xác định một số hoạt chất trong thể quả và sinh khối nuôi cấy chìm của nấm linh chi giống nhật (ganoderma lucidum)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HOẠT CHẤT TRONG THỂ QUẢ VÀ SINH KHỐI NUÔI CẤ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HOẠT CHẤT TRONG THỂ QUẢ VÀ SINH KHỐI NUÔI CẤY CHÌM

CỦA NẤM LINH CHI GIỐNG NHẬT (Ganoderma lucidum)

MSSV: 3102779 LỚP: CNSHTT K36

Cần Thơ, Tháng 11/2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HOẠT CHẤT TRONG THỂ QUẢ VÀ SINH KHỐI nuôi cấy chìm

CỦA NẤM LINH CHI GIỐNG NHẬT (Ganoderma lucidum)

MSSV: 3102779 LỚP: CNSHTT K36

Cần Thơ, Tháng 11/2014

PHẦN KÝ DUYỆT

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM TẠ

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Cần Thơ, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại Học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài này

Xin chân thành cảm ơn Cô Bùi Thị Minh Diệu vừa là một giảng viên vừa là cán

bộ hướng dẫn của em Trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn, cô đã giúp

đỡ, truyền thụ kiến thức, tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn này

Xin chân thành cảm ơn Cô Trần Thị Xuân Mai, cố vấn học tập, người đã luôn quan tâm, chia sẻ, giúp đỡ và động viên em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu Cảm ơn bạn Nguyễn Trung Duẩn, Nguyễn Thị Diễm An, tập thể lớp Công nghệ sinh học tiên tiến khóa 36, các em sinh viên lớp Công nghệ sinh học khóa 37, Vi sinh vật 37, Công nghệ sinh học khóa 38 và Công nghệ sinh học tiên tiến khóa 38 đã luôn giúp đỡ em trong quá trình học tập và thực hiện luận văn Cảm ơn các cán bộ quản lý ở các phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đề tài cũng như các anh chị đã nhiệt tình chia sẻ kiến thức kinh nghiệm cho em hoàn thành tốt đề tài

Ngoài ra, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và những người thân đã giúp đỡ em về vật chất lẫn tinh thần trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

và thực hiện luận văn tốt nghiệp

Kính chúc quý thầy cô, anh chị cùng tất cả các bạn sinh viên dồi dào sức khỏe và thành công trong công việc

Cần thơ, ngày 20 tháng 11 năm 2014

TÓM LƯỢC

Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) đã được biết đến từ xa xưa như một loại nấm dược liệu quý với nhiều tác dụng dược lý quan trọng nhờ vào thành phần hoạt chất khá phong phú và đa dạng Loài nấm này đã được nuôi trồng nhân tạo để thu hoạch thể quả từ những thập niên trước, và phương pháp nuôi cấy chìm cũng bắt đầu được áp dụng trong sản xuất nấm Linh chi Tuy nhiên, những nghiên cứu về thành phần hoạt chất trong thể quả và sinh khối nuôi cấy chìm của nấm Linh chi ở Việt Nam vẫn còn ít Do đó, đề tài “Xác định một số hoạt chất trong thể quả và sinh khối nuôi cấy chìm của nấm Linh chi giống Nhật (Ganoderma lucidum)” được tiến hành nhằm xác định và so sánh một số hoạt chất quan trọng cũng như khả năng kháng khuẩn của thể quả và khuẩn ty nuôi cấy chìm của Ganoderma lucidum Phân tích định tính sơ bộ cho thấy cả hai mẫu Linh chi đều chứa triterpenoid, alkaloid và saponin Kết quả phân tích định lượng cho thấy hàm lượng polysaccharide và acid ganoderic trong thể quả nấm Linh chi lần lượt là 2,730% và 10,815% Hàm lượng các hoạt chất này trong khuẩn ty nuôi cấy chìm đều cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với hàm lượng trong mẫu thể quả, trong đó hàm lượng polysaccharide và acid ganoderic lần lượt là 2,830% và 13,773% Nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết methanol từ thể quả và khuẩn ty chống lại vi khuẩn Escherichia coli ATCC 25922 lần lượt là 4,5 mg/mL và 1,8 mg/mL, cho thấy khuẩn ty nuôi cấy chìm thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt hơn

Từ khóa: Hoạt chất, khuẩn ty, nồng độ ức chế tối thiểu, nấm Linh chi, thể quả

MỤC LỤC

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ ii

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

TỪ VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 1

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Khái quát về Nấm 2

2.2 Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) 2

2.2.1 Khái quát chung về nấm Linh chi 2

2.2.2 Phân loại khoa học 4

2.2.3 Đặc điểm hình thái và chu trình sống của nấm Linh chi 4

2.2.4 Thành phần hóa học và tác dụng dược lý của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) 6

2.2.5 Công dụng của nấm Linh chi 10

2.3 Giới thiệu sơ lược về một số hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi 13

2.3.1 Polysaccharide 13

2.3.2 Triterpenoid 15

2.3.3 Alkaloid 17

2.3.4 Saponin 18

2.4 Một số phương pháp hóa học trong phân tích dược liệu 19

2.4.1 Phương pháp chiết xuất dược liệu 19

2.4.2 Phương pháp Phenol-sulfuric acid (PSA) 19

2.4.3 Phương pháp Liebermann-Burchard 20

2.4.4 Các loại thuốc thử chung cho alkaloid 20

2.5 Một số nghiên cứu về thành phần dược tính trong nấm Linh chi 21

2.5.1 Nghiên cứu ngoài nước 21

2.5.2 Nghiên cứu trong nước 22

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Thời gian và địa điểm 24

3.2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 24

3.3 Phương tiện nghiên cứu 24

3.3.1 Dụng cụ 24

3.3.2 Thiết bị 24

3.3.3 Hóa chất 24

3.3.4 Vật liệu 26

3.4 Phương pháp nghiên cứu 26

3.4.1 Chuẩn bị mẫu 26

3.4.2 Xác định và so sánh một số thành phần dược tính quan trọng trong thể quả và khuẩn ty nuôi cấy chìm chìm của nấm Linh chi 27

3.4.3 So sánh khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ thể quả và từ khuẩn ty nuôi cấy chìm của nấm Linh chi trên vi khuẩn Escherichia coli ATCC 29522 34

3.4.4 Xử lý số liệu 35

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

4.1 Xác định và so sánh một số thành phần dược tính quan trọng trong thể quả và khuẩn ty nuôi cấy chìm chìm của nấm Linh chi 36

4.1.1 Phân tích định tính một số thành phần dược tính trong thể quả và trong khuẩn ty nuôi cấy chìm của nấm Linh chi 36

4.1.2 Xác định và so sánh hàm lượng polysaccharide và acid ganoderic trong thể quả và khuẩn ty nuôi cấy chìm nấm Linh chi 40

4.2 So sánh khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ thể quả và từ khuẩn ty nuôi cấy chìm của nấm Linh chi trên vi khuẩn Escherichia coli 43

4.2.1 Thử tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên giấy lọc 43

4.2.2 Xác định MIC bằng phương pháp pha loãng trên thạch 43

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46

5.1 Kết luận 46

5.2 Đề nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Các hình ảnh

Phụ lục 2: Kết quả thí nghiệm

1 Thử nghiệm định tính saponin trong thể quả và khuẩn ty nuôi cấy chìm của G lucidum

2 Xác định và so sánh hàm lượng polysaccharide trong thể quả và khuẩn ty nuôi cấy chìm của G lucidum

3 Xác định và so sánh hàm lượng acid ganoderic trong thể quả và khuẩn ty nuôi cấy chìm của G lucidum

4 So sánh khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ thể quả và từ khuẩn ty nuôi cấy chìm của nấm Linh chi trên vi khuẩn Escherichia coli ATCC 29522

Phụ lục 3: Kết quả phân tích thống kê bằng phần mềm Minitab 16.0

1 Định tính saponin bằng thử nghiệm tính tạo bọt

2 So sánh hàm lượng polysaccharide trong thể quả và khuẩn ty nuôi cấy chìm của nấm Linh chi

3 So sánh hàm lượng acid ganoderic trong thể quả và khuẩn ty nuôi cấy chìm của nấm Linh chi

4 So sánh khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ thể quả và từ khuẩn ty nuôi cấy chìm của nấm Linh chi trên vi khuẩn Escherichia coli ATCC 29522

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Hàm lượng polysaccharide và triterpenoid từ 11 sản phẩm nấm Linh chi (G

lucidum) thương mại trên thị trường 8

Bảng 2: Các hoạt chất sinh học và dẫn xuất của chúng trong nấm Linh chi 9

Bảng 3: Thành phần cho 1 L môi trường CYM lỏng 25

Bảng 4: Thành phần cho 1 L môi trường MHA 26

Bảng 5: Bố trí thử nghiệm định tính triterpenoid 28

Bảng 6: Bố trí thử nghiệm định tính alkaloid 29

Bảng 7: Thành phần dung dịch dùng để dựng đường chuẩn glucose 32

Bảng 8: Thành phần dung dịch dùng để dựng đường chuẩn thymol 33

Bảng 9: Kết quả phân tích định tính sơ bộ thành phần dược tính trong thể quả và khuẩn ty nuôi cấy chìm của G lucidum 36

