thử nghiệm khả năng điều trị bệnh do staphylococcus aureus của lá đại bi (blumea balsamifera l) trên chuột bạch (mus musculus domesticus)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG -oOo- NGUYỄN THỊ KIM NGÂN THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG ĐIỀU TRỊ BỆNH DO STAPHYLOCOCCUS AUREUS CỦA LÁ ĐẠI BI Blumea balsamifera L

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

-oOo-

NGUYỄN THỊ KIM NGÂN

THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG ĐIỀU TRỊ BỆNH

DO STAPHYLOCOCCUS AUREUS

CỦA LÁ ĐẠI BI (Blumea balsamifera L)

TRÊN CHUỘT BẠCH

(Mus musculus domesticus)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH THÚ Y

Cần Thơ, 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

(Mus musculus domesticus)

MSSV: 3103040 LỚP: DƯỢC THÚ Y K36

Cần Thơ, 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

Đề tài: “Thử nghiệm khả năng điều trị bệnh do Staphylococcus aureus của lá Đại bi (Blumea balsamifera L) trên chuột bạch (Mus musculus domesticus)” do sinh viên Nguyễn Thị Kim Ngân thực hiện tại phòng thí nghiệm

Dược lý (E009) và phòng thí nghiệm Vi sinh Thú y (E209) thuộc bộ môn Thú y, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ, từ tháng

07 đến tháng 11 năm 2013

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 Cần Thơ, ngày tháng … năm 2014

Huỳnh Kim Diệu

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

Duyệt khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

LỜI CẢM ƠN



Trong suốt quá trình học tập tại trường Đại Học Cần Thơ, quý thầy cô đã dìu dắt, ân cần truyền đạt những tri thức vô giá của mình cho chúng tôi, những tri thức ấy sẽ là hành trang cho chúng tôi vững bước vào đời Hôm nay, ước mơ của tôi đã thành sự thật, với sự phấn đấu của bản thân, tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Sự dạy dỗ, động viên và lo lắng của cha mẹ và những người thân trong gia đình chính là nguồn động lực thúc đẩy tôi nỗ lực và phấn đấu Trong tận đáy lòng tôi xin chân thành cám ơn những người thân yêu và kính dâng lên ông bà, cha mẹ lòng biết ơn sâu sắc, người đã dành trọn cả cuộc đời mình cho tôi cất bước đến trường

Xin chân thành cảm ơn cô Huỳnh Kim Diệu, người đã hết lòng chỉ dạy, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn để tôi có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Xin chân thành cảm ơn cô Châu Thị Huyền Trang trong suốt những năm qua đã luôn quan tâm, giúp đỡ và động viên để tôi có thể đạt được như ngày hôm nay

Xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất của tôi đến quý thầy cô bộ môn Thú y

và bộ môn Chăn nuôi đã hết lòng truyền đạt những kinh nghiệm và kiến thức quý báu cho tôi được rèn luyện, học tập trong suốt thời gian học Đại học

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến chị Nguyễn Thị Cẩm Quyên và các anh chị cao học Thú y K18 đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm

đề tài

Cám ơn tất cả bạn bè trong và ngoài lớp Dược Thú y K36, các anh chị sinh viên Thú y K35 đang làm đề tài tại phòng thí nghiệm đã giúp đỡ và cùng chia sẻ những vui buồn với tôi trong suốt thời gian học đại học và thực hiện đề tài Tôi

sẽ không bao giờ quên những kỉ niệm vui buồn bên mọi người trong suốt những năm học vừa qua

Trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp, mặc dù đã có rất nhiều cố gắng, tuy nhiên do thời gian có hạn và kiến thức còn hạn chế nên không tránh được những sai sót Rất mong nhận được sự quan tâm, góp ý của quý thầy cô để bài luận văn được hoàn thiện hơn

Nguyễn Thị Kim Ngân

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH BẢNG viii

DANH SÁCH HÌNH viii

TÓM LƯỢC ix

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 2

2.1 Giới thiệu về cây Đại bi 2

2.1.1 Thực vật học 2

2.1.2 Mô tả cây 2

2.1.3 Phân bố và sinh thái 4

2.1.4 Một số thành phần hóa học có trong cây Đại bi 4

2.1.5 Hoạt tính sinh học của các hoạt chất có trong cây Đại bi 8

2.1.6 Công dụng chữa bệnh của cây Đại bi 9

2.1.7 Một số chế phẩm từ cây Đại bi 10

2.2 Tình hình nghiên cứu cây Đại bi trong và ngoài nước 11

2.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 11

2.2.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 11

2.3 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 13

2.3.1 Lịch sử phát hiện 13

2.3.2 Đặc điểm hình thái 14

2.3.3 Đặc tính nuôi cấy 14

2.3.4 Đặc tính sinh hóa 15

2.3.5 Cấu trúc kháng nguyên 16

2.3.6 Điều kiện tăng trưởng và sự phân bố 16

2.3.7 Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus 17

2.3.8 Sức đề kháng 19

2.3.9 Tính kháng thuốc kháng sinh 20

2.3.10 Đặc tính gây bệnh 21

2.3.11 Một số nhiễm khuẩn do Staphylococcus aureus gây ra trên người 22

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Thời gian và địa điểm 24

3.1.1 Thời gian 24

3.1.2 Địa điểm 24

3.2 Nội dung nghiên cứu 24

3.3 Phương tiện nghiên cứu 24

3.3.1 Nguyên liệu 24

3.3.2 Dụng cụ, hóa chất chính 24

3.4 Phương pháp nghiên cứu 25

3.4.1 Phương pháp trồng cây 25

3.4.2 Phương pháp lấy mẫu Đại bi 25

3.4.3 Điều chế cao thô 25

3.4.4 Nuôi chuột 27

3.4.5 Pha vi khuẩn 27

3.4.6 Pha cao 27

3.4.7 Phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm trên môi trường Baird Parker 27

3.4.8 Bố trí thí nghiệm 27

3.4.9 Chỉ tiêu theo dõi 28

3.4.10 Phương pháp xử lý số liệu 29

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Tỷ lệ chuột còn sống sau khi điều trị bằng cao Đại bi 30

4.2 Triệu chứng lâm sàng của chuột trong quá trình thử nghiệm điều trị 32

4.3 Kết quả mổ khám chuột sau quá trình điều trị 34

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

5.1 Kết luận 41

5.2 Đề nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ CHƯƠNG 50

MRSA Methicillin resistant Staphylococcus aureus

TRAIL TNF-related apoptosis-inducing ligand

VRSA Vancomycin Resistant Staphylococcus aureus

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của lá Đại bi 7

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm điều trị bệnh nhiễm khuẩn do Staphylococcus aureus

của cao lá Đại bi 28 Bảng 4.1 Tỷ lệ chuột còn sống sau khi điều trị 30 Bảng 4.2 Kết quả bệnh tích trên chuột thí nghiệm sau quá trình điều trị 34

DANH SÁCH HÌNH

Trang Hình 2.1 Cây Đại bi Error! Bookmark not defined.

Hình 2.2 Hoa Đại bi 3

Hình 2.3 Cấu trúc Borneol 5

Hình 2.4 Cấu trúc Cryptomeridiol 6

Hình 2.5 Dược phẩm bào chế từ cây Đại bi 10

Hình 2.6 Trà Sambong 10

Hình 2.7 Staphylococcus aureus trên môi trường Baird Parker 15

Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết mẫu Đại bi 26

Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ chuột còn sống sau các ngày điều trị 32

Hình 4.1 Bệnh tích hoại tử vùng tiêm trước và sau khi điều trị 35

Hình 4.2 Phổi chuột xuất huyết 35

Hình 4.3 Gan chuột 34

Hình 4.4 Thận chuột 36

Hình 4.5 Lách chuột 36

Hình 4.6 Tích mủ ở xoang bụng chuột 35

Hình 4.7 Lách chuột tích mủ 37

Hình 4.8 Gan chuột tích mủ 37

Hình 4.9 Thận chuột tích mủ 37

Hình 4.10 Khuẩn lạc Staphylococcus aureus được phân lập từ gan sau 2 lần cấy

chuyển 38

Hình 4.11 Khuẩn lạc Staphylococcus aureus được phân lập từ thận và lách 38

Hình 4.12 Khuẩn lạc Staphylococcus aureus được phân lập từ phổi và tim 38

TÓM LƯỢC

Thử nghiệm trên chuột bạch được thực hiện để đánh giá khả năng điều trị bệnh nhiễm khuẩn Staphylococcus aureus của lá Đại bi (Blumea balsamifera L) Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm thức: 3 nghiệm thức điều trị và nghiệm thức đối chứng Mỗi nghiệm thức có 4 chuột với 3 lần lặp lại Tất cả chuột đều được gây nhiễm với vi khuẩn Staphylococcus aureus ở nồng độ

10 10 cfu/ml, liều 1 ml/con bằng đường tiêm xoang bụng Chuột ở các nghiệm thức điều trị 30 phút sau khi tiêm vi khuẩn được cho uống cao Đại bi (0,1 ml/con), nghiệm thức 1 (NT1) với liều 0,25 g/kg thể trọng, nghiệm thức 2 (NT2) với liều 0,5 g/kg thể trọng, nghiệm thức 3 (NT3) với liều 0,75 g/kg thể trọng, nghiệm thức đối chứng (NTĐC) cho chuột uống nước muối sinh lý

