ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn bacillus megaterium bn9

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN S

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG

PHÂN GIẢI BÃ BIA CỦA VI KHUẨN

BACILLUS MEGATERIUM BN9

LỚP: VI SINH VẬT HỌC K36

Cần Thơ, Tháng 05/2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN VÀ KHẢ NĂNG

PHÂN GIẢI BÃ BIA CỦA VI KHUẨN

BACILLUS MEGATERIUM BN9

TS BÙI THỊ MINH DIỆU NGUYỄN YẾN NHI

Ths TRẦN VŨ PHƯƠNG MSSV: 3108497

LỚP: VI SINH VẬT HỌC K36

Cần Thơ, Tháng 05/2014

PHẦN KÝ DUYỆT

(ký tên) (ký tên)

ThS Trần Vũ Phương

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

LỜI CẢM TẠ

-- -

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến:

Ban Giám Hiệu, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, cùng tập thể quý Thầy, Cô - Trường Đại học Cần Thơ đã dạy bảo, truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp

TS Bùi Thị Minh Diệu, Ths Trần Vũ Phương đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm và đóng góp những ý kiến quý báu trong quá trình tôi thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Cô Nguyễn Thị Pha – Cố vấn học tập lớp Vi sinh vật học, khóa 36 – trường Đại học Cần Thơ đã động viên, an ủi và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện

và hoàn thành luận văn này

Tập thể lớp Vi sinh vật học, khóa 36 cùng với các bạn Công nghệ Sinh học, khóa

36 đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp

Hơn hết, tôi vô cùng biết ơn công lao to lớn của cha mẹ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về mặt vật chất và động viên tinh thần cho tôi trong suốt khóa học và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe, thành đạt trên nhiều lĩnh vực, luôn có cống hiến quý báo cho sự nghiệp giáo dục

Xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

Nguyễn Yến Nhi

TÓM LƯỢC

Bã bia chứa nhiều protein, là phụ phẩm của ngành công nghiệp sản xuất bia, được thải ra với một khối lượng lớn nhưng chưa được sử dụng nhiều, gây ô nhiễm môi trường Sử dụng vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn để xử lý nguồn chất thải bã bia hứa hẹn nhiều tiềm năng như chế biến thức ăn gia súc, sản xuất phân bón với giá thành thấp và thân thiện với môi trường Mục tiêu của nghiên cứu này là khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn Bacillus megaterium BN9 được phân lập từ nước thải tại nhà máy bia Sabeco thuộc tỉnh Bạc Liêu Kết quả khảo sát cho thấy thời gian nuôi cấy tối ưu cho dòng vi khuẩn này là 3 ngày Vi khuẩn phát triển thuận lợi và cho hiệu suất phân giải bã bia đạt giá trị cao nhất trong môi trường có pH 8 tại nhiệt độ 35 o C Sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn bị ức chế khi môi trường có bổ sung glucose, sucrose (1% w/v) Trong khi đó, môi trường có bổ sung rỉ đường (1% w/v), mật số vi khuẩn đạt cao nhất nhưng khả năng phân giải bã bia lại giảm Ngoài bã đậu nành (0,5% w/v) giúp làm tăng mật số vi khuẩn, các nguồn nitơ khác khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy đều làm giảm sự phát triển cũng như khả năng phân giải bã bia của

vi khuẩn so với môi trường chỉ chứa bã bia là nguồn dinh dưỡng duy nhất

Từ khóa: Bacillus megaterium, môi trường nuôi cấy, phân giải bã bia

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

CÁC TỪ VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Sơ lược về bia và ngành công nghiệp sản xuất bia 2

2.2 Sơ lược về bã bia 2

2.2.1 Bã bia 2

2.2.2 Thành phần hóa học của bã bia 4

2.3 Sơ lược về vi sinh vật phân giải bã bia 6

2.3.1 Giới thiệu chung về vi sinh vật phân giải bã bia 6

2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng phân giải cơ chất của vi khuẩn 7

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 10

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 10

2.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 11

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Phương tiện nghiên cứu 13

3.1.1 Địa điểm - Thời gian 13

3.1.2 Giống vi khuẩn 13

3.1.3 Vật liệu thí nghiệm 13

3.1.4 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 13

3.1.5 Hóa chất 14

3.1.6 Thiết bị - dụng cụ 14

3.2 Phương pháp nghiên cứu 15

3.2.1 Chuẩn bị mẫu vi khuẩn giống và cơ chất 15

3.2.2 Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian 15

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn Bacillus megaterium BN9 16

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn Bacillus megaterium BN9 16

3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn Bacillus megaterium BN9 17

3.2.6 Đánh giá khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn Bacillus megaterium BN9 và thành phần của bã bia trước và sau khi phân giải 18