Bảng 10: Chiều cao trung bình của các cột bọt 40

Bảng 11: Kết quả thử tính kháng khuẩn của cao chiết methanol từ thể quả và khuẩn ty nuôi cấy chìm của G lucidum 43

Bảng 12: Kết quả xác định MIC của các cao chiết methanol từ thể quả và khuẩn ty nuôi cấy chìm của G lucidum 44

Bảng 13: Chiều cao cột bọt trong thử nghiệm tính tạo bọt (đơn vị: cm) Phụ lục 2 Bảng 14: Giá trị OD trong xây dựng đường chuẩn D-glucose Phụ lục 2

Bảng 15: Hàm lượng polysaccharide trong thể quả và khuẩn ty nuôi cấy chìm của G lucidum Phụ lục 2

Bảng 16: Giá trị OD trong xây dựng đường chuẩn thymol Phụ lục 2

Bảng 17: Hàm lượng acid ganoderic trong thể quả và khuẩn ty nuôi cấy chìm của G lucidum Phụ lục 2

Bảng 18: Đường kính vòng vô khuẩn của các cao chiết methanol từ thể quả và khuẩn

ty nuôi cấy chìm của G lucidum Phụ lục 2

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Chu kì phát triển của nấm Linh chi 5

Hình 2 Kết quả phân tích định tính thành phần triterpenoid 37

Hình 3 Kết quả định tính alkaloid với thuốc thử Dragendorff 38

Hình 4 Kết quả định tính alkaloid với thuốc thử Wagner 38

Hình 5 Kết quả định tính alkaloid với thuốc thử Mayer 39

Hình 6 Kết quả thử nghiệm tính tạo bọt 39

Hình 7 Hàm lượng polysaccharide và acid ganoderic trong thể quả và khuẩn ty nuôi cấy chìm của G lucidum 41

Hình 8 Một số thiết bị được sử dụng trong quá trình nghiên cứu Phụ lục 1 Hình 9 Mẫu nấm Linh chi Phụ lục 1 Hình 10 Quá trình chiết xuất và định lượng polysaccharide trong Linh chi Phụ lục 1 Hình 11 Quá trình chiết xuất và định lượng acid ganoderic trong Linh chi Phụ lục 1 Hình 12 Kết quả xác định MIC của cao chiết thể quả Phụ lục 1 Hình 13 Kết quả xác định MIC của cao chiết khuẩn ty nuôi cấy chìm Phụ lục 1 Hình 14 Đường chuẩn D-glucose Phụ lục 2 Hình 15 Đường chuẩn thymol Phụ lục 2

TỪ VIẾT TẮT

ACE Angiotensin-converting enzyme

CGA Crude ganoderic acids

CP Crude polysaccharides

DMSO Dimethyl sulfoxide

GLPS Ganoderma lucidum polysaccharide

HIV Human Immunodeficiency Virus

HBV Hepatitis B virus

HSPL Hệ số pha loãng

HSV Herpes simplex virus

LSD Least Significant Difference

MHA Mueller-Hinton Agar

MIC Minimal Inhibitory Concentration

NK Natural killer

PSA Phenol-sulfuric acid

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Nấm Linh chi là một loại dược liệu quý được biết đến và sử dụng từ xa xưa ở các nước châu Á, đặc biệt là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, (Wachtel-Galor et al., 2011; Wasser, 2010)

Trong “Thần nông bản thảo kinh”, nấm Linh chi được xếp vào loại siêu thượng phẩm hơn cả nhân sâm Nhờ vào các hoạt chất sinh học, Linh chi có nhiều tác dụng như: giải độc; kháng viêm; hỗ trợ chức năng tim mạch và hệ miễn dịch; phòng chống ung thư; chống lão hóa; chữa một số bệnh liên quan đến hệ bài tiết, hệ tiêu hóa, hệ hô hấp, Theo Wachtel-Galor et al (2011), loại nấm này có thành phần hoạt chất sinh học khá đa dạng, có nhiều acid amin thiết yếu, kể cả vitamin và khoáng chất Trong số

đó, polysaccharide và triterpene được xem là hai hoạt chất quan trọng nhất trong

Ganoderma lucidum

Ngày nay, ngoài dạng thể quả nấm, còn có nhiều dạng sản phẩm từ Linh chi được bán trên thị trường như trà Linh chi, rượu Linh chi, thuốc bổ từ Linh chi, Các sản phẩm này được sản xuất từ thể quả, khuẩn ty hoặc bào tử của Linh chi (Wachtel-Galor

et al., 2011) Các nghiên cứu cho thấy có sự khác nhau về tính chất và hàm lượng của thành phần hóa học trong các sản phẩm từ Linh chi do nhiều yếu tố (Wasser, 2010)

Tại Việt Nam, nấm Linh chi giống Nhật (loài Ganoderma lucidum) được xem là

có thành phần hoạt chất phong phú và được trồng phổ biến để thu hoạch thể quả Phương pháp nuôi cấy chìm cũng đã được nghiên cứu và áp dụng để nuôi và thu sinh khối của loài nấm này Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu xác định và so sánh thành phần dược tính trong thể quả và sinh khối nuôi cấy chìm của nấm Linh chi giống Nhật

ở Việt Nam Để góp phần vào nghiên cứu thành phần dược tính trong Linh chi, đề tài

“Xác định một số hoạt chất trong thể quả và sinh khối nuôi cấy chìm của nấm Linh chi

giống Nhật (Ganoderma lucidum)” được thực hiện

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Khái quát về Nấm

Theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành (2010), nấm (tiếng Anh là “fungi”)

là vi sinh vật nhân thực, ở thể tản (thalophyte), sống dị dưỡng (kí sinh, hoại sinh, cộng sinh); tế bào của nấm không có diệp lục tố; vách tế bào của nấm có cấu tạo chủ yếu là chitin và một số thành phần khác với hàm lượng thấp; đa số các loài nấm không có cellulose trong vách tế bào Nhìn chung, nấm sinh sản dưới 2 hình thức: hữu tính và vô tính Nhiều loài nấm có thể kí sinh trên các kí chủ như động vật, thực vật, sản phẩm sau thu hoạch, Một số là tác nhân gây bệnh hoặc gây hư hỏng vật dụng, thực phẩm nhưng cũng có nhiều loài nấm có ích và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Đặc biệt, một số loài nấm còn được xem là những loại dược liệu tốt cho sức khỏe

Theo Nguyễn Lân Dũng (2004a), trước đây nấm được xếp vào giới Thực vật Tuy nhiên, nấm có những đặc điểm khác với thực vật như: không có lục lạp và sắc tố quang hợp; không có đời sống tự dưỡng; không có sự phân hoá thành rễ, thân, lá; không có hoa như hầu hết các loài thực vật; không có một chu trình phát triển chung như các loài thực vật; đa số các loài nấm không chứa cellulose trong vách tế bào Vì thế, nấm được xem là một giới riêng, ngang hàng với giới Thực vật và giới Động vật trong tất cả các hệ thống phân loại sinh giới ngày nay Giới Fungi bao gồm nấm men, nấm sợi và nấm bậc cao (nấm có thể quả  mũ nấm) Cho đến nay, có khoảng 80.000 đến 120.000 loài nấm đã được mô tả, trong khi số lượng loài nấm được ước tính lên đến khoảng 1,5 triệu (Hawksworth, 2001)

Năm 2007, một hệ thống phân loại giới Nấm đã được xây dựng trong một nghiên cứu hợp tác của nhiều nhà Nấm học và nhà khoa học Theo đó, giới Nấm gồm có 7 ngành, 10 ngành phụ, 35 lớp, 12 lớp phụ và 129 bộ; hai ngành Ascomycota và Basidiomycota được xếp vào một giới phụ Dikarya (Hibbett et al., 2007)

2.2 Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)

2.2.1 Khái quát chung về nấm Linh chi

Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) còn được gọi là Vạn Niên Nhung, Bất Lão

Thảo, Thần Tiên Thảo, Đoạn Thảo, nấm Thần Linh, nấm Trường Thọ, cỏ Huyền Diệu, cây Điềm Lành, (Nguyễn Hữu Đống và Đinh Xuân Linh, 2000) Ở miền Bắc, nấm Linh chi còn có tên gọi khác là nấm Lim Nấm Linh chi có tên tiếng Anh là Lingzhi

(xuất phát từ tiếng Trung Quốc) hoặc Reishi (từ tiếng Nhật) (Wachtel-Galor et al., 2011)

Theo Wachtel-Galor et al (2011), từ xa xưa Linh chi đã được sử dụng làm thuốc tăng cường sức khỏe hoặc kéo dài tuổi thọ ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và các nước châu Á khác Linh chi là loại dược liệu quý trong y học cổ truyền, và những công dụng của nó đã được ghi nhận trong nhiều văn bản cổ Tên nấm Linh chi ở Trung Quốc lần đầu tiên được ghi lại trong “Thần nông bản thảo kinh” vào triều đại Đông Hán (25  220 năm trước Công nguyên), theo đó Linh chi được xem như một loại siêu thượng phẩm hơn cả nhân sâm Một số tài liệu còn cho rằng Linh chi được dùng làm thuốc từ khoảng 4000 năm nay ở Trung Quốc (Nguyễn Hữu Đống và Đinh Xuân Linh, 2000; Wasser, 2010) Tuy nhiên, Linh chi thực sự được chú ý nghiên cứu và sử dụng rộng rãi từ những năm 1960, đặc biệt là ở Trung Quốc