Kết quả ghi nhận về triệu chứng lâm sàng trên chuột: sau khi gây nhiễm, tất cả chuột ở các lô thí nghiệm có biểu hiện lười hoạt động, nằm co cụm lại, ủ

rũ, bỏ ăn uống, chuột có biểu hiện thở bụng, tim đập nhanh và thân nhiệt tăng từ

4 – 5 o C Sau 7 ngày điều trị bằng cao Đại bi, chuột ở NT3 hoạt động linh hoạt và nhanh nhẹn hơn, thân nhiệt và nhịp tim ổn định, chuột ăn uống nhiều hơn so với NT2, ở NT1 thì chuột có biểu hiện hồi phục chậm nhất

Về tỷ lệ khỏi bệnh: liều 0,75 g/kg thể trọng cho hiệu quả điều trị cao nhất với tỷ lệ khỏi bệnh là 100%, kế đến là liều 0,5 g/kg thể trọng với tỷ lệ khỏi bệnh

là 91,7%, tỷ lệ khỏi bệnh 75% với liều 0,25 g/kg thể trọng; so sánh với NTĐC không điều trị tỷ lệ chuột chết là 50%

Kết quả mổ khám cho thấy: ở các nghiệm thức điều trị, chuột không có bệnh tích mủ ở gan, lách, thận và phổi; so sánh với NTĐC bệnh tích này chiếm tỷ

lệ 50% Bệnh tích mủ dưới da và hoại tử vùng tiêm không thể hiện ở NT3; ở NT1

và NT2 bệnh tích này có tỷ lệ lần lượt là 22,2% và 9,1%; so sánh với NTĐC với

tỷ lệ 66,6% 100% chuột ở NTĐC có bệnh tích phổi xuất huyết; ở NT1, NT2 và NT3 bệnh tích này chiếm tỷ lệ lần lượt là 33,3%; 18,2% và 16,6% Bệnh tích gan, thận sưng, nhạt màu và lách sưng có tỷ lệ thấp nhất 8,3% ở NT3, tỷ lệ 18,2% ở NT2 và cao nhất là 33,3% ở NT1; so sánh với NTĐC với tỷ lệ 100%

Trong số 3 liều cao Đại bi được sử dụng điều trị thì liều 0,75 g/kg thể trọng có hiệu quả nhất, còn giúp 33,3% chuột tăng trọng 1 – 3 g sau điều trị

Từ khóa: Đại bi, điều trị, Staphylococcus aureus

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một nước nhiệt đới gió mùa có hệ thực vật vô cùng phong phú

và đa dạng, có nhiều cây cỏ với nhiều dược tính quý giá Từ ngàn đời, nhân dân

ta đã biết vận dụng những dược tính từ nguồn dược liệu tự nhiên trong phòng ngừa và điều trị từ những bệnh thông thường cho đến bệnh nan y

Với ưu điểm là ít tác dụng phụ đi kèm, những bài thuốc từ thảo mộc vẫn chiếm ưu thế đáng kể trong thời đại tây y phát triển hiện nay với phương pháp chữa trị ngày ngày đa dạng hơn

Cây Đại bi từ lâu đời đã được dân gian biết đến như một “thần dược” trị bách bệnh như: một số bệnh lý viêm có mủ, bệnh ho, viêm họng, đau lưng, thấp khớp và một số bệnh cảm lạnh thông thường Theo các tài liệu nghiên cứu mới hiện nay, ngoài đặc tính kháng viêm, kháng khuẩn, cao chiết lá Đại bi còn có tác dụng chống lại các tế bào ung thư gan, tác dụng làm hạ huyết áp và còn có khả năng điều trị được bệnh gout (Nguyễn Thị Mai Hương, 2010)

Song song đó, vi khuẩn Staphylococcus aureus được biết đến như một vi

khuẩn sinh mủ điển hình, thường hay gặp và hiện diện rất phổ biến trong môi trường chăn nuôi Loại vi khuẩn này có khả năng đề kháng với nhiều loại thuốc kháng sinh, gây thiệt hại không nhỏ cho ngành chăn nuôi

Với bối cảnh hiện nay, trong việc điều trị bệnh, kháng sinh tân dược có khả năng ức chế vi khuẩn mạnh, hiệu quả điều trị cao nhưng khi dùng thuốc một thời gian dài, vi khuẩn tạo sự đề kháng và kháng với nhiều loại thuốc kháng sinh

(Essawi et al., 2000)

Những năm gần đây xu hướng sử dụng thảo dược trong chữa trị bệnh trên động vật được xem như một giải pháp có biên độ an toàn, ít tốn kém và mang lại hiệu quả cao

Xuất phát từ tình hình thực tế, trong điều kiện cho phép chúng tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài: “Thử nghiệm khả năng điều trị bệnh do Staphylococcus aureus của lá Đại bi (Blumea balsamifera L) trên chuột bạch (Mus musculus domesticus)”

Mục tiêu của đề tài:

Xác định hiệu quả điều trị bệnh nhiễm khuẩn Staphylococcus aureus trên chuột bạch của cao lá Đại bi

Loài: Blumea balsamifera (L.) DC

Tên thường gọi: Đại bi

Tên khác: ở Việt Nam, cây Đại bi còn được gọi bằng những tên khác nhau tùy thuộc vào từng vùng miền như: băng phiến, mai hoa băng phiến, mai phiến, long não hương, mai hoa não, đại ngãi, ngãi phiến, từ bi xanh, từ bi (miền Nam),

bơ nạt, co nát (Thái), phặc phà (Tày).Ở một số nước trên thế giới, cây Đại bi còn được biết đến với những tên gọi như: sambong (Philippines), ngai-camphor

(Anh), camphrée (Pháp) (Đỗ Huy Bích và ctv., 2004)

Hình 2.1 Cây Đại bi

(http://images.yume.vn/blog/201207/12/1342071204_img_3635.jpg)

2.1.2 Mô tả cây

Đại bi là một loại cây nhỏ, thân thẳng, có chiều cao từ 1 – 2 m, thân có nhiều khía rãnh, phân cành ở ngọn và có lông bao bọc xung quanh, cây thường mọc thành bụi, thân cây trưởng thành có màu xám nâu và có đường kính khoảng 2,5 cm (Đỗ Tất Lợi, 2003)

Lá Đại bi có hình ê-lip, mọc so le nhau, phiến lá có hình bầu dục, dài từ 8 –

30 cm, rộng từ 3 – 6 cm, gân lá chằng chịt thành mạng lưới rất rõ ở hai mặt lá, mặt trên lá có màu lục sẫm và có ít lông, mặt dưới lá có màu trắng nhạt và có nhiều lông Mép lá gần như nguyên hay xẻ thành răng cưa và ở gốc lá thường có

từ 2, 4 hay 6 thùy nhỏ do phiến lá dưới bị xẻ quá sâu, lá xếp thành nhiều hàng, không đều nhau (Đỗ Tất Lợi, 2003) Khi vò lá ta sẽ thấy mùi thơm dễ chịu của

băng phiến (Zhari et al., 1999)

Cụm hoa gồm nhiều đầu màu vàng, trên hoa có nhiều lông tơ, hợp thành ngù ở kẽ lá và đầu cành, đầu hoa có đường kính từ 8 – 10 mm, cuống hoa ngắn Trong một cụm hoa thì có nhiều hoa cái ở xung quanh, ở giữa là hoa lưỡng tính, mào lông có màu gỉ sắt Tràng hoa cái hình ống có 3 răng cưa, tràng hoa lưỡng

tính gần như có hình trụ, có 5 răng và 5 nhị (Đỗ Huy Bích và ctv., 2004)

Hình 2.2 Hoa Đại bi

(http://www.balinghasai-farms.info/2012/09/04/blumea-balsamifera/)

Đại bi là cây thường xanh ra hoa quanh năm, đặc biệt có hoa nhiều vào tháng 3 đến tháng 5 Hoa Đại bi có mùi thơm mạnh mẽ nên vào mùa cây ra hoa thường thu hút nhiều côn trùng đến thụ phấn Quả Đại bi là loại quả bế và thường

có quả từ tháng 7 đến tháng 8 Quả Đại bi có túm lông ở đỉnh nên thường phát

tán xa nhờ gió (Đỗ Huy Bích và ctv., 2004)

2.1.3 Phân bố và sinh thái

Chi Blumea DC có khoảng 80 loài trên thế giới, phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á, châu Phi và châu Đại Dương Ở Việt Nam có 25 – 30 loài, trong đó có

cây Đại bi Loài này còn phân bố khá rộng rãi ở nhiều nước thuộc vùng Nam và Đông Nam Á, bao gồm: Ấn Độ, Malaysia, Thái Lan, Campuchia, Lào, Nam

Trung Quốc, đảo Hải Nam và Philippines (Perry, 1980; Osaki et al., 2005)

Ở Việt Nam, Đại bi là cây phân bố rộng ở hầu hết các tỉnh miền núi thấp (dưới 1000 m), từ trung du đến đồng bằng và nhiều đảo lớn Cây có đặc tính ưa

ánh sáng, thường sống từ 1 – 2 năm, cây Đại bi ưa mọc trên các vùng nương rẫy

cũ, đồi cây bụi hoặc ven rừng Cây mọc từ hạt thường có hoa ngay trong năm đầu

tiên Vào mùa đông cây rụng lá hoặc có thể tàn lụi (Võ Văn Chi và ctv., 1999)

