khảo sát sự biến động của enzyme phytase và phytate trong sản xuất gạo mầm giai đoạn ngâm và nảy mầm của hai giống lúa nếp than (dh6) và nếp trắng (cln)

TÓM LƯỢC Đề tài “Khảo sát sự biến động của enzyme phytase và phytate trong sản xuất gạo mầm giai đoạn ngâm và nảy mầm của hai giống lúa nếp than DH6 và nếp trắng CLN” với mục đích nâng c

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

NẾP TRẮNG (CLN)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

2014

Đề tài “KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỘNG CỦA ENZYME PHYTASE VÀ

PHYTATE TRONG SẢN XUẤT GẠO MẦM GIAI ĐOẠN NGÂM VÀ NẢY MẦM CỦA HAI GIỐNG LÚA NẾP THAN (DH6) VÀ NẾP TRẮNG (CLN)”

do Đặng Công Minh thực hiện Luận văn đã báo cáo trước hội đồng chấm luận

văn tốt nghiệp Đại Học và được Hội Đồng thông qua

Giáo viên hướng dẫn Cần Thơ, ngày tháng 12 năm 2014

Chủ tịch hội đồng

Nguyễn Công Hà Phan Nguyễn Trang

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây

Cần Thơ, ngày tháng 12 năm 2014

Tác giả

Đặng Công Minh

LỜI CẢM TẠ

Trải qua nhiều quá trình nghiên cứu, thử nghiệm cuối cùng luận văn tốt nghiệp đã hoàn thành Để có kết quả như ngày hôm nay cũng nhờ sự giúp đỡ tận tình từ

thầy cô, gia đình và bạn bè

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Thầy Nguyễn Công Hà và Cô Phan Nguyễn Trang đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ em rất nhiều, truyền đạt cho em nhiều kinh

nghiệm quí báo để em có thể hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc quí thầy cô bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ đã tạo mọi

điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu của em trong suốt thời gian qua

Xin cảm ơn các anh, chị học viên cao học và lớp Công Nghệ Thực Phẩm khóa 37 trường Đại Học Cần Thơ đã cùng chia sẻ, động viên tôi trong suốt thời gian

nghiên cứu

Cuối cùng, con xin cảm tạ và biết ơn cha mẹ đã nuôi dưỡng, bảo bọc và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho con học tập để có được thành quả như ngày hôm nay

Cần Thơ, ngày tháng 12 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Đặng Công Minh

TÓM LƯỢC

Đề tài “Khảo sát sự biến động của enzyme phytase và phytate trong sản xuất gạo mầm giai đoạn ngâm và nảy mầm của hai giống lúa nếp than (DH6) và nếp trắng (CLN)” với mục đích nâng cao chất lượng sản phẩm, đồng thời tạo ra sản phẩm

phù hợp với thị hiếu người tiêu dùng

Quy trình hình thành gạo mầm từ gạo lứt và khảo sát thành phần chức năng trong gạo mầm được tiến hành trên hai giống nếp than và nếp trắng Vấn đề đặt ra cho quá trình nghiên cứu là khảo sát quá trình pH dung dịch ngâm ở điều kiện nhiệt

độ phòng và thời gian ủ 16, 20, 24, 28, 32 giờ ở nhiệt độ 370C trong điều kiện hàm lượng CO2 0%, 3%, 5%, 7%, 9% ảnh hưởng đến hàm lượng hợp chất chức

năng sinh ra trong gạo mầm

Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt tính enzyme phytase tối thích ở pH 5 và nhiệt

độ 370

C Sau khi ngâm gạo lứt trong 6 giờ ở các dung dịch pH ngâm khác nhau hoạt tính enzyme glutamate decarboxylase (GAD) đạt cao nhất ở pH 5 Hoạt tính enzyme GAD cao sinh ra hợp chất chức năng cao là gamma-aminobutyric acid (GABA) Ở pH 5 sau 6 giờ ngâm thì hoạt tính enzyme phytase ở nếp than (DH6)

là 236,32 (U/kg), nếp trắng (CLN) là 227,47 (U/kg) và hàm lượng phytate ở nếp than (DH6) là 591,73 (mg/100g), ở nếp trắng là 495,62 (mg/100g) Sau quá trình nảy mầm hoạt tính enzyme GAD đạt cao nhất ở nồng độ CO2 5% với thời gian ủ

28 giờ Tại mốc enzyme GAD cao nhất thì hoạt tính enzyme phytase ở nếp than (DH6) là 340,82 (U/kg), nếp trắng (CLN) là 331,99 (U/kg) và hàm lượng phytate

ở nếp than (DH6) là 575,76 (mg/100g), nếp trắng (CLN) là 462,44 (mg/100g)

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ii

LỜI CẢM TẠ iii

TÓM LƯỢC iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH BẢNG viii

DANH SÁCH HÌNH ix

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 NGUYÊN LIỆU 3

2.1.1 Giới thiệu chung 3

2.1.2 Gạo lứt và các thành phần dinh dưỡng 4

2.1.3 Giới thiệu về gạo nếp 5

2.2 KHÁI QUÁT VỀ GẠO MẦM 6

2.2.1 Gạo mầm 6

2.2.2 Quá trình nảy mầm 7

2.3 THÀNH PHẦN CHỨC NĂNG TRONG GẠO MẦM 9

2.3.1 γ-aminobutyric acid (GABA) 9

2.3.2 Acid phytic 10

2.3.3 γ-oryzanol 12

2.3.4 Acid ferulic 14

2.4 CÁC ENZYME TRONG GẠO NẾP NẢY MẦM 14

2.4.1 Enzyme amylase 14

2.4.2 Enzyme phytase 19

2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme 20

2.5 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 23

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 24

3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 24

3.1.2 Nguyên liệu 24

3.1.3 Dụng cụ - Thiết bị thí nghiệm 24

3.1.4 Hóa chất 25

3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 25

3.2.1 Phương pháp thí nghiệm 25

3.2.2 Phương pháp phân tích 26

3.3 NỘI DUNG THÍ NGHIỆM 26

3.3.1 Quy trình thí nghiệm 26

3.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 28

3.4 TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 28

3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH tối ưu đến hoạt tính enzyme phytase trong nguyên liệu gạo lứt 28

3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát pH dung dịch ngâm ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 6 giờ đến hàm lượng hợp chất chức năng sinh ra 29

3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát điều kiện ủ CO2 ở nhiệt độ 370C đến hoạt tính enzyme phytase và hàm lượng phytate 30

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 ẢNH HƯỞNG CỦA pH VÀ NHIỆT ĐỘ LÊN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME PHYTASE TRONG GẠO LỨT NGUYÊN LIỆU 32

4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA pH DUNG DỊCH NGÂM GẠO LỨT ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME PHYTASE VÀ HÀM LƯỢNG PHYTATE 34

4.3 ẢNH HƯỞNG ĐIỀU KIỆN Ủ CO2 Ở CÁC NỒNG ĐỘ KHÁC NHAU Ở NHIỆT ĐỘ 370C ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME PHYTASE VÀ HÀM LƯỢNG PHYTATE 37

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

5.1 KẾT LUẬN 41 5.2 ĐỀ NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC A – CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH I PHỤC LỤC B – BẢNG KẾT QUẢ THỐNG KÊ CÁC THÍ NGHIỆM IX

