phân lập vi khuẩn nội sinh trong rễ cây bắp (zea mays l ) trồng trên đất xám ở tỉnh đồng nai – bình phước – tp hồ chí minh

Kiểm tra khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường Burk’s không đạm, kết quả 50/50 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm đạt tỷ lệ 100%.. Mục tiêu đề tài:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- - -    - - -

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH

TRONG RỄ CÂY BẮP (Zea mays L.) TRỒNG TRÊN ĐẤT XÁM

Ở TỈNH ĐỒNG NAI – BÌNH PHƯỚC – TP HỒ CHÍ MINH

SINH VIÊN THỰC HIỆN HOÀNG MẠNH HÙNG MSSV: 3103955

LỚP: VI SINH VẬT HỌC K36

Cần Thơ, Tháng 04/2014 GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Gs.Ts CAO NGỌC ĐIỆP

PHẦN KÝ DUYỆT

(ký tên) (ký tên)

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

LỜI CẢM TẠ

Trước hết em xin chân thành gửi lời cám ơn đến Gs.Ts Cao Ngọc Điệp đã tận tình dạy bảo và hướng dẫn em trong suốt thời gian học, cũng như thực hiện luận văn Tiếp đến em xin gửi lời cám ơn đến Cha mẹ đã dạy bảo trong suốt thời gian qua, đã cố gắng tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có cơ hội học tập

Em cũng xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện NC&PT CNSH Trường Đại Học Cần Thơ đã tạo điều kiện để em thực hiện tốt luận văn

Bên cạnh đó, em cũng gửi lờicảm ơn đến toàn thể quý thầy cô đã nhiệt tình dạy

dỗ và hướng dẫn em trong suốt thời gian trên giảng đường Đại Học Cảm ơn đến chị Nguyễn Thị Xuân Mỵ - phòng thí nghiệm vi sinh vật đất, chị Trần Thị Giang - phòng thí nghiệm vi sinh vật môi trường đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ em thực hiện luận văn

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các anh chị và các bạn đã đồng hành

và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

TÓM LƯỢC

Năm mươi dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường NFb và LGI từ các mẫu rễ bắp thu ở 3 tỉnh Đồng Nai-Bình Phước-TP Hồ Chí Minh Kiểm tra khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường Burk’s không đạm, kết quả 50/50 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm đạt tỷ lệ 100% Kiểm tra khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường NBRIP, kết quả 50/50 dòng có khả năng hòa tan lân, đạt tỷ lệ 100% Ngoài ra thí nghiệm cũng đánh giá thêm khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn trên môi trường lỏng không bổ sung tryptophan, kết quả 41/50 dòng có khả năng tổng hợp IAA đạt tỷ lệ 82% Trong

đó 11/50 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm cao là ĐRL1d (3.145); HRL2a (1.477mg/l) ĐRL1b(1.521mg/l); PRL1b (2.053mg/l); ĐRL2c(2.923mg/l); ĐRL3a (2.42mg/l) ĐRN5 (1.540mg/l); PRN1c (2.301mg/l); ĐRN4a (1.741mg/l); ĐRN4b (1.536mg/l); ĐRN1d (1.553mg/l); 8/50 dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân cao là HRL1b (52,127 mg/l), PRL1d (67,134 mg/l), ĐRL3a(60,507 mg/l), ĐRN1a (72,963 mg/l), ĐRN1d (61,304 mg/l), PRN1c(56,963 mg/l), ĐRN4b(60,37 mg/l), ĐRN2c (71,804 mg/l); 10/41 dòng có khả năng tổng hợp IAA cao là ĐRL2f (9.375 mg/l), PRL1c (10,209 mg/l), HRL1b(9,084 mg/l), HRL1a (10,708 mg/l), PRN1b (10,168 mg/l), ĐRN2d (7,374 mg/l), PRN1c (8.079 mg/l), ĐRN3b (9,417 mg/l), ĐRN5 (8,337 mg/l), ĐRN1d (7,292 mg/l)

Từ khóa: Cây bắp, cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA, vi khuẩn nội sinh

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT i

LỜI CẢM TẠ ii

TÓM LƯỢC iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH BẢNG vi

DANH SÁCH HÌNH vii

TỪ VIẾT TẮT viii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về cây bắp 3

2.1.1 Sơ lược về đặc điểm thực vật học của cây bắp 3

2.1.2 Đặc điểm sinh trưởng của cây bắp 3

2.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng của cây bắp 3

2.1.4 Vai trò của cây bắp 4

2.2 Tổng quan về đất xám 6

2.3 Vi khuẩn nội sinh 7

2.3.1 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh 7

2.3.2 Nguồn gốc của vi khuẩn nội sinh 7

2.3.3 Một số nhóm vi khuẩn nội sinh 8

2.3.4 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh 12

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 15

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17

3.2 Phương tiện nghiên cứu 17

3.2.1 Dụng cụ, thiết bị 17

3.2.2 Nguyên vật liệu 18

3.2.3 Hóa chất 18

3.3 Phương pháp nghiên cứu 21

3.3.1 Thu mẫu 21

3.3.2 Xử lí mẫu 21

3.3.3 Khử trùng mẫu 22

3.3.4 Phân lập 22

3.3.5 Quan sát hình thái và đo kích thước khuẩn lạc 23

3.3.6 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn 23

3.3.7 Xác định đặc tính các dòng vi khuẩn phân lập được 23

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Phân lập và đặc điểm các dòng vi khuẩn phân lập được 28

4.1.1 Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập 28

4.1.2 Đặc điểm các dòng vi khuẩn phân lập được 29

4.2 Đặc tính của các dòng vi khuẩn phân lập được 34

4.2.1 Khả năng cố định đạm 34

4.2.2 Khả năng hòa tan lân 37

4.2.3 Khả năng tổng hợp IAA 39

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

5.1 Kết luận 42

5.2 Kiến nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

PHỤ LỤC

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1 Nhu cầu dinh dưỡng của cây bắp theo tuổi cây 4

Bảng 2 Thành phần của hạt bắp (ngô) so với gạo 4

Bảng 3 Công thức môi trường NFb 18

Bảng 4 Công thức môi trường LGI 19

Bảng 5 Công thức môi trường NBRIP 20

Bảng 6 Công thức môi trường Burk’s không đạm 21

Bảng 7 Đường chuẩn đo đạm 24

Bảng 8 Đường chuẩn đo lân 26

Bảng 9 Đường chuẩn đo IAA 27

Bảng 10 Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập được 28

Bảng 11 Đặc điểm các dòng vi khuẩn nội sinh đã phân lập 29

Bảng 12 Tỷ lệ (%) về đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn 31

Bảng 13 Khả năng tổng hợp đạm (mg/l) của các dòng vi khuẩn 34

Bảng 14 Khả năng hòa tan lân (mg/l) của các dòng vi khuẩn 37

Bảng 15 Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn 39

Bảng 16 Khả năng phát triển của 50 dòng vi khuẩn trên môi trường Burk’s và NBRIP……….46