Đại bi là loại cây rất dễ trồng và có khả năng thích ứng với điều kiện khí hậu tốt nên có thể xanh tốt quanh năm khi được chăm sóc cẩn thận Trồng cây trên đất tơi xốp, có đủ ánh sáng, bẻ các chồi của cây hoặc cắt khúc các thân cây dài 15 – 20 cm sau đó giâm xuống đất, các khúc thân sẽ tự đâm rễ và phát triển thành cây Cây sinh trưởng phát triển tốt trong điều kiện đất giàu dinh dưỡng và thoát nước tốt Bộ phận dùng là lá và rễ, thu hái quanh năm và rửa sạch, dùng tươi hoặc phơi, sấy khô Cây có khả năng tái sinh mạnh nên có thể tỉa cành và

tuốt lấy lá

2.1.4 Một số thành phần hóa học có trong cây Đại bi

Trong hệ thực vật ở Việt Nam có khoảng 657 loài, thuộc 357 chi và có 114

họ chứa tinh dầu Trong đó Đại bi là một trong số những loài thảo dược có chứa

nhiều tinh dầu (Lã Đình Mỡi và ctv., 2000) Thành phần chủ yếu của tinh dầu là

borneol, camphor và cineol Lá Đại bi chứa acid chlorogenic và rễ chứa 2 dẫn chất thiophene

Thành phần hóa học có trong tinh dầu Đại bi được chia ra thành 3 nhóm:

- Nhóm terpen gồm: borneol, camphor và cineol (Amornchai et al., 1997)

Một số thành phần khác cũng được phát hiện như: limonen, acid palmitic, acid myristic và dimethylether (Perry, 1980)

- Nhóm flavonoid gồm: 3-O-7’-biluteolin; trihydroxy-5’,7-dimethoxyflavonol; 3,4’,5-trihydroxy-3’,7-dimethoxyflavonol; 4’-methylether-3,3’,5,7-tetrahydroxy-4’-methoxyflavonol; 3’,7-dimethylether-3,4’,5-trihydroxy-3’,7-dimethoxyflavonol; 4’,7-dimethylether-3,4’,5-trihydroxy-

5’,6-dimethylether-2’,3,4-3’,7-dimethoxyflavonol; 4’,5-dihydroxy-3’,7-dimethoxyhydroflavonol (Ali et al.,

2005)

Theo tạp chí The Wealth of India (1948) xuất bản ở Ấn Độ, Đại bi ở Trung Quốc chứa chủ yếu là borneol

Hình 2.3 Cấu trúc Borneol

(http://www.ebi.ac.uk/chebi/searchId.do?chebiId=CHEBI:15394)

Borneol còn gọi là băng phiến, có công thức hóa học là C10H18O, là một tinh thể trông óng ánh và trắng như hoa mai do đó còn có tên gọi là mai hoa Điểm chảy 203 – 204oC, rất dễ thăng hoa, độ sôi 212oC Borneol có thể được tổng hợp từ tinh dầu thông

Theo y học cổ truyền, chất băng phiến có vị cay, đắng, tính mát, hơi hàn, qui kinh tâm, tỳ, phế

Theo nghiên cứu dược lý hiện đại, băng phiến có tác dụng kích thích nhẹ thần kinh cảm giác ngoại vi và làm giảm đau thần kinh Khi sử dụng đường uống, băng phiến được hấp thu nhanh qua màng ruột và thời gian thải ra một nửa lượng thuốc là 5,3 giờ Ngoài ra, chất băng phiến được chiết xuất từ cây Đại bi có tác dụng ức chế đối với các loại tụ cầu khuẩn, liên cầu khuẩn, song cầu phế viêm, trực khuẩn đại tràng và một số nấm gây bệnh ngoài da

Fazilatun et al (2001, 2004) đã cô lập được một số hợp chất như

dihydroquercetin-7,40-dimethylether từ chiết xuất ether; blumeatin và luteolin-7- methylether từ các chất chiết xuất chloroform; luteolin, luteolin-7-methylether, quercetin, 5,7,30,50-tetrahydroxyflavonol, blumeatin, và dihydroquercetin-40-methylether từ các chất chiết xuất methanol của Đại bi

Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Đại bi được thu hái tại Hà Nội, có chứa các thành phần chính là borneol (50,57%), camphor (18,71%), β-caryophyllen (10,06%), δ-cadinol (3,14%), patchoulen (2,99%) và veridiflorol (2,01%) Ở Hà Giang là borneol (57,8%), β-caryophyllen (8,27%), δ-cadiol (7,95%) và caryophyllen oxit (3,01%) Ở Đắc Lắc là camphor (70,05%), β-caryophyllen (10,54%), borneol (5,70%) và carvacrol (5,70%) (Nguyễn Thị Mai Hương, 2010)

Ngoài những thành phần hóa học được tìm thấy phổ biến trong cây Đại bi như trên, các nhà khoa học Thái Lan còn phát hiện ra những hợp chất có mặt với thành phần rất ít Cryptomeridiol được tìm thấy trong tinh dầu Đại bi, là một hợp

chất có tác dụng chống co thắt (Nijsiriet et al., 1985)

Hình 2.4 Cấu trúc Cryptomeridiol

(http://www.ebi.ac.uk/chebi/searchId.do?chebiId=CHEBI:67796

Ngoài ra cây Đại bi còn có chứa 2 hợp chất quercetin, nhưng thành phần

hóa học của 2 hợp chất này vẫn chưa được xác định (Asolkar et al., 1992)

Nazrul et al (2009), phân tích thành phần hóa học, xác định được 50 chất

được tìm thấy trong tinh dầu lá Đại bi Trong đó, các thành phần chính là: borneol (33,22%), caryophyllene (8,24%), ledol (7,12%), tetracyclo (5,18%), phytol (4,63%), thujopsene-13 (4,42%), caryophyllene oxit (4,07%), dimethoxydurene (3,59%), guaiol (3,44%), và γ-eudesmol (3,18%) Tác giả cho rằng, tinh dầu lá Đại bi là một hỗn hợp phức tạp Trong đó, một số chất đã có mặt với số lượng rất ít Do đó, thành phần hóa học trong tinh dầu lá Đại bi luôn luôn thay đổi tùy thuộc vào điều kiện địa lý, khí hậu và thổ nhưỡng nơi cây phân bố

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của lá Đại bi (Nazrul et al., 2009)

7 Limonen 0,19 32 Neocloven, dihydro 0,10

8 (E) Ocimen 1,16 33 β-Elemen 1,23

9 Linalool 1,31 34 Geranyl iso-valerat 0,07

10 Camphor 0,11 35 Ledol 7,12

11 Borneol 33,22 36 Gemaren-D-4-ol 0,22

12 Cuminal 0,06 37 Caryophyllen oxit 4,07

13 Perillaldehydre 0,22 38 Guaiol 3,44

14 Neryl acetat 0,4 39 Globulol 1,12

15 Perillol 0,09 40 2(1H)-Naptalen,

2.1.5 Hoạt tính sinh học của các hoạt chất có trong cây Đại bi

Chất flavonoid blumeatin (5,3’,5’-trihydroxy-7-methoxydihydroflavonol) khi tiêm xoang bụng cho chuột nhắt trắng gây nhiễm độc bằng CCl4, có tác dụng

ức chế sự gia tăng của các men alanin-aminotransferase trong huyết thanh và triglyceride trong gan, những tổn thương về tổ chức gan ở lô chuột dùng flavonoid blumeatin không nghiêm trọng bằng lô chuột đối chứng Trên chuột nhắt trắng gây ngộ độc bằng thioacetamid, dùng flavonoid blumeatin tiêm xoang bụng cũng có tác dụng ức chế sự gia tăng các men alanin-aminotransferase trong huyết thanh và triglyceride trong gan Các kết quả trên chứng tỏ flavonoid blumeatin có tác dụng bảo vệ gan đối với sự nhiễm độc do CCl4 và thioacetamid

gây nên ( Xu et al., 1993)

Ba chất sesquiterpen lactone chiết tách từ Đại bi (blumealactone A, blumealactone B và blumealactone C) đều có tác dụng chống ung thư đối với tế bào sarcom yoshida trên môi trường nuôi cấy Cao chiết từ Đại bi có tác dụng làm giảm khả năng gây đột biến của mitomycin C, dimethylnitrosamine và

tetracycline trên chuột nhắt trắng (Đỗ Huy Bích và ctv., 2004)

Nước sắc lá Đại bi khi tiêm vào tĩnh mạch của động vật thí nghiệm, xuất hiện hiện tượng hạ huyết áp do làm tim co bóp yếu và làm giãn mạch ngoại vi, hoạt động hô hấp của súc vật thí nghiệm được tăng cường có thể là do trung khu

hô hấp bị kích thích, đồng thời sức co bóp và trương lực của ruột và tử cung đều

giảm (Đỗ Huy Bích và ctv., 2004)

Trong số 288 chiết chất được chiết xuất từ 96 loại cây thuốc ở Việt Nam, các chiết chất methanol của Đại bi cho thấy tác động ức chế enzyme xanthine oxidase mạnh mẽ với giá trị IC50 ít hơn 20 μg/ml Điều này cho thấy, chiết chất từ

cây Đại bi có thể được sử dụng để điều trị bệnh gout (Nguyen et al., 2004)

Ngoài ra, Đại bi còn có tác dụng kháng histamine và kháng nấm Thành phần kháng histamine gồm có: acid rosmarinic, astragalin, nicotiflorin và bauereol Cao chiết bằng ethanol của Đại bi có tác dụng ức chế đối với nấm

Epidermothyton floccosum với nồng độ ức chế tối thiểu dưới 10 μg/ml (Đỗ Huy Bích và ctv., 2004)