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Sự phân bố chất dinh dưỡng trong gạo 5 Bảng 2.2 Thành phần hóa học của nếp trắng 6 Bảng 2.3 Thành phần hóa học của gạo nếp than 6 Bảng 4.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ tối ưu đến hoạt tính của enzyme phytase (U/kg) trong nếp than 32 Bảng 4.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ tối ưu đến hoạt tính của enzyme phytase (U/kg) trong nếp trắng 33 Bảng 4.3 Thành phần nguyên liệu của nếp than và nếp trắng 34 Bảng 4.4 Hoạt tính enzyme phytase của hai giống nếp than và nếp trắng khi ngâm trong pH dung dịch khác nhau trong 6 giờ ở nhiệt độ phòng (30±20C) 35 Bảng 4.5 Hàm lượng phytate của hai giống nếp than và nếp trắng khi ngâm trong

pH dung dịch khác nhau trong 6 giờ ở nhiệt độ phòng (30±20C) 36 Bảng 4.6 Hoạt tính enzyme phytase của nếp than trong các điều kiện ủ CO2 và thời gian khác nhau 38 Bảng 4.7 Hoạt tính enzyme phytase của nếp trắng trong các điều kiện ủ CO2 và thời gian khác nhau 38 Bảng 4.8 Hàm lượng phytate của nếp than trong các điều kiện ủ CO2 và thời gian khác nhau 39 Bảng 4.9 Hàm lượng phytate của nếp trắng trong các điều kiện ủ CO2 và thời gian khác nhau 40

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Cấu tạo của hạt lúa trưởng thành 4

Hình 2.2 Các quá trình liên quan đến sự nảy mầm và sau nảy mầm theo thời gian 8 Hình 2.3 Cấu trúc của GABA 9

Hình 2.4 Con đường trao đổi chất của GABA 10

Hình 2.5 Cấu trúc của acid phytic 11

Hình 2.6 Con đường sinh tổng hợp terpenoid trong thực vật 13

Hình 2.7 Các loại enzyme endoamylase và exoamylase 15

Hình 2.8 Hoạt động của phytase 19

Hình 3.1 Nguyên liệu nếp than và nếp trắng 24

Hình 3.2 Quy trình thí nghiệm 27

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Gạo là lương thực chính trong các bữa ăn ở hầu hết các quốc gia trên thế giới, cung cấp phần lớn năng lượng cho các hoạt động hàng ngày của con người Ngày nay, khi cuộc sống ngày càng phát triển, con người không chỉ sử dụng gạo như một nguồn lương thực mà còn là thực phẩm chữa bệnh Chính vì thế gạo lứt, là một loại thực phẩm nhiều dinh dưỡng hơn gạo trắng, có thể đáp ứng các nhu cầu con người mong muốn Đặc biệt, gạo lứt được sản xuất từ nếp có giá trị dinh

dưỡng và chức năng hơn thế

Gạo lứt do còn chứa lớp vỏ cám nên rất giàu chất xơ, sắt, vitamin và chất khoáng

có lợi cho sức khỏe mà trong quá trình xay xát để sản xuất gạo trắng đã làm mất (Swati Bhauso and Khalid Khan, 2011) Do đó, việc sử dụng gạo lứt sẽ mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe Tuy nhiên, về mặt cảm quan thì gạo lứt không được

ưa chuộng bằng gạo trắng do các nguyên nhân: màu sắc gạo lứt kém hấp dẫn, thời gian nấu chín cơm gạo lứt lâu hơn gạo trắng, cơm gạo lứt thường khô, cứng hơn cơm được nấu từ gạo trắng Vì vậy để cải thiện tình hình này cần phải có phương pháp chế biến gạo lứt thích hợp nhằm đẩy mạnh giá trị dinh dưỡng trong gạo lứt

để tạo ra sản phẩm vừa có giá trị dinh dưỡng vừa có giá trị cảm quan

Một trong những phương pháp đó là quá trình nảy mầm gạo lứt làm cải thiện chất lượng của gạo (Kim et al., 2012) Gạo mầm kế thừa những ưu điểm về mặt dinh dưỡng của gạo lứt Hơn thế, thời gian chế biến gạo mầm ngắn, hạt gạo mềm hơn,

vị tốt hơn (Jiamyangyuen and Ooraikul, 2008) Tại thời điểm nảy mầm, số lượng lớn các chất dinh dưỡng được chuẩn bị cho sự phát triển nảy mầm Sự nảy mầm kích hoạt tất cả các enzyme trong gạo từ trạng thái tĩnh sang trạng thái hoạt động để cung cấp cho quá trình nảy mầm Các chất dinh dưỡng có sẵn trong gạo tăng đáng

kể Chất dinh dưỡng tăng trong gạo lứt nảy mầm bao gồm acid γ-aminobutyric, chất xơ, inositols, γ-oryzanol….Ngoài ra, gạo nảy mầm giải phóng khoáng chất

ràng buộc, làm cho chúng được hấp thụ vào trong cơ thể

Tuy nhiên, gạo mầm chưa thật sự phổ biến và các tài liệu nghiên cứu về gạo mầm

ở Việt Nam cũng rất ít Do đó đề tài tiến hành quá trình nảy mầm của hai giống nếp than (DH6) Vũng Thơm – Sóc Trăng và giống nếp trắng (CLN) Phú Tân –

An Giang vì hai giống nếp khá phổ biến hiện nay, nhằm đa dạng hóa thị trường gạo mầm, đồng thời khảo sát các biến đổi trong quá trình nảy mầm tạo tiền đề

cho việc xây dựng quy trình sản xuất nhằm đạt tối ưu các hợp chất chức năng, đa

dạng hóa sản phẩm và nâng cao chất lượng, giá trị của gạo Việt Nam

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Khảo sát sự biến động của enzyme phytase và acid phytic trong quá trình nảy mầm của hai giống lúa nếp than và nếp trắng Tìm hiểu sự tương quan đến các điều kiện tối ưu cho quá trình hình thành các hợp chất chức năng trong gạo nếp

nảy mầm

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Giới thiệu chung

Lúa có tên khoa học là Ozyra sativa, cấu tạo gồm 4 phần chính là vỏ trấu (hull),

vỏ cám (bran layers), nội nhũ (starchy andosperm) và phôi hạt (embryo)

Vỏ trấu chiếm khoảng 15 - 30% trọng lượng hạt, bạo gồm chủ yếu là cellulose và chất xơ Vỏ trấu cho phép nước truyền qua trong quá trình sấy khô hoặc làm ướt hạt Vỏ trấu rất cứng có tác dụng như một màng bảo vệ chống sự xâm nhập của côn trùng, nấm mốc và những điều kiện thời tiết bất lợi Trên vỏ trấu có các đường gân nổi lên rất rõ và màu sắc của vỏ trấu (từ vàng nhạt đến vàng nâu) tùy thuộc vào giống lúa Ở đầu mảnh dưới của vỏ trấu có ba mũi nhọn, mũi ở giữa nhọn và bén hơn hai mũi bên Đầu mảnh trên có một mũi nhọn, mũi giữa của mảnh dưới hợp với mảnh trên tạo thành vỏ của hạt (Nguyễn Đức Lượng và ctv.,

hỏng hơn gạo trắng trong quá trình bảo quản

Nội nhũ là phần chủ yếu của hạt thóc, thành phần chủ yếu của nội nhũ là tinh bột (chiếm đến 90%) Tùy theo điều kiên canh tác và giống lúa, nội nhũ có màu trắng trong hay trắng đục (giống hạt dài nội nhũ trắng trong, giống hạt tròn nội nhũ có màu trắng đục) Sự hiện diện của protein và tinh bột chịu trách nhiệm cho những

thay đổi trong quá trình già của hạt gạo

Phôi là thành phần riêng rẽ nằm trong nội nhũ, bên góc dưới hạt gạo Phôi là nơi

dự trữ chất dinh dưỡng của hạt và nảy mầm tạo cây mới trong điều kiện thích hợp (Dương Thị Phượng Liên, Hà Thanh Toàn, 2012)