Theo Nguyễn Hữu Đống và Đinh Xuân Linh (2000), loài nấm này có thể mọc trên cây còn sống lẫn thân cây gỗ đã chết Chúng phân bố khắp nơi trên thế giới từ các khu rừng nhiệt đới cho đến rừng ôn đới, kí sinh hoặc hoại sinh trên các loài cây lá rộng đến lá kim, kể cả trên tre, trúc, dừa, cau, nho, Chất lượng của Linh chi phụ thuộc nhiều vào chất dinh dưỡng ở nơi chúng sống Trong Bản thảo cương mục (1590), đại danh y Trung Quốc Lý Thời Trân đã phân loại Linh chi theo màu sắc thành 6 loại gọi

là “Lục Bảo Linh chi” Mỗi loại có công dụng chữa bệnh khác nhau:

+ Loại có màu vàng gọi là Hoàng chi hoặc Kim chi

+ Loại có màu xanh gọi là Thanh chi hoặc Long chi

+ Loại có màu hồng, màu đỏ gọi là Hồng chi hay Ðan chi hoặc Xích chi

+ Loại có màu trắng gọi là Bạch chi hay Ngọc chi

+ Loại có màu đen gọi là Huyền chi hay Hắc chi

+ Loại có màu tím gọi là Tử chi

Trên thế giới, có hơn 250 loài trong chi Linh chi (Ganoderma) được mô tả,

nhưng Hồng chi (Ganoderma lucidum) là loài được nghiên cứu chi tiết nhất (Wasser,

2010) Theo Nguyễn Hữu Đống và Đinh Xuân Linh (2000), trong “Lục Bảo Linh chi”

thì Hồng chi được coi là Linh chi thật sự Loài chuẩn Ganoderma lucidum này có

thành phần hoạt chất phong phú với hàm lượng nhiều nhất

Theo Wasser (2010), trước đây nấm Linh chi chỉ có trong tự nhiên với số lượng rất ít nên chúng có giá rất đắt Từ đầu những năm 1970, các nhà khoa học đã thành công trong việc nuôi trồng nhân tạo nấm Linh chi, từ đó kỹ thuật này liên tục được cải tiến và dần đạt đến quy mô công nghiệp Từ năm 1980, việc sản xuất nấm Linh chi phát triển nhanh chóng, đặc biệt là ở Trung Quốc Nguyễn Lân Dũng (2004b) nói rằng Linh chi có thể được nuôi trồng nhân tạo bằng các cách như nuôi trồng trên thân gỗ, trên các môi trường chứa phụ phẩm lâm nghiệp, hoặc nuôi cấy chìm thu nhận sinh khối Bên cạnh môi trường truyền thống là mùn cưa, Linh chi còn có thể được trồng trên rơm rạ, bã mía,

2.2.2 Phân loại khoa học

Vực: Eukaryota (Sinh vật nhân chuẩn)

Chi: Ganoderma (Nấm Linh chi)

Loài: Ganoderma lucidum

(*Nguồn: NCBI, 2012)

2.2.3 Đặc điểm hình thái và chu trình sống của nấm Linh chi

2.2.3.1 Đặc điểm hình thái của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)

G lucidum thuộc họ Ganodermataceae bao gồm các nấm đảm đa tầng (nhiều lỗ)

có bào tử đảm hai vách (Wachtel-Galor et al., 2011)

Nấm có thể mọc thành cụm hoặc đơn lẻ Phần thịt của thể quả nấm Linh chi có màu nâu, mềm xốp nhưng hóa gỗ theo thời gian Nguyễn Hữu Đống và Đinh Xuân Linh (2000) chỉ ra rằng thể quả của nấm Linh chi gồm có hai phần, mũ nấm và cuống nấm (phần phiến đối diện với cuống nấm) Trên mũ nấm Linh chi có hai vách, bào tử hình thành phía bên trong giữa hai vách Đây là đặc điểm giúp phân biệt nấm Linh chi

với các loài khác Mũ nấm ban đầu có hình chùy; khi trưởng thành có hình bán nguyệt, hình quạt hoặc hình thận, kích thước thay đổi nhiều (dài 3  30 cm, rộng 2  25 cm, dày 0,5  2 cm) Mặt trên mũ nấm sáng bóng, màu nâu đỏ, có vân đồng tâm, lượn sóng

và vân tán xạ; mặt dưới có màu nâu nhạt, có các ống rất nhỏ chứa bào tử Khi còn non,

bề mặt mũ nấm có màu trắng hoặc vàng hay nâu nhạt (Microbe Wiki, 2011) Cuống nấm dài, hình trụ tròn, có màu nâu bóng Kích thước cuống nấm là khoảng 1  1,5 cm

x 15  20 cm Đầu cuống lệch một bên mũ, hoặc đôi khi nằm giữa trung tâm mũ Đôi khi Linh chi còn có dạng trung gian hình gạc (Roy, 2006)

Theo Kou (2004), bào tử nấm có màu nâu, kích thước khoảng 9  12 x 5,5  8

µm Bào tử hình thuẫn, có gai lõm, một đầu tròn lớn, một đầu tròn nhỏ có lỗ là nơi khuẩn ty mọc ra khi bào tử nảy mầm Khuẩn ty của nấm Linh chi là những sợi nấm trắng, có enzyme để phá vỡ các thành phần gỗ như lignin và cellulose

Nghiên cứu cho thấy, đặc điểm hình thái của Linh chi thay đổi tùy theo một số yếu tố như môi trường nuôi trồng, khí hậu, đột biến (Wachtel-Galor et al., 2011)

2.2.3.2 Chu trình sống của nấm Linh chi

Hình 1 Chu kì phát triển của nấm Linh chi

A: Thể quả; B: Mặt ngoài phiến nấm; C: Đảm; D: Sự phối nhân trong đảm;

E: Đảm và bào tử đảm; F: Bào tử đảm nảy mầm; G: Sợi nấm đơn nhân;

H: Sự phối chất của 2 sợi nấm đơn nhân; I: Sợi nấm song nhân

(*Nguồn: Nguyễn Lân Dũng, 2004b, trang 236)

2.2.4 Thành phần hóa học và tác dụng dược lý của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)

G lucidum không chứa nhiều chất dinh dưỡng để tạo ra năng lượng như các loài

nấm ăn khác nhưng lại có các dược chất quý mà ở các loài nấm ăn khác có rất ít Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã định danh được các hoạt chất và xác định tác dụng dược lý của chúng trong thể quả, khuẩn ty, bào tử và dịch nuôi cấy của nấm Wasser (2010) nhìn nhận rằng trong các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng, Linh chi được cho là có nhiều tác dụng dược lý bao gồm: điều biến hệ miễn dịch, chống xơ vữa động mạch, chống dị ứng, giảm đau, ngăn ngừa ung thư, chống khối u, chống oxy hóa, ngăn tác hại của chất phóng xạ, an thần, kháng khuẩn, kháng virus (kể cả HIV - Human Immunodeficiency Virus), giảm lượng chất béo trong máu, chống xơ hóa, bảo

vệ gan, chống lão hóa, hạ đường huyết, chống viêm loét, Tuy nhiên, không có nhiều báo cáo nghiên cứu tác dụng dược lý của Linh chi trên đối tượng người, và các thử nghiệm lâm sàng cũng chưa đủ điều kiện để đánh giá một cách khoa học về hiệu quả của chúng trong một ứng dụng nào đó (Wasser, 2010) Các nhà khoa học cho rằng cần

có những nghiên cứu chi tiết hơn, chính xác hơn về những tác dụng dược lý này trên

cơ thể người Cho đến gần đây, Linh chi được xem như thuốc hỗ trợ điều trị bệnh bạch cầu, ung thư biểu mô, viêm gan, và tiểu đường (type II) (Wasser, 2010)

Không như nhiều loài nấm khác có hàm lượng nước lên đến 90%, nấm Linh chi

tươi chỉ chứa khoảng 75% nước Thành phần chủ yếu của G lucidum là chất xơ,

carbohydrate, chất béo và protein trong đó tỉ lệ xơ thô là trên 50% khối lượng khô (Mau et al., 2001; Wasser, 2010) Theo Wasser (2010), các nghiên cứu cho thấy thể

quả, khuẩn ty và bào tử của G lucidum có chứa khoảng 400 hoạt chất sinh học khác

nhau, chủ yếu là các polysaccharide, triterpenoid, nucleotide, acid béo, sterol, steroid,

protein/peptide, các nguyên tố vi lượng Bên cạnh các hoạt chất chính, G lucidum còn

có các alkaloid, tannin, flavonoid, saponin, dẫn xuất của nucleotide, acid ganodermic, acid amin, coumarin, cyclo-octasulfur, ergosterol (tiền vitamin D2), anthraquinone, cerebroside, (Chandrashekar et al., 2013; Fakoya et al., 2013; Shamaki et al., 2012; Wasser, 2010) Trong bào tử của nấm có chứa choline, acid tetracosanoic, acid stearic, acid palmitic, acid nonadecanoic, acid behenic, ergosta-7, 22-dien-3-ol, tetracosane, hentri-acontane, ergosterol, betaine, và β-sitosterol (Wasser, 2010)