3.2.7 Phương pháp phân tích 18

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

4.1 Sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian 20

4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn B megaterium BN9 21

4.3 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn B megaterium BN9 23

4.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn B.megaterium BN9 26

4.5 Khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn Bacillus megaterium BN9 và thành phần của bã bia trước và sau khi phân giải 28

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 29

5.1 Kết luận 29

5.2 Đề nghị 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO 30

PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Một số hình ảnh thí nghiệm Phụ lục 2 Kết quả thí nghiệm Phụ lục 3 Kết quả phân tích thống kê

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1 Thành phần của bã malt 4

Bảng 2 Thành phần hóa học của mầm malt 4

Bảng 3 Giá trị thức ăn gia súc của mầm malt 5

Bảng 4 Thành phần chất khô của men bia 5

Bảng 5 Thành phần hóa học của bã bia khô 6

Bảng 6 Thành phần dinh dưỡng của rỉ đường mía 9

Bảng 7 Thành phần của bã đậu nành 10

Bảng 8 Thành phần môi trường bã bia lỏng 13

Bảng 9 Thành phần môi trường bã bia rắn 14

Bảng 10 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn 21

Bảng 11 Thành phần carbon và nitơ của bã bia trước và sau khi phân giải 28

Bảng 12 Sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian

Bảng 13 Sự phát triển của vi khuẩn theo sự tương tác giữa pH và nhiệt độ

Bảng 14 Hiệu suất phân giải theo sự tương tác giữa pH và nhiệt độ

Bảng 15 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự phát triển của vi khuẩn

Bảng 16 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến hiệu suất phân giải bã bia của vi khuẩn

Bảng 17 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự phát triển của vi khuẩn

Bảng 18 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hiệu suất phân giải bã bia của vi khuẩn

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1 Quy trình sản xuất bia 3

Hình 2 Bã bia 3

Hình 3 Vi khuẩn Bacillus megaterium 7

Hình 4 Sự thay đổi mật số vi khuẩn theo thời gian 20

Hình 5 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn 24

Hình 6 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn 26

Hình 7 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến sự phát triển của vi khuẩn

Hình 8 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Công nghiệp sản xuất bia và thị trường tiêu thụ bia ngày càng phát triển Bia là thức uống phổ biến và được yêu thích ở nhiều quốc gia, do đó bia được sản xuất với số lượng rất lớn và mang lại lợi nhuận khổng lồ Tuy nhiên, một trong những vấn đề mà các hãng bia phải đối mặt là hàng nghìn tấn bã ngũ cốc được thải ra ở công đoạn cuối trong quá trình sản xuất bia và phải tốn một khoản chi phí không nhỏ cho việc xử lý bã bia Phần bã tươi còn chứa nhiều chất dinh dưỡng, các chất men và xác vi sinh vật Thông thường, bã bia được bán cho nông dân làm phân bón, hay làm thức ăn cho gia súc nhưng hiệu quả không cao Bã bia vẫn chưa được sử dụng rộng rãi, lượng bã bia tiêu thụ không nhiều và chưa tận dụng được hết các thành phần dinh dưỡng có trong

bã bia mà chỉ thải ra môi trường bên ngoài, điều này sẽ gây ô nhiễm môi trường vì chất thải men bia có hàm lượng COD rất cao

Do đó, việc nghiên cứu các kỹ thuật xử lý bã bia và kỹ thuật sản xuất các sản phẩm từ bã bia sẽ giúp giải quyết được nhiều vấn đề: giảm ô nhiễm môi trường; giảm được giá thành bia thương phẩm nhờ giảm chi phí đầu tư vào máy móc, thiết bị để xử

lý chất thải đồng thời tận dụng được các phụ phẩm để tạo ra các sản phẩm có giá trị dinh dưỡng, đem lại hiệu quả kinh tế cao

Bacillus megaterium là một trong những vi khuẩn được ứng dụng rộng rãi trong

các chế phẩm sinh học, xử lý môi trường và công nghệ thực phẩm, chúng có khả năng phát triển và phân giải protein, tinh bột Tuy nhiên, sự phát triển và khả năng phân giải

cơ chất của các vi khuẩn thường chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố Do đó, việc xác định các điều kiện tối ưu cho sự phát triển và phân giải bã bia của vi khuẩn là rất cần

thiết trước khi đưa dòng vi khuẩn này ứng dụng vào thực tế Đó là lý do đề tài “Ảnh

hưởng của một số yếu tố đến sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của vi

khuẩn Bacillus megaterium BN9” được thực hiện

1.2 Mục tiêu đề tài

Đề tài được thực hiện nhằm xác định các điều kiện môi trường nuôi cấy thích

hợp cho sự phát triển và khả năng phân giải bã bia của chủng vi khuẩn Bacillus

megaterium BN9 để có thể ứng dụng vào quá trình phân giải bã bia làm thức ăn gia

súc

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về bia và ngành công nghiệp sản xuất bia