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1 Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus dưới kính hiển vi………… 9

Hinh 2 Vòng sáng pellicle sau 2 ngày chủng mẫu………22

Hình 3 Đặc điểm của một số khuẩn lạc………33

Hình 4 Biểu đồ hàm lượng đạm cố định (mg/l) của các dòng vi khuẩn………… 36

Hình 5 Biểu đồ hàm lượng lân hòa tan (mg/l) của các dòng vi khuẩn……….39

Hình 6 Biểu đồ hàm lượng IAA tổng hợp (mg/l) của các dòng vi khuẩn…………41

TỪ VIẾT TẮT

ABA: Abscisic acid

DK: Đường kính

IAA: Indole-3-acetic acid

IBA: Indole-3-butyric acid

Trp: Tryptophan

Bđ : Bán đặc

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Bắp (danh pháp khoa học: Zea mays L.) được xem là một loại ngũ cốc vàng và là

cây lương thực quan trọng đứng thứ hai sau lúa ở nước ta Bắp còn là cây lương thực quan trọng trên toàn thế giới bên cạnh lúa mì và lúa gạo Ở các nước thuộc Trung Mỹ, Nam Á và Châu Phi, người ta sử dụng bắp làm lương thực chính cho người với phương thức rất đa dạng theo vùng địa lí và tập quán từng nơi Ở Việt Nam, bắp là cây thức ăn chăn nuôi quan trọng nhất hiện nay: 70% chất tinh trong thức ăn tổng hợp của gia súc là từ bắp; bắp còn là thức ăn xanh và ủ chua lí tưởng cho đại gia súc đặc biệt là

bò sữa Gần đây cây bắp còn là cây thực phẩm; người ta dùng bắp bao tử làm rau cao cấp vì nó sạch và có hàm lượng dinh dưỡng cao; bắp nếp, bắp đường (bắp ngọt) được dùng làm quả ăn tươi (luộc, nướng) hoặc đóng hộp làm thực phẩm xuất khẩu Bắp còn

là nguyên liệu của ngành công nghiệp lương thực - thực phẩm và công nghiệp nhẹ để sản xuất rượu, cồn, tinh bột, dầu, glucose, bánh kẹo… Trong y dược bắp được dùng để

(http://thuvientailieu01.googlecode.com/files/ky-thuat-trong-va-cham-soc-ngo-252.pdf, ngày 11/12/13)

Cây bắp cần rất nhiều nguyên tố đa lượng như N, P, K, Ca, Mg và ít nguyên tố vi lượng như Cu, Zn, Mn, Fe, trong các nguyên tố dinh dưỡng này thì N, P, K là những nguyên tố dinh dưỡng quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất cây trồng Nguồn dinh dinh dưỡng này chủ yếu được cung cấp từ phân bón hóa học vì chúng có tác động thúc đẩy nhanh quá trình sinh trưởng, phát triển và làm tăng đột biến năng suất các loại cây trồng Việc sử dụng phân bón vô cơ giúp cho nông dân có nhiều lợi ích trước mắt như tăng năng suất, tiết kiệm ngày công và sức lực lao động Cho đến nay, những tính chất ưu việt của phân bón hóa học đối với tất cả các loại cây trồng cũng được con người phát huy và sử dụng rộng rãi trong trồng trọt Càng ngày các tiến bộ khoa học

kỹ thuật về phân bón hóa học càng được nông dân ứng dụng mạnh mẽ và rộng khắp Ngoài các phân bón đơn đạm, lân, kali, phân hóa học còn có các loại phân hỗn hợp đa dinh dưỡng như phân NPK giúp cho nông dân bón phân cân đối giữa các loại đạm, lân, kali Mặc dù phân bón hóa học có nhiều ưu điểm song nó cũng có nhược điểm rất lớn mà nếu lạm dụng trong sản xuất thì lợi bất cập hại Đó là sự phản tác dụng của phân hóa học và việc làm ô nhiễm môi trường sản xuất Phân hóa học kích thích sự

sinh trưởng và phát triển của cây nhưng lại không cung cấp chất dinh dưỡng cho đất

1.2 Mục tiêu đề tài:

Phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh trong rễ bắp và xác định khả năng cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn phân lập được trồng trên đất xám ở Đồng Nai- Bình Phước- TP Hồ Chí Minh

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây bắp (ngô)

2.1.1 Sơ lược về đặc điểm thực vật học

Bắp hay còn gọi là ngô có tên khoa học là Zea mays L thuộc họ hòa thảo Poacea

do nhà thực vật học Thụy Điển Linnaeus đặt tên theo hệ thống tên kép Hy Lạp – La Tinh: Zea – từ Hy Lạp để chỉ cây ngũ cốc và mays là từ “Maya”- tên một bộ tộc da đỏ

ở vùng Trung Mỹ - xuất xứ của cây bắp (Hữu Tình ,2009)

(http://cropsdiversity.blogspot.com/2013/03/cay-ngo-cay-bap.html,ngày 13/12/2013)

Không giống những hoa hoàn chỉnh của hầu hết những loài hoà thảo, bắp có hoa đực

và hoa cái tách biệt trên cùng một cây Hoa đực ở đỉnh ngọn thường gọi là cờ bắp và hoa cái sinh ra ở bên trong những mầm phụ được gọi là bắp Cấu tạo đó được coi là

(http://thuvientailieu01.googlecode.com/files/ky-thuat-trong-va-cham-soc-ngo-252.pdf, ngày 11/12/13)

2.1.2 Đặc điểm sinh trưởng của cây bắp

Cây bắp ưa khí hậu ấm có khả năng thích nghi với khoảng khí hậu rộng, nên có thể trồng được trong tất cả các vùng của Việt Nam Được phát triển trong điều kiện thuận lợi, bắp có thể cho thu hoạch 60 ngày kể từ khi nảy mầm, trong khi có giống cần đến 280 ngày

Bắp có thể phát triển tốt trên bất kỳ loại đất nào nếu có hệ thống tưới tiêu đầy đủ

để duy trì đủ oxy cho rễ phát triển, và có khả năng giữ nước để tạo độ ẩm thích hợp trong mùa sinh trưởng Cây bắp không kén đất nên có thể trồng được trên nhiều loại đất khác nhau, nhưng thích hợp nhất là đất trung tính có độ pH từ 6.0-7.2, đất giàu mùn và chất dinh dưỡng (Đỗ Thị Ren, 2003)

2.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng của cây bắp

Bắp là cây phàm ăn, muốn đạt năng suất cao phải trồng bắp trên các loại đất giàu dinh dưỡng Nếu đất trồng thiếu chất dinh dưỡng phải tiến hành bón phân bổ sung để cây phát triển tốt, đạt năng suất cao Một vụ bắp muốn đạt năng suất 9,5 tấn hạt/ha cần lấy từ 191kg N, 89kg P2O5, 235kg K2O (Đỗ Thị Ren, 2003)

