện tại phòng Mô học thuộc Bộ môn Thú Y, Khoa

Nông nghiệp và Sinh hoc ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ

Thời gian: từ ngày 03/05/2014 đến 30/09/2014

3.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị, hoá chất

3.1.2.1 Dụng cụ

- Chai, lọ, phễu, lame, lamelle

- Dao lam, kéo, kẹp

- Máy cắt vi mẫu, lưỡi dao cắt vi mẫu, kính hiển vi, tủ hấp, lò điện, bếp tải, bản đúc và thanh đúc mẫu, máy ảnh kỹ thuật số

3.1.2.2 Hoá chất

- Cồn 700, 800, 900, 1000

- Thuốc nhuộm: Hematoxylin, Eosin Y

- Xylene, formol, paraffin, acid acetic, keo Canada Balsam, nước cất

Hình 3.1: Một số dụng cụ và hoá chất thí nghiệm

Lame và lamelle Thuốc nhuộm

3.2 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

3.2.1 Lấy mẫu

Chọn thỏ đực có trọng lượng khoảng 2kg, khoẻ mạnh Thỏ được giết bằng cách tiêm không khí vào tĩnh mạch tai Tách nội tạng ra khỏi cơ thể và dùng kéo giải phẫu lấy các bộ phận: thận, niệu quản, bàng quang, niệu đạo, động mạch, tĩnh mạch

3.2.2 Cố định mẫu

Mẫu sau khi lấy phải được cố định ngay để tránh tình trạng bị thoái hoá,

hoại tử hay biến dạng do một số phản ứng sinh hoá của những enzyme nội bào hay do điều kiện bên ngoài tác động như vi sinh vật Cố định bằng dung dịch formol 10% do formol có đặc tính:

Vận tốc xuyên thấm, vận tốc cố định nhanh

Không làm co mẫu nhưng làm mẫu cứng lại

Bảo quản tốt cấu trúc tế bào

Làm tăng sự kiềm tính của cấu trúc khi nhuộm

Mục đích của giai đoạn này là giết thật nhanh tổ chức nhưng vẫn giữ nguyên hình dạng cấu trúc như tổ chức lúc còn sống Lúc đầu ngâm nguyên phần mẫu trong formol 10% trong 15 phút để ổn định tổ chức cho dễ cắt

3.2.3 Lấy mẫu nhỏ

Cắt nhỏ mẫu với kích thước 0,5 cm x 0,5 cm x 1 cm Tiếp tục cố định mẫu trong formol 10%, thời gian cố định khoảng 24 giờ nhưng thời gian này còn tuỳ thuộc vào nồng độ dung dịch, vận tốc xuyên thấm, vận tốc cố định của dung dịch, nhiệt độ môi trường, độ dày mỏng của mẫu, cấu trúc từng loại mẫu… Nếu cố định mẫu quá lâu, mẫu sẽ bị cứng, giòn Khi cắt và nhuộm tính bắt màu giảm, hình dạng tế bào bị nhăn nhúm Nếu cố định mẫu trong thời gian ngắn quá đến khi cắt sẽ dễ làm vỡ mẫu

3.2.4 Rửa mẫu

Mẫu sau khi được cố định xong phải được rửa lại bằng nước sạch Ta đặt mẫu vào trong chậu nước đặt dưới vòi nước chảy nhẹ liên tục trong 2 giờ Mục đích để loại trừ tất cả formol thừa trong mẫu Nếu formol còn sót lại sẽ kết hợp với Hematoxylin khi nhuộm sẽ tạo ra kết tủa màu đen sậm, làm phai màu mẫu nên không giữ mẫu được lâu; đồng thời dễ làm vỡ khối mẫu

Mật độ mẫu trong lọ không nên quá nhiều sẽ làm loãng nồng độ ảnh hưởng đến sự rút nước từ mẫu ra ngoài

Thường xuyên lắc đều lọ ngâm mẫu để tránh nước thoát ra từ trong mẫu lắng xuống ở đáy lọ