Bia là một loại nước uống chứa cồn được sản xuất bằng quá trình lên men của

đường trong môi trường lỏng và nó không được chưng cất sau khi lên men Nói một cách khác, bia là loại nước giải khát có độ cồn thấp, bọt mịn xốp và có hương vị đặc trưng của hoa hublon Đặc biệt, CO2 hòa tan trong bia có tác dụng giải nhiệt nhanh, hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa, ngoài ra trong bia còn chứa một lượng vitamin khá phong phú (chủ yếu là vitamin nhóm B như vitamin B1, B2, PP, .) Nhờ những ưu điểm này, bia được sử dụng rộng rãi ở hầu hết các nước trên thế giới Ở nước ta, bia đã trở thành loại đồ uống quen thuộc với sản lượng ngày càng tăng và đã trở thành một

ngành công nghiệp mũi nhọn trong nền công nghiệp nước ta

2.2 Sơ lược về bã bia

2.2.1 Bã bia

Bã bia là sản phẩm tách ra sau khi lên men bia Phần nước được sử dụng làm bia Trong bã men bia có chứa nhiều thành phần bao gồm protein, vitamin, lignin, carbohydrate trong đó có tế bào nấm men Mặt khác trong tế bào nấm men có chứa nhiều chất dinh dưỡng như vitamin, protein,…Những protein này có nguồn gốc từ động vật, chứa khoảng 20 acid amin và đầy đủ các acid amin thiết yếu

Bã bia tươi có chứa nhiều nước, có mùi thơm và vị ngọt, có nhiều khoáng, vitamin nhóm B và đặc biệt là có hàm lượng protein thô cao khoảng 19-25% (Oluponna, 2002) Trên thế giới, bã bia đã được nghiên cứu và sử dụng làm thức ăn cho gia súc nhai lại, cho lợn (Westendorf và Wohlt, 2002; Aguilera-Soto et al., 2008)

Bã bia có thể sử dụng ở dạng tươi và cũng phù hợp cho việc ủ chua (Naoki Nishino et al., 2001) Nếu tận dụng đúng cách, bã bia sẽ là một nguồn dinh dưỡng phong phú Bã bia thường được sử dụng làm phân bón, thức ăn gia súc, thu sinh khối nấm men, lên men nước chấm,

Hình 1 Quy trình sản xuất bia

(Nguồn: http://my.opera.com/gianghugo/blog/show.dml/38236692)

Hình 2 Bã bia

2.2.2 Thành phần hóa học của bã bia

Bã malt được tạo ra trong quá trình dịch hóa và lọc dịch đường Trong quá trình dịch hóa, dưới tác dụng của các enzyme amylase, protease và các men khác thì 65 – 70% vật chất khô của malt sẽ chuyển vào dịch sau khi lọc, phần còn lại nằm ở trong bã malt Tùy thuộc vào phương pháp tách và vận chuyển mà độ ẩm của bã malt dao động

từ 75 – 85% Với độ ẩm này thì bã malt được dùng làm thức ăn gia súc Bã malt tươi thường có dạng sền sệt, có màu nâu nhạt, vị ngọt và mùi mạch nha

Bã malt tươi và khô đối với gia súc có khả năng kích thích tạo sữa và thịt khá tốt,

do đó nó vừa được dùng làm thức ăn cho bò sữa vừa làm thức ăn cho gia súc lấy thịt (trâu, bò) và lợn

Bảng 3 Giá trị thức ăn gia súc của mầm malt (trong 100 kg mầm malt)

(Densikow, 1963)

Bã bia tươi là loại thức ăn nhiều nước, có mùi thơm và vị ngon Hàm lượng khoáng, vitamin (chủ yếu là vitamin nhóm B) và đặc biệt là hàm lượng đạm trong bã bia cao Do đó bã bia có thể được coi là loại thức ăn bổ sung đạm Hơn nữa, thành phần xơ trong bã bia rất dễ tiêu nên có tác dụng kích thích vi sinh vật phân giải xơ trong dạ cỏ phát triển Vì thế nó có thể dùng để bổ sung vào khẩu phần chính là rơm rạ cho kết quả rất tốt (Nguyễn Xuân Trạch, 2000) Ngoài ra bã bia còn chứa các sản phẩm lên men có tác dụng kích thích tính ngon miệng và kích thích tiết sữa rất tốt Chính vì thế bã bia được sử dụng rất rộng rãi trong chăn nuôi bò sữa Tuy nhiên, theo Phùng Quốc Quảng (2002) lượng bã bia trong khẩu phần bò sữa cần tính toán làm sao

có thể thay thế không quá 1/2 lượng thức ăn tinh (cứ 4,5kg bã bia có giá trị tương đương với 1kg thức ăn tinh) và không nên cho ăn trên 15kg/con/ngày Cho ăn nhiều bã bia (ví

dụ trên 25kg/con/ngày) sẽ làm giảm tỷ lệ tiêu hoá chất xơ, các chất chứa nitơ và kéo theo sự giảm chất lượng sữa Tốt nhất là trộn bã bia và cho ăn cùng với thức ăn tinh, chia làm nhiều bữa trong một ngày