Lượng chất dinh dưỡng cây bắp thu hút gia tăng dần theo thời gian sinh trưởng Trong giai đoạn cây con (2-3 tuần sau khi gieo) cây sinh trưởng chậm, lượng dinh

dưỡng cây hút ít Sau đó lượng hút chất dinh dưỡng tăng lên rất nhanh do cây tăng trưởng mạnh, kéo theo sự tích lũy chất khô tăng (Đỗ Thị Ren, 2003)

Bảng 1 Nhu cầu dinh dưỡng của cây bắp theo tuổi cây (năng suất 11,80 T/ha)

a Bắp làm cây lương thực cho con người:

Bắp là cây lương thực nuôi sống gần 1/3 số dân trên toàn thế giới

( http://vaas.vn/kienthuc/cayngo/vaitrocuango.php, 20/10/2013) Toàn thế giới sử dụng

21% sản lượng bắp làm lương thực Chất dinh dưỡng trong bắp phong phú hơn lúa mì

b Bắp làm thức ăn gia súc: bắp là cây thức ăn gia súc quan trọng nhất hiện nay Hầu

như 70% chất tinh trong thức ăn tổng hợp là từ bắp Ngoài cung cấp chất tinh, cây bắp còn là thức ăn xanh và ủ chua lý tưởng cho đại gia súc đặc biệt là bò sữa

c Bắp cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp: ngoài cung cấp nguyên liệu chính

cho các nhà máy thức ăn gia súc tổng hợp, bắp còn là nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất rượu cồn, tinh bột, dầu,bánh kẹo,…

(http://www.nsl.hcmus.edu.vn/greenstone/collect/thesiskh/index/assoc/HASH2be1.dir/

5.PDF, 08/11/2013)

d Bắp ngăn ngừa và cải thiện bệnh: bắp được xem là một loại ngũ cốc vàng vì

không những nó đáp ứng cho nhu cầu thực phẩm chính của con người từ thuở sơ khai

mà còn là một nguồn dinh dưỡng tiềm năng góp phần:

Chống ung thư: trong hạt bắp có chứa rất nhiều chất beta-cryptoxanthin, một loại

carotenoid có tác dụng chống oxy hóa, giúp ngăn ngừa ung thư phổi hiệu quả Bên cạnh bắp còn giúp giảm được đáng kể nguy cơ ung thư vú ở phụ nữ

Tăng cường sức khỏe hệ tiêu hóa: bắp giàu chất xơ, chất xơ này hỗ trợ sự phát

triển của vi khuẩn có lợi trong ruột già và ngược lại vi khuẩn giúp biến đổi chất xơ thành chuỗi acid béo ngắn Chuỗi acid béo có thể cung cấp năng lượng cho các tế bào ruột, từ đó giàm các nguy cơ mắc các vấn đề về ruột, kể cả ung thư ruột kết

Tốt cho người tiểu đường: bắp nằm trong số những nguồn carbohydrate được

khuyên dung cho các bệnh nhân tiểu đường Chỉ số đường huyết thấp và tỉ lệ chất xơ cao của bắp cao giúp tăng cường cảm giác no đồng thời làm chậm hấp thu và chuyển hóa đường

Bảo vệ tim: bắp là thực phẩm có chứa nhiều chất xơ hòa tan và không hòa tan

Các chất xơ hòa tan lien kết với cholesterol trong mật được bài tiết từ gan, sau đó lan truyền đi khắp nơi cơ thể để tiếp tục hấp thu cholesterol có hại Ngoài ra lượng vitamin

B trong bắp cũng giúp làm giảm homocysteine Chúng ta biết rằng, nếu homocysteine tăng cao có thể phá hủy các mao mạch, từ đó dẫn đến nhồi máu cơ tim, đột quỵ

Tốt cho phụ nữ mang thai: Folate là chất giúp ngăn chặn nguy cơ bị sảy thai và

thai nhi bị dị tật Trong khi đó, bắp lại rất giàu folate, giúp cơ thể thai nhi tổng hợp tế bào mới và khỏe mạnh

và đá cát

Đất xám bạc màu trên phù sa cổ: Được phân bố ở những thềm phù sa cũ cao

chừng 15-20 m, địa hình bằng phẳng hoặc bậc thang, quanh năm không nghập nước Thành phần cơ giới từ trên mặt xuống sâu đều nhẹ, thịt nhẹ, cát pha đến cát Đất có độ phì tự nhiên không cao: hàm lượng các nguyên tố dinh dưỡng trong đất thấp đặc biệt là nguyên tố kali, chất hữu cơ đã nghèo lại có tốc độ khoáng hóa nhanh, dung tích hấp thu thấp, độ bão hòa bazơ thường nhỏ hơn 50% dẫn đến khả năng điều hòa dinh dưỡng rất hạn chế Tuy đất có độ phì tự nhiên thấp, nhưng lại có độ phì nhiêu thực tế cao nếu biết áp dụng các tiến bộ kỹ thuật Đất xám bạc màu có nhiều nhược điểm nhưng đất xám bạc màu vẫn là loại đất quý vì: có địa hình bằng phẳng không bị úng, đất thoát nước tốt, đở tốn công làm đất, có nguồn nước ngầm tốt lại ở nông nên có thể khai thác

để tưới Đất bạc màu rất thích hợp với hoa màu trồng cạn nhiều cây công nghiệp quý, cây ăn quả và đặc biệt là bắp

Đất xám bạc màu glây trên phù sa cổ: Loại đất này có nguồn gốc phát sinh

giống loại trên nhưng ở địa hình thấp hơn, thường ngập nước vào mùa mưa Chế độ canh tác điển hình là một vụ lúa-một vụ màu Lớp đất mặt thường là thịt nhẹ, màu xanh trắng Tầng đế cày hơi chặt và bắt đầu có glây So với đất xám bạc màu trên phù

sa cổ, đất này có hàm lượng mùn cao hơn, các dưỡng chất cũng khá hơn

Đất xám bạc màu phát triển trên sản phẩm phong hóa của đá macma axit và

đá cát: Đất chua, nghèo dinh dưỡng và dễ bị khô hạn Ngoại trừ một ít đất có thể dùng

sản xuất nông nghiệp ở vùng thềm thấp, còn ở địa hình cao hơn nên để phát triển lâm nghiệp

(http://vaas.vn/kienthuc/cayngo/motsotinhchatcuadattrongcokhanangtrongngoovietna

m.php, 15/09/2013)