Đối với gạo lứt bao gồm 1 - 2% vỏ, lớp aluerone và vỏ hạt gạo 4 - 6%, phôi 1%, lớp vảy 2%, nội nhũ chiếm khoảng 91 - 92% (Nguyễn Nhật Minh Phương, 2010)

Hình 2.1 Cấu tạo của hạt lúa trưởng thành

(Nguồn: Juliano and bechtel, 1985)

2.1.2 Gạo lứt và các thành phần dinh dưỡng

Gạo lứt rất giàu dinh dưỡng vì do chỉ bỏ phần vỏ trấu và còn giữ nguyên phần vỏ cám nên thành phần dinh dưỡng hầu như được giữ nguyên vẹn và cao hơn rất nhiều so với gạo trắng và gạo được đánh bóng Ngoài ra lớp vỏ cám của gạo lứt cũng chứa một chất dầu đặc biệt có tác dụng điều hòa huyết áp, làm giảm cholesterol xấu, giúp ngăn ngừa qua các bệnh tim mạch Tuy chỉ chiếm 10% hạt

nhưng lại chiếm tới 65% các chất có giá trị nhất về mặt dinh dưỡng

Bảng 2.1 Sự phân bố chất dinh dƣỡng trong gạo

Gạo

(Rice)

Protein (%)

Chất béo (Fat ) (%)

Chất xơ (Fiber) (%)

Tro (Ash) (%)

Tinh bột (Starch) (%)

Xơ thô (Dietary fiber) (%) Rough 6,7-8,3 2,1-2,7 8,4-12,1 3,4-6,0 62,1 19,1

Brown 8,3-9,6 2,1-3,3 0,7-1,2 1,2-1,8 77,2 4,5

Milled 7,3-8,3 0,4-0,6 0,3-0,6 0,4-0,9 90,2 2,7

Hull 2,3-3,2 0,4-0,7 40,1-53,4 15,3-24,4 1,8 77,3

Bran 13,2-17,3 17,0-22,9 9,5-13,2 9,2-11,5 16,1 27,6-33,3 Embryo 17,7-23,9 19,3-23,8 2,8-4,1 6,8-10,1 2,4 -

Polish 13,0-14,4 11,7-14,4 2,7-3,7 6,1-8,5 48,3-55,4 -

(Nguồn: Juliano and Bechtel, 1985)

Ngoài các thành phần chính là tinh bột, protein, lipid,…trong gạo lứt còn chứa nhiều vitamin, đặc biệt là các vitamin nhóm B và các vi lƣợng khác So với các loại ngũ cốc khác thì gạo lứt chứa hàm lƣợng protein thấp, tuy nhiên trong gạo lứt chứa hàm lƣợng vitamin nhóm B cao nhất đặc biệt là vitamin B1 và B3

2.1.3 Giới thiệu về gạo nếp

Gạo nếp (Oryza sativa var glutinosa hay Oryza glutinosa) là loại gạo hạt ngắn

phổ biến ở châu Á

Gạo nếp không chứa gluten tiêu hóa (glutenin và gliadin), do vậy an toàn cho chế

độ ăn không có gluten Điểm phân biệt gạo nếp với các loại gạo khác là gạo nếp không chứa amyloza hoặc chứa không đáng kể, ngƣợc lại amylopectin rất cao Chính amylopectin tạo ra tính chất dính của gạo nếp

(Nguồn: Huỳnh Thị Mỹ Duyên, 2009)

Bảng 2.3 Thành phần hóa học của gạo nếp than

(Nguồn: Nguyễn Thị Hiền, 2006)

2.2 KHÁI QUÁT VỀ GẠO MẦM

2.2.1 Gạo mầm

Sau quá trình ngâm nước, ủ trong điều kiện nhiệt độ và thời gian thích hợp thu được gạo mầm từ gạo lứt, và đồng thời làm tăng các hợp chất chức năng cũng

như kích thích sự hoạt động cao nhất của các enzyme bên trong hạt

Sự nảy mầm bị ảnh hưởng bởi các nhân tố bên ngoài như: thời gian nảy mầm, hàm lượng chất dinh dưỡng dự trữ trong hạt,…(Ridge, 1991) Quá trình nảy mầm của gạo lứt giúp các enzyme nội bào bên trong hạt hoạt động và phân cắt thành các chất có khối lượng phân tử lớn như protein, carbohydrate,…thành những chất

có khối lượng phân tử nhỏ dễ hấp thụ Quá trình này góp phần làm thay đổi cấu trúc của hạt Ngoài ra, quá trình nảy mầm gây ra những biến đổi quan trọng về dinh dưỡng như tăng hàm lượng GABA, hàm lượng chất xơ, tocotrienols, γ-oryzanol, inositols, acid ferulic, acid phytic, magiê, kali, kẽm và chất ức chế prolylendopeptidase (Kayahara and Tukahara, 2000)

Gạo mầm được xem như một loại gạo tiên tiến có giá trị dinh dưỡng cao bao gồm vitamin, chất khoáng, và những giá trị dinh dưỡng khác cần thiết cho cơ thể chống lại bệnh tật, sự lão hóa và tăng cường sức khỏe Sản phẩm gạo mầm có chỉ

số Glycemic thấp giúp kiểm soát lượng đường trong máu, do đó có vai trò quan trọng đối với bệnh nhân tiểu đường và những người muốn kiểm soát cân nặng Nguồn magiê trong gạo mầm có tác dụng làm giảm tính trầm trọng của bệnh hen suyễn, giảm bệnh cao huyết áp, chứng đau nữa đầu, bệnh tim và đột quỵ (Dinesh

et al, 2009)

2.2.2 Quá trình nảy mầm

Nảy mầm là sự phát triển của phôi bên trong hạt Đây là một quá trình bao gồm

sự kết hợp những khả năng có thể xảy ra để bắt đầu sự hấp thu nước của hạt gạo khô và đang trong trạng thái ngừng hoạt động Kết thúc quá trình này là sự phát triển của phôi và sự hình thành rễ mầm xuyên qua cấu trúc của hạt xung quanh phôi và tiếp theo là sự phát triển thành cây con (Bewley and Black, 1994)

Quá trình nảy mầm của hạt phụ thuộc vào điều kiện bên trong và bên ngoài Thời gian mà hạt giống có thể sống sót rất khác nhau và phụ thuộc vào điều kiện tồn trữ và loại hạt giống (Mayer and Poljakoff-Mayber, 1975) Để hạt gạo có thể nảy mầm, nó phải được đặt trong môi trường thuận lợi Một số yếu tố ảnh hưởng đến

quá trình nảy mầm của hạt như: nhiệt độ, hàm lượng nước, ánh sáng,…

Trong hạt gạo khô có sẵn một lượng nước ở dạng liên kết Nước từ bên ngoài khi thấm vào bên trong hạt sẽ hòa tan các chất dự trữ và hoạt hóa các enzyme xúc tác quá trình phân giải các hợp chất cao phân tử trong hạt thành những chất đơn giản cung cấp cho hoạt động tăng trưởng của phôi để hình thành cây mầm Phôi là nơi hút nước rất mạnh Tốc độ hút nước rất mạnh ở thời gian đầu do sự chênh lệch áp suất thẩm thấu rất lớn giữa môi trường bên ngoài và các tế bào bên trong hạt, đồng thời các chất keo háo nước trương nở rất mạnh, càng về sau sức hút nước của hạt càng giảm (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2004) Sự hấp thụ nước của hạt bao gồm 3 pha: sự hấp thụ nước nhanh chóng ở pha I, trạng thái ổn định pha II và tiếp

theo là sự phát triển của phôi và hoàn thành quá trình nảy mầm ở pha III

Hình 2.2 Các quá trình liên quan đến sự nảy mầm và sau nảy mầm theo thời gian

(Nguồn: Bewley, 1997)