Thành phần và giá trị dinh dưỡng của bã bia phụ thuộc vào tỷ lệ nước, nguồn gốc sản xuất và thời gian bảo quản Bã bia ướt dễ bị phân giải làm mất dinh dưỡng và tăng

độ chua, cho nên người ta thường chỉ có thể cho gia súc ăn trong vòng 48 giờ Để kéo dài thời gian bảo quản người ta thường cho thêm muối ăn với tỷ lệ 1% Mặt khác, người ta có thể làm thành bã bia khô (chứa khoảng 10% nước) để thuận tiện cho bảo quản và sử dụng

Bảng 5 Thành phần hoá học của bã bia khô

2.3 Sơ lược về vi sinh vật phân giải bã bia

2.3.1 Giới thiệu chung về vi sinh vật phân giải bã bia

Những dòng vi khuẩn sản sinh ra enzyme được tìm thấy trong bã bia Các dòng

này chủ yếu thuộc chi Bacillus Vi khuẩn Bacillus phân bố rộng trong tự nhiên, nhất là

trong đất, chúng tham gia tích cực vào sự phân giải vật chất hữu cơ nhờ vào khả năng sinh nhiều loại enzyme ngoại bào (Priest, 1993) Đây là những vi khuẩn hình que, Gram dương, sinh trưởng hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc và hình thành nội bào

tử Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn thuộc chi Bacillus rất đa dạng Khuẩn lạc thường

to và có màu trắng đến xám

Các dòng vi khuẩn thuộc chi này đều có triển vọng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực đời sống đặc biệt là trong lĩnh vực xử lý môi trường Đối với bã bùn bia và nước thải đều là những môi trường giàu dinh dưỡng và các chất hữu cơ cho các dòng

Bacillus phát triển Triển vọng phân giải được 2 loại chất thải này là khá cao đối với

các dòng vi khuẩn Bacillus subtilis và Bacillus megaterium (Nguyễn Thị Minh Thùy, 2013) Bacillus megaterium là vi khuẩn Gram dương, hình que, hình thành bào tử, hô hấp hiếu khí và nó được tìm thấy trong đất Bacillus megaterium phát triển ở nhiệt độ

từ 30 – 45oC, tối ưu khoảng 30oC Một số phân lập từ một hồ địa nhiệt ở Nam Cực đã

được tìm thấy phát triển ở nhiệt độ lên đến 63oC Bacillus megaterium đã được sử

dụng trong công nghiệp hơn 50 năm, vì nó sở hữu một số enzyme rất hữu ích và là

nguồn sản xuất exoenzymes dồi dào Bacillus megaterium thực hiện chu trình hoại

sinh chất hữu cơ có trong đất là quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ thành những hợp chất đơn giản hơn Trong môi trường đất, vi khuẩn ở dạng sinh dưỡng khi có sẵn

cơ chất cho chúng phát triển và chuyển thành dạng bào tử khi chất dinh dưỡng dần trở nên cạn kiệt Bên cạnh đó, chúng còn thể phân giải nhiều hợp chất như protein, tinh

bột, pectin, Chính nhờ những đặc tính này hiện nay Bacillus megaterium là một trong

những vi khuẩn được sử dụng khá phổ biến trong lĩnh vực xử lý môi trường (Patricia

S Vary et al., 2007)

Bacillus megaterium BN9 được phân lập từ nước thải tại nhà máy bia Sabeco

thuộc tỉnh Bạc Liêu có khả năng sinh bào tử, hình que dài, di động, khuẩn lạc tròn, bìa nguyên, màu trắng sữa, kích thước khuẩn lạc lớn 5,5 mm Catalase dương tính, có khả năng sinh enzyme amylase, protease (Nguyễn Thị Minh Thùy, 2013)