2.3 Vi khuẩn nội sinh

2.3.1 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh

Vi khuẩn nội sinh được xác định là vi khuẩn phát hiện bên trong các cây đã khử trùng bề mặt hoặc từ dịch trích bên trong của các cây và không có tác động có hại trên các cây (Mano và Morisaki, 2008) Vi khuẩn nội sinh phổ biến hầu như ở tất cả các cây trên trái đất, chúng được tìm thấy trong rễ, thân lá, hạt, trái,…Hầu hết ở cây, rễ có

số lượng vi khuẩn nội sinh nhiều hơn so với các mô ở bên trên mặt đất Vi khuẩn nội sinh trong một cây chủ không bị hạn chế một loài mà bao gồm nhiều loài (Rosenblueth

et al., 2006) Vi khuẩn nội sinh từ vùng rễ và vào cây thông qua khí khổng,bì khổng và các vết thương, các vùng xuất hiện rễ bên và rễ mầm Tuy nhiên, vi khuẩn nội sinh xâm nhập chủ yếu thông qua vết thương xảy ra một cách tự nhiên ở các điểm xuất hiện của rễ bên và ở các chóp rễ là kết quả của sự phát triển của cây Vi khuẩn nội sinh được phát hiện là có ích trên cây chủ như thúc đẩy tăng trưởng thực vật, tăng chống chịu bệnh cũng như là cung cấp khả năng cố định nitơ đối với cây chủ (Mano và Morisaki, 2008)

2.3.2 Nguồn gốc của vi khuẩn nội sinh

Qua những kết quả nghiên thu được từ rễ thân, lá, hạt rễ, Mano và Morisaki (2008) cho rằng nguồn của vi khuẩn nội sinh phải là đất vùng rễ

Các quần thể vi sinh vật đất và các cộng đồng liên quan với rễ của các cây thì bị ảnh hưởng bởi loại đất và cây (Latour et al., 1996) Sự ảnh hưởng này thì quan trọng hơn ở vùng có sự tương tác cao của rễ cây và các vi sinh vật đất hay còn gọi là vùng rễ (Elmerich và Newton, 2007) Một vùng hẹp của đất bị ảnh hưởng bởi sự hiện diện của các rễ cây thì được xác định là vùng rễ (Hrynkiewicz và Baum, 2011) Vùng rễ có thể

mở rộng hơn 5 mm từ rễ và được so sánh như là một ốc đảo trong sa mạc, vì vậy vùng

rễ là nơi hoạt động của vi sinh vật tăng Vùng rễ là môi trường với sự đa dạng vi sinh vật cao gây ra bởi các rễ tiết các hợp chất hữu cơ như amino acid, vitamin, phosphatid, có nguồn gốc từ sự quang hợp và các quá trình khác của cây (Sylvia et al 2005) Các vi khuẩn thường hiện diện trong vùng rễ thuộc nhiều chi khác nhau bao

gồm Azospirillum, Burkholderia, Azotobacter, Pseudomonas, Bacillus, nhờ vào sự đa

dạng vi sinh vật cao nên vùng rễ là nguồn quan trọng của vi khuẩn nội sinh (Hillel và Elsevier, 2005)

2.3.3 Một số nhóm vi khuẩn nội sinh

a Vi khuẩn Azospirillum

Năm 1923 Beijerinck phân lập được nhóm vi khuẩn giống như xoắn khuẩn

(Azospirillum lipoferum) Sau đó được khám phá lại bởi Becking năm 1963 và nhóm

của của Döbereiner năm 1970 (Von Bülow và Döbereiner 1975) Cuối cùng các vi

khuẩn này được phân lại là Azospirillum, được mô tả bởi Tarrand et al (1978) Những

vi khuẩn thuộc giống Azospirillum là những vi sinh vật cố định đạm sống tự do hoặc

kết hợp với rễ của các cây lúa, lúa mì, sorgum, bắp và một số loài không thuộc cỏ

(gramineous) Azospirillum thuộc lớp Alphaproteobacteria và đến năm 2012 có 15 loài

đã được tìm thấy (Nguyễn Hữu Hiệp, 2013)

Vi khuẩn Azospirillum là vi khuẩn gram âm, hiếu khí và kị khí nhưng thích hợp

nhất ở điều kiện vi hiếu khí, hình dấu phẩy (vibrioid) hoặc hình chữ s (xoắn khuẩn), chứa các hạt PHA (polyhydroxyalkanoate) Trong môi trường lỏng vi khuẩn này

chuyển động nhờ vào một chùm chiên mao ở đầu (polar flagellum) Ở một số loài (A

brasilense, A lipoferum, A amazonense) trong môi trường đặc ở nhiệt độ ấm di

chuyển nhờ vào các chiên mao bên (lateral flagellation) (Franche et al., 2008)

Vi khuẩn Azospirillum phát triển tốt trên muối của những acid hữu cơ như malte,

succinate, lactate hoặc pyruvate Fructose và những đường đôi khác cũng có thể được

vi khuẩn sử dụng như là nguồn carbon, vi khuẩn không sử dụng đường đơn Một số

dòng Azospirillum lipoferum cần biotin cho sự phát triển của chúng (Nguyễn Hữu

Hiệp, 2012)

Azospirillum giúp tăng năng suất lúa từ 32-81% ở điều kiện nhà lưới (Mirza và

ctv, 2000; Malik và cộng tác viên 2002) Nhưng ở điều kiện ngoài đồng vi khuẩn này

chỉ làm tăng năng suất từ 10-30% Ngoài ra Azospirillum thể tiết ra những kích thích tố

tăng trưởng như IAA (Indole-3-acetic acid), IBA (Indole-3-butyric acid), ABA (abscisic acid) và cytokynins Những kích thích tố tăng trưởng đó làm tăng chiều dài

rễ, thể tích rễ và số lượng rễ Từ đó, chúng làm tăng khả năng hấp thụ khoáng chất và nước, nhờ đó tăng khả năng sinh trưởng và phát triển cũng như tăng năng suất cây trồng

b Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus

Hình 1 Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus dưới kính hiển vi

(nguồn: http://genome.jgi-psf.org/gludi/gludi.jpg , 4.4.2014)

Gluconacetobacter diazotrophicus được phát hiện lần đầu tiên bởi Cavalcante và

Dobereiner (1988), lúc đầu được gọi là Saccharobacter nitrocaptans sau đó được đặt

tên lại là Acetobacter diazotrophicus (Gillis et al., 1988), và cuối cùng có tên

Gluconacetobacter diazotrophicus nhờ vào việc phân tích trình tự 16S rRNA (Yamada

et al., 1997)

Gluconacetobacter diazotrophicus là vi khuẩn vi hiếu khí bắt buộc, gram âm, tế

bào hình que thẳng và chịu được acid (Cavalcante và Dobereiner, 1988; Gillis et al.,

1988) Nồng độ sucrose cao (10%) là nguồn carbon tốt nhất cho sự phát triển của vi

khuẩn, glucose, fructose và galactose cũng có thể được sử dụng (Cavalcante và

Dobereiner, 1988) Tuy nhiên vi khuẩn không thể vận chuyển hoặc hấp thu sucrose mà

nhờ vào enzyme ngoại bào levansucrase để thủy phân sucrose thành glucose và

fructose (Martinez-Fleites et al., 2005; Hernandez et al., 1995) Loại enzyme này là rất

quan trọng cho sự tồn tại của vi khuẩn, và có thể chiếm hơn 70% của tất cả các protein

tiết ra bởi các chủng đặc biệt của G diazotrophicus (Hernandez et al., 1995) Nhờ vào

enzyme ngoại bào levansucrase mà G diazotrophicus có thể tồn tại và phát triển ở

nồng độ đường 30% (Eskin, 2012)