Nước đi vào trong tế bào của hạt gạo ở pha I làm phá vỡ cấu trúc màng tế bào tạm thời dẫn đến một số chất tan và những chất có khối lượng phân tử thấp sẽ tan vào trong môi trường ngâm xung quanh hạt (Crowe and Crowe, 1992) Trong quá trình hấp thụ nước thì các hoạt động trao đổi chất được hồi phục lại Cấu trúc của hạt

và các enzyme cần thiết cho quá trình trao đổi chất được kích hoạt và các quá trình hô hấp được tiếp tục hoạt động lại (Bewley and Black, 1994) Ở pha I, cả hai con đường glycolytic và oxidative pentose phosphate được khôi phục và các enzyme ở chu trình Kreb được kích hoạt (Salon et al., 1988) Trong mô của hạt chứa các ti thể và chúng chứa đầy đủ các enzyme của chu trình Kreb và cuối cùng

bị oxy hóa để cung cấp đủ lượng ATP để hỗ trợ cho quá trình chuyển hóa trong vài giờ sau quá trình hấp thu nước (Attucci et al., 1991)

Nước rất cần thiết cho sự nảy mầm của hạt Hạt sau khi bảo quản thường rất khô,

vì vậy cần hấp thụ nước để tiếp tục sinh trưởng và phát triển Sự hấp thụ nước làm cho hạt trương nở và phá vỡ vỏ hạt Mức độ hấp thụ nước phụ thuộc vào giống lúa, tính thấm của vỏ hạt và thành phần khí trong môi trường Khi hạt được hình thành, hầu hết các thành phần dự trữ trong hạt như protein, tinh bột, chất béo

sẽ cung cấp dinh dưỡng cho phôi hình thành và phát triển Khi hạt hút nước, các

enzyme thủy phân được kích hoạt sẽ phá vỡ những thành phần dự trữ tạo thành

những hợp chất có lợi cho quá trình trao đổi chất

Các hạt khác nhau có nhiệt độ tối thích cho quá trình nảy mầm khác nhau Nhiệt

độ quá thấp hay quá cao đều làm cho tất cả các hạt không thể nảy mầm Thông

thường hạt nảy mầm tốt ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng

Ánh sáng hay bóng tối có thể là một loại môi trường kích thích cho sự nảy mầm Các hạt giống thường nảy mầm tốt như nhau trong bóng tối và ánh sáng Những thay đổi trong hàm lượng của tinh bột, protein, và RNA của gạo trong bóng tối nhanh hơn trong ánh sáng (Palmiano and Juliano, 1972)

2.3 THÀNH PHẦN CHỨC NĂNG TRONG GẠO MẦM

2.3.1 γ-aminobutyric acid (GABA)

γ-aminobutyric acid (GABA) là một acid amin bốn carbon phi protein, dễ hòa tan trong H2O Về mặt cấu trúc phân tử linh hoạt, có thể về hình dáng dung dịch, cấu trúc tuần hoàn tương tự như proline GABA mang cả điện tích âm và điện tích dương ở pH sinh lý (pK: 4,03 và 10,56) (Christensen, 1994)

Hình 2.3 Cấu trúc của GABA

(Nguồn: Shelp et al, 1999)

GABA được chuyển hóa chủ yếu qua ba con đường ở Hình 2.4: Chu trình Glutamine synthetase/glutamate synthase (GS/GOGAT), đây là con đường đồng hóa Nitơ thành glutamate và acid amin ở thực vật; chu trình Glutamate dehydrogenase (GDH) và chu trình tricarboxylic acid (TCA) (Bouche and Fromm,

2004)

Thông thường, hàm lượng GABA trong mô tế bào thấp (0.03 - 2.00 µmol/g) (Fougere et al., 1991) Vì vậy, các phương pháp để làm tăng hàm lượng GABA trong thực phẩm được nghiên cứu hiện nay Hàm lượng GABA được nghiên cứu cao hơn trong trà Gabaron khi ủ trong điều kiện ủ yếm khí (Sawai et al., 2001), mầm đậu được xử lý với CO2 (Katagiri and Shimizu, 1989) Hàm lượng GABA

được tích lũy trong gạo lứt nảy mầm tăng theo các điều kiện khác nhau: giống lúa, thời gian nảy mầm, xử lý khí, điều kiện áp suất, phương pháp ngâm, nhiệt độ

nảy mầm

Hình 2.4 Con đường trao đổi chất của GABA

(Nguồn: Bouche and Fromm, 2004)

GABA có chức năng dược lý như một tác nhân hạ huyết áp, lợi tiểu, tác dụng an thần và là một chất dẫn truyền thần kinh (Huang et al., 2007) GABA có thể điều chỉnh huyết áp, nhịp tim, cảm giác đau đớn và lo lắng (Toshio et al., 2004), nồng

độ lipid trong huyết thanh (Miura et al., 2006) và hỗ trợ bài tiết insulin ngăn ngừa bệnh tiểu đường (Huang et al., 2007) Gần đây, các báo cáo cho rằng GABA trong gạo lứt nảy mầm có hiệu quả làm giảm hàm lượng glucose ở chuột mắc bệnh tiểu đường (Hagiwara et al., 2004) và kiểm soát lượng đường huyết (Ito et al., 2005)

2.3.2 Acid phytic

Acid phytic có cấu tạo phân tử là myo-inositol 1,2,3,4,5,6 hexakis dihydrogen phosphate (Ins P6), là thành phần chính trong nguồn phospho (P) dự trữ của thực vật, chiếm khoảng 50 - 80% phospho tổng của hạt Cấu trúc acid phytic là một hexaphosphate của myo-inositol Anion của gốc phosphate trên inositol mạng điện tích âm mạnh Nó có khả năng liên kết với các phân tử mang điện tích dương

như cation, protein và carbohydrate Bởi vì vô số các phản ứng của nhóm phosphate, acid phytic có thể như là một cation mà không có sự hiện diện của nhóm phosphate như giữa 2 nhóm phosphate hoặc giữa nhóm phosphate với 1 phân tử acid phytic khác (Harland and Morris, 1995)

Hình 2.5 Cấu trúc của acid phytic

(Nguồn: Cheryan, 1980)

Acid phytic là một tác nhân mạnh, đặc biệt là các cation đa hóa trị được bao bọc mạnh mẽ hơn các cation hóa trị đơn Muối phytate (phytin) thường chiếm một vài phần trăm trọng lượng khô của nhiều loại hạt và trong nhiều trường hợp chiếm khoảng 50 - 80% phospho toàn diện trong hạt Phytate như là nơi dự trữ của inositol, phosphate, K, Mg, Ca, Mn, Fe và Zn dành cho cây con Chúng được giải phóng bởi enzyme phytase để cung cấp cho sự phát triển của cây con Vai trò thứ hai là kiểm soát mức phosphate vô cơ trong hạt giống và cây con Phytate dường như chỉ được tổng hợp trong tế bào nơi nó được dự trữ, liên kết với lưới nội chất,

và một phần nhỏ chuyển đến các nhóm protein để dự trữ Khi bên trong các nhóm protein phát triển các chất dự trữ, bằng nhiều cách, tạo thành các quả cầu lớn hơn

và điện tử dày đặc hơn được gọi là globoid (Lott et al., 2000)

Acid phytic được sinh ra theo từng bậc của quá trình phosphoryl hóa inositol Myo-inositol chuyển đổi từ D-glucose-6-phosphate (IP6) đến myo-inositol-3-phosphate (IP3) bởi quá trình sinh tổng hợp myo-3-phosphate hoặc một phần qua trung gian của phosphatidyl inositol phosphate Con đường sinh hóa của acid phytic có thể được tóm tắt gồm có hai phần, thứ nhất là con đường chuyển hóa từ glucose-6-phosphate đến IP3 và thứ hai là acid phytic được sinh tổng hợp

myo-từ myo-inositol thông qua các bước của quá trình phosphoryl hóa

Acid phytic bị thủy phân bởi enzyme phytase hoặc bởi các phản ứng hóa học thành các muối phosphate inositol bậc thấp hơn như inositol pentaphosphate