Hình 3 Vi khuẩn Bacillus megaterium

khuẩn khác nhau sẽ thích nghi tốt với những khoảng nhiệt độ và pH khác nhau

Theo Bartolomé et al (2003), Streptomyces avermitilis CECT 3339 có khả năng

phát triển và sản xuất acid hydroxycinnamic trên cơ chất bã bia ở pH là 6.0 và nhiệt độ

là 37oC

Theo Sinoy et al (2011), các chủng vi khuẩn thuộc dòng Bacillus sp phát triển

thuận lợi trong khoảng nhiệt độ 30oC – 40oC và pH tối ưu là 6,0 – 8,0

b Các yếu tố dinh dưỡng

Nguồn carbon

Tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn carbon được cung cấp có thể là chất vô cơ (CO2, NaHCO3, CaCO3, ) hoặc chất hữu cơ Fructose, glucose, sucrose, lactose, galactose, starch, glycerol, maltose và dextrose là những nguồn carbon tốt nhất đối với quá trình sản sinh ra enzyme protease của vi sinh vật Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ các nguồn carbon khác nhau phụ thuộc vào 2 yếu tố: một là thành phần hóa học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn này, hai là đặc điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật Trên thế giới hầu như không có hợp chất carbon hữu cơ nào mà không bị hoặc nhóm

vi sinh vật này hoặc nhóm vi sinh vật khác phân giải Không ít vi sinh vật có thể đồng hóa được cả các hợp chất carbon rất bền vững như cao su, chất dẻo, dầu mỏ, parafin,

khí thiên nhiên

Nhiều chất hữu cơ vì không tan được trong nước hoặc vì có khối lượng phân tử quá lớn cho nên trước khi được hấp thụ, vi sinh vật phải tiết ra các enzyme thủy phân

để chuyển hóa chúng thành các hợp chất dễ hấp thụ Người ta thường sử dụng đường

để làm nguồn carbon khi nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị dưỡng Để nuôi cấy các loại vi sinh vật khác nhau người ta dùng các nồng độ đường không giống nhau Với vi khuẩn người ta thường dùng 0,5 – 2% đường, còn đối với nấm men, nấm sợi lại

thường dùng 3 – 10% đường

Rỉ đường là một phụ phẩm của ngành sản xuất đường, là sản phẩm cuối cùng của quá trình sản xuất đường mà từ đó đường không còn có thể kết tinh một cách kinh tế nữa bởi các công nghệ thông thường Khoảng 75% tổng rỉ đường của thế giới được sản xuất từ mía và đa phần còn lại có từ củ cải đường Thành phần chính của rỉ đường chủ yếu là đường saccharose một ít glucose và fructose Thành phần chính xác của rỉ đường phụ thuộc vào điều kiện thổ nhưỡng và thời tiết, khí hậu, giống mía và giai đoạn thu hoạch cũng như quy trình sản xuất đường trong từng nhà máy Do vậy,

đường thay đổi đáng kể về thành phần dinh dưỡng, mùi vị, màu sắc và độ nhớt Bảng 6

cho thấy biến động của các thành phần của rỉ đường

Thành phần tiêu chuẩn của rỉ đường được chia thành 3 phần: đường, chất hữu cơ không đường và chất khoáng Các loại glucide hòa tan (đường đôi và đường đơn) là thành phần dinh dưỡng chính của rỉ đường, trong đó saccharose là chủ yếu Bên cạnh

đó, rỉ đường là một nguồn giàu chất khoáng, vitamin - kích thích sự sinh trưởng và

phát triển của vi khuẩn

Rỉ đường được ứng dụng trong sản xuất nhiều sản phẩm như: bột ngọt, rhum, sản xuất nấm men, acid lactic, cồn, tăng sinh khối protein Ngoài ra còn rất nhiều các quy trình công nghệ tiên tiến khác cũng dùng rỉ đường làm nguyên liệu như: Micromix-3 kết hợp bổ sung rỉ đường, NPK để xử lý rác, xử lý vỏ đầu tôm với rỉ

đường và enzyme dùng làm thứ ăn cho gia súc,…

Bảng 6 Thành phần dinh dưỡng của rỉ đường mía (%)

Nguồn: Wolfrom và Binkley (1953)

nhanh enzyme protease Các dạng nitơ hữu cơ không những là nguồn dinh dưỡng nitơ

mà còn là nguồn dinh dưỡng carbon cho vi sinh vật

Bã đậu nành là phế phẩm thu được trong quá trình sản xuất sữa đậu nành hoặc đậu phụ (bánh đậu hủ) Bã đậu được loại bỏ trong quá trình sản xuất Chúng có các thành phần như sau:

(*Nguồn: http://www.dost-bentre.gov.vn/index.php?option=com_content&task=view&id=1246, ngày

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, trước đây, bã bia chỉ dùng làm thức ăn cho gia súc, một số ít làm phân bón Những năm gần đây mới có một số nghiên cứu sử dụng các thành phần trong bã bia có hiệu quả hơn