Để rút ngắn thời gian rút nước nhưng vẫn đảm bảo đạt yêu cầu nên tăng

số lọ ngâm hơn tăng thể tích cồn tuyệt đối

Nếu khử nước không tốt thì paraffin sẽ không thấm vào mẫu vì paraffin không tan trong nước Nếu mẫu còn nước đến khi cắt mẫu sẽ bể nát hoặc nứt

nẻ

3.2.6 Tẩm dung môi trung gian

Cồn có độ hoà tan paraffin thấp nên cần có dung dịch hoà tan paraffin cao hơn và tan trong cồn để paraffin ngấm vào tổ chức hoàn toàn, dung dịch trung gian là xylene Xylene loại cồn trong mẫu, làm tan paraffin để paraffin

dễ dàng ngấm vào và làm trong mẫu Tuy nhiên, xylene có thể làm cứng mẫu nếu ngâm mẫu quá lâu

Ngâm mẫu qua 2 lọ xylene, mỗi lọ ngâm trong 45 phút Ngoài xylene, ta

có thể sử dụng benzene, chloroform, toluene hoặc dầu thông nhưng có hạn chế khi sử dụng do benzene rất độc, chloroform ngấm chậm và làm trong mẫu kém, toluene và dầu thông thì rất hiếm

Cần chọn loại paraffin thích hợp tan trong các dung môi trung gian Paraffin thuần khiết là loại đặc, chắc, trắng đục, óng ánh, nóng chảy đều, dẻo

và dễ cắt Paraffin xấu là loại không thuần khiết, có nhiều bọt khí, tinh thể to, nóng chảy không đều, giòn khi cắt và có màu ngả vàng Paraffin thích hợp nhất có điểm nóng chảy khoảng 56-580C Không nên trộn paraffin thừa vào nhau sẽ làm paraffin không thuần khiết Paraffin chỉ có thể ngấm hoàn toàn vào mẫu và loại xylene ra khỏi mẫu khi nó ở trạng thái lỏng trong suốt quá trình tẩm, vì thế giai đoạn tẩm paraffin phải được tiến hành trong tủ sấy

Chuyển mẫu từ lọ xylene cuối vào các cốc chứa paraffin lỏng đặt trong

tủ sấy ở nhiệt độ 600C Chuyển mẫu qua hai cốc paraffin khác nhau, mỗi cốc tẩm trong 2 giờ

Lấy lọ paraffin đang lỏng đổ vào khuôn Dùng kẹp hơ nóng trên ngọn lửa

đèn cồn, gắp mẫu vào khuôn và định vị cấu trúc không gian của mẫu Sau 15 phút, ta tách khối paraffin ra khỏi khuôn kim loại và đúc mẫu khác

Dán nhãn, kí hiệu mẫu vào khối mẫu, 24 giờ sau mới có thể tiến hành cắt mẫu

ốc vi cấp của máy cắt, cắt thử mẫu ở độ dày 10 µm Sau đó giảm dần đến khoảng 3-5 µm

3.2.10 Tải – hấp mẫu

Chuẩn bị lame sạch, kim mũi giáo và dùng nước ấm khoảng 41-420C cho vào chậu thuỷ tinh Mục đích là làm căng mẫu từ từ Chú ý nếu nhiệt độ nước quá cao thì mẫu dễ tải nhưng khi bị gấp nếp sẽ khó can thiệp vì paraffin sẽ dính chặt vào kim mũi giáo, nếu nước không đủ nóng thì mẫu ít căng

Dùng kim mũi giáo đỡ mẫu vừa cắt được cho vào chậu nước ấm, tách mẫu từ dãy băng cho rời ra Chọn mẫu không bị rách, gấp nếp và có độ dày thích hợp Nếu mẫu bị gấp nếp thì dùng tay tỳ một bên nếp gấp, bên còn lại dùng kim mũi giáo tách nhẹ ra Thao tác phải nhẹ nhàng nếu không sẽ dẫn đến rách mẫu

Khi paraffin đã căng, lấy lame nghiêng nhẹ vớt mẫu, đặt mẫu sao cho ở giữa lame Thời gian tải mẫu phải nhanh để tránh sự tiếp xúc của tổ chức với nước sẽ làm cho tế bào trương phồng thì mẫu sẽ khó bắt màu, nhân tế bào sẽ biến đổi hình dạng

Sau khi tải mẫu cho lame vào tủ hấp, hấp ở 600 trong khoảng 25 phút