(IP5), inositol tetraphosphate (IP4), inositol triphosphate (IP3) và có thể thành dạng di- hoặc monophosphate trong suốt quá trình tồn trữ, lên men, nảy mầm, chế biến hay quá trình tiêu hóa trong cơ thể con người Chỉ có IP6 và IP5 có ảnh hưởng tốt đến khả năng sinh học trong cơ thể, các sản phẩm thủy phân khác rất ít khả năng gắn kết các chất khoáng hay có hình dạng rất phức tạp hòa tan mạnh (Garcia-Estepa et al., 1999)

Acid phytic chiếm 1-2% khối lượng của nhiều hạt ngũ cốc (Lott et al., 2000) Khoảng 90% acid phytic được tìm thấy trong lớp aleurone (Brinch-Pedersen et al.,

2007) Phytate là thành phần quan trọng của lớp vỏ lụa của hạt gạo Hàm lượng phytate trong gạo lứt là 0,2%, trong gạo mầm từ 2,2 - 2,6% và trong nột nhũ là 0,8% Phytate hiện diện trong tinh bột chỉ khoảng 0,16% (Juliano and Bechtel,

Moong-ngarm (2005) đã nghiên cứu về ảnh hưởng của quá trình nảy mầm lên sự thay đổi của hàm lượng acid phytic, hoạt tính enzyme phytase, giá trị tiềm năng của acid phytic và các sản phẩm giảm cấp của nó như là nguồn của các hợp phần chống oxi hóa Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính enzyme phytase trong gạo cho nảy mầm trong 4 ngày tăng 7,3 lần so với gạo không cho nảy mầm và quá trình nảy mầm cũng làm giảm hàm lượng acid phytic trong gạo mầm Hàm lượng acid phytic cao nhất được tìm thấy trong cám gạo và thấp nhất trong rễ và chồi Trong gạo không nảy mầm tìm thấy IP6 và IP5, sau quá trình nảy mầm hàm

lượng IP6 giảm và hàm lượng IP5 tăng nhẹ

2.3.3 γ-oryzanol

Oryzanol là hỗn hợp của acid ferulic ester hóa với các sterol thông thường hoặc các triterpene alcohol được gọi là α, β và γ-oryzanol, trong đó γ-oryzanol phổ biến nhất Các hợp phần sterol của γ-oryzanol chủ yếu là campesterol và sitosterol, và các thành phần của triterpene alcohol là cycloartenol và 24-methylene cycloartanol (Dey and Harborne, 1991)

Hình 2.6 Con đường sinh tổng hợp terpenoid trong thực vật

(Nguồn: Huang, 2003)

Con đường sinh tổng hợp terpenoid được kiểm soát và bắt đầu từ acetyl-CoA, đến mevalonate, đến 2E,6E-farnesyl pyrophosphate, đến squalene, và sau đó đến triterpenoid Phytosterol được hình thành từ triteronoid hoặc cycloartenol (Dey and Harborne, 1991) Con đường từ acetyl-CoA đến squalene chung cho tất cả các sinh vật, nhưng trình tự thay đổi của hệ thống vòng sterol và chuỗi bên có thể khác nhau từ các loài hoặc thậm chí trong các mô khác nhau hoặc trong giai đoạn phát triển khác nhau của thực vật Sự sản xuất sterol xảy ra trong cytosolic và microsome trong ngăn của tế bào thực vật (Huang, 2003)

Hàm lượng γ-oryzanol ở các loại gạo khác nhau do sự phân bố γ-oryzanol trong

hạt gạo không đồng đều

γ-oryzanol tập trung chủ yếu trong phần vỏ cám, do đó hàm lượng γ-oryzanol trong gạo lứt cao hơn rất nhiều so với gạo trắng do gạo lứt vẫn còn giữ lại lớp vỏ cám Trong một số nghiên cứu cho thấy ngâm gạo lứt trong nước và cho nảy mầm làm tăng hàm lượng các chất chống oxi hóa trong đó có γ-oryzanol so với gạo lứt

thông thường

γ-oryzanol có hoạt tính chống oxi hóa cao, làm giảm cholesterol trong huyết thanh, làm giảm hấp thu cholesterol và làm giảm xơ vữa động mạch sớm, ức chế

tụ tiểu cầu, ức chế tiến triển của các khối u bướu (Yasukawa et al., 1998)

2.3.4 Acid ferulic

Acid ferulic là một dẫn xuất của acid cinnamic với công thức phân tử C10H10O4 Acid ferulic là một trong những chuyển hóa của quá trình sinh tổng hợp ligin từ phenylalanine và tyrosine ở thực vật Trong tế bào thực vật, acid ferulic được tìm thấy ở hai dạng: dạng tự do và dạng liên hợp Tổng của hai dạng này cho biết hàm lượng tổng của acid ferulic Trong gạo trắng, gạo lứt và gạo mầm chứa hàm lượng lớn acid ferulic và phần lớn ở dạng không hòa tan Hàm lượng acid ferulic

ở gạo lứt và gạo mầm cao hơn gạo trắng Hàm lượng acid ferulic tổng tương ứng với gạo trắng, gạo lứt và gạo mầm là: 5,13; 15,51 và 20,52 mg/100g (Tian et al.,

2004)

Tính chất chống oxi hóa của acid ferulic có được là do các nguyên tử phenolic và một mạch bên khá dài Acid ferulic bảo vệ DNA và lipid chống lại quá trình oxi hóa thông qua kiểu phản ứng oxi hóa Theo đó thì acid ferulic có lợi trong việc trì hoãn hoặc có thể điều trị chứng rối loạn liên quan đến việc có quá nhiều nguyên

tử oxi trong máu như các bệnh Alzheimer’s, tiểu đường, cao huyết áp, xơ vữa động mạch Hơn nữa, cấu trúc đặc biệt của acid ferulic giúp cho nó có khả năng hấp thụ mạnh tia UV do đó nó trở thành một tác nhân bảo vệ cho da rất quan trọng (Lin et al., 2005)

Acid ferulic còn là một hợp chất có hoạt tính sinh học được cho là làm giảm cholesterol cũng như là có khả năng chống oxi hóa Sự chống oxi hóa của acid ferulic dựa trên sự cung cấp proton của nhóm hydroxyl (Nystrom et al., 2007)

2.4 CÁC ENZYME TRONG GẠO NẾP NẢY MẦM

2.4.1 Enzyme amylase

Amylase, một loại enzyme có ý nghĩa về mặt sinh lý, thương mại và lịch sử còn

được gạo là diastase Enzyme này có ở cả thực vật và động vật

Amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác sự phân giải các liên kết glucoside nội phân tử trong các polysaccharide với sự tham gia của nước Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin hạn chế Amylase trong nước bọt còn được gọi là ptyalin Amylase phân

bố rộng rãi trong tự nhiên và là một trong những loại enzyme được ứng dụng rỗng rãi nhất trong công nghiệp, y tế và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt là

trong các ngành công nghiệp thực phẩm Amylase đƣợc thu nhận từ hạt nảy mầm,

nấm mốc, nấm men và vi khuẩn

2.4.1.1 Phân loại enzyme

Hiện nay có sáu loại enzyme amylase và đƣợc xếp thành hai nhóm: endoamylase

(enzyme nội bào) và exoamylase (enzyme ngoại bào)