Nguyễn Xuân Trạch, Mai Thị Thơm (2004) đã nghiên cứu đề tài Nuôi vỗ bê lai sin bằng rơm có bổ sung cỏ xanh, ure, bã bia và cho uống dầu lạc Kết quả cho thấy chế độ nuôi dưỡng bê Lai Sin kết hợp cho ăn cỏ và cho rơm được bổ sung urê và bã bia sau một lần cho uống dầu lạc (5ml/kg thể trọng) đã làm tăng lượng thu nhận thức

ăn, tăng tốc độ sinh trưởng của bê và đem lại lợi nhuận rõ rệt cho người chăn nuôi

Nguyễn Thị Hoàng Anh, Trịnh Vinh Hiển, Bùi Thị Thu Huyền (2008) đã nghiên cứu chế biến nấm men từ phụ phế phẩm sản xuất bia để làm nguyên liệu thức ăn chăn nuôi

Phạm Quỳnh Trang (2012) đã nghiên cứu tận dụng phế thải bia sau quá trình lên men làm thức ăn chăn nuôi Kết quả bước đầu thử nghiệm trên gà cho thấy sau 2 tháng nuôi, gà được cho ăn bằng thức ăn chế biến từ sản phẩm bã nấm men bia sấy khô có sự tăng trọng rõ rệt, có thể thay thế được bột đậu nành trong khẩu phần ăn của gà, đem lại hiệu quả kinh tế cao, giảm chi phí đầu tư

Phùng Thăng Long, Lê Đức Thạo, Lê Đình Phùng (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các mức bã bia tươi trong khẩu phần đến khả năng sinh trưởng và sức sản xuất thịt của lợn lai Duroc x (Pietrain x Móng Cái) Kết quả bước đầu cho thấy việc sử dụng bã bia tươi trong khẩu phần của lợn thịt có xu hướng cải thiện tỷ lệ nạc và làm tăng hiệu quả kinh tế

Nguyễn Thị Minh Thùy (2013) đã phân lập được chủng vi khuẩn Bacillus

megaterium BN9 và Bacillus subtilis BN5 từ bã bùn bia có khả năng sinh enzyme

protease, amylase và được đề nghị ứng dụng các dòng vi khuẩn trên để xử lý bã bia

2.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Theo Belibasakis và Tsirqoqianni (Animal Feed Science and Technology, 1996),

bổ sung bã bia tươi trong khẩu phần ăn sẽ giúp tăng sản lượng sữa, chất lượng sữa và các thành phần máu của bò sữa trong thời tiết nóng

Theo Naoki Nishino et al (2001) bã bia có thể sử dụng ở dạng tươi và cũng phù hợp cho việc ủ chua

Westendorf và Wohlt (2002); Aguilera-Soto et al (2008) bã bia đã được nghiên cứu và sử dụng làm thức ăn cho gia súc nhai lại, cho lợn Bã bia có thể thay thế các thành phần ngũ cốc trong thức ăn cho lợn, làm thành phần bổ sung vào khẩu phần thức

ăn của gia súc nhai lại; đem lại hiệu quả kinh tế cao

Bartolomé et al (2003) đã sử dụng bã bia làm cơ chất bổ sung vào môi trường

nuôi cấy Streptomyces avermitilis CECT 3339 Kết quả cho thấy Streptomyces

avermitilis CECT 3339 có khả năng phát triển và sản xuất acid hydroxycinnamic trên

cơ chất bã bia ở pH là 6.0 và nhiệt độ là 37oC

Shindo và Tachibana (2004) đã sử dụng bã bia làm cơ chất cho sự phát triển và

sinh acid lactic của chủng Lactobacillus

Xu et al (2008) nghiên cứu khả năng sinh enzyme α–amylase trên cơ chất bã bia

của Aspergillus oryzae As3951 Kết quả cho thấy enzyme α–amylase sinh ra tối đa là

11.296 U/GDS thu được sau 48 giờ lên men

Aghajanzadeh-Golshani et al (2010) đã nghiên cứu xác định thành phần hóa học

và ước tính giá trị dinh dưỡng của bã cà chua và bã bia Kết luận tổng thể cho thấy rằng giá trị dinh dưỡng trong bã cà chua cao hơn trong bã bia khi bổ sung vào khẩu phần ăn của động vật nhai lại

Jovanka Levic et al (2010) đã tận dụng bã bia làm thức ăn gia cầm Kết quả cho thấy sản lượng trứng, khả năng sinh sản và ấp nở của trứng đã thụ tinh tăng đáng kể Olu Malomo et al (2013) đã sử dụng bã men bia bổ sung vào môi trường phân

lập nấm Rhizopus stolonifer, Rhizopus oligosporus, Mucor racemosus, Aspergillus

niger và Mucor rouxii Các chủng nấm phân lập được tăng trưởng tốt trên bề mặt môi

trường có chứa bã men bia và bột nấm men Aspergillus niger có sự phát triển mạnh

nhất với đường kính là 380 mm tại 144 giờ với tỷ lệ bã men bia và bột nấm men là 1:1, cho sinh khối cao nhất sau 90 giờ