Wachtel-Galor et al (2011) cho rằng loài nấm này có tất cả các acid amin thiết yếu, đặc biệt giàu leucine và lysine Hàm lượng chất béo thấp và tỉ lệ acid béo không

no cao là một trong những tính chất quan trọng tạo nên giá trị cho nấm Linh chi

Nguyễn Hữu Đống và Đinh Xuân Linh (2000) trích dẫn kết quả phân tích của Viện nghiên cứu dược liệu Quảng Đông về tỉ lệ tương đối của một số thành phần hóa học trong nấm Linh chi hoang dại như sau:

+ Nước (trong nấm khô): 12  13%

Trong nghiên cứu của Mizuno (1995), thành phần (theo khối lượng khô) của

chiết xuất từ G lucidum là: chất dương tính với folin (68,9%), glucose (11,1%),

protein (7,3%), và kim loại (10,2%) Trong nghiên cứu khác, Mau et al (2001) kết

luận trong G lucidum có chứa: tro (1,8%), carbohydrate (26 – 28%), chất béo thô (3 –

5%), xơ thô (59%), và protein thô (7 – 8%) Khi sử dụng các dung môi khác nhau để

chiết xuất và phân tích thành phần của G lucidum hoang dại, Shamaki et al (2012)

đưa ra kết luận về thành phần hóa học của nấm như sau: độ ẩm (10,54%), tro tổng (5,93%), protein (17,55%), béo thô (2,60%), xơ thô (30,25%), carbohydrate (33,13%),

và nitơ (23,52%)

Theo Wasser (2010), các giống Linh chi được nuôi trồng có hàm lượng các thành phần hóa học tương tự với giống hoang dại So với giống hoang dại, chiết xuất của Linh chi được nuôi trồng có hàm lượng protein thô và carbohydrate thô tăng đáng kể cũng như loại bỏ được chất xơ thô

Trong nghiên cứu của Mizuno (1995), chiết xuất G lucidum chứa các kim loại

như kali (K), magnesi (Mg), calci (Ca), natri (Na), sắt (Fe), kẽm (Zn), mangan (Mn), đồng (Cu), selenium (Se) và germanium (Ge); trong đó K, Mg và Ca là những thành

phần kim loại chính, và Ge đứng thứ 5 trong số các kim loại có hàm lượng cao nhất (489 µg/g) Các chất khoáng này tham gia vào nhiều quá trình sinh hóa quan trọng trong cơ thể Đặc biệt, germanium hữu cơ có khả năng làm tăng khả năng vận chuyển oxy của hồng cầu lên 1,5  2 lần, từ đó giúp chữa được nhiều bệnh đồng thời duy trì sức khỏe Nguyên tố này cũng có nhiều tác dụng dược lý khác, trong đó quan trọng là các khả năng: giải tỏa stress, chống oxy hóa, chống khối u, điều hòa lượng cholesterol trong máu, giải độc, chữa bệnh bạch cầu, ngăn chặn sự phát triển của ung thư hay tác hại của chất phóng xạ, kích thích các inteferon chống lại các virus kể cả HIV, kích thích hệ miễn dịch sản sinh các tế bào tiêu diệt tự nhiên (tế bào NK - natural killer cells) và đại thực bào (Asai, 1980; Loren, 1987)

Bảng 1: Hàm lượng polysaccharide và triterpenoid từ 11 sản phẩm nấm

Linh chi (G lucidum) thương mại trên thị trường

(*Nguồn: Chang và Buswell, 2008)

Polysaccharide và triterpenoid được xem là những hoạt chất quan trọng nhất trong Linh chi (Skalicka-Woźniak et al., 2012; Wasser, 2010) Các thí nghiệm trên người và động vật đã chứng minh khả năng của chúng trong việc phục hồi sức khỏe, ngăn ngừa và chữa trị bệnh, nâng cao sức đề kháng, (Wachtel-Galor et al., 2011) Tuy nhiên, hàm lượng của các hoạt chất sinh học có thể rất khác nhau trong sản phẩm

từ tự nhiên và sản phẩm từ nấm Linh chi được trồng nhân tạo (Bảng 1) Có nhiều yếu

Sản phẩm Polysaccharide (%) Triterpenoid (%)

K (bột khuẩn ty) 12,78 Không thể xác định

tố dẫn đến sự khác nhau về tính chất và hàm lượng của thành phần hóa học trong các

sản phẩm từ G lucidum như nguồn gốc, chủng nấm, điều kiện nuôi trồng, phương

pháp tách chiết (Wachtel-Galor et al., 2011)

Bảng 2: Các hoạt chất sinh học và dẫn xuất của chúng trong nấm Linh chi Hoạt chất Nhóm chất Hoạt tính Bộ phận của nấm

sản sinh interferon, chống virus

Bào tử

**(không xác

định)

Adenosine Nucleotide Tăng sự lưu thông máu,

làm thư giãn cơ; giảm đau

Thể quả, khuẩn ty

Các β-D-glucan Polysaccharide Chống khối u, kích thích

hệ miễn dịch, giảm lượng đường huyết, bổ tim

Thể quả

Ganodermadiol Triterpenoid Giảm huyết áp, ức chế

ACE converting enzyme)

(angiotensin-Thể quả

Các β-D-glucan Polysaccharide Chống khối u, kích thích

hệ miễn dịch sản sinh interferon

Khuẩn ty

Uridine, Uracil Nucleoside Phục hồi thần kinh-cơ Khuẩn ty

Cyclo-octasulfur Chống dị ứng Khuẩn ty

Ling Zhi-8 Protein Chống dị ứng với phổ

rộng, điều hòa hệ miễn dịch

Oleic Acid Acid béo không no Chống dị ứng Khuẩn ty

(*Ghi chú: ACE là enzyme chuyển đổi angiotensin I thành angiotensin II, làm co thắt mạch máu dẫn đến huyết áp tăng)

(**Nguồn: NAMMEX, 2011)

Dựa vào nhiều kết quả nghiên cứu, Wachtel-Galor et al (2011) nhận định rằng

trong G lucidum còn có các hợp chất khác được xem là có tác dụng dược lý như một

số protein và lectin Các protein có hoạt tính sinh học đã được phát hiện bao gồm:

Ling Zhi-8; G lucidum peptide có hoạt tính bảo vệ gan và chống oxy hóa; ganodermin

có tác dụng kháng nấm từ thể quả G lucidum Một số lectin được tách chiết từ thể quả

và khuẩn ty của Linh chi có khả năng làm đông tụ hồng cầu hoặc tăng cường chức năng miễn dịch Các thành phần khác bao gồm enzyme như metalloprotease làm chậm quá trình đông máu; tác nhân ức chế α-glucosidase rất đặc hiệu từ thể quả của Linh chi, Bảng 2 giới thiệu tóm tắt hoạt tính của một số hoạt chất quan trọng trong Linh chi

2.2.5 Công dụng của nấm Linh chi

Nấm Linh chi có vị đắng hoặc ngọt, tính ấm, không độc (Nguyễn Lân Dũng, 2004b) Cho đến nay, Linh chi đã được nghiên cứu và sử dụng ở rất nhiều nước trên

thế giới Linh chi (G lucidum) có các công dụng đáng lưu ý sau:

+ Chữa trị ung thư:

Nhiều nghiên cứu in vitro và in vivo đã chứng minh khả năng ức chế sự phát

triển ở những giai đoạn khác nhau trong chu kỳ tế bào của tế bào khối u (Boh, 2013; Wachtel-Galor et al., 2011) Một số ít nghiên cứu lâm sàng chứng minh vai trò của Linh chi trong chữa trị một số bệnh ung thư Theo Gao và Zhou (2003), phép trị liệu ung thư tuyến tiền liệt bởi một hỗn hợp các thảo dược chứa Linh chi làm giảm rõ rệt lượng kháng nguyên đặc hiệu trong tuyến tiền liệt Polysaccharide và triterpenoid đóng vai trò chính trong khả năng chống ung thư, cùng với một số thành phần khác như protein (Wasser, 2010)

Trong chữa trị ung thư, Linh chi được sử dụng để phòng ngừa nhiễm trùng cơ hội, chống lại các tác dụng phụ của các liệu pháp, giảm đau, hạn chế việc sử dụng morphine, ngăn ngừa bệnh tái phát, tăng cường sự phục hồi sức khỏe sau phẫu thuật

(Wasser, 2010)

+ Điều biến miễn dịch:

Theo Wachtel-Galor et al (2011), nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng

kích thích hệ miễn dịch của G lucidum thông qua việc cảm ứng cytokine và tăng

cường các tế bào tác động (effector cells) như bạch cầu T và B, tế bào NK,

Polysaccharide, triterpenoid và germanium đóng vai trò chính trong chức năng tăng cường hệ miễn dịch

Theo Roy (2006), trong các liệu pháp bằng thảo dược hiện nay ở phương Tây, Linh chi chủ yếu được dùng như thuốc bổ, đặc biệt là như chất điều biến miễn dịch Linh chi được dùng để tăng cường chức năng miễn dịch và đề phòng nhiễm trùng cơ hội trong các phác đồ điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV

Nhờ vào khả năng điều biến miễn dịch và ức chế sự sản sinh histamine, Linh chi cũng có thể được dùng như tác nhân chống viêm trong điều trị hen suyễn và dị ứng Linh chi cũng được dùng trong điều trị viêm khớp, viêm phế quản dị ứng (Nguyễn Hữu Đống và Đinh Xuân Linh, 2000; Wasser, 2010)

+ Tăng khả năng cung cấp oxy cho tim, não:

Vì germanium trong Linh chi có thể tăng cường khả năng cung cấp oxy cho tế bào, Linh chi được dùng để: giải tỏa sự căng thẳng; chữa đau đầu, chóng mặt, buồn nôn, mất ngủ; giảm tình trạng thiếu oxy do động mạch vành bị tắc nghẽn; giúp cơ thể chịu được tình trạng huyết áp thấp (Wasser, 2010)

+ Hỗ trợ chức năng tim mạch và hệ tuần hoàn:

Wasser (2010) nhận định rằng các nghiên cứu chứng minh Linh chi có các tác động tích cực đến hệ tuần hoàn và chức năng tim mạch: giảm cholesterol thừa trong máu, chống tình trạng mỡ máu cao, làm giãn mạch vành và tăng cường sự lưu thông máu, tăng tần số và biên độ co tim, có tác dụng nhất định trong điều trị bệnh tim, điều hòa huyết áp, giảm lượng đường trong máu, chống sự kết tụ của tiểu cầu,

+ Kháng khuẩn và kháng virus:

Gần đây, nhiều nghiên cứu chứng minh G lucidum có chứa các thành phần

kháng khuẩn có khả năng ức chế một số vi khuẩn Gram âm và Gram dương (Wasser, 2010)

Các thành phần dược tính quan trọng (polysaccharide và triterpenoid) trong Linh chi có khả năng ức chế sự nhân bản của HIV, virus viêm gan siêu vi B (hepatitis B virus  HBV), virus Herpes (Herpes simplex virus  HSV), và các loại virus khác (Wasser, 2010)

Theo một số nghiên cứu, khả năng tăng cường hệ miễn dịch của Linh chi cũng đóng vai trò trong hoạt tính kháng khuẩn và kháng virus Dù cơ chế vẫn chưa được xác

định, Linh chi mở ra một khả năng mới trong sử dụng Linh chi kèm theo các liệu pháp nhằm giảm tác hại của các loại thuốc kháng khuẩn, kháng virus (Wasser, 2010)

+ Chống oxy hóa:

Nhiều thành phần trong Linh chi, đặc biệt là polysaccharide và triterpenoid, thể

hiện khả năng chống oxy hóa in vitro Các hoạt chất trong Linh chi giúp cơ thể tiêu

diệt các gốc tự do, chống oxy hóa, từ đó ngăn ngừa ung thư và các bệnh mãn tính khác (Wachtel-Galor et al., 2011; Wasser, 2010)

+ Các công dụng khác:

Theo y học cổ truyền Việt Nam và Trung Quốc, cũng như y học hiện đại, bên cạnh các công dụng đáng lưu ý nêu trên, Linh chi còn được sử dụng để:

Tăng cường trí nhớ

Tăng cường chức năng hô hấp

Chống lão hóa, làm tăng tuổi thọ

Giảm đau

Bảo vệ gan, chữa trị viêm gan mãn tính

Giải độc

Cải thiện chuyển hóa dinh dưỡng

Hỗ trợ chữa trị tiểu đường type II

Điều trị ho do cảm cúm, ho có đờm

Điều trị chứng giảm bạch cầu

Điều trị cơn đau thắt ngực

Có tác dụng nhất định đến suy nhược thần kinh, suy nhược tim, đau lá lách, đau dạ dày, đau thận, đau nửa đầu, đau mật, (Nguyễn Hữu Đống và Đinh Xuân Linh, 2000; Roy, 2006; Wasser, 2010)

2.3 Giới thiệu sơ lược về một số hoạt chất sinh học trong nấm Linh chi

2.3.1 Polysaccharide

2.3.1.1 Khái quát chung về polysaccharide trong Ganoderma lucidum

Wachtel-Galor et al (2011) nêu rõ rằng polysaccharide là các polymer có phân tử khối lớn, bao gồm nhiều hơn 20 monosaccharide Polysaccharide là những đại phân tử sinh học có cấu trúc và tính chất sinh lý đa dạng

G lucidum sản xuất nhiều loại polysaccharide khác nhau Cho đến hiện tại, có

hơn 200 loại polysaccharide được chiết xuất từ thể quả, khuẩn ty, bào tử hoặc từ dịch

nuôi cấy chìm của G lucidum dưới dạng polysaccharide nội bào hoặc ngoại bào (Huie

và Di, 2004; Trigos và Medellín; 2011) Theo Wachtel-Galor et al (2011), các polysaccharide này có thể khác nhau về thành phần hoặc khối lượng phân tử (ví dụ,

Ganoderans A, B, và C) Wasser (2010) chỉ ra rằng hầu hết các Ganoderma lucidum

polysaccharide (GLPS) này có khối lượng phân tử từ 4 x 105 đến 1 x 106 u ở cấu trúc bậc một Nhiều loại GLPS có khối lượng phân tử từ 4 x 105 đến 1 x 106 u được tìm

thấy trong thể quả và khuẩn ty của G lucdium, nhưng chỉ có một ít GLPS loại này

hiện diện trong bào tử của nấm (Sood et al., 2013)

Các GLPS bao gồm các D-glucan, heteropolysaccharide, glycoprotein Các D-glucan bao gồm một mạch thẳng của các nhóm D-glucopyranose liên kết theo kiểu β-(13) và các mạch β-(16)-glucose phân nhánh từ vị trí C6 của gốc đường với các mức độ phân nhánh khác nhau Loại glucan này được tìm thấy trong cả thể quả và dịch

β-nuôi cấy chìm của khuẩn ty của G lucidum Trong số các polysaccharide được tìm thấy trong G lucidum, các 1,3-β-glucan và 1,6-β-glucan tan trong nước là những hợp

chất điều biến miễn dịch công hiệu nhất (Chen et al., 2012) Bên cạnh các β-D-glucan tan trong nước, β-D-glucan còn tồn tại ở dạng các chuỗi heteropolysaccharide của xylose, mannose, galactose, uronic acid, và các phức hợp β-D-glucan–protein với hàm lượng 10-50% trong nấm Linh chi khô (Gao et al., 2002; Chen et al., 1998; Wasser và Weis., 1999; Cheong et al., 1999) Ngoài kiểu liên kết chủ yếu β-(13), β-(16), trong các heteropolysaccharide còn có các kiểu liên kết khác như β- hay α-(13), (14), và (16), với các nhóm đường ở cấu hình dạng D hoặc L Theo Wasser (2010), một số polysaccharide gắn protein và các glycoprotein chứa fucose có hoạt tính sinh học cũng đã được ly trích Cấu hình phân nhánh và độ tan của GLPS được

cho là có ảnh hưởng đến khả năng chống khối u của chúng (Wachtel-Galor et al., 2011)

Về đặc điểm, GLPS nhạy cảm với nhiệt nên dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao (Chin

et al., 2011) Nhìn chung, đa số các polysaccharide là những phân tử phân cực không mang điện tích Theo Hall (2003), một số loại polysaccharide như fructan, hợp chất pectic, dextrin, tan được trong nước, trong khi các polysaccharide khác không tan Ngược lại, các polysaccharide không tan trong dung dịch ethanol, trong khi monosaccharide, oligosaccharide và các acid amin tan được Kết tủa bằng ethanol là một trong những phương pháp phổ biến để phân tách polysaccharide Nghiên cứu của

Xu et al (2014) kết luận rằng các polysaccharide với những đặc điểm cấu trúc khác nhau, kể cả các polysaccharide có khối lượng phân tử tương đương, thể hiện sự khác biệt rõ rệt về khả năng kết tủa trong ethanol Đối với một glucan cụ thể, phân tử chất

đó có kích thước càng nhỏ thì nồng độ ethanol cần để tạo kết tủa chất đó càng cao Tính chất này được áp dụng trong quy trình phân tách các polysaccharide, bao gồm GLPS, khỏi nguyên liệu ban đầu

GLPS thường được tách chiết bằng nước nóng sau đó tủa với ethanol hoặc methanol, hoặc có thể được chiết xuất bằng nước và kiềm (Wachtel-Galor et al., 2011) Chang và Lu (2004) trích dẫn kết quả của nhiều nghiên cứu cho thấy GLPS thô

có chứa một lượng nhỏ protein, acid uronic, chitin; GLPS có chứa α-D-glucan bản chất giống tinh bột nên có phản ứng với dung dịch iod

2.3.1.2 Dược tính của GLPS

Các GPLS là nguồn dược chất chủ yếu trong Linh chi, đóng vai trò chính trong hoạt tính sinh học của Linh chi, bao gồm tác dụng kháng viêm, chống oxy hóa, phá các gốc tự do, chống loét, chống khối u, chống xơ gan, chống kết tụ của tiểu cầu, giảm lượng đường và mỡ trong máu, tăng cường chức năng của hệ miễn dịch, bảo vệ gan, Những tác dụng này được nghiên cứu trong các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng (Wachtel-Galor et al., 2011; Wasser, 2010)

Đặc biệt, các nghiên cứu trên chuột cho thấy các GLPS có khả năng chống khối u trên dòng tế bào ung thư mô liên kết Sarcoma 180 Sự tăng cường chức năng miễn dịch với sự hỗ trợ của polysaccharide được xem là cơ chế chính trong tác dụng chống

khối u của G lucidum Các nghiên cứu của Gao et al (2002) và Gao et al (2003) cho thấy polysaccharide từ G lucidum giúp tăng sức đề kháng của đa số bệnh nhân bị ung

thư giai đoạn sau Trong số các loại GLPS, β-D-glucan được xem là polysaccharide có

vai trò chủ yếu trong hoạt tính chống khối u Ganoderan, một loại β-glucan từ G lucidum, có thể làm tăng khả năng miễn dịch chống khối u trong nghiên cứu trên chuột