Trong nghiên cứu được công bố trên tạp chí American Society of Hematology (2005), các nhà khoa học đã xác định được chất dihydroflavonol là một chất tự nhiên chiết xuất từ cây Đại bi có tác dụng làm chết tế bào ung thư trong bệnh bạch cầu Cũng trong năm 2005, các nhà khoa học thuộc trường đại học Nhật Bản đã cô lập được 2 ester sesquiterpenoid mới và 9 flavonoid từ cây

Đại bi, kết quả thử nghiệm cho thấy tác động ức chế plasmid của các chất này

2.1.6 Công dụng chữa bệnh của cây Đại bi

Dung dịch nước chiết xuất từ lá Đại bi được sử dụng trong thực phẩm, thức uống hoặc làm nước hoa, như một nguồn tanin (Perry, 1980)

Lá Đại bi có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, giải nhiệt, hạ sốt và làm

giảm đau (Asolkar et al., 1992)

Đại bi có tác dụng bảo vệ gan và làm hồi phục chức năng gan (Xu et al.,

1993) Tác dụng chữa cảm sốt, cảm cúm, làm ra mồ hôi dưới dạng thuốc xông Dùng ngoài, lá Đại bi được nấu với nước, sau đó ngâm rửa hoặc dùng lá tươi giã nát đắp tại chỗ lở loét, vết thương sưng đau (Lê Trần Đức, 1997)

Trong y học truyền thống Thái Lan và Trung Quốc, cây Đại bi điều trị được

các vết thương nhiễm trùng và bệnh rối loạn thận (Ruangrungsi et al., 1985; Zhari et al., 1999) Điều trị bệnh nhiễm trùng đường hô hấp và đau dạ dày

(ICRAF, 2009)

Thuốc đắp từ lá Đại bi giã nhỏ còn được dùng để điều trị bệnh trĩ Giã nhỏ cây, trộn chung với rượu còn được dùng để xoa bóp cho trường hợp đau cơ, đau

khớp (Ruangrungsi et al., 1985; ICRAF, 2009)

Ở Thái Lan, lá Đại bi được thái nhỏ phơi khô rồi cuộn thành điếu thuốc để hút chữa bệnh viêm xoang Ở Trung Quốc, lá Đại bi dùng làm thuốc chữa đầy

hơi và diệt giun sán (Nadkarni et al., 1976) Ở Ấn Độ, lá Đại bi dùng chữa bệnh

mất ngủ, trạng thái tâm thần bị kích thích Ở Philippines, Đại bi được sử dụng

như một loại trà và có tác dụng chữa bệnh cảm lạnh (Amornchai et al., 1997) Ở

Việt Nam, lá Đại bi được sử dụng như là một loại thuốc lợi tiểu, chữa bệnh sỏi thận, bệnh nhiễm trùng đường tiểu và có tác dụng làm hạ huyết áp (Santos, 1981)

Đại bi có vị cay, đắng, tính ôn, mát vào tâm, tỳ, phế, làm thông khiếu và làm tan máu ứ Chữa bệnh đột ngột bị cảm ngất không tỉnh, chữa chứng phong thấp hoặc chứng đau nhức, đau bụng, lạnh da và đi ngoài nhiều lần (Võ Văn Chi, 2003)

Lá Đại bi còn được dùng để tắm cho em bé và phụ nữ sau khi sinh Nước sắc lá Đại bi chữa đầy bụng, ăn uống khó tiêu, ho nhiều đờm Ngoài ra nước sắc

từ lá và rễ cây dùng để làm giảm sốt và trị đau dạ dày (Ahmad et al., 2003)

Lá và rễ cây Đại bi có tác dụng hạ nhiệt rõ đối với mô hình gây sốt thực

nghiệm bằng men bia (Đỗ Huy Bích và ctv., 2004)

Hơn nữa, cây Đại bi là một cây thuốc được biết đến với nhiều công dụng bao gồm cả tác dụng chống béo phì ở người (Hiroaki Kubota et al., 2009)

2.1.7 Một số chế phẩm từ cây Đại bi

Ở Philippines, cây Đại bi được bào chế thành rất nhiều loại thuốc dạng viên nén, viên nang để điều trị bệnh sỏi thận hoặc phục hồi chức năng thận Ngoài ra, một số loại trà thanh nhiệt, trà túi lọc, cồn xoa bóp với tên Sambong, cũng có chứa các thành phần hóa học của lá Đại bi

Ở Đức, các nhà hóa học đã sản xuất ra một loại thuốc chống kiến từ chất borneol có trong dịch chiết lá Đại bi Loại thuốc này không độc, chỉ làm mất những mùi đánh dấu quan trọng của kiến, làm cho chúng mất phương hướng và

2.2 Tình hình nghiên cứu cây Đại bi trong và ngoài nước

2.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nguyễn Thị Mai Hương (2010) đã nghiên cứu về thành phần hóa học của

cây Đại bi Kết quả nghiên cứu cho thấy, cao cây Đại bi có khả năng ức chế

enzyme xanthine oxidase gây ra bệnh gout

Nghiên cứu tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn của dịch chiết lá Đại bi trên chuột nhắt trắng Khi dùng dịch chiết lá Đại bi với liều 40 g/kg thể trọng, cho

chuột uống có tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn do vi khuẩn Streptococcus pneumoniae gây ra (Nguyễn Thị Nghi Trung và ctv., 2010)

Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm của dịch chiết cỏ Ngũ sắc

và Đại bi trên chuột nhắt trắng Cỏ Ngũ sắc và Đại bi có tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm trên mô hình viêm xoang mũi trên chuột nhắt trắng gây ra bởi

Streptococcus pneumoniae và mô hình gây u hạt thực nghiệm (Nguyễn Thái Linh

và ctv., 2010)

Lê Thị Minh Dung và ctv (2012), khảo sát tác dụng của Đại bi trên mô

hình gây tăng acid uric máu ở chuột nhắt trắng Nghiên cứu cho thấy cao chiết bằng cồn và nước cất của lá Đại bi có hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase

và có tác dụng hạ acid uric máu trên thực nghiệm Kết quả này làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng Đại bi trong hỗ trợ điều trị bệnh gout

Trần Thị Thúy Quỳnh và ctv (2012), nghiên cứu về thực vật học và thành phần hóa học của cây Đại bi Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng: hàm lượng chất

chiết trong dược liệu Đại bi theo phương pháp chiết nguội với dung môi ethanol 96% là 10,02% Qua định tính sơ bộ cho thấy, trong cây Đại bi có chứa flavonoid, tinh dầu, triterpenoid, coumarin, tanin, saponin, chất khử và hợp chất polyuronic

2.2.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Từ lá cây Đại bi, các nhà khoa học Thái Lan đã cô lập được hợp chất

cryptomeridiol là thành phần chính của thuốc chống co thắt (Nijsiriet et al.,

1985)

Amornchai et al (1997), nghiên cứu về thành phần hóa học và tác động

kháng khuẩn của tinh dầu Đại bi Đại bi có hàm lượng tinh dầu cao và chứa một lượng đáng kể dầu long não Lá Đại bi cũng được sử dụng như một loại trà ở Philippines và điều trị bệnh cảm lạnh Tinh dầu từ lá có chứa borneol, camphor

và cineol

Ragasa et al (2005) đã cô lập được các chất ichthyothereol acetat,

cryptomeridiol, luteolin và β-caroten từ lá cây Đại bi Sau khi thử nghiệm, nhóm tác giả đã chỉ ra hợp chất ichthyothereol acetat có hoạt tính cao hơn hợp chất

cryptomeridiol và luteolin đối với một số chủng nấm như: Aspergillus niger, Trichophyton mentagrophytes và Candida albicans

Haseqawa et al (2006) nghiên cứu và chỉ ra rằng dihydroflavonol BB-1,

một chiết chất từ cây Đại bi, tác động như một yếu tố kháng lại quá trình gây chết tế bào (TRAIL) trong tế bào bạch cầu Kết quả này gợi ý cho việc kết hợp giữa dihydroflavonol BB-1 và TRAIL có thể là một chiến lược mới cho điều trị bệnh ung thư

Norikura et al (2008) đã công bố về tác động chống ung thư của chất

methylhydroxide được chiết xuất từ cây Đại bi Methylhydroxide tác động ức chế các biểu mô tế bào ung thư gan ở chuột mà không có khả năng gây độc đối với tế bào gan chuột bình thường

Hiroaki Kubota et al (2009) đã công bố về tác dụng chống béo phì, chống

viêm và chống đái tháo đường của dịch chiết lá Đại bi

Nazrul et al (2009), nghiên cứu về thành phần hóa học của lá cây Đại bi,

kết quả phân tích được 50 chất hóa học có trong tinh dầu lá

Liang Zhu et al (2011) đã nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt động

kháng khuẩn của tinh dầu Đại bi thông qua chưng cất hơi nước của các mẫu thu thập từ dãy núi Shiwang ở tỉnh Quảng Tây, Trung Quốc Trong số 65 hợp chất được xác định trong dầu, các hợp chất chính là borneol (13,6%), β-caryophyllene (9,56%), germacrene D (9,09%), sabinene (6,37%) và các cấu

tử chính (4,78%) Hoạt tính kháng khuẩn cho thấy tinh dầu (1.000 mg/đĩa) có khả năng kháng khuẩn đối với một số tác nhân gây bệnh, vùng ức chế lớn với đường kính vòng vô khuẩn (21,5 mm, 23,4 mm, 23,8 mm) và giá trị MIC (125

mg/ml, 62,5 mg/ml) ức chế vi khuẩn Gram âm (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli), vi khuẩn Gram dương (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus) và men (Hansenulaanomala)