Ulfina Galmessa et al (2013) đã nghiên cứu tận dụng bã bia để thay thế ngũ cốc trong khẩu phần ăn của bê Kết quả cho thấy bã bia hoàn toàn có thể thay thế ngũ cốc trong khẩu phần ăn của bê Sử dụng bã bia bổ sung vào thức ăn hỗn hợp hay thức ăn thô xanh giúp giảm chi phí sản xuất, đem lại hiệu quả kinh tế cao

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm - Thời gian

- Thời gian thực hiện: từ tháng 09/2013 đến 01/2014

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Sinh học Phân Tử Thực Vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

3.1.2 Giống vi khuẩn

Chủng vi khuẩn Bacillus megaterium BN9 do phòng thí nghiệm SHPT Thực Vật

thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ cung cấp

3.1.3 Vật liệu thí nghiệm

- Bã bia thu tại nhà máy sản xuất bia Thanh Trang, Hậu Giang

- Rỉ đường mía thu tại nhà máy đường Phụng Hiệp, Hậu Giang

- Bột bắp, bột đậu nành mua tại điểm bán thức ăn gia súc đường 30/4, Cần Thơ

- Bã đậu nành mua tại nơi chế biến sữa đậu nành, tàu hủ đường 3/2, Cần Thơ

3.1.4 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Bảng 8 Thành phần môi trường bã bia lỏng

Bảng 9 Thành phần môi trường bã bia rắn

- Đĩa petri, bình tam giác và các dụng cụ thủy tinh

- Các dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, cốc thuỷ tinh, đầu cone (vàng, xanh, trắng), găng tay, đèn cồn, bình hút ẩm,

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Chuẩn bị mẫu vi khuẩn giống và cơ chất

a Mẫu vi khuẩn

Giống vi khuẩn ròng trữ lạnh trong ống nghiệm được cấy chuyển sang đĩa petri chứa môi trường TSA, sau đó cấy chuyển sang môi trường bã bia đặc, ủ ở 37oC trong

hai ngày Sau đó cấy vào bình chứa 100mL môi trường bã bia lỏng đã được khử trùng

ở 121oC trong 20 phút, nuôi tăng sinh khối trên máy lắc ở 37oC trong 48 giờ Rút 1mL dịch nuôi cấy tiến hành đếm mật số vi khuẩn Mật số cần đạt khoảng 108 CFU/mL Trữ lạnh bình nuôi tăng sinh khối trong tủ lạnh ở 4oC

b Cơ chất

Bã bia, bột bắp, bộ đậu nành, bã đậu nành được sấy khô ở 80oC trong 2 ngày, nghiền mịn bằng máy nghiền, bảo quản trong bọc nylon ở điều kiện nhiệt độ mát

3.2.2 Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian

Mục đích: Xác định thời gian phát triển tối ưu của chủng vi khuẩn Bacillus

- Ủ lắc ở 120 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng (dao động khoảng 25-30oC)

- Mỗi ngày rút 100µL ở mỗi bình tiến hành pha loãng, cấy trãi, ủ trong 24 giờ và đếm mật số vi khuẩn (như phương pháp đã nêu trên)

- Kết quả thí nghiệm sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm sau

Chỉ tiêu theo dõi: Mật số vi khuẩn

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng

phân giải bã bia của vi khuẩn Bacillus megaterium BN9

Mục đích: Xác định pH và nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chủng vi khuẩn

Bacillus megaterium BN9 và phân giải bã bia hiệu quả nhất

- Ủ lắc ở 120 vòng/ phút với các mức nhiệt độ như đã bố trí thí nghiệm

- Sau 3 ngày tiến hành pha loãng, cấy trãi, đếm mật số vi khuẩn, tính kết quả

- Sau 7 ngày tiến hành lọc qua giấy lọc, thu số bã bia còn lại, sấy ở 80oC trong 48 giờ (đến khi trọng lượng không đổi), để vào bình hút ẩm, cân tính kết quả

- Kết quả thí nghiệm sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm sau

Chỉ tiêu theo dõi: Mật số vi khuẩn, hiệu suất phân giải bã bia

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự phát triển và khả năng phân

giải bã bia của vi khuẩn Bacillus megaterium BN9

Mục đích: Xác định nguồn carbon thích hợp cho chủng vi khuẩn Bacillus

megaterium BN9 phát triển và phân giải bã bia hiệu quả nhất

Bố trí thí nghiệm:

- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố là nguồn carbon: rỉ đường, glucose, sucrose, bột bắp (nghiền mịn) với nồng độ là 1% (w/v) và nghiệm thức đối chứng không bổ sung thêm nguồn carbon