(Ooi và Liu, 2000)

Các GLPS có thể ức chế sự nhân bản của HIV, HBV, HSV, Nhiều loại

polysaccharide gắn với protein và proteoglycan trong G lucidum thể hiện tác dụng ức

chế HSV-1, HSV-2 và virus gây viêm miệng có mụn nước (Wachtel-Galor et al., 2011; Wasser, 2010)

Hiện nay, có nhiều sản phẩm thương mại là chiết xuất polysaccharide từ Linh chi được dùng để chữa trị các bệnh mãn tính, bệnh gan, ung thư (Wachtel-Galor et al., 2011)

2.3.2 Triterpenoid

2.3.2.1 Khái niệm chung về triterpenoid

Theo Harborne (1998), triterpenoid là những hợp chất có mạch sườn carbon dựa trên sáu đơn vị isoprene có nguồn gốc từ squalene (một loại hydrocarbon C30 mạch hở) Chúng có cấu trúc vòng tương đối phức tạp

Các triterpenoid thường ở dạng tinh thể, không màu và có nhiệt độ nóng chảy cao Triterpenoid tan trong dung môi kém phân cực, ít tan trong nước trừ khi chúng kết hợp với các glycoside Các dung môi như methanol, ethanol, acetone, chloroform, ether, hoặc hỗn hợp của chúng thường được dùng để tách chiết triterpenoid

Thông thường, các triterpenoid có khối lượng phân tử từ 400 đến 600 kDa, có cấu trúc hóa học phức tạp và bị oxy hóa nhiều Chúng được chia làm 4 nhóm: triterpene thật sự, saponin, steroid, và glycoside tim (cardiac glycoside) (Harborne, 1998)

Wachtel-Galor et al (2011) nói rằng triterpene là nhóm triterpenoid phổ biến

nhất trong G lucidum, có cấu trúc dựa trên lanostane là dẫn xuất dạng vòng của squalene Cho đến nay, có hơn 140 loại triterpene được phát hiện trong loài G lucidum, trong đó 100 loại đã được nghiên cứu kĩ về thành phần hóa học và cấu hình

phân tử Trong số các triterpene được tìm thấy, có hơn 50 hợp chất được xem là mới

và duy nhất ở loài nấm này Đa số các triterpene trong G lucidum là acid ganoderic và

acid lucidenic, còn lại là các ganoderal, ganoderiol, và acid ganodermic Thành phần

các triterpene có thể được dùng để phân biệt loài nấm này với các loài họ hàng cũng như đánh giá chất lượng của các mẫu nấm Linh chi (Wasser, 2010) Cũng như

polysaccharide, triterpene trong G lucidum rất dễ bị phân hủy khi tiếp xúc với nhiệt độ

cao trong thời gian dài (Chin et al., 2011)

Theo Wachtel-Galor et al (2011) và Wasser (2010), phần lớn các triterpene có vị đắng, làm nên vị đắng của Linh chi Linh chi chứa nhiều triterpene, nhưng hàm lượng khác nhau ở các bộ phận và giai đoạn sinh trưởng khác nhau của nấm Các nghiên cứu

sơ bộ cho thấy bào tử G lucidum chứa nhiều acid ganoderic hơn bất cứ phần nào của

nấm, ngoài ra còn có các triterpene lactone (Wasser, 2010)

Theo Huie và Di (2004), triterpene trong Linh chi thường được tách chiết theo một trong hai cách sau:

Tách chiết triterpene toàn phần bằng các dung môi hữu cơ và nước;

Tách chiết có chọn lọc các acid triterpene từ phân đoạn triterpene toàn phần bằng các dung môi khác nhau

2.3.2.2 Dược tính của triterpenoid

Theo Wasser (2010), cùng với polysaccharide, triterpenoid là loại hoạt chất

chính trong tạo nên tác dụng chống ung thư của Linh chi Trong nghiên cứu in vitro,

các acid ganoderic T-Z trong Linh chi thể hiện tác dụng gây độc tế bào ung thư gan Một số thí nghiệm khác cho thấy các triterpenoid trong Linh chi có khả năng ngăn chặn sự nhân bản của tế bào ung thư hoặc tiêu diệt chúng, cũng như hạn chế sự di căn (Kao et al., 2013; Skalicka-Woźniak, 2012) Một số triterpenoid còn có tác dụng ức chế sự tổng hợp cholesterol (Trigos và Medellín, 2011)

Các triterpenoid của G lucidum cũng có khả năng ức chế các enzyme khác nhau

Đóng vai trò như chất ức chế phospholipase A2, acid ganoderic T được xem như tác nhân kháng viêm trong điều trị thấp khớp, bệnh vảy nến và hen suyễn

Đặc biệt, triterpenoid có ý nghĩa quan trọng trong phòng chống HIV Các nghiên

cứu in vitro cho thấy nhiều loại triterpenoid khác nhau có khả năng ức chế HIV Một

số triterpenoid trong G lucidum có thể tác động đến HIV bằng cách ức chế hoạt động

của reverse transciptase trong HIV-1, ức chế protease của HIV (Wasser, 2010)

2.3.3 Alkaloid

2.3.3.1 Khái niệm chung về alkaloid

Alkaloid là một nhóm gồm các chất chuyển hóa thứ cấp có chứa nitơ, có nguồn gốc từ các acid amin (Sarker và Nahar, 2007) Hầu hết các alkaloid có nhân dị vòng,

có nguyên tử nitrogen là một phần nằm trong cấu trúc vòng Tuy nhiên, một số alkaloid không có nhân dị vòng chứa nitơ Alkaloid thường gặp trong thực vật, đôi khi trong động vật (Nguyễn Thúy Dần, 2007)

Theo Sarker và Nahar (2007), trong tự nhiên, các alkaloid có tính kiềm gây ra bởi các nguyên tử nitơ trong alkaloid mà điển hình là các amine bậc 1, 2 hoặc 3, và tạo muối tan trong nước với các acid vô cơ Độ kiềm của alkaloid biến đổi nhiều, phụ thuộc các yếu tố như cấu trúc phân tử, sự có mặt và vị trí của các nhóm chức Đa số các alkaloid là kiềm yếu, nhưng cũng có một số chất là base mạnh có khả năng làm xanh giấy quỳ Một số ít alkaloid có tính kiềm rất yếu, hoặc không có tính kiềm, hoặc tính acid yếu (El-Sakka, 2010)

Theo Nguyễn Hoàng Tuấn (2012b), nhìn chung, các alkaloid dạng base không tan trong nước và dễ tan trong các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, chloroform, Trong khi đó các muối alkaloid thường dễ tan trong nước và hầu như không tan trong các dung môi ít phân cực Tuy nhiên cũng có một số trường hợp ngoại

lệ Tính hòa tan của alkaloid đóng vai trò quan trọng trong việc tách chiết alkaloid ra khỏi nguyên liệu và trong sản xuất dược phẩm điều chế dạng thuốc để uống

Hầu hết các alkaloid ở thể rắn tinh thể và có vị đắng (Sarker và Nahar, 2007) Một số alkaloid ở dạng lỏng, một số ở dạng vô định hình Đa số alkaloid không có màu, trừ một số alkaloid có màu (Nguyễn Hoàng Tuấn, 2012b) Alkaloid thường có dược tính rất mạnh, và có những phản ứng hóa học với một số thuốc thử chung của alkaloid (Nguyễn Thúy Dần, 2007)

2.3.3.2 Dược tính của alkaloid

Alkaloid là những chất có hoạt tính sinh học, có nhiều ứng dụng trong y dược Theo Wasser (2010), tác dụng của alkaloid rất khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc của chúng Một số nghiên cứu cho thấy alkaloid trong Linh chi có tính kháng khuẩn và là tác nhân kháng HIV

2.3.4 Saponin

2.3.4.1 Khái niệm chung về saponin

Theo Hostettmann và Marston (2005), saponin là các glycoside có khối lượng phân tử lớn, bao gồm một hay nhiều đơn vị đường liên kết với một aglycone dạng triperpene hoặc steroid Tên gọi saponin có nguồn gốc từ chữ Latin “sapo” có nghĩa là

Saponin có trong nhiều loài thực vật, và là thành phần của nhiều loại thuốc dân gian và thuốc từ thảo mộc đặc biệt là các loại Đông dược Ngoài ra, chúng cũng được tìm thấy trong động vật biển như hải sâm, sao biển thuộc ngành động vật da gai

Aglycone hay phần khác đường của phân tử saponin được gọi là genin hoặc sapogenin Dựa vào cấu trúc của sapogenin, saponin được chia thành ba loại chính: + Triterpene glycoside: Phần aglycone có 30 nguyên tử carbon

+ Steroid glycoside

+ Steroid alkaloid glycoside

Gốc đường thường gắn ở C-3 của các saponin vì đa số sapogenin có nhóm hydroxyl ở vị trí đó Số mạch đường gắn với sapogenin có thể là một hoặc nhiều hơn,

và gốc đường có thể là mạch thẳng hoặc mạch phân nhánh

Nhìn chung, các saponin tan trong nước, không tan trong các dung môi không phân cực, và thường ở dạng vô định hình trong tự nhiên