Dong Gu Lee et al (2012), phân tích hợp chất apigenin

(4',5,7-trihydroxyflavonol) trong trong cây Đại bi, và khả năng ức chế hoạt động enzyme aldose reductase trong mắt chuột Kết quả cho thấy, apigenin có tác động ức chế enzyme aldose reductase cao với giá trị IC50 là 4,03 μM Tác giả cho rằng, Đại bi có thể là nguồn thảo dược tự nhiên chứa nhiều apigenin có

tác dụng chống lại biến chứng của bệnh tiểu đường

2.3 Vi khuẩn Staphylococcus aureus

Hình 2.7 Vi khuẩn Staphylococcus aureus

(http://vi.wikipedia.org/wiki/Staphylococcus_aureus)

Staphylococcus aureus do Robert Koch (1843 – 1910) phát hiện vào năm

1878 được phân lập từ mủ ung nhọt và Louis Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời kì đầu của lịch sử ngành vi sinh vật học

Năm 1926, Julius von Daranyi là người đầu tiên phát hiện mối tương quan giữa sự hiện diện của men coagulase huyết tương của vi khuẩn với khả năng gây bệnh của nó Tuy nhiên, mãi đến năm 1948 phát hiện này mới được chấp nhận rộng rãi

2.3.2 Đặc điểm hình thái

Staphylococcus aureus là vi khuẩn hình cầu, đường kính 0,7 – 1 μm, không

di động, không sinh nha bào, thường không có vỏ nhày và không có lông (Gotz, 2006)

Trong bệnh phẩm, tụ cầu khuẩn thường xếp thành từng đôi, từng đám nhỏ hình chùm nho Trong canh khuẩn, chúng thường xếp thành từng đám giống hình

chùm nho

Khi nhuộm bằng phương pháp nhuộm Gram, vi khuẩn bắt màu Gram dương

2.3.3 Đặc tính nuôi cấy

Tụ cầu sống hiếu khí hoặc hiếu khí tùy tiện, nhiệt độ thích hợp từ 32 –

37oC, pH thích hợp từ 7,2 – 7,6 Dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường

Môi trường nước thịt

Sau khi cấy 5 – 6 giờ vi khuẩn đã làm đục môi trường, sau 24 giờ môi trường đục rõ hơn, không có màng, lắng cặn nhiều, màu trắng rồi từ từ chuyển sang vàng

Môi trường Gelatin

Cấy môi trường theo đường cấy trích sâu, nuôi ở nhiệt độ 20oC sau 2 – 3 ngày gelatin bị tan chảy ra tạo thành phễu ở giữa, phần đản bạch ở keo bị tan là

do một thứ men làm tan keo Staphylococcus aureus làm tan gelatin rất rõ

Môi trường thạch máu

Vi khuẩn mọc rất tốt, sau khi cấy 24 giờ vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc tròn, lồi, nhẵn, và đục mờ Nếu là tụ cầu loại gây bệnh sẽ gây hiện tượng dung huyết dạng β xung quanh khuẩn lạc Khuẩn lạc có thể sinh sắc tố trong, vàng hoặc vàng chanh (Carter, 1975)

Môi trường thạch thường

Sau khi cấy 24 giờ, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc tương đối to, dạng S (Smouth), mặt khuẩn lạc hơi ướt, bờ nhẵn đều, khuẩn lạc có màu trắng, vàng thẫm hay vàng chanh Màu sắc khuẩn lạc là do vi khuẩn sinh ra, sắc tố này không tan trong nước, căn cứ vào màu sắc khuẩn lạc, Nguyễn Vĩnh Phước (1977) và

Taylor (1992) cho rằng chỉ có khuẩn lạc của Staphylococcus aureus có màu vàng

thẫm là có độc lực và có khả năng gây bệnh cho động vật, còn khuẩn lạc màu

vàng chanh và màu trắng không có độc lực và không gây bệnh

Môi trường thạch Chapman

Đây là môi trường đặc biệt dùng để nuôi cấy và phân lập tụ cầu

Môi trường chapman còn gọi là môi trường MSA (mannitol salt agar), là môi trường thạch có 75‰ muối ăn và 10‰ mannitol màu vàng cam Khi cấy tụ cầu vào môi trường thạch chapman nếu là tụ cầu gây bệnh sẽ lên men đường mannitol làm pH thay đổi (pH =6,8) môi trường chapman trở nên vàng, nếu là tụ cầu không gây bệnh, sẽ không lên men đường mannitol (pH=8,4) môi trường

chapman không đổi màu (Mary et al., 2002)

Môi trường BP (Baird Parker)

Khuẩn lạc đặc trưng của Staphylococcus aureus có màu đen nhánh, bóng,

lồi, đường kính 1 – 1,5 mm, quanh khuẩn lạc có màu sáng rộng 2 – 5 mm do khả năng khử potassium tellurite K2TeO3 và khả năng thủy phân lòng đỏ trứng của

lethinase (Rosamund et al., 1995; Mary et al., 2002)

Hình 2.8 Staphylococcus aureus trên môi trường Baird Parker

Các phản ứng khác: indol âm tính, H2S âm tính, MR dương tính, hoàn

nguyên nitrat thành nitrit (Tô Minh Châu và ctv., 2001)

Vi khuẩn có thêm men phosphatase và deoxyribonuclease là enzyme phân giải DNA

2.3.5 Cấu trúc kháng nguyên

Cấu trúc kháng nguyên của Staphylococcus aureus là hỗn hợp của hơn 30

loại kháng nguyên Kháng nguyên bề mặt ở thành tế bào gồm: kháng nguyên thân O chủ yếu gồm 2 loại là peptidoglican và protein A

- Peptidoglican là một polysaccharide của thành tế bào có tác dụng giữ cho thành tế bào vững chắc đồng thời kích thích monocyte sản xuất interleukin để lôi cuốn thực bào thực hiện quá trình thực bào Peptidoglican kích thích cả hai loại miễn dịch tế bào và dịch thể

- Protein A là kháng nguyên đặc biệt có ở các chủng Staphylococcus aureus, 90% protein A được tạo thành trong tế bào kết hợp với peptidoglican Ở

hầu hết các loại động vật protein A kích thích tạo kháng thể kết hợp bổ thể

Sở dĩ kháng nguyên này mang tên protein A là vì protein này gắn được phần Fc của IgG, điều này dẫn tới làm mất tác dụng của IgG, chủ yếu là mất đi opsonin hóa (opsonisatin) nên làm giảm thực bào Sự gắn Fc của IgG cũng làm mất đi vị trí để bổ thể có thể gắn trên bề mặt và hoạt hóa theo đường thay đổi,

làm giảm tác dụng bảo vệ cơ thể Những Staphylococcus aureus sản sinh ra nhiều

protein A thì tác dụng thực bào giảm đi rõ rệt (Lê Huy Chính, 2003)

Kháng nguyên adherin (yếu tố bám): giống như nhiều loại vi khuẩn khác, tụ cầu có bề mặt protein đặc hiệu, có tác dụng bám vào receptor đặc hiệu tế bào và adherin có thể là các protein: laminin, fibionectin, collagen Sự bám này có liên quan đến sự định vị của tụ cầu trên mô, sự xâm nhập và chống thực bào (Tô

Minh Châu và ctv., 2001)

2.3.6 Điều kiện tăng trưởng và sự phân bố

Staphylococcus aureus lây nhiễm từ người chế biến, động vật bị nhiễm

bệnh, được xếp vào nhóm vi khuẩn cơ hội vì nó có mặt rộng rãi và thường xuyên

trong mô chờ đợi điều kiện thuận lợi để xâm nhập Staphylococcus aureus

thường ký sinh trên da, niêm mạc người và gia súc Khi sức đề kháng cơ thể kém, hoặc tổ chức cơ thể bị tổn thương vi khuẩn xâm nhập và gây bệnh (Nguyễn Như

Thanh và ctv., 1997)

Staphylococcus aureus có thể phát triển gây bệnh lên đến 90% trên da,

lông chó và một nghiên cứu khác về hệ vi sinh trên da và lông chó đã tìm ra

Staphylococcus aureus (Krogh et al., 1976)

Trên động vật, vi khuẩn hiện diện trên các sản phẩm động vật như thịt, sữa

chưa được tiệt trùng (Werckenthin et al., 2001) Theo El-jakee et al (2008), trong số 409 mẫu điều tra, chủng Staphylococcus aureus hiện diện trên người

Nhu cầu dinh dưỡng cho sự phát triển của Staphylococcus aureus thay đổi tùy thuộc vào từng dòng, Staphylococcus aureus có khả năng phát triển trong

khoảng nhiệt độ rất rộng, từ 7 – 48oC, với nhiệt độ cực thuận là 30 – 45oC, khoảng pH từ 4,2 – 9,3 với độ pH cực thuận là 7 – 7,5 và trong môi trường chứa trên 15% NaCl Tụ cầu bền vững khi có nồng độ đường cao, nhưng bị ức chế bởi nồng độ 60%, nồng độ đường từ 33 – 35% tụ cầu vẫn phát triển, trong khi các vi

khuẩn khác như Shigella và Salmonella bị ức chế

Ngoài ra, chúng còn có khả năng bám dính tốt trên nhiều loại tế bào và máy móc thiết bị giúp gia tăng tính kháng của tụ cầu với sự sấy khô và lọc thấm

