định lượng paclitaxel trong huyết tương thỏ bằng HPLC

Góp phần vào quy trình nghiên cứu, sản xuất thuốc paclitaxel generic d ng dung dịch và đông khô, đề tài khóa luận tốt nghiệp” Khảo sát nồng độ thuốc tiêm paclitaxel d ng dung dịch trong

Trang 1

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học - 2013

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ v

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT vii

LỜI CẢM ƠN viii

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 2

2.1 PACLITAXEL 2

2.1.1 Cấu trúc và tác động 2

2.1.2 Tính chất vật lý và dược động học 4

2.1.3 Liều lượng và cách dùng 4

2.1.4 Ðộ ổn định và bảo quản 5

2.2 MÔ HÌNH DƯỢC ĐỘNG 1 NGĂN, 2 NGĂN 5

2.2.1 Mô hình dược động một ngăn 6

2.2.2 Mô hình dược động hai ngăn 7

2.2.3 Mô hình dược động nhiều ngăn 10

2.3 DƯỢC ĐỘNG HỌC 12

2.3.1 Dược động học 12

2.3.2 Những thông số dược động cơ bản 13

2.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA PTX 17

2.5 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 18

2.5.1 Tính phù hợp của hệ thống 19

2.5.2 Tính đ c hiệu 19

2.5.3 Độ đúng và độ chính xác 20

2.5.4 Giới h n định lượng dưới 20

2.5.5 Đư ng chuẩn và khoảng tuyến tính 21

2.5.6 Tỷ lệ thu hồi 22

Trang 2

2.5.7 Độ ổn định của mẫu thử 23

2.6 KĨ THUẬT CHIẾT TÁCH ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH 25

2.6.1 Kĩ thuật tách 25

2.6.2 Kĩ thuật chiết 26

CHƯƠNG 3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 28

3.2 HÓA CHẤT VÀ THUỐC THỬ NGHIỆM 28

3.2.1 Thuốc thử 28

3.2.2 Thuốc đối chứng 28

3.2.3 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 29

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.3.1 Pha mẫu chuẩn 30

3.3.2 Phương pháp chiết 30

3.3.3 Điều kiện sắc kí 31

3.3.4 Định lượng palitaxel trong huyết tương thỏ 32

3.3.5 Quy trình 32

3.3.6 Phương pháp xử lý mẫu 32

3.3.7 Xử lý kết quả 33

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32

4.1 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PTX (PTX) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VỚI ĐẦU DÒ DÃY DIOT QUANG (PDA) 32

4.1.1 Điều kiện sắc kí 32

4.1.2 Tính phù hợp hệ thống 32

4.1.3 Tính đ c hiệu 33

4.1.4 Độ đúng trong ngày và liên ngày 37

4.1.5 Đư ng chuẩn và khoảng tuyến tính 38

4.1.6 Giới h n định lượng dưới 39

4.1.7 Tỷ lệ thu hồi – Hiệu suất chiết CAR 40

Trang 3

4.1.8 Tỷ lệ thu hồi – Hiệu suất chiết PTX 41

4.1.9 Độ l p l i và độ chính xác liên ngày 42

4.1.10 Độ ổn định của mẫu thử 43

4.2 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ THUỐC GỐC PTX (CHẾ PHẨM STRAGEN 30 MG/5 ML) VÀ THUỐC THỬ PTX DẠNG DUNG DỊCH 45

4.2.1 Kết quả thẩm định đư ng tuyến tính trong ngày 45

4.2.2 Kết quả thực nghiệm thuốc chứng Stragen 30 mg/5 ml 46

4.2.3 Kết qủa thực nghiệm thuốc thử 49

4.3 BÀN LUẬN 57

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59

5.1 KẾT LUẬN 59

5.2 KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

Trang 4

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Thông số tính phù hợp hệ thống 32

Bảng 4.2 Độ đúng trong ngày và liên ngày 37

Bảng 4.3 Độ đúng và chính xác ở LLOQ 39

Bảng 4.4 Tỷ lệ thu hồi và hiệu suất chiết CAR 40

Bảng 4.5 Hiệu suất chiết PTX trong huyết tương ở 4 nồng độ 41

Bảng 4.6 Độ l p l i và độ chính xác liên ngày ở 4 nồng độ 42

Bảng 4.7 Nồng độ PTX tìm l i sau 6 gi bảo quản trong autosampler ở 15 oC 43

Bảng 4.8 Nồng độ PTX tìm l i sau khi pha mẫu để ở nhiệt độ phòng trong 6 gi 43

Bảng 4.9 Nồng độ PTX đo được sau 3 chu kì đông và rã đông 44

Bảng 4.10 Kết quả nồng độ thuốc trong huyết tương thỏ liều 3 mg/kg 46

Bảng 4.11 Nồng độ thuốc gốc PTX trong huyết tương thỏ (µg/ml) 47

Bảng 4.12 Các thông số dược động của PTX gốc trên thỏ 49

Bảng 4.13 Nồng độ thuốc thử PTX công thức 1 trong huyết tương thỏ (µg/ml) 51

Bảng 4.14 Thông số dược động của thuốc thử công thức 1 53

Bảng 4.15 Nồng độ thuốc thử PTX công thức 2 trong huyết tương thỏ (µg/ml) 55

Bảng 4.16 Thông số dược động của thuốc thử công thức 2 56

Bảng 4.17 So sánh giữa thuốc chứng và thuốc thử 57

Trang 5

DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 2.1 Cấu trúc PTX 2

Hình 2.2 Nhân taxan 3

Hình 2.3 Mô hình dược động một ngăn 6

Hình 2.4 (a) Nồng độ thuốc trong huyết tương (Cp) theo th i gian, (b) log Cp theo th i gian ở mô hình dược động một ngăn 7

Hình 2.5 Mô hình dược động hai ngăn 8

Hình 2.6 (a) Nồng độ thuốc trong huyết tương theo th i gian, (b) log Cp theo th i gian ở mô hình dược động 2 ngăn 9

Hình 2.7 (a) Nồng độ thuốc theo th i gian, (b) log Cp theo th i gian ở mô hình dược động 3 ngăn 11