Endoamylase: gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh Nhóm enzyme khử nhánh này đƣợc chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase (hay α-dextrin 6-glucanohydrolase); khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) và amylo-1,6-glucosidase Các enzyme này thủy phân các liên kết

bên trong của chuỗi polysaccharide

Exoamylase: gồm có β-amylase và γ-amylase Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide

Hình 2.7 Các loại enzyme endoamylase và exoamylase

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004)

2.4.1.2 Cơ chất của enzyme amylase

Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen

a Tinh bột

Là nhóm carbohydrate ở thực vật có chủ yếu trong các loại củ như khoai lang, khoai tây, khoai mì,…trong các loại ngũ cốc, các loại hạt và có công thức tổng quát là (C6H12O6)n Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều cấu tạo từ amylose và

amylopectin Các loại tinh bột đều có 20-30% amylose và 70-80% amylopectin

Amylose có trọng lượng phân tử 50.000-160.000, được cấu tạo từ 200-1.000 phân

tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glycoside tạo thành một mạch xoắn

dài không phân nhánh

Amylopectin có trọng lượng phân tử 400.000 đến hàng chục triệu, được cấu tạo

từ 600-6.000 phân tử D-glucose, nối với nhau bởi liên kết 1,4-glucoside và

α-1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh

Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng khi hỗn hợp dịch tinh bột bị đun nóng (60-850C) thì tinh bột sẽ bị hồ hóa và được gọi là hồ tinh bột Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucoside bị phân cắt Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo hai mức độ: dịch hóa và đường hóa Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi dextrin tiếp tục bị đường hóa thì sản phẩm là maltose và glucose (Nguyễn Đức

Lượng và ctv, 2004)

b Glycogen

Glycogen là một loại carbohydrate dự trữ ở động vật được dự trữ trong cơ thể động vật và được cơ thể chuyển hóa để sử dụng từ từ Amylase có vai trò quan trọng trong sự chuyển hóa glucid ở tế bào động vật và vi sinh vật Glycogen được cấu tạo từ các glucose liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside Ở các vị trí phân nhánh, glucose có số mạch nhánh nhiều hơn tinh bột Phân tử lượng ở trong khoảng 2 triệu - 3 triệu Glycogen dễ tan trong nước, nếu như chúng ta ăn quá nhiều carbohydrate trong cơ thể thì cơ thể chúng ta sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ Ở động vật và người, glycogen tập trung chủ yếu ở trong gan (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004)

2.4.1.3 Các loại enzyme amylase

a Enzyme α-amylase (1,4-α-glucan 4-glucanhydrolase) (EC 3.2.1.1)

α-amylase có khả năng phân cắt liên kết α-1,4-glucoside của cơ chất một cách ngẫu nhiên và là enzyme nội bào (endoamylase) α-amylase không chỉ có khả

năng thủy phân hồ tinh bột mà còn có khả năng thủy phân tinh bột nguyên vẹn

Cơ chế tác dụng của α-amylase:

Trước tiên enzyme này phân cắt một số liên kết trong tinh bột tạo ra một lượng lớn dextrin phân tử thấp, sau đó các dextrin này thủy phân tiếp tục để tạo ra

maltose và glucose

Amylose bị phân cắt thành các oligosaccharide hay còn gọi là polyglucose (6 - 7 gốc glucose) dưới tác dụng của α-amylase, sau đó các oligosaccharide tiếp tục bị phân cắt nên chuỗi ngắn dần và tạo thành maltotetrose, maltotriose, maltose Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm của quá trình thủy phân amylose là 13% và 87%

maltose

Tác dụng của α-amylase trên amylopectin cũng xảy ra tương tự và sản phẩm được tạo là 72% maltose, 19% glucose, ngoài ra còn có phân tử dextrin phân tử thấp và isomaltose (8%) do α-amylase không thể cắt được liên kết 1,6-glucoside ở

mạch nhánh của phân tử amylopectin

b Enzyme β-amylose (1,4-glucan-maltohydrolase) (EC 3.2.1.2)

β-amylose hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là ở hạt nảy mầm Ở trong các hạt ngũ cốc nảy mầm, β-amylose xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4-glucan trong tinh bột, glycogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu

c γ-amylase (glucoamylase hay α-1,4-glucan-glucohydrolase) (EC 3.2.1.3)

Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, amylopectin, dextrin, pentose, isomaltose và maltose thành glucose mà không cần sự tham gia của các amylase khác Glucoamylase thủy phân giải phóng polysaccharide có nhánh như amylopectin, glycogen, β-amylose bị glucoamylase thủy phân khá

nhanh

Glucoamylase có khả năng thủy phân liên kết α-1,4 lẫn α-1,6-glucoside Khi thủy phân liên kết α-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose Ngoài

ra, gluamylase còn có khả năng thủy phân các liên kết α-1,2 lẫn α-1,3-glucoside

d Oligo-1,6-glucoside hay dextrinase tới hạn (dextrin-6-glucanhydrolase) (EC 3.2.1.10)

Enzyme này thủy phân liên kết α-1,6-glucoside trong isomaltose, pentose và các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được Enzyme này có ở vi sinh vật

nhưng đồng thời cũng có trong hạt nảy mầm

Ngoài oligo-1,6-glucosidase, hệ dextrinase của hạt ngũ cốc nảy mầm còn có amylopectin-1,6-glucosidase hay R-enzyme (EC 3.2.1.9) và dextrin-1,6-glucosidase hay amylo-1,6-glucosidase hay dextrin-1,6-glucanhydrolase (EC 3.2.1.33) Hai loại enzyme này đều thủy phân dextrin triệt để hơn α và β-amylase

do đó trong dịch thủy phân có nhiều maltose hơn

e Pullunase (EC 3.2.1.4)

Pullunase thủy phân liên kết α-1,6-glucoside trong tinh bột hay glycogen pH tối thích là 5,1 và nhiệt độ hoạt động tối thích là 45,70C Enzyme này có khả năng thủy phân các dextrin phân tử thấp gồm 2 gốc maltose nối với nhau bằng liên kết

α-1,6-glucoside

f Transglucoside (EC 3.2.1.68)

Transglucoside luôn tương tác với glucoamylase Nó có hoạt tính transferase lẫn hoạt tính thủy phân nên sự có mặt của nó trong dung dịch thường gây sự nhầm lẫn với sự tồn tại của glucoamylase Transglucoside không chỉ thủy phân maltose thành glucose mà còn tổng hợp isomaltose và panose, tức là nó có khả năng chuyển gốc glucose và chuyển nó vào phân tử maltose hoặc phân tử glucose bằng liên kết α-1,6-glucoside để tạo thành maltose hoặc isomaltose (Nguyễn Đức Lượng

và ctv., 2004)

2.4.2 Enzyme phytase

Phytase (myo-inositol hexakis photphat phosphohydrolase) là một enzyme đặc biệt của lớp enyme phosphatase xúc tác phản ứng thủy phân liên kết phosphomonoester của acid phytic giải phóng orthophosphate vô cơ và các dẫn xuất myo-inositol chứa ít nhóm photphate hơn, có thể thành myo-inositol tự do (Oh et al., 2004)

Dựa vào đặc điểm sinh hóa và trình tự acid amin, có thể phân phytase thành hai lớp: Histidine acid phytase (HAP; EC 3.1.3.2) (Van et al., 1952) và Alkaline phytase (chưa có EC) Lớp enzyme HAP có sự đặc hiệu với cơ chất rộng và thủy phân các phytase không liên kết với kim loại ở pH acid tạo ra sản phẩm cuối là myo-inositol monophosphate Trái lại, lớp Alkaline phytase chỉ đặc hiệu đối với phức hợp Canxi-phytate và tạo sản phẩm cuối là myo-inositol triphosphate (Oh et al., 2004)

Hình 2.8 Hoạt động của phytase

(Nguồn: http://nptel.ac.in/courses/102103016/module5/lec40/2.html)