- Số nghiệm thức: 5 nghiệm thức

- Số lần lặp lại: 3 lần

Tổng số đơn vị thí nghiệm là: 5 x 3 = 15

Cách tiến hành:

- Tiến hành như thí nghiệm trên, bổ sung thêm nguồn carbon với tỉ lệ như đã bố trí thí nghiệm, điều chỉnh pH ở mức tối ưu như kết quả khảo sát ở thí nghiệm trên, đậy nút gòn, khử trùng ở 121oC, 20 phút, để nguội Chủng 0,5mL dung dịch vi khuẩn như thí nghiệm trên, ủ - lắc ở nhiệt độ tối ưu như kết quả thí nghiệm 2

- Sau 3 ngày tiến hành pha loãng, cấy trãi, đếm mật số, tính kết quả

- Sau 7 ngày tiến hành lọc, thu số bã bia còn lại, sấy ở 80oC trong 48 giờ (đến khi trọng lượng không đổi), để vào bình hút ẩm, cân tính kết quả

- Kết quả thí nghiệm sẽ được sử dụng cho thí nghiệm sau

Chỉ tiêu theo dõi: Mật số vi khuẩn, hiệu suất phân giải bã bia

3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự phát triển và khả năng phân

giải bã bia của vi khuẩn Bacillus megaterium BN9

Mục đích: Xác định nguồn nitơ thích hợp cho chủng vi khuẩn Bacillus

megaterium BN9 phát triển và phân giải bã bia hiệu quả nhất

Bố trí thí nghiệm:

- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố là nguồn nitơ: yeast extract, bột đậu nành (đậu nành nghiền mịn), bã đậu nành (chất bã từ quá trình chế biến tàu hủ), NH4Cl với nồng độ là 0,5% (w/v) và nghiệm thức đối chứng không bổ sung thêm nguồn nitơ

- Sau 3 ngày tiến hành pha loãng, cấy trải, đếm mật số vi khuẩn và tính kết quả

- Sau 7 ngày tiến hành lọc, thu số bã bia còn lại, sấy ở 80oC trong 48 giờ (đến khi trọng lượng không đổi), để vào bình hút ẩm, cân tính kết quả

- Kết quả thí nghiệm sẽ được sử dụng cho thí nghiệm sau

Chỉ tiêu theo dõi: Mật số vi khuẩn, hiệu suất phân giải bã bia

3.2.6 Đánh giá khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn Bacillus megaterium BN9

và thành phần của bã bia trước và sau khi phân giải

Xác định thành phần carbon và nitơ của bã bia trước và sau khi phân giải bởi vi

khuẩn Bacillus megaterium BN9 bằng phương pháp AOAC (2002) Mẫu được phân

tích là các kết quả cao nhất từ các thí nghiệm trước Mục đích của thí nghiệm này là tính được thành phần dinh dưỡng của bã bia trước và sau khi xử lý Từ đó đánh giá

được khả năng phân giải bã bia của vi khuẩn Bacillus megaterium BN9

3.2.7 Phương pháp phân tích

a Phương pháp xác định mật số vi sinh vật (phương pháp đếm sống)

 Phương pháp pha loãng mẫu

- Lấy 100L mẫu chứa vi khuẩn cho vào eppendorf đã chứa 900L nước cất đã được khử trùng trước

- Lắc đều bằng máy lắc cơ học, được độ pha loãng 10-1 Tiếp tục lấy 100L dịch

pha loãng ở nồng độ 10-1 cho vào ống nghiệm có chứa 900L nước cất đã khử trùng, ta được độ pha loãng 10-2

- Tương tự như trên, ta sẽ được dãy nồng độ pha loãng, 10-3, 10-4, 10-5,…

- Tùy theo sự ước đoán mật số vi khuẩn trong mẫu mà pha loãng nhiều hay ít Trong đề tài này, mật số vi khuẩn được khảo sát ở độ pha loãng khoảng 10-8

- Sau khi có độ pha loãng thích hợp thì tiến hành xác định mật số vi khuẩn

 Phương pháp kiểm tra

- Ở mỗi nồng độ pha loãng dùng pipet vô trùng lấy 100L cấy lên 2 đĩa petri đã chứa sẵn môi trường agar thích hợp

- Dùng que gạt để phân phối giọt dịch đều khắp mặt đĩa petri tạo điều kiện thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng

- Đặt các đĩa petri vào tủ ấm, ủ ở 37oC trong 24 giờ

- Kết thúc thời gian ủ, lấy các đĩa thạch ra, tiến hành đếm khuẩn lạc và tính số lượng tế bào trong 100L mẫu theo công thức đã nêu trên

 Cách tính kết quả

Mật số tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng Di được tính theo công thức là:

Mi (CFU/ml) = Ai x Di / V