Hình 2.8 Chu trình thuốc trong cơ thể 12

Hình 2.9 AUC của thuốc 13

Hình 2.10 Sơ đồ đơn giản hệ thống HPLC 26

Hình 2.11 Các bước chính trong quá trình chiết lỏng – lỏng 27

Hình 2.12 Các bước chính trong quá trình chiết rắn SPE 28

Hình 3.1 Sơ đồ chiết PTX trong huyết tương 31

Hình 4.1 Hình sắc kí mẫu chuẩn và mẫu thử tự t o 36

Hình 4.2 Đồ thị đư ng chuẩn và khoảng tuyến tính 38

Hình 4.3 Đồ thị đư ng chuẩn và khoảng tuyến tính trong ngày 45

Hình 4.4 Đồ thị đư ng chuẩn và khoảng tuyến tính trong ngày 46

Hình 4.5 Biểu đồ nồng độ thuốc PTX đối chiếu trong huyết tương thỏ theo th i gian

48

Trang 6

Hình 4.6 Biểu đồ nồng độ thuốc PTX đối chiếu trung bình trong huyết tương thỏ 49 Hình 4.7 Đồ thị đư ng tuyến tính trong ngày 50 Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn nồng độ thuốc PTX công thức 1 trong huyết tương thỏ 52 Hình 4.9 Đồ thị biểu diễn nồng độ thuốc PTX công thức 1 trung bình trong huyết

tương thỏ 52

Hình 4.10 Đư ng tuyến tính trong ngày 54 Hình 4.11 Đồ thị biểu diễn nồng độ thuốc PTX công thức 2 trong huyết tương thỏ 55

Trang 7

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT

5 CrEL Cremopher và ethanol

7 HPLC High performance liquid

chromatography

Sắc kí lỏng hiệu năng cao

10 LLOQ Lower limit of quantitation Giới h n định lượng dưới

trong huyết tương

Trang 8

Và l i cảm ơn chân thành đến gia đình và b n bè đã động viên, khuyến khích em vƣợt qua những lúc khó khăn trong th i gian thực hiện đề tài

Trang 9

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh ung thư đang là vấn đề được quan tâm hàng đầu trên thế giới Theo ước tính của

Tổ chức y tế thế giới thì hàng năm có khoảng 9-10 triệu ngư i mắc bệnh ung thư và một nửa trong số đó chết vì căn bệnh này Số bệnh nhân ngày càng gia tăng mỗi năm trong đó tỷ lệ mắc bệnh ở các nước nghèo ngày càng tăng trong khi tỷ lệ này ở các nước giàu có xu hướng giảm Tỷ lệ mắc bệnh giữa nam và nữ cũng khác nhau (nam/nữ

là 1/3) Các lo i ung thư thư ng g p là ung thư phổi, vú, đ i trực tràng, d dày và gan, theo thứ tự giảm dần Ở Việt Nam, tình hình bệnh ung thư cũng đáng lo ng i với ước tính mỗi năm có khoảng 150000 ngư i mới mắc và khoảng 50-70 nghìn ngư i chết vì ung thư Tỷ lệ chết vì ung thư ở Việt Nam hiện cao nhất thế giới Để điều trị căn bệnh này, có thể áp dụng phương pháp phẫu thuật, x trị, hóa trị hay điều trị kết hợp Những thuốc trị ung thư phổ biến hiện nay được xếp vào 7 nhóm (nhóm kháng chuyển hóa, ức chế vi quản tế bào, alkyl hóa, kháng sinh, nội tiết tố, kháng thể và cytokin) Trên thị trư ng Việt Nam hiện nay, thuốc trị ung thư phần lớn là các thuốc ngo i nhập với giá thành cao Chính vì vậy, nhằm mục tiêu giảm giá thành thuốc cho bệnh nhân mà vẫn giữ được hiệu quả trị liệu tốt nhất, bộ môn Hóa Dược, bộ môn Công Nghiệp Dược – Khoa Dược – đ i học Y Dược Tp Hồ Chí Minh phối hợp với Viện kiểm nghiệm thuốc

Tp Hồ Chí Minh tiến hành nghiên cứu bào chế thuốc paclitaxel generic d ng dung dịch dầu tiêm tĩnh m ch Góp phần vào quy trình nghiên cứu, sản xuất thuốc paclitaxel generic d ng dung dịch và đông khô, đề tài khóa luận tốt nghiệp” Khảo sát nồng độ thuốc tiêm paclitaxel d ng dung dịch trong huyết tương thỏ” được thực hiện với mục tiêu:

- Thẩm định quy trình định lượng paclitaxel trong huyết tương thỏ

- So sánh nồng độ paclitaxel trong huyết tương thỏ giữa chế phẩm Stragen®30 mg/5

ml và chế phẩm thuốc tiêm paclitaxel d ng dung dịch

Trang 10

PTX: thuốc chống ung thư, thuộc nhóm taxan

Các chất thuộc nhóm taxan được sử dụng rộng rãi trong hóa trị liệu Trong đó hai chất được sử dụng nhiều nhất là docetaxel (chế phẩm Taxotere) và PTX (chế phẩm Taxol) Đây là những chất đầu tiên của nhóm tác động lên tulubin của tế bào PTX được Viện ung thư quốc gia (NCI) Mỹ đánh giá là một bước tiến quan trọng trong trị liệu trong khoảng những năm 1960 và được chấp nhận sử dụng từ tháng 12 năm 1992 PTX là một diterpenoid pseudoalkaloid có công thức phân tử C47H5NO14, trọng lượng phân tử

853 Dalton Để có tác động chống ung thư, toàn bộ nhân taxan phải hiện diện trong cấu

Trang 11

trúc PTX được phân lập từ những năm đầu 1960 từ vỏ cây Thủy tùng Thái Bình

Dương (Taxus brevifolia, họ Taxaceae) PTX được tinh chế năm 1969 và công thức

được xác định năm 1971 Năm 1979, lần đầu tiên ho t tính đ c biệt của PTX trên khối

u được khám phá bởi nhà khoa học Susan Horwitz

Cơ chế tác động của PTX:

Trư ng hợp bình thư ng

Trư ng hợp có PTX

Tubulin (monomer protein)

Vi ống (polymer)

Vi ống xoắn

(bình thư ng)

Chu kì tế bào bình thư ng

Tubulin

(polymer)

Vi ống xoắn ổn định

(22 A)

Chu kì tế bào bị gián

đo n (tế bào tự chết)