Chính nhờ những đặc điểm trên giúp Staphylococcus aureus có sự phân bố rộng,

chủ yếu được phân lập từ da, màng nhày, tóc và mũi của người và động vật máu

nóng Staphylococcus aureus được cho là vi khuẩn khá mạnh có thể sống tốt bên

ngoài ký chủ Vi khuẩn này có mặt trong không khí, bụi và trong nước mặc dù chúng thiếu tính di động và rất nhạy với thuốc kháng sinh và chất diệt khuẩn

Tuy nhiên, Staphylococcus aureus cũng khá nhạy với nhiệt độ, bị diệt ở 60oC từ

2 – 50 phút tùy từng loại thực phẩm và là vi sinh vật cạnh tranh yếu, dễ bị các vi

sinh vật khác ức chế (Bremer et al., 2004)

Theo ước tính có khoảng 10 – 50% dân số vẫn sống khỏe mạnh dù mang

Staphylococcus aureus (Bremer et al., 2004) Tuy nhiên, khả năng nhiễm vào thực phẩm và gây bệnh của Staphylococcus aureus cũng rất lớn do chúng phân

bố ở khắp nơi và có khả năng sinh độc tố Tụ cầu nhiễm vào thực phẩm chủ yếu qua con đường chế biến có các công đoạn tiếp xúc trực tiếp với người Sự hiện

diện với mật độ cao của Staphylococcus aureus trong thực phẩm cho thấy điều

kiện vệ sinh của quá trình chế biến kém, kiểm soát nhiệt độ trong các công đoạn chế biến không tốt Tuy nhiên, điều đó không đủ bằng chứng để cho rằng thực

phẩm đó sẽ gây độc, nó chỉ xảy ra khi Staphylococcus aureus được phân lập tạo độc tố Ngược lại, chỉ với một lượng nhỏ Staphylococcus aureus tạo độc tố cũng

có thể gây độc (Reginald et al., 2001)

2.3.7 Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus

Theo Kenneth Todar (2005), vi khuẩn Staphylococcus aureus tạo ra nhiều

Yếu tố xâm lấn

- Hemolysin: α-toxin (α-hemolysin): đây là độc tố khử màng mạnh nhất của

Staphylococcus aureus β-toxin: đây là một mạch enzyme phân hủy màng giàu

lipid, γ-toxin: là một độc tố có peptide nhỏ, có thể phân hủy một số dạng tế bào khác nhau

- Leukocidin: độc tố này gây độc cho bạch cầu người và thỏ, không gây độc cho bạch cầu động vật khác, làm hoại tử da thỏ

- Hyaluronidase: làm giảm chất gian bào của tế bào chủ và có thể giúp tụ cầu lan rộng sang các vùng xung quanh

- Coagulase: coagulase là một enzyme ngoại bào sẽ gắn với prothrombin trong tế bào chủ hình thành phức hợp staphylothrombin Coagulase là một chỉ thị

thường dùng để phát hiện Staphylococcus aureus ở các phòng thí nghiệm

(Kenneth Todar, 2005)

- Staphylokinase: đây là yếu tố phân giải fibrin Một phức hợp sẽ được hình thành giữa staphylokinase và plasminogen kích hoạt hoạt tính phân giải protein giúp phân hủy fibrin

- β-lactamase: enzyme này được biết đến như một độc tố giúp vi khuẩn kháng lại kháng sinh

- Một số enzyme ngoại bào khác: TNase: là enzyme kháng nhiệt, có khả năng hidro hóa DNA và RNA của tế bào chủ DNase, protease, lipase: cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn FAME: là enzyme rất quan trọng ở những chỗ bị

áp xe, đó là nơi chúng có thể biến đổi những lipid kháng khuẩn và kéo dài sự sống của vi khuẩn

Độc tố ruột enterotoxin (SE) của Staphyloccus aureus

Staphylococcal enterotoxin (SE) là những chuỗi protein đơn có trọng lượng phân tử thấp, từ 25000 – 29000 dalton, mỗi chuỗi có những kháng nguyên chuyên biệt Đặc điểm chính trong cấu trúc của độc tố là vòng cystein ở giữa phân tử Theo sau vòng cystein là chuỗi acid amin cần thiết, ban đầu người ta nghĩ rằng trình tự này là vị trí hoạt động, nhưng những thí nghiệm thay thế amino acid vẫn chưa xác nhận được điều này

SE là những protein đơn giản, hút ẩm, dễ tan trong nước và nước muối, là những protein cơ bản, độ đẳng điện pI là 7 – 8,6 trừ SEG và SEH có độ đẳng điện pI tuần tự là 5,6 và 5,7 Dù có một mức độ tương đồng giữa các SE, nhưng vẫn có sự khác nhau giữa các trình tự amino acid làm cho các độc tố có vị trí

kháng nguyên khác nhau (Scott et al., 2000)

SE giàu lysine, acid aspartic, acid glutamic và tyrosine Hầu hết có vòng cystine tạo cấu trúc thích hợp có thể liên quan đến hoạt tính gây nôn Chúng có tính ổn định cao, kháng với hầu hết các enzyme phân hủy protein và vì thế chúng giữ được hoạt tính trong đường tiêu hóa sau khi được ăn vào bụng Chúng còn

kháng với chymotrypsin, rennin và papain (Yves Le Loir et al., 2003) Đặc biệt,

tính bền nhiệt là một trong những tính chất quan trọng nhất của các SE trong lĩnh vực an toàn thực phẩm Chúng không bị phân hủy ở 100oC trong 30 phút (Trần Linh Thước, 2006), thậm chí ở 121oC trong 28 phút thì những SE vẫn giữ được

hoạt tính sinh học (Naomi Balaban et al., 2000) Tính kháng nhiệt của SE trong thực phẩm cao hơn so với trong môi trường nuôi cấy (Yves Le Loir et al., 2003)

Theo Eunice (1983), liều gây chết 50% số động vật thí nghiệm khác nhau tùy theo nguồn gốc của chủng vi khuẩn và phụ thuộc vào loại độc tố

Staphylococcus aureus sinh ra những độc tố như: coagulase, hyaluronidase,

hemolysine, leukocidine, exfoliatine Năm độc tố ruột (Enterotoxin A, B, C, D, E) bền với nhiệt, các độc tố này đóng vai trò quan trọng trong ngộ độc thực phẩm

Trong số các loại độc tố, enterotoxin của Staphylococcus aureus (SE) đóng vai trò quan trọng trong các vụ ngộ độc thực phẩm (Yves Le Loir et al., 2003)

Sự phân loại dựa vào tính kháng nguyên, 5 loại độc tố đầu tiên được tìm thấy đó là: độc tố A (SEA), độc tố B (SEB), độc tố C (SEC), độc tố D (SED) và độc tố E (SEE) Trong đó, SEC được chia thành SEC1, SEC2, SEC3 Sau đó, các độc tố

SE mới cùng các gen tương ứng được tìm thấy và đánh dấu từ SEG đến SER và SEU (Jogensen, 2004)

Các loại độc tố khác nhau sẽ tác động và gây bệnh ở mức độ khác nhau

Theo Liben et al (2012), khi phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus trên người và bò bị viêm vú với chủng Staphylococcus aureus enterotoxin A liều gây

chết 50% số động vật thí nghiệm là 2x109 cfu/ml

2.3.8 Sức đề kháng

Vi khuẩn không có nha bào nên đề kháng kém đối với tác nhân lý hóa Nhiệt độ 70oC diệt vi khuẩn trong môi trường trong 1 giờ, nhiệt độ 80oC diệt vi khuẩn từ 10 – 30 phút, đun sôi 100oC vài phút vi khuẩn mới chết Vi khuẩn đề kháng với sự khô lạnh và đóng băng Ở nơi khô ráo vi khuẩn sống trên 200 ngày Đối với chất sát trùng acid fenic 3 – 5% giết vi khuẩn sau 3 – 15 phút HgCl2 1‰ giết vi khuẩn trong 30 phút hay lâu hơn, 0,5% trong 1 giờ, formol 1% trong 1 giờ, cồn nguyên chất không có tác dụng đối với tụ cầu khuẩn, cồn 70o diệt vi khuẩn trong vài phút Tím gentian 1/300000 có thể ngăn được tạp khuẩn phát triển (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977)

2.3.9 Tính kháng thuốc kháng sinh

Ở Denmark sự đề kháng nafcillin của Staphylococcus aureus chiếm 40%

các chủng phân lập được năm 1970 và chỉ có 10% năm 1980 Còn ở Mỹ sự

kháng nafcillin của Staphylococcus aureus chỉ có 0,1% chủng phân lập năm

1990, các năm tiếp theo thì tăng đến 20 – 30% chủng kháng được phân lập từ các

nhiễm khuẩn ở một vài bệnh viện (Janetx et al., 2001)

Sự dung nạp kháng sinh được phát hiện trong trường hợp điều trị viêm nội

tâm mạc ghi nhận năm 1977, một số chủng Staphylococcus aureus mặc dù bị ức

chế bởi penicillin ở các nồng độ thông thường, nhưng nó chỉ bị diệt ở các nồng

độ cao hơn Hiện tượng này gọi là sự dung nạp chưa hoàn toàn, nhưng nó liên quan đến sự không tan bào của các chủng vi khuẩn này khi có mặt của kháng sinh ở nồng độ nhạy cảm bình thường Có lẽ vi khuẩn đã ức chế được sự tan bào Trong trường hợp này nên thay kháng sinh hay phối hợp kháng sinh (Lê Huy Chính, 2003)