Nhờ vào khả năng nội cộng sinh cố định đạm mà không gây hại cho cây, lại sản

xuất hormone thực vật (auxin, gibberellin), có thể hòa tan Zn, phosphorus nên

G diazotrophicus là một loài vi khuẩn đầy hứa hẹn, với khả năng cung cấp gần một

nửa N cố định được ở dạng hữu ích cho cây Thực nghiệm ngoài đồng cho thấy lượng

N mà G diazotrophicus tạo ra bằng với đố chứng có bón 275 kg N/ha

c Vi khuẩn Burkholderia

Vi khuẩn Burkholderia thuộc vi khuẩn gram âm, có dạng hình que, đường kính

khoảng 1µm, chúng có thể di chuyển nhờ các chiên mao ở đầu (Jesús et al.,2004) VI

khuẩn Burkholderia sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí,

nhưng môi trường ít oxy thì phát triển tốt nhất, chúng phát triển sâu trong môi trường nuôi cấy từ 1-4mm (Paulina,2001) Trong môi trường nuôi cấy chúng tạo thành các khuẩn lạc màu trắng hoặc hơi vàng, đường kính khoảng 2-4mm, tròn phẳng hoặc lài (Jesús et al.,2004)

Vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với nhiều loại cây trồng và có khả năng

cố định đạm, kích thích sự tăng trưởng của cây, hiện diện trong vùng rễ và rễ của nhiều loại cây như: bắp, mía, cà phê, lúa (Scarpell et al.,2004; Chen et al., 2006) Hiện

nay người ta tìm được khoảng hơn 40 loài Burkholderia (Martinez-Aguilar et al.,

2008) bao gồm vi khuẩn cố định đạm trong đất, trong rễ cây, đẩy mạnh các giai đoạn phát triển của cây (Coenye and Vadnamme, 2003; Osulliva and Mahenthiralingam, 2005)

Vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây trồng và có khả năng cố định

đạm, kích thích sự tăng trưởng của cây, hiện diện trong vùng rễ của nhiều loại cây

trồng như bắp, lúa mì, cà phê, lúa Nhiều nghiên cứu cho thấy Burkholderia cepacia

cộng sinh ở rễ bắp trồng ở Châu Âu, rễ lúa và đậu trồng ở Úc giúp tăng năng suất, tăng khả năng kháng bệnh, giảm lượng thuốc trừ sâu sử dụng Thí nghiệm ngoài đồng cho

thấy loài Burkholderia vietnamensis sau 14 ngày chủng giúp tăng khả năng đâm chồi

33%, số lượng rễ tăng 57%, bề mặt lá tăng 30%, năng suất lúa tăng từ 13-22% Thí

nghiệm cũng cho thấy chủng Burkholderia vietnamensis và lúa ngoài đồng bón phân

đạm 25-30kg N/ha thì năng suất tương đương nhau

d Vi khuẩn Azotobacter

Vi khuẩn Azotobacter có hình que, hiếu khí, di động nhờ chiên mao Vi khuẩn

này có tính mẫn cảm cao với pH, nồng độ phosphate cao và với nhiệt độ trên 35oC

Các giống vi khuẩn Azotobacter ở môi trường biển hay các giống chịu được mặn rất hiếm Các tế bào Azotobacter già gồm các thể bào xác có hình thái rõ rệt Các thể bào

xác có thể tạo ra bằng cách nuôi trong môi trường có thêm một hóa chất như butanol Các bào xác có đặc tính hơi chống chịu lại với các điều kiện khó khăn của môi trường như nhiệt độ, sự khô khan (Nguyễn Hữu Hiệp, 2012)

n-e Vi khuẩn Azoarcus

Vi khuẩn Azoarcus là vi khuẩn gram âm, hầu hết các giống Azoarcus được phân

lập từ cỏ Kallar (Reinhold-Hurek et al.,1993; Hurek et al., 1995), loài cỏ này mọc ở

ven bờ biển Pakistan Vi khuẩn Azoarcus có trong rễ, bề mặt rễ (Reihold-Hurek et al.,1993) Năm 1987 Bilal và Malik đã phân lập được một loài vi khuẩn Azoarcus có

trong rễ cỏ Kallar Khi khai phá những vùng có cỏ Kallar phát triển tốt để trồn lúa mì người ta thấy lúa mì được trồng ở những nơi đó có năng suất cao mà không cần thiết bón nhiều phân hóa học (Malik et al., 1980) Vi khuẩn này còn được phân lập từ rễ lúa, kích thích sự sinh trưởng của lúa Ở những nơi trong vùng rễ có lượng oxy thấp vi khuẩn này vẫn thể hiện khả năng cố định đạm tốt (Hurek et al., 1995)

f Vi khuẩn Herbaspirillum

Herbaspirillum là một nhóm beta – proteobacteria, là những vi khuẩn gram âm,

hình que, sinh trưởng tốt trong môi trường có dicarboxylic và tổng hợp N trong

khoảng pH biến thiên từ 5,3 – 8 Trong môi trường bán đặc vi khuẩn Herbaspirillum

tạo thành một lớp màng mỏng, trắng, mịn

Những vi khuẩn này là những thể cộng sinh có khả năng cố định đạm trong mô của các cây như: lúa, bắp, mía, sorgum, chuối và khóm Cây cộng sinh với

Herbaspirillum spp có thể tăng trưởng và cho năng suất cao Ngoài khả năng cố định

đạm, chúng còn có khả năng tạo ra những sản phẩm như auxins và gibberillins rất tốt

cho sự tăng trưởng của cây Khi thử nghiệm chủng giống Herbaspirillum để xem ảnh

hưởng của nó trên lúa thì cho thấy giống vi khuẩn này giúp tăng năng suất tương đương với việc bón 40 kg N/ha