Trang 12

Nồng độ thuốc trong huyết tương tỷ lệ thuận với liều được truyền vào tĩnh m ch và

giảm theo đồ thị có 2 pha Tỷ lệ gắn với protein là 89% (in vitro) và không bị thay đổi

khi dùng cùng với cimetidin, ranitidin, dexamethason, ho c diphenhydramin Ở giai

đo n ổn định, thể tích phân bố trung bình ở d ng ổn định khi truyền PTX 24 gi thay đổi từ 227 – 668 L/m2

cho thấy thuốc khuếch tán nhiều ra ngoài m ch và/ho c gắn nhiều với các thành phần của mô Ngư i ta còn chưa biết rõ hoàn toàn sự phân bố và chuyển hóa thuốc trong cơ thể Th i gian bán thải trong huyết thanh là 6 - 13 gi Sau khi truyền tĩnh m ch, có khoảng 2 - 13% lượng thuốc được thải qua nước tiểu dưới

d ng ban đầu, như vậy là ngoài thận còn có những đư ng đào thải khác Trên động vật thí nghiệm, PTX được chuyển hóa t i gan Ðộ thanh thải dao động từ 0,3 đến 0,8 lít/gi /kg (hay 6,0 - 15,6 lít/gi / m2).[1]

2.1.3 Liều lượng và cách dùng [1]

Thuốc được truyền tĩnh m ch với liều 175 mg/m2

trong 3 gi Có thể l p l i sau một khoảng th i gian ít nhất là 3 tuần Chỉ dùng liều mới khi số lượng b ch cầu trung tính lớn hơn 1,5 x 109/lít (1.500/mm3) và số lượng tiểu cầu lớn hơn 100 x 109

/lít (100.000/mm3)

Ở ngư i bệnh có số lượng b ch cầu h t bị giảm n ng (dưới 0,5 x 109/lít) (500/mm3) trong quá trình điều trị dài hơn bằng PTX thì nên giảm 20% liều dùng

Việc pha thuốc để truyền tĩnh m ch phải do ngư i có kinh nghiệm tiến hành, ở một phòng thích hợp Khi pha thuốc cần phải mang găng tay và tiến hành thận trọng để tránh thuốc tiếp xúc với da và niêm m c Nếu da bị tiếp xúc với thuốc thì phải cọ rửa

Trang 13

kỹ da bằng nước và xà phòng; nếu niêm m c bị tiếp xúc với thuốc thì phải dùng nước súc rửa thật kỹ Việc pha thuốc phải đảm bảo vô khuẩn

Dung môi để pha loãng thuốc có thể là: dung dịch natri clorid 0,9%, dung dịch glucose 5%, hỗn hợp dung dịch natri clorid 0,9 % và dung dịch glucose 5%, ho c hỗn hợp dung dịch glucose 5% và dung dịch Ringer

Thông thư ng thuốc được pha vào một trong các dung dịch trên sao cho dịch truyền có nồng độ PTX là 0,3 - 1,2 mg/ml Chỉ dùng các lọ, chai truyền làm bằng thủy tinh, polypropylen hay polyolefin Bộ dây truyền phải được làm bằng polyethylen Không dùng dụng cụ làm từ vật liệu PVC (polyvinyl clorid) vì chất dẻo PVC có thể bị phá hủy

và giải phóng di-(2-ethyl-hexyl) phtalat (DEHP) khi tiếp xúc với PTX Dịch truyền chuẩn bị như trên ổn định về m t lý hóa trong vòng 27 gi ở nhiệt độ phòng (khoảng

25 oC) và có ánh sáng Tiến hành truyền dịch ngay ho c trong vòng 3 gi sau khi pha xong Không để dịch truyền đã pha vào tủ l nh

Trong quá trình pha chế, dịch truyền có thể trở nên hơi đục Ðiều này là do dung môi của chế phẩm nên dù lọc cũng không làm cho trong l i được Khi truyền nên cho dịch chảy qua một bầu lọc có lỗ lọc không lớn hơn 0,22 micromet trên đư ng truyền Ðiều này không ảnh hưởng đến chất lượng thuốc

2.1.4 Ðộ ổn định và bảo quản [1]

Các lọ thuốc chưa pha loãng phải để trong hộp, nhiệt độ 15 – 25 oC, tránh ánh sáng Thuốc được bảo quản trong tủ l nh ho c tủ đông đều được

2.2 MÔ HÌNH DƯỢC ĐỘNG 1 NGĂN, 2 NGĂN [10]

Mô hình dược động học là cấu trúc giả định để mô tả sự phân bố thuốc trong hệ thống sinh học thông qua sự theo dõi thuốc

Trang 14

2.2.1 Mô hình dược động một ngăn

Trong mô hình này, cơ thể được mô tả như một đơn vị động học đồng nhất Điều này giả định rằng thuốc đ t được sự phân bố trong cơ thể ngay lập tức và thuốc được cân bằng ngay tức thì giữa các mô Do vậy sự thay đổi nồng độ thuốc theo th i gian cho thấy diễn tiến theo một pha

Chú ý rằng điều đó không có nghĩa là nồng độ thuốc trong huyết tương (Cp) bằng nồng

độ thuốc trong mô Tuy nhiên, sự thay đổi nồng độ thuốc trong huyết tương phản ánh

sự thay đổi nồng độ thuốc trong mô Mối quan hệ này được thể hiện trong sơ đồ bên dưới Nếu lấy log Cp theo th i gian sẽ thu được mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ

và th i gian Đó là mô hình dược động một ngăn

Hình 2.3 Mô hình dược động một ngăn ka = hằng số hấp thu , k = tốc độ thải trừ

Phân bố một ngăn

Trang 15

Hình 2.4 (a) Nồng độ thuốc trong huyết tương (Cp) theo th i gian, (b) log Cp theo th i

gian ở mô hình dược động một ngăn

2.2.2 Mô hình dược động hai ngăn

Mô hình dược động hai ngăn chia cơ thể thành một ngăn trung tâm và một ngăn ngo i biên M c dù những ngăn này không có ý nghĩa sinh lý hay giải phẫu học, nó được giả định rằng ngăn trung tâm bao gồm các mô được tưới máu nhiều như tim, phổi, thận, gan và não Ngăn ngo i biên bao gồm các mô kém tưới máu hơn như cơ, mô mỡ và da

CP

Th i gian(a)