Staphylococcus aureus kháng với penicillin và cephalosporin nhờ tiết được

men β-lactamase, tính kháng thuốc được truyền bởi plasmid bằng cơ chế chuyển nạp hay giao phối (Nguyễn Thanh Bảo, 2003)

Trong số 100 mẫu bệnh phẩm trên lâm sàng được phân lập có 48 chủng

Staphylococcus aureus Kết quả của kháng sinh đồ chỉ ra vi khuẩn đề kháng cao

với penicillin 95,8%, ampicillin 89,6%, tetracycline 87,5% và 75% đối với

chloramphenicol (Uwaezuoke et al., 2004)

Trong phòng thí nghiệm, người ta đã tìm thấy plasmid kháng vancomycin ở

Enterococcus faecalis có thể chuyển sang Staphylococcus aureus và được nghĩ

rằng việc chuyển này có thể xảy ra ngoài tự nhiên, trong đường tiêu hóa chẳng

hạn Ngoài ra, Staphylococcus aureus còn kháng với chất khử trùng và tẩy uế

(Kenneth Todar, 2005)

Từ khi sử dụng penicillin vào những năm 1940, tính kháng thuốc đã hình thành ở tụ cầu trong thời gian rất ngắn Nhiều dòng hiện nay đã kháng với hầu hết kháng sinh thông thường và sắp tới sẽ kháng cả kháng sinh mới Thật sự là trong hai năm gần đây, việc thay thế kháng sinh cũ bằng vancomycin đã dẫn đến

sự gia tăng các dòng kháng vancomycin VRSA (Vancomycin Resistant

Staphylococcus aureus ) (Kenneth Todar, 2005)

Khảo sát sự đề kháng kháng sinh tại thành phố Hồ Chí Minh năm 2005 cho

thấy các chủng Staphylococcus aureus phân lập từ bệnh phẩm có đến 94,1%

chủng kháng penicillin, 52,9% kháng ciprofoxacin, 52% kháng amoxicillin và

12,5% kháng gentamicin (Nguyễn Thị Kê và ctv., 2006)

Sự kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus là một đặc điểm rất đáng chú ý Đa số Staphylococcus aureus kháng penicillin G do vi khuẩn này sản xuất

được men penicillinase Một số còn kháng lại được methicillin gọi là methicillin

resistant Staphylococcus aureus (MRSA), do nó tạo ra các protein gắn vào các vị

trí tác động của kháng sinh (Lê Huy Chính, 2007)

Theo Võ Thị Huyền Trân (2007), Staphylococcus aureus có tỷ lệ nhạy cảm

thấp đối với kháng sinh như tetracycline (41,46%), ampicillin (36,59%) và đề kháng cao với erythromycin (70,73%)

Theo Forough et al (2012) phân lập 348 mẫu sữa thô của bò, cừu, dê từ đàn

gia súc ở các trang trại ở Iran, hơn 46 mẫu sữa thô được tìm thấy có chứa

Staphylococcus aureus Trong đó có 54,3% đề kháng với ampicillin; 28,3% đề

kháng với oxacillin; 26,1% đề kháng với tetracycline; 23,9% đề kháng với penicillin G; 23,9% đề kháng với erythromycin; 2,2% đề kháng với cephalotin; 17,4% đề kháng với trimethoprim và sulfamethoxazole

2.3.10 Đặc tính gây bệnh

Staphylococcus aureus là vi khuẩn sinh mủ điển hình, có thể phân lập được

từ phân, da, khoang miệng, hệ hô hấp trên, nếp gấp âm vật, âm đạo và ruột của

heo khỏe Staphylococcus aureus truyền qua đường không khí, qua tiếp xúc và ăn uống Giao phối có thể giúp Staphylococcus aureus gây nhiễm trùng đường sinh

dục Viêm vú, viêm âm đạo và viêm tử cung là hậu quả của nhiễm trùng kế phát

Sự sẩy thai có liên quan đến sự hiện diện kháng thể trong huyết thanh với chủng dung huyết α ở heo nái (Taylor, 1992)

Staphylococcus aureus gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng, tạo mủ Thường xảy

ra ở những chỗ sây sát trên bề mặt da như nhọt, gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng như viêm phổi, viêm vú, viêm tĩnh mạch, viêm màng não, nhiễm trùng tiểu và những bệnh nguy hiểm khác như viêm xương tủy, viêm màng trong

tim Staphylococcus aureus cũng là nguyên nhân chủ yếu của việc nhiễm trùng vết mổ Ngoài ra, Staphylococcus aureus còn gây ngộ độc thực phẩm do tạo độc

tố ruột enterotoxin trong thực phẩm (Kenneth Todar, 2005)

Staphylococcus aureus là loại gây bệnh thường hay gặp nhất, nó có vai trò

và ý nghĩa quan trọng đối với y học và thú y học Khoảng 30% người khỏe mạnh

mang Staphylococcus aureus ở trên da và niêm mạc, khi có những tổn thương ở

da và niêm mạc hoặc những rối loạn về chức năng thì các nhiễm trùng do

Staphylococcus aureus dễ dàng xuất hiện Nó là nguyên nhân gây viêm xoang,

viêm amygdale và viêm vú cho người (Trần Thị Phận, 2004)

Theo Rasheed (2011), trong số 60 gà từ 30 – 55 ngày tuổi có triệu chứng viêm khớp, kết quả phân lập có 26 con (60%) có sự hiện diện của vi khuẩn

Staphylococcus aureus Những nghiên cứu gần đây của Lizeng (1997) và Skeeles (1997) cho thấy tỉ lệ viêm khớp do Staphylococcus aureus trên đàn gà thịt là trên

3% tuy nhiên trong một số trường hợp có thể lên tới 20%

Trong thiên nhiên

Vi khuẩn có khả năng tồn tại trên cơ thể động vật Khi sức đề kháng yếu hay do nhiễm trùng trên da với vi khuẩn có độc lực mạnh gây hiện tượng sưng

mủ trên da hay niêm mạc, gây ung nhọt, áp xe, viêm vú ở bò và cừu, nhiễm độc

do độc tố đường ruột ở người Sự xâm nhập của vi khuẩn vào nang lông gây hoại

tử da Tụ cầu khuẩn có thể theo đường máu gây ra mưng mủ ở nội tạng từ đó gây

ra bại huyết và nhiễm độc huyết

Trong các loài vật, ngựa cảm nhiễm nhất rồi đến chó, bò, heo và cừu Gia cầm có sức đề kháng cao với tụ cầu khuẩn (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977; Lưu Hữu Mãnh, 2010)

Một số bệnh ở chó do Staphylococcus aureus gây ra là: viêm tử cung cấp

tính, bệnh tích mủ tử cung, viêm vú có nhiễm trùng, viêm tuyến tiền liệt, viêm bàng quang, viêm mủ nếp gấp, viêm da mỏm (Nguyễn Văn Biện, 2001)

Ngoài ra, ở người còn thấy độc tố ruột do tụ cầu tiết ra gây nên nhiễm độc

thức ăn và viêm ruột cấp tính (Nguyễn Như Thanh và ctv., 1997)

Trong phòng thí nghiệm

Thỏ là loài động vật dễ cảm nhiễm nhất Tiêm vào tĩnh mạch thỏ 1 – 2 ml canh khuẩn tụ cầu, sau 36 – 48 giờ thỏ chết vì chứng huyết nhiễm mủ Khi mổ khám quan sát thấy nhiều ổ áp xe dưới da (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977)

2.3.11 Một số nhiễm khuẩn do Staphylococcus aureus gây ra trên người

Theo Lê Huy Chính (2001), tụ cầu vàng thường ký sinh ở da, mũi và họng

Vi khuẩn này gây bệnh cho những người bị suy giảm sức đề kháng do chúng có nhiều yếu tố độc lực Tụ cầu vàng là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và có

khả năng gây nhiều bệnh khác nhau như:

Nhiễm khuẩn ngoài da

Do tụ cầu vàng ký sinh trên da và niêm mạc mũi, nên có thể xâm nhập vào các lổ chân lông, chân tóc hoặc các tuyến dưới da Sau đó gây nên các nhiễm khuẩn sinh mủ như: mụn nhọt, đầu đinh, các ổ áp xe, eczema,… Mức độ các nhiễm khuẩn này phụ thuộc vào sức đề kháng của cơ thể và độc lực của vi khuẩn

Nhiễm khuẩn huyết

Tụ cầu vàng là loại thường gây nhiễm khuẩn huyết nhất Do chúng gây nên các loại nhiễm khuẩn, đặc biệt là nhiễm khuẩn ngoài da Từ đây vi khuẩn xâm nhập vào máu gây nên nhiễm khuẩn huyết Đây là loại nhiễm trùng rất nặng, tụ cầu vàng đi tới các cơ quan khác nhau và gây nên các ổ áp xe (gan, não, tủy xương) hoặc viêm nội tâm mạc, có thể viêm tắt tĩnh mạch Một số nhiễm trùng

khu trú này trở thành viêm mãn tính như viêm xương

Nhiễm khuẩn bệnh viện do tụ cầu

Thường rất hay gặp, nhất là đối với nhiễm trùng vết mổ và vết bỏng Từ đó dẫn đến nhiễm khuẩn huyết Các chủng tụ cầu này có khả năng kháng kháng sinh rất mạnh Tỷ lệ tử vong của bệnh này rất cao