2.3.4.2 Dược tính của saponin

Ở liều nhỏ, saponin có tác dụng nhuận tràng, long đờm, thông tiểu Saponin có nhân steroid có tác dụng kháng viêm và kích thích sự tổng hợp acid nucleic (Nguyễn Thúy Dần, 2007)

Nghiên cứu cho thấy saponin trong G lucidum có khả năng chống lại vi khuẩn và

ký sinh trùng (Ogbe et al., 2009)

2.4 Một số phương pháp hóa học trong phân tích dược liệu

2.4.1 Phương pháp chiết xuất dược liệu

Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để tách các chất tan ra khỏi các nguyên liệu Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng và hiệu quả của quá trình chiết xuất

là bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp suất, cấu tạo của vách tế bào, kích thước tiểu phân bột dược liệu,

Các chất có thể được chiết ở nhiệt độ thường (ngâm lạnh, ngấm kiệt (chiết kiệt) ở nhiệt độ thường) hoặc nhiệt độ cao (chiết nóng, hãm, sắc, ngấm kiệt nóng) Các phương pháp chiết gồm ngâm và chiết kiệt

Về nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycoside, các muối của alkaloid, ) thì sử dụng dung môi phân cực Để chiết các chất kém phân cực (chất béo, tinh dầu, triterpene, thì phải sử dụng dung môi kém phân cực Trên thực tế, ethanol với các nồng độ khác nhau thường được sử dụng Ethanol có thể hòa tan được nhiều nhóm hoạt chất, không độc, rẻ tiền và dễ tìm

Ngoài các kỹ thuật chiết cổ điển như trên, các kỹ thuật chiết mới như chiết với sự

hỗ trợ của sóng siêu âm, vi sóng, chiết bằng chất lỏng quá tới hạn, chiết dưới áp suất cao, đã được phát triển để nâng cao hiệu quả và chất lượng chiết xuất (Nguyễn Hoàng Tuấn, 2012a)

2.4.2 Phương pháp Phenol-sulfuric acid (PSA)

Theo Nielsen (2011), phương pháp PSA là một phương pháp đo màu nhanh và đơn giản để xác định lượng carbohydrate tổng trong mẫu Phương pháp có thể áp dụng cho các loại carbohydrate bao gồm mono-, di-, oligo-, và polysaccharide Tuy nhiên, các loại carbohydrate khác nhau có độ hấp thụ khác nhau

Trong phương pháp này, acid sulfuric đặc được dùng để phân cắt các polysaccharide, oligosaccharide, và disaccharide thành monosaccharide Các pentose (hợp chất 5 carbon) sẽ trở thành furfural, và các hexose (6 carbon) sẽ bị mất nước tạo thành hydroxymethyl furfural Sau đó, furfural và hydroxymethyl furfural phản ứng với phenol tạo ra màu vàng kim Màu của sản phẩm thường bền trong nhiều giờ

Với các sản phẩm giàu hexose, glucose thường được dùng để xây dựng đường chuẩn và độ hấp thụ được đo ở bước sóng 490 nm Với các sản phẩm giàu xylose,

xylose cần được dùng để xây dựng đường chuẩn và độ hấp thụ được đo ở bước sóng

480 nm

2.4.3 Phương pháp Liebermann-Burchard

Phương pháp thử Liebermann-Burchard là phương pháp thử màu để xác định sự hiện diện của steroid không no như cholesterol Theo Burke et al (1974), phản ứng màu này được mô tả lần đầu tiên vào năm 1885 bởi Liebermann và được Burchard sử dụng để phân tích cholesterol Phương pháp này cũng được dùng để xác định sự hiện diện của các triterpenoid

Theo Harborne (1998), phản ứng Liebermann-Burchard tạo ra sản phẩm màu hồng, tím hoặc đỏ với các hợp chất có khung sườn triterpenoid, và tạo ra sản phẩm cuối cùng có màu xanh lục pha xanh dương với hầu hết các triterpene và sterol

2.4.4 Các loại thuốc thử chung cho alkaloid

Theo Nguyễn Hoàng Tuấn (2012b), các alkaloid thường có các phản ứng hóa học với thuốc thử chung dành cho hợp chất này Các phản ứng với thuốc thử gồm hai loại:

+ Phản ứng tạo tủa: Gồm 2 nhóm thuốc thử:

 Nhóm thuốc thử tạo tủa rất ít tan trong nước Tủa này hầu hết được tạo ra bởi sự kết hợp của một anion lớn của thuốc thử và cation lớn là alkaloid Có nhiều thuốc thử tạo tủa như thuốc thử Mayer (K2HgI4), thuốc thử Dragendorff (KBiI4), thuốc thử Bouchardat (Iodo-Iodide), Phản ứng tạo tủa này rất nhạy, và độ nhạy của thuốc thử tùy thuộc vào bản chất từng alkaloid Ví dụ như:

 Thuốc thử Dragendorff dương tính với hầu hết các alkaloid, ngoại trừ amine mạch thẳng bậc 1 và bậc 2;

 Thuốc thử Wagner rất nhạy với alkaloid nhưng một số chất khác có cấu trúc tương tự alkaloid cũng có thể phản ứng, (Brossi, 1988)

Để xác định chắc chắn sự hiện diện của alkaloid trong dược liệu, cần sử dụng nhiều loại thuốc thử khác nhau để tăng tính chính xác

 Nhóm thuốc thử cho kết tủa ở dạng tinh thể như dung dịch acid picric bão hòa, dung dịch platin chloride,

+ Phản ứng tạo màu: Một số thuốc thử tác dụng với alkaloid tạo ra màu đặc biệt

khác nhau, do đó có thể được dùng để định tính alkaloid Thuốc thử tạo màu thường là những hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ hòa tan trong H2SO4 đặc Những thuốc thử màu

quan trọng bao gồm H2SO4 đặc, HNO3 đặc, thuốc thử Marquis, thuốc thử Mandelin, Trong dịch chiết có nhiều loại alkaloid và lẫn tạp chất, phản ứng tạo màu không thật rõ bằng các alkaloid đã được tách chiết và phân lập ở dạng tinh khiết Vì thế, để kết luận chắc chắn, người ta thường kết hợp phản ứng màu với phương pháp sắc kí lớp mỏng

có alkaloid chuẩn làm đối chứng

Phản ứng tạo tủa để xác định sự có mặt của alkaloid, và phản ứng tạo màu cho biết có alkaloid loại nào trong dược liệu (Nguyễn Hoàng Tuấn, 2012b)

2.5 Một số nghiên cứu về thành phần dược tính trong nấm Linh chi

2.5.1 Nghiên cứu ngoài nước

Chang và Lu (2004) đã tiến hành tủa phân đoạn các polysaccharide trong chiết

xuất bằng nước nóng của G lucidum bằng ethanol ở các nồng độ khác nhau để xác

định khối lượng phân tử và tính chất lý hóa của các nhóm polysaccharide đó Chang và

Lu kết luận rằng (13), (16)-β-D-glucan là loại polysaccharide có hoạt tính quan trọng; chúng có khối lượng phân tử trung bình cao nhất (2,08 x 106 g/mol) trong 3 nhóm, và thể hiện khả năng kích hoạt giải phóng nhân tố tiêu diệt khối u (Tumor necrosis factor-α) cao nhất Glucan tan ít trong nước ở nhiệt độ bình thường Hai nhóm còn lại là polysaccharide có chứa D-glucose, D-galactose và D-mannose với tỉ lệ khác nhau

Một nghiên cứu trên 11 mẫu sản phẩm Linh chi thương mại ở Hồng Kông được tiến hành bởi Chang và Buswell (2008) cho thấy hàm lượng polysaccharide của các

mẫu G lucidum biến đổi từ 1,1–15,8%, trong khi đó hàm lượng triterpene thay đổi từ

mức độ không thể xác định đến 7,8%

Huang et al (2010) đã khảo sát điều kiện tối ưu cho quy trình chiết xuất

polysaccharide từ G lucidum bằng dung môi kiềm, trong đó các mẫu nấm được chiết

bằng nước với sự hỗ trợ của vi sóng và sóng siêu âm trước khi được chiết bằng NaOH Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu để hiệu suất của quá trình chiết xuất đạt cao nhất là nhiệt độ 60,1ºC, thời gian chiết 77,3 phút, nồng độ NaOH là 5,1% và tỉ lệ nguyên liệu/dung môi là 1:21,4, với hiệu suất trích ly polysaccharide trong thực nghiệm là 8,30 ± 0,12% Kết quả phân tích cho thấy các polysaccharide tan trong kiềm có thể trì hoãn phản ứng quá mẫn với dinitrofluorobenzene, và cải thiện hoạt động của tế bào