(b)logCP

Th i gian

Trang 16

Một mô hình dược động hai ngăn giả định rằng, sau khi thuốc vào ngăn trung tâm, thuốc sẽ phân bố giữa ngăn trung tâm và ngăn ngo i biên Tuy nhiên, thuốc không đ t được sự phân bố và cân bằng giữa hai ngăn ngay lập tức

Nồng độ thuốc theo th i gian được thể hiện trong hình dưới nhưng log Cp theo th i gian thể hiện một đáp ứng hai pha và có thể được dùng để phân biệt một thuốc thể hiện

mô hình dược động một hay hai ngăn

Hình 2.5 Mô hình dược động hai ngăn k12, k21 và k là hằng số tốc độ bậc 1 k12 = tốc

độ chuyển thuốc từ ngăn trung tâm ra ngăn ngo i biên; k21 = tốc độ chuyển thuốc từ ngăn ngo i biên vào ngăn trung tâm; k = tốc độ thải trừ thuốc ở ngăn trung tâm

Trang 17

Hình 2.6 (a) Nồng độ thuốc trong huyết tương theo th i gian, (b) log Cp theo th i

gian ở mô hình dược động 2 ngăn

(a)

CP

Th i gian

(b)logCP

Th i gian

Trang 18

Hình (b) cho thấy sự giảm nhanh nồng độ thuốc do sự thải trừ từ ngăn trung tâm và sự phân bố thuốc đến các ngăn ngo i biên Do vậy trong pha nhanh đầu tiên nồng độ thuốc giảm m nh ở ngăn trung tâm, tăng đ t đỉnh ở ngăn ngo i biên và sau đó giảm tối

đa

Sau một khoảng th i gian (t), nồng độ thuốc đ t được cân bằng phân bố giữa ngăn trung tâm và ngăn ngo i biên, và sự thải trừ thuốc được giả định là xuất hiện ở ngăn trung tâm Tương tự như mô hình dược động một ngăn, tốc độ của các quá trình được

mô tả bằng phản ứng bậc một

2.2.3 Mô hình dược động nhiều ngăn

Trong mô hình này, thuốc được phân bố vào nhiều ngăn và nồng độ thuốc theo th i gian được thể hiện bằng hàm số mũ Mỗi bậc số mũ mô tả một ngăn Ví dụ, gentamicin

có thể được mô tả bằng mô hình dược động 3 ngăn theo đơn liều tiêm tĩnh m ch

Trang 19

Hình 2.7 (a) Nồng độ thuốc theo th i gian, (b) log Cp theo th i gian ở mô hình dƣợc

Th i gian

Trang 20

Hệ số thanh thải (Clearance) biểu thị khả năng đào thải thuốc trong cơ thể

Thể tích phân bố (Volume of distribution = Vd) là ƣớc số khoảng biểu kiến trong cơ thể

có thể chứa thuốc

Sinh khả dụng (bioavailability) là tỷ lệ thuốc hấp thu vào tuần hoàn so với liều dùng

Nồng độ thuốc trong tuần hoàn

Liều dùng

Thuốc chuyển hóa và đào thải

Nồng độ thuốc ở nơi tác động

Trang 21

2.3.2 Những thông số dược động cơ bản

2.3.2.1 Diện tích dưới đường cong (AUC = area under curve) [2], [3]

Cho bệnh nhân nhân uống thuốc rồi đo nồng độ thuốc trong máu từ khi bắt đầu cho thuốc vào cơ thể đến khi số lượng thuốc còn l i trong cơ thể không đáng kể Vẽ đư ng biểu diễn liên quan giữa nồng độ thuốc với th i gian Diện tích của phần dưới đư ng cong nồng độ - th i gian với trục tung - trục hoành được gọi là "diện tích dưới đư ng cong - AUC"

Hình 2.9 AUC của thuốc

Ý nghĩa: Từ giá trị AUC có thể tính ra trị số sinh khả dụng của thuốc

Thời gian (giờ)

Trang 22

Vận tốc hấp thu được đo lư ng bởi:

Nồng độ tối đa trong huyết tương (Cmax)

Th i gian để đ t được nồng độ tối đa (Tmax)

Hằng số của vận tốc hấp thu (ka)

Đối với một d ng bào chế được cho dùng bằng dư ng uống có hai lo i SKD:

Sinh khả dụng tuyệt đối:

Được tính đối với d ng bào chế làm chuẩn: dung dịch tiêm IV

Thể tích phân bố (Vd) được thiết kế để biểu thị sự phân bố thuốc trong cơ thể

Đó là thể tích mà trên lý thuyết lượng thuốc đưa vào cơ thể phải được phân tán đế có cùng nồng độ trong huyết tương của thuốc này

Thể tích phân bố biểu kiến là hệ số giữa tổng lượng thuốc đưa vào cơ thể (DxF) và nồng độ thuốc trong huyết tương (Cp)

Trang 23

D = Vd x Cp D: Liều thuốc cần đưa vào cơ thể

Vd: Thể tích phân bố

Cp: Nồng độ thuốc trong huyết tương

Tính liều n p ban đầu :

Liều n p ban đầu = Vd x

2.3.2.4 Hệ số thanh thải [3]

Hay còn gọi là hệ số thanh lọc(clearance) Hệ số thanh thải biểu thị khả năng của một

cơ quan nào đó (thư ng là gan và thận) lọc s ch thuốc ra khỏi huyết tương khi máu tuần hoàn qua cơ quan đó

Sự thanh lọc có thể xảy ra ở gan, thận hay một cơ quan khác như tuyến mồ hôi, nước bọt, ruột… Do đó nếu gọi ClT là độ thanh lọc toàn phần thì :

Trang 24

F = sinh khả dụng của thuốc

2.3.2.5 Thời gian bán thải (half-life) [3]

Th i gian bán thải là th i gian cần thiết để nồng độ thuốc trong huyết tương giảm đi một nửa

Đó là một thông số dược động có thể được xác định dễ dàng bằng phương pháp đồ thị, dựa trên hai nồng độ trong quá trình thải trừ thuốc:

Trang 25

Tương tự thể tích phân bố biểu kiến, th i gian bán thải cũng không bị ảnh hưởng bởi

sự gắn kết thuốc với protein trong huyết tương

Biểu thức liên hệ giữa các thông số dược động: t1/2, Vd và ClT của thuốc là:

Năm 1998, Martin và cộng sự đã xây dựng phương pháp định lượng PTX (Taxol) trong huyết tương và nước tiểu bằng HPLC để ứng dụng trong nghiên cứu dược động học của paditaxel trên trẻ em Sử dụng nội chuẩn là docetaxel, chiết bằng phương pháp lỏng – lỏng với dung môi diethyl ether, cột sắc kí pha đảo, bước sóng 227 nm; kết quả thu được th i gian lưu của PTX và docetaxel lần lượt là 7,7 và 6,7 phút, vùng tuyến tính từ 25 – 1000 ng/ml với giới h n định lượng dưới của PTX là 25 và 40 ng/ml trong huyết tương và trong nươc tiểu Phương pháp này thích hợp cho những nghiên cứu dược động của PTX ở trẻ em trong pha I của thử nghiệm lâm sàng.[7]

Brouwer và cộng sự (2000) đã xây dựng một phương pháp định lượng PTX (Taxol)

d ng không kết hợp trong huyết tương ngư i khi dùng thuốc d ng tiêm với tá dược CrEl Nghiên cứu trên 3 bệnh nhân nhận liên tiếp trong 3 tuần PTX với những nồng độ khác nhau: 135, 175 và 225 mg/m2 Kết quả cho thấy tá dược CrEL có ảnh hưởng tới

Trang 26

nồng độ d ng không kết hợp PTX trong huyết tương, do đó có thể làm thay đổi dược động của thuốc.[5]

Wang và cộng sự (2010) đã nghiên cứu về dược động, phân bố và ho t tính chống ung thư của PTX ở d ng vi nhũ tương khi giảm lượng tá dược CrEL Kết quả cho thấy khi giảm lượng tá dược CrEL, tác dụng phụ dị ứng cũng giảm đi có ý nghĩa, trong khi hiệu quả chống ung thư vẫn được giữ nguyên PTX d ng vi nhũ tương khi giảm lượng tá dược CrEL đã khắc phục được nhược điểm lớn nhất của d ng thuốc tiêm là gây dị ứng

và đưa ra một hướng trị liệu mới thích hợp hơn khi sử dung PTX.[11]

2.5 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH [9]

Khi phát triển một phương pháp phân tích, điều quan trọng là phải thẩm định phương pháp đó theo những giao thức được công nhận để đảm bảo sự kiểm tra đ c biệt phù hợp với mục đích sử dụng Một kết quả phân tích tin cậy đòi hỏi phải tuân thủ theo những quy định quốc tế và phải đảm bảo tính an toàn khi áp dụng Theo quy định của FDA, các phương pháp phân tích phải được thẩm định trước khi sử dụng thư ng xuyên Có nhiều hướng dẫn cho việc thẩm định các phương pháp phân tích như quy định của FDA, Viện thẩm định, EU,…, tuy nhiên giao thức có liên quan nhiều nhất đến phân tích sinh học được Hiệp hội Washington đ t ra năm 1990 bởi Shal và cộng

sự Nhiều tác giả đề ra nhiều tham số khác nhau cho một quá trình thẩm định nhưng tất

cả đều đồng ý với những tham số quan trọng sau: độ chính xác, độ đúng, độ đ c hiệu,

đư ng chuẩn và khoảng tuyến tính, độ phục hồi và độ ổn định Lý thuyết này được quyết định theo hướng dẫn do Shah và cộng sự đề ra vì nó có liên quan nhiều đến phương pháp thẩm định; bao gồm độ chính xác trong ngày (độ l p l i) và độ chính xác liên ngày (độ chính xác trung gian), độ đúng, độ đ c hiệu, giới h n định lượng (LLOQ)

và giới h n phát hiện (LLOD), đư ng chuẩn và khoảng tuyến tính, độ phục hồi và ổn định sau các chu kì rã đông

Trang 27

2.5.1 Tính phù hợp của hệ thống

Định nghĩa: tất cả các thiết bị, dụng cụ, sự vận hành hệ thống, mẫu phân tích, … cấu thành nên hệ thống hoàn chỉnh của một quá trình phân tích nên phải được đánh giá tính tương thích trước khi tiến hành phân tích để đảm bảo toàn bộ hệ thống có hiệu năng phù hợp

Tiến hành: xác định giá trị và độ l p l i của các thông số kỹ thuật của hệ thống khi tiến hành sắc ký mẫu chuẩn và mẫu thử tự t o ít nhất là t i 2 nồng độ trong ph m vi định lượng với 6 lần tiêm mẫu liên tiếp ứng với mỗi nồng độ

Yêu cầu: quy trình đ t tính tương thích hệ thống khi các thông số sắc ký trong cả hai mẫu mẫu đối chiếu và mẫu thử tự t o phải đ t theo yêu cầu của quy định đối với quy trình định lượng

2.5.2 Tính đ c hiệu

Định nghĩa: tính đ c hiệu là khả năng cho phép xác định chính xác và đ c hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi sự có m t của các chất khác có trong mẫu thử Tiến hành: sắc ký mẫu huyết tương trắng, mẫu thử tự t o (mẫu huyết tương chứa chuẩn đối chiếu), và mẫu chuẩn đối chiếu pha trong dung môi t i 3 nồng độ trong ph m vi định lượng (trong đó phải có 1 nồng độ gần ho c bằng LLOQ)

Yêu cầu:

Th i gian lưu của pic của chất khảo sát trong mẫu tự t o phải tương đương với th i gian lưu của pic của chất khảo sát trong mẫu đối chiếu, đồng th i mẫu huyết tương trắng không có đỉnh trùng với đỉnh ho t chất

Với đầu dò PDA, phổ UV-Vis t i th i gian lưu của pic của chất khảo sát trong mẫu tự

t o giống phổ UV-Vis t i th i gian lưu của pic của chất khảo sát trong mẫu đối chiếu Pic của chất khảo sát tách hoàn toàn với các pic khác trong sắc ký đồ của mẫu tự t o

Trang 28

Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết phải cho thấy pic của chất khảo sát không có thành phần khác trong mẫu tự t o (với đầu dò PDA)

2.5.3 Độ đúng và độ chính xác

Định nghĩa: độ đúng là mức độ sát gần của giá trị tìm thấy so với giá trị thực

Độ chính xác là mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng rẽ so với giá trị trung bình