Herbaspirillum seropediace là vi khuẩn tổng hợp đạm cộng sinh với rễ của cây

lúa, bắp và sorgum Ngoài ra, vi khuẩn Herbaspirillum seropediace còn chịu được

nồng độ đường cao và có thể phát triển ở nồng độ sucrose cao 10%, mặc dù nguồn

carbon này ít khi được sử dụng bởi Herbaspirillum spp Loài vi khuẩn Herbaspirillum

seropediace có thể tổng hợp 31 – 54% đạm cho cây trồng trong điều kiện phòng thí

nghiệm Khi nhiễm loại vi khuẩn này vào cây trồng trên những cánh đồng mang lại nhiều hiệu quả như: giúp cho chồi, thân và rễ dài hơn, tăng năng suất và trọng lượng hạt

g Vi khuẩn Pseudomonas sp

Vi khuẩn Pseudomonas sp thường là vi khuẩn gram âm hình que, có chiên mao ở

cực, có khả năng di chuyển tốt trong nước, không có khả năng tạo bào tử

Pseudomonas là vi khuẩn sống tự do, chúng hiện diện khắp nơi trong đất, trong nước,

thực vật, động vật, cơ thể người, một số làm hư hỏng thực phẩm Chúng có khả năng

hô hấp hiếu khí hay kỵ khí trong môi trường không có oxy

Nhiệt độ thuận lợi để chúng phát triển là 30-37oC Tuy nhiên một số chủng

Pseudomonas lại có thể sống ở 40oC Pseudomonas có thể được nuôi trong môi trường

đơn giản và pH trung tính Một vài chủng có thể tạo huỳnh quang dưới ánh sáng tia cực tím ở bước sóng 254 nm

Các thuộc tính của vi khuẩn Pseudomonas:

Tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật như ở một số loài:

Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas syringae auxin,

cytokinin, kích thích sự phát triển của bộ rễ cây làm tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng trong đất (Favilli et al., 1998)

Hòa tan lân ở dạng khó tan thành dạng dễ tan giúp cây trồng dễ hấp thụ như:

Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas chlororaphis

2.3.4 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh

a Cố định đạm

Đạm là một trong những chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tổng hợp tế bào của các enzyme, protein, chlorophyll, DNA và RNA Vì thế đạm có vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng và phát triển của cây (Hayat et al., 2010) Cây chỉ có thể đồng hóa đạm, bao gồm ammonium, nitrate và các hợp chất hữu cơ , được cung cấp chủ yếu từ

phân bón hóa học, tuy nhiên khoảng 65% lượng đạm bị đánh mất từ hệ thống đất, thực vật thông qua sự phát thải khí, dòng chảy, xói mòn đất và sự rửa trôi (Bhattacharjee et al., 2008) Trong khi đó lượng đạm trong không khí có khoảng 78% tồn tại ở dạng N2, cây không thể đồng hóa một cách trực tiếp mà phải nhờ vào quá trình cố định đạm sinh học (Claudine Franche, 2008)

Cố định đạm sinh học là một quá trình được thực hiện bởi vi khuẩn, trong đó nitơ phân tử được biến đổi thành dạng nguyên tử sau đó thành dạng đạm vô cơ ammonia, tiếp đó vi khuẩn sẽ chuyển hóa tiếp một phần thành dạng hữu cơ acid amin cho bản thân vi khuẩn (Cao Ngọc Điệp, 2011) Quá trình cố định đạm sinh học xảy ra nhờ enzyme nitrogenase (nhạy cảm với O2) hiện diện trong vi khuẩn xúc tác cho phản ứng:

N2 + 8H++ 8e- nitrogenase 2NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi

Enzyme này có cấu tạo bởi 2 protein: 1 protein sắt và 1 protein Mo-Fe (Bhattacharjee et al., 2008)

b Hòa tan Lân

P là một trong những dưỡng chất rất cần thiết cho sự sống và phát triển của sinh vật P đóng một vai trò quan trọng trong sự chuyển hóa vật chất và năng lượng từ đó quy định chiều hướng, cường độ các quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật và cuối cùng là năng suất cây (Nguyễn Hữu Hiệp, 2012) Trong đất P tồn tại dưới hai dạng là P vô cơ như tricalcium phosphate, dicalcium phosphate, hydroxyapatite và P hữu cơ Mặc dù trong đất thường chứa một lượng lớn P tổng (hiện diện ở mức 400-

1200 mg/kg đất), nhưng hầu hết các P này ở dưới dạng không hòa tan như là iron và aluminum phosphates trong các đất acid và calcium phosphates trong các đất kiềm Trong khi đó cây chỉ hấp thu một vài dang P nhưng chủ yếu là ở dạng hòa tan như HPO4

2-, H2PO4

(hiện diện trong đất rất thấp, thường ở mức 1ppm hoặc ít hơn

-(Hariprasad and Niranjana, 2008; Hayat, 2010) Chính vì vậy, các dạng P không hòa

tan phải được chuyển đổi thành dạng hòa tan thì cây mới hấp thu được Một số vi khuẩn trong đất có khả năng hòa tan lân dạng khó tan thành dạng hòa tan Các vi khuẩn này hòa tan lân theo hai cơ chế:

- Hòa tan P vô cơ: vi khuẩn tạo ra các acid hữu cơ như citrate, lactate, succinate, gluconic acid và 2-ketogluconic acid để hòa tan các hợp chất P Trong đó gluconic

acid 2-ketogluconic acid thường xuyên hiện diện và có vai trò quan trọng nhất Trong khi đó các acid hữu cơ tiết ra bởi các rễ cây có ảnh hưởng đến sự hòa tan P lớn hơn các acid hữu cơ từ vi khuẩn (Jones,1998) Tuy nhiên các vi khuẩn này sử dụng các acid hữu cơ tiết ra từ rễ cây vì thế có thể gián tiếp ức chế sự hòa tan P và các nguyên tố bất định khác như Fe và Mn (Mukerji et al., 2006)

- Hòa tan P hữu cơ: cơ chế của sự hòa tan là nhờ vào các phosphatases (hay phosphohydrolases) do vi khuẩn tiết ra Các phosphohydrolases là nhóm acid hoặc bazơ Bởi vì hầu hết các loại đất có pH từ acid đến trung tính nên các phosphohydrolases acid có vai trò quan trọng Không giống với phosphohydrolases bazơ, các phosphohydrolases acid thể hiện hoạt tính xúc tác đặc trưng ở giá trị pH acid đến trung tính Các enzyme này thủy giải các liên kết phosphoester hoặc phosphoanhydride (Rodríguez, 1999 và Stefan et al.,2012)

Các P dạng khó tan sau khi được vi khuẩn phân giải chúng trở nên có giá trị cho cây, cây có thể hấp thu chúng

c Tổng hợp IAA

Indole-3-acetic acid (IAA) hay còn gọi là auxin, là chất điều hòa chủ yếu của sự sinh trưởng thực vật IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự giãn dài của tế bào, phân hóa sinh mô, phát triển trái và hạt, chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây trồng Tác động của auxin phụ thuộc vào dạng tế bào, ở các nồng độ như nhau IAA kích thích đồng thời sự giãn dài trục lá mầm, ngăn cản sự sinh trưởng của rễ chính, kích thích sự khởi đầu của rễ bên và sự thành lập lông rễ (Theologis và Ray, 1982; Gray et al., 2001)