Do hầu hết phytase có nguồn gốc vi khuẩn, nấm và thực vật đều thuộc lớp HAP nên các nghiên cứu về phytase đều được thực hiện trên HAP Đặc điểm enzyme phytase chủ yếu được mô tả trên HAP vì hầu hết các phương pháp xác định hoạt tính phytase điều được thiết kế để đo lượng hoạt tính phosphate vô cơ được giải phóng từ cơ chất phytate không liên kết với kim loại (sodium phytate) (Englen et al., 1994)

Theo Ủy Ban Thuật Ngữ thuộc Hiệp Hội Sinh Hóa và Sinh Học Phân Tử Quốc

Tế (Nonmenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology – NC – IUBMB), Hiệp Hội Quốc Tế về Hóa Học và Ứng Dụng (The International Union of Biochemistry – IUB), phytase được phân thành hai nhóm dựa trên thứ tự ưu tiên nhóm phosphate bị tấn công trong vòng carbon của Inositol: 3-phytase (EC 3.1.3.8) và 6-phytase (EC 3.1.3.26) (Oh et al., 2004)

Phytase có nhiều trong các loại ngũ cốc như lúa mì, bắp, lúa mạch, gạo, và từ các loại đậu nành, đậu trắng…Phytase cũng được tìm thấy trong mù tạt, khoai tây, củ cải, rau diếp, rau bina, và phấn hoa huệ tây (Dvorakova, 1998) Trong hạt đang nảy mầm hoặc trong hạt phấn phytase có vai trò phân giải phytin (William and Taylor,

1985)

2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ của enzyme

2.4.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Khảo sát trong trường hợp đơn giản nhất, phản ứng chỉ có một cơ chất (S), enzyme (E) xúc tác cho sự chuyển hóa cơ chất [S] chỉ tạo thành một sản phẩm,

phản ứng như sau:

Ở giai đoạn đầu khi nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất Khi toàn bộ lượng enzyme trong phản ứng điều tham gia vào phản ứng ES, tốc độ phản ứng sẽ đạt cực đại Tuy nhiên, sự liên hệ này chỉ giới hạn đến nồng độ nhất định nào đó thôi Nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất

sẽ ức chế ngược lại hoạt động xúc tác của enzyme (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011)

2.4.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Trong trường hợp thừa cơ chất nồng độ enzyme tăng sẽ làm tăng tốc độ phản ứng Sự tăng tốc độ phản ứng trong tế bào sinh vật lại phụ thuộc rất nhiều vào khả năng điều hòa gen Nhìn chung gốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính với nồng

Cũng có trường hợp khi nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm (Lê Ngọc Tú và ctv., 2004)

2.4.3.3 Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa

Các chất hoạt hóa làm tăng hoạt độ xúc tác của enzyme, thường có bản chất hóa học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại nằm ở ô thứ 11 đến ô thứ 55 của bản tuần hoàn hóa học Medelev hoặc các chất hữu cơ có cấu tạo phức tạp hơn làm nhiệm vụ chuyển nhóm, chuyển hydro hoặc các chất có khả năng phá vỡ một

số liên kết trong phân tử tiền enzyme hoặc các chất có tác dụng phục hồi những

nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme

Ví dụ, tác dụng của anion Clo, Brom, Iod đến hoạt độ của α-amylase động vật Tuy nhiên, tác dụng hoạt hóa chỉ giới hạn ở những nồng độ xác định, vượt quá

giới hạn này có thể làm giảm hoạt độ của enzyme

Glutation dạng khử (Glu-Cys-Gli) có tác dụng khử liên kết disulfur thành nhóm disulfi (-SH) nên cũng có tác dụng hoạt hóa nhiều enzyme Các chất đã nêu trên thường kết hợp trực tiếp với phân tử enzyme, làm thay đổi cấu tạo không gian của

nó theo hướng có lợi cho hoạt độ xúc tác của enzyme Một số chất có thể tác dụng theo cách gián tiếp, ví dụ, loại trừ các yếu tố kìm hãm khỏi môi trường phản ứng (Lê Ngọc Tú và ctv., 2004)

2.4.3.4 Ảnh hưởng của chất kiềm hãm

Hoạt động của enzyme có thể bị thay đổi dưới tác dụng của một số chất cơ bản chất hóa học khác nhau Các chất làm giảm hoạt độ enzyme nhưng không bị chuyển hóa thành enzyme được gọi là các chất kìm hãm hoặc các chất ức chế (inhibitor), thường ký hiệu là I, các chất này có thể là những ion, các phân tử vô

cơ, hữu cơ kể cả các protein Các chất ức chế tham gia trong điều hòa, kiểm tra

các quá trình trao đổi chất trong hệ thống sống

Các chất này gây biến tính protein là những chất kìm hãm không đặc hiệu Nhiều chất khác không làm biến tính protein nhưng vẫn làm giảm hoạt độ xúc tác của

enzyme theo cơ chế khác nhau

Các chất này có thể kìm hãm thuận nghịch hoặc không thuận nghịch enzyme Nếu là kìm hãm thuận nghịch, phản ứng kết hợp với enzyme và chất kìm hãm (I)

nhanh chóng đạt đến cân bằng

E + I k1 EI

k2

Trong trường hợp chất kìm hãm không thuận nghịch, k-1 rất bé có thể xem như bằng 0, I kết hợp với E bằng liên kết đồng hoá trị hoặc kết hợp rất chặt chẽ đến mức khó tách khỏi enzyme, sự phân ly phức EI là rất chậm Các chất kìm hãm cạnh tranh là các chất kìm hãm thuận nghịch enzyme có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất, do đó có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của E

chiếm chỗ kết hợp của cơ chất

Các chất kìm hãm không cạnh tranh: các chất này kết hợp với enzyme ở chỗ khác với trung tâm hoạt động, làm thay đổi dạng không gian của phân tử enzyme theo hướng không có lợi cho hoạt động cho xúc tác của nó, do đó làm giảm tốc độ phản ứng Sau khi kết hợp với chất kìm hãm không cạnh tranh, enzyme vẫn có thể tiếp tục kết hợp với cơ chất tạo thành phức EIS (Lê Ngọc Tú và ctv., 2004)

2.4.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng theo nhiệt độ trong giới hạn xác định mà ở đó phân tử enzyme vẫn bền và chưa bị biến tính Đại lượng đặc trưng cho ảnh hưởng nhiệt độ đến vận tốc phản ứng hóa học cũng như phản ứng enzyme là hệ số Q10

Hệ số Q10 càng lớn, phản ứng càng khó xảy ra ở nhiệt độ bình thường, hệ số Q10của phản ứng enzyme là từ 1 đến 2 (của phản ứng hóa học từ 2 đến 3) Từ hệ số

Q10 có thể tính năng lượng hoạt hóa của enzyme phản ứng, đánh giá quá trình xúc tác Nhiệt độ phản ứng với hoạt độ enzyme cao nhất gọi là nhiệt độ tối ưu của enzyme (Lê Ngọc Tú và ctv., 2004)

Nhiệt độ tối ưu của những enzyme khác nhau hoàn toàn khác nhau Nếu đưa nhiệt

độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm Khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính Nhiệt độ tối ưu của enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH, các chất bảo vệ Khi nhiệt độ cao thường làm mất hoạt tính của enzyme Phản ứng vô hoạt của enzyme dưới tác

dụng của nhiệt thường biểu diễn thứ bậc một

Người ta thường sử dụng yếu tố nhiệt độ để điều khiển hoạt động của enzyme và tốc độ phản ứng trong chế biến và bảo quản thực phẩm (Nguyễn Đức Lượng và ctv.,

2004)

2.4.3.6 Ảnh hưởng của pH

pH của môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, enzyme

và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền enzyme Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến enzyme (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2004)