Độ đúng và độ chính xác được xác định cùng lúc

Tiến hành: thực hiện ít nhất t i 3 nồng độ trong ph m vi định lượng (một nồng độ gần với LLOQ, một nồng độ gần với điểm giới h n trên của đư ng chuẩn và một nồng độ ở gần điểm giữa) Mỗi nồng độ phải được xác định trên ít nhất 5 mẫu

Yêu cầu: độ chính xác ở mỗi mức nồng độ có RSD không được vượt quá 15%, riêng

t i LLOQ thì không được vượt quá 20%

Độ đúng được biểu thị là khả năng tiến tới gần nồng độ thực nhất của chất phân tích trong mẫu sinh học Điều đó có thể được biểu thị bằng khả năng tìm l i tương đối và phải nằm trong khoảng 85% - 115%, nhưng có thể chấp nhận 80% - 120% đối với điểm gần LLOQ

2.5.4 Giới hạn định lượng dưới (lower limit of quantitation, LLOQ)

Định nghĩa: Giới h n định lượng dưới là lượng thấp nhất của chất cần thử có trong mẫu thử còn có thể xác định được với độ đúng và độ chính xác thích hợp

Điểm thấp nhất của đư ng chuẩn nên được chấp nhận như giới h n định lượng dưới nếu như đáp ứng tín hiệu của nó so với đáp ứng của mẫu trắng ít nhất bằng 5 lần (tỷ số S/N  5), và có thể xác định với độ chính xác trong khoảng  20%, độ đúng từ 80 – 120%

Tiến hành: xác định LLOQ theo một trong hai cách sau

Lập tỷ số tín hiệu của mẫu thử tự t o (S) và mẫu trắng (N)

Trang 29

Dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng với độ dốc

Yêu cầu: LLOQ ít nhất phải thỏa mãn khả năng phân tích nồng độ của mẫu thử lấy ở

th i điểm bằng 3 – 5 lần th i gian bán thải ho c bằng 1/10 đến 1/20 giá trị Cmax của chất phân tích

2.5.5 Đường chuẩn và khoảng tuy n tính

Định nghĩa: tính tuyến tính là khả năng luận ra các kết quả của phương pháp dựa vào

đư ng biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đ i lượng đo được (y) và nồng độ là một đư ng th ng (x) [hay trực tiếp tính toán dựa vào tương quan tỷ lệ giữa đ i lượng

đo được (y) và nồng độ (x)]

Miền giá trị là khoảng xác định thư ng được lấy từ những nghiên cứu tính tuyến tính

và phụ thuộc vào việc ứng dụng dự định của quy trình, được thiết lập bởi việc kh ng định quy trình đã xây dựng có tính tuyến tính, độ đúng và độ chính xác chấp nhận được khi áp dụng định lượng chất phân tích

Để xây dựng đư ng chuẩn, các mẫu thử nên được chuẩn bị trên cùng một dịch sinh học như mẫu thử trong nghiên cứu bằng cách cho chuẩn đối chiếu đã biết trước nồng độ vào dịch sinh học

Nồng độ của chuẩn đối chiếu dùng xây dựng đư ng chuẩn phải dựa vào ph m vi định lượng được dự đoán trong nghiên cứu thực tế

Đư ng chuẩn bao gồm từ 6 – 8 điểm (trừ điểm 0) nằm trong ph m vi cần định lượng (có cả giới h n định lượng dưới)

Tiến hành: chuẩn bị các dung dịch chuẩn đối chiếu pha trong dung môi Thêm các dung dịch này vào trong dịch sinh học để thu được các dung dịch có nồng độ trong

ph m vi định lượng Tiến hành sắc ký ít nhất 2 lần cho mỗi dung dịch

Xác định sự tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh của các dung dịch

Trang 30

Thiết lập phương trình hồi quy và vẽ đư ng biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ và đáp ứng

Sử dụng “phân tích hồi quy” với trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy và trắc nghiệm F để kiểm tra tính tương thích của phương trình hồi quy

2.5.6 Tỷ lệ thu hồi (hiệu suất chi t, recovery)

Định nghĩa: tỷ lệ thu hồi là đáp ứng ghi nhận được từ một lượng chất phân tích thêm vào và chiết ra từ dịch sinh học, được so sánh với đáp ứng từ nồng độ thực của chất phân tích

Đáp ứng ghi nhận được từ một lượng chất phân tích thêm vào và chiết ra từ dịch sinh học, được so sánh với đáp ứng từ nồng độ thực của chất phân tích

Tỷ lệ thu hồi của chất chiết được không nhất thiết phải là 100% nhưng phải ổn định và chính xác Tỷ lệ thu hồi thực nghiệm được xác định t i 3 nồng độ thấp, trung bình và cao của đư ng chuẩn

Xác định tỷ lệ thu hồi bằng cách so sánh đáp ứng của chất phân tích chiết được từ mẫu thử tự t o ở 3 mức nồng độ (thấp, trung bình và cao) với đáp ứng của mẫu chuẩn đối chiếu không chiết (mẫu đối chiếu có cùng nồng độ được pha trong dung môi ho c trong dịch sinh học thu được sau khi xử lý, có độ phục hồi 100%)

Trang 31

2.5.7 Độ ổn định của mẫu thử

Định nghĩa: độ ổn định là mức độ l p l i những kết quả thu được của cùng một mẫu thử nhưng được thử với những thay đổi của điều kiện môi trư ng thực hiện qui trình như thay đổi phòng thí nghiệm, kiểm nghiệm viên, dụng cụ, thuốc thử, ngày, …

Độ ổn định của thuốc trong dịch sinh học phụ thuộc vào điều kiện bảo quản và định lượng, tính chất hóa học của thuốc, môi trư ng sinh học và vật liệu chứa mẫu

Độ ổn định cần được khảo sát ở các điều kiện và th i gian tương tự như thực tế trong suốt quá trình từ thu thập mẫu, bảo quản, rã đông, xử lý và phân tích

Các dung dịch khảo sát độ ổn định nên được pha loãng từ một dung dịch gốc của chất cần thử (chỉ được chuẩn bị ngay trước khi pha loãng) trong môi trư ng dịch sinh học bảo đảm không có chất gây nhiễu và không có sự hiện diện của chất cần thử