Nhiễm độc thức ăn do viêm ruột cấp

Ngộ độc thức ăn có thể do ăn uống phải độc tố ruột của tụ cầu, hoặc do tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột chiếm ưu thế về số lượng Nguyên nhân là do sau một thời gian dài bệnh nhân dùng kháng sinh có phổ hoạt động rộng dẫn đến các vi khuẩn ở đường ruột nhạy cảm với kháng sinh và tạo điều kiện cho tụ cầu vàng (kháng kháng sinh) tăng trưởng về số lượng

Triệu chứng của ngộ độc thức ăn do tụ cầu thường rất cấp tính Sau khi ăn phải thức ăn nhiễm độc tố tụ cầu từ 2 – 8 giờ, bệnh nhân nôn, đi ngoài dữ dội, phân lẫn nước, càng về sau phân và chất nôn đều là nước Do mất nhiều nước và điện giải có thể dẫn đến shock

Hội chứng da phồng rộp (Scalded skin syndrome)

Một số chủng tụ cầu vàng tiết ra độc tố exfoliatin gây viêm da hoại tử ly giải và phồng rộp Bệnh này thường gặp ở trẻ em mới đẻ và tiên lượng xấu

Viêm phổi

Viêm phổi do tụ cầu vàng ít gặp Nó chỉ xảy ra sau khi viêm đường hô hấp

do virus (cúm) hoặc sau khi bị nhiễm khuẩn huyết Tuy vậy, cũng có viêm phổi tiên phát do tụ cầu vàng ở những người suy yếu hay trẻ em Tỷ lệ tử vong của bệnh này khá cao vì thế nó được coi là bệnh nặng

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

3.2 Nội dung nghiên cứu

Điều chế cao thô từ lá Đại bi

Gây nhiễm chuột bạch với vi khuẩn Staphylococcus aureus

Điều trị bệnh trên chuột bạch bằng cao Đại bi

3.3 Phương tiện nghiên cứu

Chuột bạch (Mus musculus domesticus), giống ddY (Nhật Bản) sạch bệnh,

có trọng lượng từ 18 – 22 g (từ 4 – 5 tuần tuổi) có nguồn gốc từ Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh

3.3.2 Dụng cụ, hóa chất chính

Dụng cụ: tủ sấy dụng cụ (Classware drying oven), tủ ấm (Incubator), autoclave, máy cô quay chân không, máy ly tâm, máy lắc, buồng cấy vô trùng, cân điện tử, dao, kéo, đĩa petri, kim tiêm, ống nghiệm, ống đong, cốc thủy tinh, ống hút, que cấy, đèn cồn, nhiệt kế, túi nylon, lồng nuôi chuột thí nghiệm, chai nước uống cho chuột và một số dụng cụ khác

Hóa chất: methanol 100%, nước muối sinh lý, nước cất, dung dịch Ringer’s solution, dung môi DMSO, cồn 70o, cồn 90o

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp trồng cây

Từ kết quả phân tích di truyền và thử hoạt tính kháng khuẩn các dòng cây Đại bi của Nguyễn Thị Cẩm Quyên (2013), chúng tôi chọn dòng Đại bi có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất đem trồng trong chậu, đất trồng là hỗn hợp đất, xơ dừa, tro và trấu Mỗi ngày tưới nước một lần vào lúc sáng sớm

3.4.2 Phương pháp lấy mẫu Đại bi

Chọn những lá Đại bi tốt nhất, có màu sậm và không bị khô héo Lá Đại bi làm thí nghiệm được hái vào buổi sáng (khoảng 8 – 10 giờ), rửa loại sạch đất, những dược liệu bị sâu, nấm ký sinh và loại những tạp chất khác (Nguyễn Văn

Đàn và ctv., 1985)

3.4.3 Điều chế cao thô

Lá Đại bi sau khi được sấy khô (nhiệt độ 50oC), đem cắt nhỏ sau đó ngâm trong methanol 100% (tỷ lệ mẫu và methanol là 1:1) 3 ngày, sau đó chiết lấy dịch chiết riêng và tiếp tục ngâm và chiết với methanol lần 2 (tỷ lệ lá và methanol là 1:1), chiết lần 3 (tỷ lệ lá và methanol là 1:1) (24 giờ/lần) Loại bỏ dung môi trong các dịch chiết và cô đặc các dịch chiết đó bằng máy cô quay chân không ở nhiệt

độ 40oC cho đến cắn, thu được cao sử dụng trong thí nghiệm (Nguyễn Văn Đàn

và ctv., 1985)

Quy trình chiết mẫu Đại bi được tóm lược qua sơ đồ 3.1:

chiết (lần 2)

Dịch chiết (lần 3, trữ)

Mẫu đã loại dịch chiết (lần 3), loại bỏ

Cô quay

Cao thô

Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết mẫu Đại bi

3.4.4 Nuôi chuột

Chuột bạch sau khi được mua về từ Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh được nuôi trong hộp nhựa hình chữ nhật có kích thước 30x15x10 cm và được đâm thủng nhiều lỗ cho thông thoáng, phía dưới đáy mỗi hộp sẽ được lót một lớp trấu và có sát trùng cẩn thận Nước uống được đựng trong chai nhựa có nắp đậy

và có ống thông nhỏ cắm vào nắp chuồng để chuột hút nước uống, thức ăn được đựng trong đĩa nhựa Chuột nuôi được cho ăn thức ăn dành riêng cho chuột với khẩu phần khoảng 5 g/ngày Mỗi ngày cho chuột ăn hai lần và dọn vệ sinh một lần vào buổi sáng Tất cả chuột thí nghiệm được nuôi dưỡng và chăm sóc trong cùng điều kiện

3.4.5 Pha vi khuẩn

Vi khuẩn Staphylococcus aureus sau khi được nuôi cấy tăng sinh trên môi

trường NA (Nutrient agar), ở 37oC trong 24 giờ, sau đó được chuyển vào môi trường BHI (Brain heart infusion) để nuôi tăng sinh trong 4 – 6 giờ, trong quá trình nuôi cấy có lắc để kích thích tăng sinh của vi khuẩn Lấy 2ml dung dịch trên đem ly tâm ở 2.500 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút, phần dung dịch phía trên sau khi ly tâm được bỏ đi, phần lắng dưới đáy được rửa sạch 2 lần bằng dung dịch Ringer’s solution Phần vi khuẩn lắng dưới đáy sẽ được pha loãng với dung dịch Ringer’s solution pha ở các nồng độ khác nhau (so với độ đục chuẩn Mac Farland 0,5) thu được nồng độ vi khuẩn cần Nồng độ này sử dụng làm canh

khuẩn để tiêm truyền cho chuột bạch (Liben et al., 2012)

3.4.8 Bố trí thí nghiệm

Mục đích: thí nghiệm được tiến hành nhằm xác định khả năng điều trị bệnh

nhiễm khuẩn do Staphylococcus aureus của cao lá Đại bi trên chuột bạch

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố,

4 mức độ, 3 lần lặp lại Tổng số 12 đơn vị thí nghiệm Bố trí thí nghiệm được trình bày qua bảng 3.1

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm điều trị bệnh nhiễm khuẩn do Staphylococccus aureus

của cao lá Đại bi

Nghiệm

thức

Lặp lại (lần)

Tổng

số chuột (con)

Nguồn tác động

Liều dùng (g/kg TT)

Nhịp cấp Đường

cấp:

uống

Liệu trình

NT1 3 12 Cao Đại bi 0,25 2 lần/ngày 0,1 ml 7 ngày

NT2 3 12 Cao Đại bi 0,5 2 lần/ngày 0,1 ml 7 ngày

NT3 3 12 Cao Đại bi 0,75 2 lần/ngày 0,1 ml 7 ngày

sinh lý

– 2 lần/ngày 0,1 ml 7 ngày

Ghi chú: NT (nghiệm thức), ĐC (đối chứng), TT( thể trọng)

Phương pháp tiến hành: chuột sau khi mua về được nuôi thích nghi trong

3 ngày, qua ngày thứ 4 thì bắt đầu tiến hành bố trí thí nghiệm

Từ kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của cây Đại bi và thử LD50 của vi

khuẩn Staphylococcus aureus theo Nguyễn Thị Cẩm Quyên (2013) Thí nghiệm

được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm thức: 3 nghiệm thức điều trị và nghiệm thức đối chứng Mỗi nghiệm thức có 4 chuột với 3 lần lặp lại Tất cả các

chuột đều được gây nhiễm bởi vi khuẩn Staphylococcus aureus ở nồng độ 1010

cfu/ml, liều 1 ml/con bằng đường tiêm xoang bụng Chuột ở các nghiệm thức điều trị 30 phút sau khi tiêm vi khuẩn thì bắt đầu cho uống cao Đại bi với liều như sau: nghiệm thức 1 (NT1) với liều 0,25 g/kg thể trọng, nghiệm thức 2 (NT2) với liều 0,5 g/kg thể trọng và nghiệm thức 3 (NT3) với liều 0,75 g/kg thể trọng Nhịp cấp là 2 lần/ngày, mỗi lần cấp 0,1 ml Nghiệm thức đối chứng (NTĐC) cho chuột uống nước muối sinh lý

Liệu trình điều trị sau khi gây nhiễm là 7 ngày

3.4.9 Chỉ tiêu theo dõi

Biểu hiện lâm sàng của tất cả các chuột thí nghiệm

Tỷ lệ chuột còn sống sau khi điều trị bằng cao đại bi