Theo Sergeeva et al (2007), các nhóm vi khuẩn khác nhau kể cả vi khuẩn đất, vi

khuẩn nội sinh và một số Cyanobacteria đã được phát hiện có khả năng sinh tổng hợp indole-3-acid-acetic từ tiền chất L-tryptophan (Trp) Ngoại trừ một số loài của những

nhóm này như Psedomonas savastanoi và Agrobacterium tumefaciens có liên quan

đến bệnh thực vật, ở các loài còn lại thì kích thích sự sinh trưởng của thực vật (Patten

và Glick, 1996)

Có 3 lộ trình tiêu biểu nhất cho sự biến đổi của L-tryptophan thành IAA đã được

Koga et al (1991) Mô tả chi tiết như sau:

-Lộ trình indole-3-pyruvic acid

Tryptophan indole-3-pyruvic acid indole-3-acetaldehyde IAA

-Lộ trình tryptamine

Tryptophan tryptamine indole-3-acetaldehype IAA

-Lộ trình indole-3-acetamide

Tryptophan indole-3-acetamide IAA

Trong đó lộ trình indole-3-pyruvic acid là lộ trình chủ yếu để tổng hợp IAA từ

tryptophan của vi khuẩn

Tuy nhiên, trong nhóm vi khuẩn Pseudomonas còn có cơ chế tổng hợp IAA không

sử dụng tiền chất tryptophan Trong đó chất indole-3-glycerol phosphate chuyển sang acid indole-3-pyruvic không chuyển qua tryptophan, từ đây tiền chất này chuyển sang chất indole-3-acetaldehyde rồi chuyển sang IAA

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy nhiều giống vi khuẩn nội sinh

Azoarcus, Enterobacter, Rhizobium, Agrobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Clavibacter, Bradyrhizobium, Azopirillum, Gluconacetobacter, Cellulomonas, Klebsiella, Corynebacterium, Burkholderia, Herbaspirillum… được nhận diện từ

các cây lương thực khác nhau như cây hoa màu, cây họ đậu và cây cỏ… Berg et

al., (1980) đã nghiên cứu đặc tính sinh học của Azospirillum cộng sinh ở mía làm tăng

cường hoạt tính của enzim nitrogenase từ đó làm tăng lượng đạm tổng hợp cho cây

Ở Thụy Điển, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy vi khuẩn nội sinh ở vùng rễ của

các loài ngũ cốc và cỏ chăn nuôi như Enterobacter và Bacillus (Lindberg và

Granhall, 1984)

Ở Nhật, nhiều nhà nghiên cứu đã xác định được các vi khuẩn Herbaspirillum có

khả năng cố định đạm ở các loài lúa hoang (Elbeltagy et al., 2001)

Ở Mỹ, mất hơn 6 năm nghiên cứu ở 4 loài cây nông nghiệp (bắp, lúa miếng, đậu tương, lúa mì) và 27 loài cỏ tự nhiên khác đã xác định được giống vi khuẩn

Corynebacterium, Agrobacterium, Clavibacter, Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Escherichia, Klebsella, Microbacterium, Microbacterium, Micrococus, Rothia, Xanthomonas… (Zinniel et al., 2002) Trong đó số vi khuẩn Gram dương xấp xỉ

bằng số vi khuẩn Gram âm

Ở Ấn Độ, khi nghiên cứu 4 loài lúa trồng khác nhau đã xác định được vi khuẩn

nội sinh Glucoacenobacter diazotrophicus cũng có khả năng cố định đạm nhờ gen nif

(Muthukumarasamy et al., 2004)

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu các vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm, hoà tan lân, tổng hợp kích thích tố IAA trên cây nông nghiệp đã được tiến hành khá nhiều trong những năm gần đây Tại Viện nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học-Đại học Cần Thơ Cao Ngọc Điệp (2005) đã phân lập và nhận diện các dòng

Azospirillum bằng kỹ thuật PCR từ rễ, thân, lúa hoang, lúa trồng và một số loại cỏ ở

ruộng lúa, ảnh hưởng của vi khuẩn nốt rễ (Sinorhizobium fredii) và vi khuẩn

Pseudomonas sp trên cây đậu nành đã làm gia tăng số trái và giảm trái lép trên cây

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

- Thời gian: thí nghiệm được tiến hành từ tháng 8 năm 2013 đến tháng 4 năm

- pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ)

- Cân điện tử Sartorius (Đức)

- Kính hiển vi Olympus CHT ( Nhật)

- Cân điện tử Sartorius (Đức)

- Nồi khử trùng nhiệt ướt

- Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức)

3.2.2 Nguyên vật liệu

Thu 9 mẫu rễ bắp (thu toàn bộ rễ của mỗi cây) từ các huyện ở 3 tỉnh :

- Tỉnh Đồng Nai : Huyện Trảng Bom (1 mẫu), Huyện Thống Nhất (2 mẫu) , Huyện Long Thành (2 mẫu)

- Tỉnh Bình Phước : Huyện Chơn Thành (2 mẫu)

- Tp Hồ Chí Minh : Huyện Củ Chi (2 mẫu)

Dd vitamine: Biotin: 10mg; Pyridoxyl-HCl: 20mg; thêm nước cất cho đủ 100ml

- Môi trường LGI

Bảng 4 Công thức môi trường LGI (Cavalcante và Dobereiner, 1988)

(♦) Bđ : Bán đặc

c Hoá chất kiểm tra khả năng hòa tan Lân

- Môi trường NBRIP

Bảng 5 Công thức môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999)

d Hoá chất kiểm tra khả năng cố định nitơ

- Môi trường Burk’s không đạm

Bảng 6 Công thức môi trường Burk’s không đạm (Park et al., 2005)

3.3.2 Xử lí mẫu

Rửa mẫu dưới vòi nước chảy mạnh cho sạch đất, rửa lại 2 lần bằng nước cất, để ráo tự nhiên Dùng dao bén tách rời rễ thành từng đoạn nhỏ 1 cm để riêng trong các bọc nilon sạch, bảo quản trong tủ lạnh -5oC nếu chưa phân lập

3.3.3 Khử trùng mẫu

Mẫu rễ được khử trùng bề mặt như sau: Cho mẫu vào bình tam giác 100 ml, sau

đó cho cồn 96% vào bình tam giác vừa ngập mẫu, lắc nhẹ trong 3 phút, tiếp tục khử trùng bằng H2O2 3% trong 3 phút, rửa lại bằng nước cất khử trùng 4-5 lần

3.3.4 Phân lập

Lấy khoảng 2 gram mẫu rễ cho vào cối vô trùng, giã nhuyễn, thêm 0.5-1 ml nước cất vô trùng vào cối, trộn và hút phần dịch trích mẫu cho vào tube 1.5 ml Rút lấy 100l phần dung dịch trong bên trên và cấy vào các ống nghiệm có chứa môi trường LGI và NFb (mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần), sau đó đậy nắp các ống nghiệm lại và đem ủ khoảng 2-3 ngày

Sau 2-3 ngày quan sát ống nghiệm thấy có một lớp màng mỏng sậm màu cách bề mặt môi trường 2-5 mm , đó là dấu hiệu chứng tỏ có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh, lần lượt cấy chuyển sang môi trường LGI và NFb đặc