Độ ổn định của dung dịch gốc cũng nên được khảo sát

2.5.7.1 Độ ổn định đông và rã đông

Độ ổn định của chất phân tích được xác định sau 3 chu kỳ làm đông l nh và rã đông Thực hiện ở ít nhất 3 mẫu ở hai nồng độ cao và thấp được làm đông l nh ở nhiệt độ bảo quản dự kiến trong 24 gi và rã đông ở nhiệt độ phòng, sau khi rã đông hoàn toàn, các mẫu được làm l nh trở l i trong vòng 12 – 24 gi giống lần đầu, sau 3 chu kỳ như thế mẫu được đem đi phân tích

Nếu mẫu phân tích không ổn định ở nhiệt độ dự kiến thì phải làm l nh ở nhiệt độ -70 oC

2.5.7.2 Độ ổn định ngắn hạn

Thực hiện trên 3 mẫu khác nhau ở mỗi nồng độ cao và thấp, sau khi rã đông ở nhiệt độ phòng và giữ ở nhiệt độ này từ 4 – 24 gi , sau đó đem phân tích

Trang 32

2.5.7.5 Độ ổn định dung dịch sau khi pha

Độ ổn định của mẫu sau khi đƣợc xử lý, kể cả th i gian mẫu đƣợc đ t trong bộ phận tiêm mẫu tự động nên đƣợc xác định

Độ ổn định của thuốc, nên đƣợc đánh giá trong khoảng th i gian phân tích dự kiến tất

cả các mẫu, sẽ đƣợc thẩm định bằng cách xác định nồng độ của thuốc dựa vào đƣ ng cong chuẩn

Trang 33

2.6 KĨ THUẬT CHIẾT TÁCH ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH

2.6.1 Kĩ thuật tách [9]

Hiện nay có rất nhiều kĩ thuật tách áp dụng trong quy trình định lượng thuốc trong dịch sinh học Kĩ thuật có nhiều ưu điểm nhất là điện di mao quản Bên c nh đó còn có nhiều kĩ thuật khác dựa trên nguyên tắc sắc kí bao gồm sắc kí khí và sắc kí lỏng

Điện di dựa vào sự di chuyển của các h t tích điện dưới tác dụng của điện trư ng Quá trình tách phụ thuộc vào tốc độ di chuyển khác nhau của các chất tan Khi có một điện trư ng ngoài tác động lên dung dịch có h t tích điện, mỗi ion sẽ di chuyển theo về phía điện cực đối diện Tốc độ di chuyển của mỗi lo i h t tùy thuộc vào bản chất môi trư ng, kích thước h t và cư ng độ điện trư ng

Trong sắc kí khí, mẫu được làm bay hơi và tiêm vào cột phân tích Mẫu sau khi tiêm được di chuyển qua cột bằng dòng khí trơ ho t động như một pha động Các khí mang thư ng dùng là nitrogen, argon carbon dioxid và helium Cột thư ng được tráng bằng pha tĩnh lỏng Nhiệt độ cột phụ thuộc vào điểm sôi của mẫu được bay hơi Có nhiều

lo i bộ phận phát hiện (detector) sử dụng trong sắc kí khí gồm có detector ion hóa ngọn lửa, ngọn lửa trắc quang, bắt điện tử và dẫn nhiệt Mỗi lo i detector phù hợp cho từng điều kiện tách các lo i mẫu khác nhau

Kĩ thuật tách thư ng được sử dụng nhất trong phân tích dịch sinh học là sắc kí lỏng (LC) LC, hay còn gọi là sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), là một quá trình phân tích, phân tách từng thành phần trong một hỗn hợp và thư ng sử dụng cho cả định tính và định lượng Thành phần cơ bản của bất kì một hệ thống LC nào cũng bao gồm: bơm/

hệ thống cung cấp dung môi, bơm tiêm, cột phân tích (pha tĩnh), bộ phận phát hiện (detector) và máy tính (PC) Pha động chứa mẫu được bơm vào hệ thống và tương tác với pha tĩnh-phần quan trọng nhất của hệ thống Cột với pha tĩnh bên trong là nơi quá trình phân tách xảy ra ở đây Các thành phần sau khi được tách ra sẽ đi đến detector trước khi chảy ra ngoài ho c được thu l i Đối với hệ thống HPLC cũng có nhiều lo i

Trang 34

detector khác nhau như detector UV-Vis, huỳnh quang, dãy diod quang (PDA) và khổi phổ (MS)

Hình 2.10 Sơ đồ đơn giản hệ thống HPLC

2.6.2 Kĩ thuật chi t[9]

Trước khi đưa mẫu sinh học vào phân tích bằng hệ thống HPLC, mẫu phải được xử lý

và làm s ch Lượng thuốc trong mẫu phải được chiết ra với độ phục hồi cao nhất có thể Có nhiều kĩ thuật chiết được áp dụng cho các mẫu sinh học như tủa protein (PP), chiết lỏng – lỏng (LLE) và chiết pha rắn (SPE)

2.6.2.1 PP[9]

PP là một kĩ thuật chiết khá tốt trong đó một dung môi hay acid ho c base m nh được thêm vào mẫu sinh học để tủa protein dưới d ng h t nhỏ, sau đó đem ly tâm, dịch nổi chứa chất cần phân tích được thu l i và đem đi phân tích Độ tan của protein trong

Buồng tiêm mẫu

Bộ phận phát hiện

Máy tính

Thu hồi Cột sắc kí

Dung môi

Bơm

Trang 35

dung dịch đệm phụ thuộc vào bản chất của acid amin phân cực hay không phân cực cấu thành nên protein Những protein có tỷ lệ acid amin kị nước cao trên bề m t sẽ không thể hòa tan trong nước Giữa các protein có lực hút hay đẩy tĩnh điện phụ thuộc vào bản chất môi trư ng chứa chúng PP xảy ra bằng cách thêm vào một tác nhân tủa (như h t gel trong kĩ thuật lọc gel) vào dịch chứa protein Nhược điểm của phương pháp là dịch chiết vẫn còn chứa nhiều thành phần phức t p và dịch nổi vẫn có nguy cơ

bị tủa

2.6.2.2 LLE [9]

LLE là phương pháp chiết dựa vào sự hòa trộn của hai chất lỏng không đồng tan Sự phân tán lỏng lỏng được t o ra bằng quá trình trộn được tách ra bằng trọng lực ho c bằng lực ly tâm sau đó Đối với mẫu sinh học thư ng một dung môi hữu cơ được thêm vào và trộn lên Thuốc cần chiết di chuyển từ pha nước vào pha hữu cơ có độ hòa tan tốt hơn, không kèm protein và lipid Một nhược điểm lớn của LLE là khó tự động hóa

và lượng dung môi hữu cơ tiêu tốn khá lớn LLE thư ng đòi hỏi kèm theo quá trình bốc hơi đến khô và phục hồi mẫu