Đa số các enzyme bền trong giới hạn pH = 5 – 9, độ bền của enzyme có thể tăng lên khi có các yếu tố làm bền như cơ chất, coenzyme, Ca2+,…(Lê Ngọc Tú và ctv.,

2004)

2.5 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

Banchuen et al (2010) cũng đã nghiên cứu về tối ưu hóa quá trình nảy mầm của

3 giống lúa khác nhau của Thái Lan để đạt được hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học trong gạo mầm là cao nhất Trong quá trình nảy mầm thì hàm lượng GABA được sinh ra tăng 9,43 đến 16,74 lần, ngoài ra quá trình nảy mầm còn làm tăng hàm lượng acid ferulic từ 1,12 đến 1,43 lần, trong khi đó hàm lượng phytate

giảm sau quá trình nảy mầm từ 0,27 – 0,29%

Keqin et al (2010) đã nghiên cứu hoạt tính phytase quá trình ngâm và nảy mầm

của gạo lứt ở 2 giống lúa II-838 (Trung Quốc) và THU-35C (Nhật Bản) Theo kết quả nghiên cứu, hàm lượng enzyme phytase tăng 82% so với nguyên liệu ban

đầu

Khampang et al (2009) đã nghiên cứu về sự thay đổi thành phần hóa học trong

lúa và ngũ cốc trong quá trình nảy mầm Trong quá trình nảy mầm thì hàm lượng

acid phytic giảm từ 3,47% đến 5,27%

Moong-ngarm (2005) đã nghiên cứu về ảnh hưởng của quá trình nảy mầm lên sự thay đổi của hàm lượng acid phytic, hoạt tính enzyme phytase, giá trị tiềm năng của acid phytic và các sản phẩm giảm cấp của nó như là nguồn của các hợp phần chống oxi hóa Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính enzyme phytase trong gạo cho nảy mầm trong 4 ngày tăng 7,3 lần so với gạo không cho nảy mầm và quá

trình nảy mầm cũng làm giảm hàm lượng acid phytic trong gạo mầm

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

Địa điểm: phòng thí nghiệm bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông Nghiệp

và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ

Thời gian: từ tháng 08 đến tháng 11 năm 2014

3.1.2 Nguyên liệu

Thí nghiệm được tiến hành khảo sát trên giống nếp than (DH6) và nếp trắng (CLN) Hai giống nếp được mua tại An Giang và tại Sóc Trăng Hai giống nếp than và nếp trắng là các giống đang được quan tâm hiện nay Các giống lúa này sau khi thu mua và tiến hành đo ẩm, cho vào bao bì PE buộc kín và bảo quản ở nhiệt độ mát để làm mẫu cho các thí nghiệm, đảm bảo độ đồng nhất cho thí

nghiệm

Hình 3.1 Nguyên liệu nếp than và nếp trắng

3.1.3 Dụng cụ - Thiết bị thí nghiệm

- Cân điện tử 2 số lẻ (độ chính xác 0,01 gram), cân điện tử 3 số lẻ (độ chính xác

0,001 gram), cân điện tử 4 số lẻ (độ chính xác 0,0001 gram)

- Hệ thống phân tích đạm

- Máy đo pH vernier SENSOR

- Máy đo độ ẩm (MA35-sartorius35)

- Máy ly tâm(2323K-Hermel)

- Tủ ủ CO2 (Sanyo MCO-5AC)

- Bếp hồng ngoại (SANAKY)

- Máy đo mật độ quang phổ Spectrophotometer (CECIL, UK)

- Một số dụng cụ thủy tinh phòng thí nghiệm

- Các dụng cụ khác có liên quan: rổ nhựa, thau, cốc, muỗng, khăn

3.1.4 Hóa chất

- Acid tricloacetic (Trung Quốc)

- Triton X100 (Mỹ)

- BSA (bovine serum albumin) (Trung Quốc)

- Acid acetic (Trung Quốc)

- Sodium phytate (Sigma)

- Ammonium heptanmolybdate (Trung Quốc)

- Acid nitric (Việt Nam)

- Potassium thiocyanate (KSCN) (Việt Nam)

- Nước cất (Việt Nam)

- Cồn tuyệt đối (Việt Nam)

- NaOH (Việt Nam)

- Fe(NO3)3 chuẩn (Việt Nam)

3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.2.1 Phương pháp thí nghiệm

Đề tài sẽ tiến hành nghiên cứu quy trình sản xuất gạo mầm từ hai giống nếp than

và nếp trắng Khảo sát sự thay đổi hàm lượng phytate và hoạt tính của hai giống nếp trong từng điều kiện sản xuất Lựa chọn các giải pháp tiến hành để đạt được

hàm lượng hợp chất chức năng

Các chỉ tiêu đánh giá: độ ẩm, hàm lượng protein, lipid, phytate, hoạt tính enzyme

phytase

Nội dung thí nghiệm được thực hiện:

- Các chỉ tiêu được đo đạc và phân tích bằng thiết bị xác định độ ẩm, thiết bị phân

tích đạm tổng số, máy đo mật độ quang phổ Spectrophotometer (CECIL, UK)

- Kết quả khảo sát được so sánh và đánh giá theo chương trình Statgraphic 16.0

3.2.2 Phương pháp phân tích

Chỉ tiêu Phương pháp

Độ ẩm Phương pháp sấy ẩm ở nhiệt độ 1050

C Đạm tổng số Phương pháp Kjeldahl

Lipid Phương pháp Soxhlet

Phytate Theo phương pháp của Wheeler, E., and Ferrel, R E (1971)

Enzyme phytase Phương pháp xác định hoạt tính phytase (Heinonen and Lahti,

1981) 3.3 NỘI DUNG THÍ NGHIỆM

3.3.1 Quy trình thí nghiệm

Các thí nhiệm sẽ được tiến hành theo quy trình tổng quát:

Hình 3.2 Quy trình thí nghiệm

Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần Thông số tối ưu của thí nghiệm được chọn làm cơ sở để khảo sát cho thí

nghiệm tiếp theo

Thuyết minh quy trình:

Hai giống nếp than và nếp trắng được chọn để tiến hành thí nghiệm này Gạo lứt thu được sau quá trình xay xát được rửa sạch trong nước để loại bỏ tạp chất và một số vi sinh vật bám trên bề mặt hạt Sau đó, ngâm hạt trong nước cất và các dung dịch có pH khác nhau cho đến khi đạt trạng thái cân bằng ẩm thì vớt ra để ráo nước Sau đó tiến hành ủ hạt trong điều kiện hàm lượng CO2 khác nhau ở nhiệt độ 370C cho đến khi hạt nảy mầm trong các khoảng thời gian khác nhau

Gạo lứt (2 giống khác nhau)

Sau khi kết thúc quá trình nảy mầm, hạt được sấy khô ở các chế độ nhiệt độ khác

nhau đến độ ẩm an toàn < 13% và cho vào bao bì để bảo quản

3.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại Kết quả tối ưu của thí nghiệm trước sẽ được chọn để thực hiện cho các thí nghiệm sau Các thí nghiệm đều được thực hiện tương tự trên cả hai giống nếp với cùng các điều kiện thí

nghiệm nhằm đưa ra sự so sánh chọn lựa giống điều kiện tốt nhất

Trích dịch chiết enzyme trong nguyên liệu bằng các mức pH và nhiệt độ khác

nhau Tiến hành đo quang phổ với bước sóng 700 nm

d) Chỉ tiêu phân tích

Phân tích hoạt tính phytase, chọn pH và nhiệt độ tối ƣu của enzyme phytase sử

dụng cho các thí nghiệm sau

3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát pH dung dịch ngâm ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 6 giờ đến hàm lƣợng hợp chất chức năng sinh ra