Vòng pellicle

Hình 2 Vòng Pellicle sau hai ngày chủng mẫu (25.08.2013)

Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, chạm nhẹ vào lớp màng mỏng

để lấy vi khuẩn trãi lên đĩa chứa môi trường đặc (đường cấy thứ nhất), tiếp tục vẽ đường cấy thứ hai cắt vuông góc đường cấy thứ nhất và đường cấy thứ ba cắt vuông góc với đường cấy thứ hai để tách rời khuẩn lạc (giữa các lần vẽ phải khử trùng que cấy) và ủ ở 30oC Sau 1-2 ngày chọn những khuẩn lạc rời, đều nhau nằm trên đường

cấy, cấy chuyển sang môi trường khác cho đến khi quan sát dưới kính hiển vi thấy vi khuẩn đã ròng Sau đó chuyển mẫu đã ròng vào ống nghiệm chứa môi trường đặc ủ trong 2 ngày để vi khuẩn phát triển, sau đó trữ ở -5oC

3.3.5 Quan sát hình thái và đo kích thước khuẩn lạc

Khi cấy chuyển vi khuẩn trên môi trường phân lập đặc ta đồng thời tiến hành đo kích thước và quan sát hình thái khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng,

độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường Tuy nhiên đối với các dạng khuẩn lạc

có kích thước quá nhỏ thì ta sử dụng kích lúp để quan sát

3.3.6 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn

Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp

- Chuẩn bị mẫu vi khuẩn

- Nhỏ 15 µl nước cất vô trùng lên kính mang vật (lame)

- Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội

- Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước cất vô trùng trên kính mang vật

- Đậy kính đậy vật (lammelle) lên giọt huyền phù vi khuẩn bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với lame một góc 45o rồi hạ kính đậy vật xuống

từ từ và nhẹ nhàng sao cho mẫu vật không có bọt khí

- Tiến hành quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 400 lần để thấy được hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn

3.3.7 Xác định đặc tính của các dòng vi khuẩn phân lập được

a Khả năng cố định đạm và định lượng đạm tổng hợp được

* Khả năng cố định đạm

Vi khuẩn cố định đạm có thể phát triển tốt trên môi trường không đạm do chúng

có khả năng tổng hợp đạm từ không khí Cấy chuyển tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường Burk’s không đạm ủ ở 30oC và theo dõi sự phát triển của chúng trong 3 ngày Dòng nào phát triển được trên môi trường Burk’s không đạm thì có khả năng cố định đạm

Lấy mẫu vào các thời điểm 2, 4, 6, và 8 ngày để xác định hàm lượng ammonium (NH4+) vi khuẩn tổng hợp được bằng phương pháp so màu Oniani Ion NH4+ trong dung dịch sẽ phản ứng với phenol dưới sự hiện diện của ion hypocholoride trong môi trường kiềm tạo thành indophenol có màu xanh lá cây

Chuẩn bị hoá chất đo đạm:

- Nitroprusside: Cân 5g phenol và 0,025g Phenol-nitroprusside có thêm 0,5 lít nước cho vào cốc

- Sodium hypochloride: Pha 15 ml hypochloride với 5g NaOH và 0,5 lít nước cho vào cốc

- Dung dịch chuẩn NH4+ 1 mg/l

Tiến hành dựng đường chuẩn đo đạm

Bảng 7: Đường chuẩn đo đạm

Đo mẫu

- Hút 1,5 ml dịch vi khuẩn cho vào tuýp 2-ml, ly tâm 12000 vòng/phút/5phút

- Sau đó hút 0,5 ml dịch sau ly tâm cho vào ống nghiệm có chứa 2 ml H2O khử khoáng, kế đến bổ sung 2,5 ml Phenol-nitroprusside và 2,5 ml sodium hypochloride, vortex và để ổn định khoảng 15 phút tiến hành đo OD bước sóng 636 nm (OD640nm)

- Dựa vào phương trình đường chuẩn: Y= a*x + b

Trong đó: x là nồng độ của mẫu (mg/l)

Y là độ hấp thụ quang

Sau đó, đo độ hấp thụ quang của mẫu cần phân tích để tính hàm lượng NH4

+ theo công thức: x= (y – b)/a

b Khả năng hòa tan lân và định lượng lân hòa tan được

* Khả năng hòa tan lân

Cấy chuyển tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường NBRIP đặc

ủ ở 30oC và theo dõi sự phát triển trong 3 ngày Dòng nào phát triển được trên môi trường NBRIP thì có khả năng hòa tan lân

* Định lượng lân hòa tan được

Tiến hành nhân giống vi khuẩn trên môi trường NFb và LGI lỏng trong các ống nghiệm

Hút 1 ml mẫu vi khuẩn sau khi nhân giống cho vào 20 ml môi trường NBRIP trong trong các ống fancol, để trên máy lắc tốc độ 120 vòng/phút, nuôi trong 20 ngày mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần cùng với đối chứng (không chủng vi khuẩn)

(Chú ý: Để định lượng lân môi trườngNBRIP không để Bromothymol Blue)

Lấy mẫu vào các thời điểm 5, 10, 15, và 20 ngày để khảo sát khả năng hoà tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn bằng phương pháp so màu Oniani Hàm lượng P2O5 được hoà tan trong môi trường tác dụng với amoniummolypdate trong môi trường acid tạo thành chất phosphomolypdate màu vàng Dưới sự hiện diện của chất khử Mo6+ bị khử thành Mo3+ làm cho dung dịch có màu xanh dương Màu xanh dương chỉ thị vi khuẩn có khả năng hoà tan lân

Chuẩn bị hoá chất đo lân :

- Dung dịch A:

(1): Cân 12 gam (NH4)6MO24.4H2O (amoniummolypdate), sau đó thêm 250

H2O vào cốc và khoấy tan

(2): Cân 0,2908 gam KsbOC4H2O6 (potassium antymonyl tartrate), sau đó thêm

100 ml H2O vào cốc

(3): Thêm H2O vào cốc có chứa 140 ml H2SO4 đậm đặc cho đủ lượng 1lít

(4): Trộn chung hỗn hợp (1), (2), (3), sau đó thêm H2O đủ lượng 2 lít

- Dung dịch B: Cân 1,050 g acid ascorbic vào cốc, thêm 200 ml dung dịch A

Tiến hành dựng đường chuẩn đo lân

Bảng 8: Đường chuẩn đo lân

- Hút 1,5 ml dịch vi khuẩn cho vào tuýp 2-ml, ly tâm 12000 vòng/phút/5phút

- Hút 0,5 ml dịch sau ly tâm cho vào ống nghiệm có chứa 5 ml H2O khử khoáng, sau

đó bổ sung 4 ml dung dịch B và 3,5 ml H20 khử khoáng, khoấy hỗn hợp, để ổn định khoảng 15 phút tiến hành đo OD bước sóng 880 nm