Hình 2.11 Các bước chính trong quá trình chiết lỏng – lỏng

Dịch nước

Dung môi hữu cơ

Thêm vào pha hữu

Trang 36

có thể Một ưu điểm lớn của SPE là có thể tự động hóa với th i gian tối ưu và công suất tăng

Hình 2.12 Các bước chính trong quá trình chiết rắn SPE

Các chất ảnh hưởng trong dịch rửa giải

Trang 37

CHƯƠNG 3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Thỏ cái khỏe m nh, n ng từ 2-2,5 kg, chưa qua thử nghiệm Thỏ mua về được nuôi trong môi trư ng thử nghiệm 1 tuần trước khi tiến hành thí nghiệm

3.2 HÓA CHẤT VÀ THUỐC THỬ NGHIỆM

3.2.1 Thuốc thử

PTX 6 mg/ml được bào chế ở d ng dung dịch, lọ 30 mg/5 ml t i Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh dưới sự phối hợp nghiên cứu của bộ môn Hóa Dược, bộ môn Công Nghiệp Dược, khoa Dược ĐH Dược Tp.HCM và Viện kiểm nghiệm thuốc Tp.HCM Thuốc đ t tiêu chuẩn dược điển Mỹ - USP 35

Tween khan Nước cất pha tiêm

3.2.2 Thuốc đối chứng

PTX Stragen®6 mg/ml d ng đóng gói 30 mg/5 ml, số lô X070, số đăng kí VN1 – 423 –

11, h n dùng 10.2014, do công ty Haupt pharma Wolfratshausen GmbH (Pfaffenriederer Strabe 5, D-82515 Wolfratshausen, Germany) sản xuất

Thuốc thử và thuốc chứng được đánh giá các thông số dược động trên thỏ

Trang 38

Nước muối sinh lý dùng để pha tiêm: natri chlorid (NaCl) 0,9 %, chai 500 ml, số lô 13178PN, số đăng kí VD – 10634 – 10, ngày sản xuất 13/05/13, h n dùng 13/05/16, do công ty Mekophar Chemical Pharmaceutical Joint-Stock (297/5 Lý Thư ng Kiệt, quận

11, TP HCM, Việt Nam) sản xuất

3.2.3 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm

Ống ly tâm bằng thủy tinh thể tích 12 ml

Dung dịch EDTA 1% để tráng kim tiêm trước khi lấy máu

Methanol (HPLC) (Merk), acetonitril (HPLC)(Merk), diethyl ether (HPLC) (Merk), nước cất, KH2PO4 d ng rắn và amoniacetat để pha dung dịch đệm có t i Viện kiểm nghiệm thuốc TP HCM

Máy thổi nitơ có điều nhiệt

Máy ly tâm thư ng MRC (Israel) và ly tâm l nh MICRO 220R (Germany)

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp thẩm định qui trình định lượng pacitaxel trong huyết tương thỏ bằng HPLC

Trang 39

3.3.1 Pha mẫu chuẩn

Pha chuẩn PTX (PTX) 500 µg/ml và nội chuẩn (IS) carbamazepin (CAR) 500 µg/ml trong methnol, bảo quản ở 4 oC Dùng dung dịch chuẩn PTX pha thành các dung dịch với nồng độ 50-25-12,5-5 và 2,5 µg/ml Những dung dịch này được dùng để t o mẫu tự

t o trong huyết tương để thẩm định quy trình trong 3 ngày liên tiếp Nội chuẩn được pha thành nồng độ 20 µg/ml Mẫu để xây dựng đư ng chuẩn được chuẩn bị trong 400

µl huyết tương trắng với các nồng độ thuốc thích hợp vào ngày thẩm định Mẫu để thẩm định độ đúng, độ chính xác và tỷ lệ phục hồi được chuẩn bị trong huyết tương với các nồng độ 0,5-1-2,5-50 µg/ml, bảo quản ở -20 oC

3.3.2 Phương pháp chi t

Thêm vào 0,5 ml huyết tương 100 µl dung dịch chuẩn nội (IS) carbamazepin 20 µg/ml, 0,2 ml đệm ammonium acetat 0,2M-pH 5,0 và 4 ml ether Trộn kĩ trong 5 phút và ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 5 phút Hút lấy 3,5 ml dịch hữu cơ chuyển vào ống

s ch, bốc hơi dung môi bằng hơi nitơ ở 40o

C Hòa tan mẫu trong 0,5 ml pha động (acetonitril / methanol / 2mM đệm phosphate pH 5,0) (42/22/36 v/v), ly tâm tốc

độ 4000 vòng/phút trong 5 phút trong máy ly tâm l nh ở -10 o

C, hút dịch, lọc qua màng lọc milipore 0,45 µm trước khi sắc kí

Trang 40

Hình 3.1 Sơ đồ chiết PTX trong huyết tương

Mẫu xây dựng đư ng chuẩn được chuẩn bị ở các nồng độ trong vùng từ 0,5 – 50 µg/ml

3.3.3 Điều kiện sắc kí

Đầu dò PDA, bước sóng phát hiện 227 nm

Cột phenomenax Gemini C-18, 250 x 4,60 mm – 5 microns

Pha động: acetonitril / methanol / 2mM đệm phosphate pH 5,0 (42 / 22 / 36 v/v/v) Chương trình ch y: đ ng dòng

100 ml IS 20

+ 0,5 ml pha động, lắc, ly tâm

Bốc hơi nito, 40 oC Cắn khô

Dịch

Dịch ch y sắc kí

Lắc 5 phút, ly tâm 5 phút-tốc độ 4000 rpm Dịch ether

0,5 ml huyết tương

4 ml ether

Lọc qua màng 0,45

µm

Định dạng
Số trang	80
Dung lượng	1,15 MB