NK

Ofodile (2011) đã nghiên cứu tính kháng khuẩn của khuẩn ty nuôi cấy từ G lucidum được tìm thấy ở Nigeria bằng cách kiểm tra tính kháng khuẩn của khuẩn ty

trên các loài vi sinh vật gây bệnh ở người Kết quả cho thấy khuẩn ty của loài nấm này

có hoạt tính đối kháng với tất cả vi sinh vật được dùng để kiểm tra bao gồm

Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa Trong đó, Escherichia coli thể hiện độ nhạy cảm nhất với khuẩn ty nấm Odofile khẳng định G lucidum có thể được dùng để chữa các bệnh gây ra bởi các loài

vi sinh vật đó

Liu et al (2011) đã sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng để tối ưu hóa quy trình

chiết xuất polysaccharide từ G lucidum Kết quả cho thấy hiệu quả chiết xuất

polysaccharide đạt cao nhất trong điều kiện nồng độ NaOH là 1,29 mol/l, nhiệt độ 58,55°C và thời gian chiết là 2,16 giờ Đồng thời, Liu et al (2011) khẳng định hàm lượng polysaccharide và thời gian chiết xuất của quy trình chiết bằng kiềm cao hơn so với quy trình chiết bằng nước nóng thông thường

Shamaki et al (2012) đã nghiên cứu và đưa ra kết luận về thành phần hóa học

của G Lucidum hoang dại ở Nigeria như sau: độ ẩm (10,54%), tro tổng (5,93%),

protein (17,55%), béo thô (2,60%), xơ thô (30,25%), carbohydrate (33,13%), và nitơ (23,52%) Các phân tích khác cho thấy trong mẫu nấm này có chứa alkaloid, flavonoid, tanning, đường khử, glycoside tim, anthraquinone, saponin, tinh dầu dễ bay hơi và steroid

2.5.2 Nghiên cứu trong nước

Toai et al (2005) đã tiến hành phân tách 1,3-β-D-glucan từ thể quả và sinh khối

của G lucidum bằng các dung môi khác nhau Qua các thí nghiệm, quy trình phân tách

1,3-β-D-glucan tối ưu được xây dựng Hiệu suất thu hồi sản phẩm trong quá trình phân tách loại polysaccharide này trong thể quả và sinh khối nấm Linh chi lần lượt là 36%

và 15% Sản phẩm 1,3-β-D-glucan có khối lượng phân tử khoảng 250 kDa Cấu trúc

và đặc điểm của đơn vị 1,3-β-D-glucan cũng được mô tả

Lê Xuân Thám et al (2009) đã phân tích loài nấm Linh chi đen Amauroderma subresinosum được phát hiện tại Vườn Quốc gia Cát Tiên Trong công trình này, các

nghiên cứu về hình thái của nấm, về phân hóa cấu trúc của DNA, và về thành phần hoạt chất của nấm được thực hiện Kết quả các nghiên cứu về hình thái và phân hóa cấu trúc của DNA đều cho thấy loài nấm mới phát hiện này có thể thuộc nhóm loài

trung gian giữa hai chi Ganoderma và Amauroderma Đồng thời, các tác giả đã phân

lập và xác định được năm acid béo, hỗn hợp các sterol với bản chất là dẫn xuất của triterpenoid/dẫn chất của khung triterpenoid và hỗn hợp một số loại đường trong đó có thể có polysaccharide, vốn là các thành phần dược tính rất phổ biến trong các loài

Ganoderma

Nguyễn Thị Thu Hương và Nguyễn Thị Ngọc Hằng (2010) đã khảo sát tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan của cao chiết nước và cao chiết cồn từ Hồng chi giống của Nhật được nuôi trồng ở Việt Nam Cao nước được chuẩn bị bằng cách đun nguyên liệu với nước nóng ở 100°C, và cao cồn được chuẩn bị bằng cách chiết hồi lưu bột nguyên liệu với cồn 96% Trên mô hình thực nghiệm tế bào gan bị gây tổn thương oxy hóa bằng cyclophosphamide, cao cồn thể hiện tính chống oxy hóa mạnh hơn cao nước

Trần Thị Văn Thi et al (2012) đã tiến hành chiết xuất, xác định hàm lượng và khảo sát tác dụng dược lý của phân đoạn polysaccharide từ nấm Linh chi nuôi trồng tại Thừa Thiên Huế Kết quả cho thấy hàm lượng polysaccharide toàn phần là 4,57±0,18% khối lượng khô tuyệt đối, hàm lượng polysaccharide trong cao toàn phần

là 86,00±0,53% Cao chiết này không thể hiện độc tính cấp lẫn tác dụng chống oxy hoá trong mô hình thử nghiệm với chuột, nhưng có hoạt tính tốt trong việc bảo vệ tế bào gan

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: Từ tháng 8/2014 đến tháng 11/2014

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật và Phòng thí nghiệm Sinh Hóa, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ

3.2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng: Thể quả được trồng trên mùn cưa và sinh khối được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy chìm (khuẩn ty nuôi cấy chìm) của nấm Linh chi giống Nhật

(Ganoderma lucidum)

Phạm vi nghiên cứu: Xác định sự hiện diện và so sánh hàm lượng của một số thành phần dược tính (polysaccharide, triterpenoid, saponin, alkaloid) ở thể quả được trồng trên mùn cưa và khuẩn ty nuôi cấy chìm của nấm Linh chi giống Nhật

(Ganoderma lucidum), so sánh khả năng kháng khuẩn của cao nấm Linh chi được

chiết xuất từ hai mẫu nấm trên

3.3 Phương tiện nghiên cứu

3.3.3 Hóa chất

Acetic anhydride (Tây Ban Nha), agar (Việt Nam), bismuth nitrate (Trung Quốc), cao nấm men (Ấn Độ), cao thịt bò (Ấn Độ), chloroform (Trung Quốc), dimethyl

sulfoxide (DMSO) (Pháp), ethanol (Việt Nam), glacial acetic acid (Trung Quốc), HCl (Trung Quốc), H2SO4 đặc (Trung Quốc), K2HPO4 (Trung Quốc), KH2PO4 (Trung Quốc), MgSO4 (Trung Quốc), NaOH (Trung Quốc), nước cất, nước khử ion, peptone (Trung Quốc), phenol (Trung Quốc), D-Glucose (Trung Quốc), casein thủy phân (Đức), tinh bột (Trung Quốc)

+ Thuốc thử Dragendorff (Wagner et al., 1996): Trộn 0,85 g bismuth nitrate

với 40 mL nước cất và 10 mL glacial acetic acid, đun nhẹ và lọc dung dịch nếu cần (Dung dịch D1) Hòa tan 8 g KI trong 30mL nước cất (Dung dịch D2) Trộn hai dung dịch D1 và D2 với tỉ lệ 1:1 để có được dung dịch stock Khi sử dụng, lấy 10 mL dung dịch stock pha với 20 mL glacial acetic acid và pha loãng với nước cất thành 100 mL dung dịch Dung dịch stock này có thể được trữ lạnh trong vài tháng nếu được chứa trong chai tối màu

+ Thuốc thử Wagner (Lide, 2005): Hòa tan 2 g I2 và 6 g KI trong 100 mL nước cất

+ Thuốc thử Mayer (Lide, 2005): Hòa tan 1,358 g HgCl2 trong 60 mL nước cất

và 5 g KI trong 10 mL nước cất Trộn đều 2 dung dịch này, pha loãng bằng nước cất cho đủ 100 mL

+ Môi trường CYM (Complete Medium + Yeast Extract) (Atlas, 2010): Bảng 3: Thành phần cho 1 L môi trường CYM lỏng

Chuẩn bị môi trường: Cho các thành phần vào nước cất Thêm nước cất cho đủ

1,0 L Trộn đều Khử trùng nhiệt ướt ở 121oC trong 15 phút

+ Môi trường MHA (Mueller-Hinton Agar) (Atlas, 2010):

Bảng 4: Thành phần cho 1 L môi trường MHA

Chuẩn bị môi trường: Cho các thành phần vào nước cất và thêm nước cất cho

đủ 1,0 L Trộn đều Khử trùng nhiệt ướt ở 121oC trong 15 phút

3.3.4 Vật liệu

+ Thể quả của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được trồng trên mùn cưa,

được sản xuất bởi phòng Sinh học Phân tử Thực vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ

+ Sinh khối khuẩn ty của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được thu từ quy

trình nuôi cấy chìm tại phòng Sinh học phân tử thực vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ

+ Vi khuẩn Escherichia coli chủng ATCC 25922 được cung cấp bởi Trung tâm

Kỹ thuật và Ứng dụng Công nghệ, Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Cần Thơ

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Chuẩn bị mẫu

3.4.1.1 Chuẩn bị mẫu thể quả nấm Linh chi

Thể quả nấm Linh chi được chọn là những thể quả đã được sấy khô, có đường kính 10  12 cm, màu nâu đỏ và không có dấu vết sâu bệnh Thể quả này được trồng

trên cơ chất mùn cưa với giống nấm là giống Ganoderma lucidum nhập khẩu từ Nhật

đã được phân lập và tạo dòng thuần Thể quả khô được xay thành bột có kích thước ≤ 0,2 cm

3.4.1.2 Chuẩn bị mẫu khuẩn ty nuôi cấy chìm của nấm Linh chi

Khuẩn ty nấm Linh chi được chọn là sinh khối nuôi cấy chìm trong môi trường CYM (Bảng 3), được thu mẫu vào ngày thứ 10 trong giai đoạn tăng sinh khối Dịch

nuôi cấy được lọc để thu khuẩn ty Khuẩn ty được rửa sạch nhiều lần bằng nước cất, sấy khô ở 60oC và tán nhuyễn thành bột có kích thước ≤ 0,1 cm

3.4.2 Xác định và so sánh một số thành phần dược tính quan trọng trong thể quả

và khuẩn ty nuôi cấy chìm chìm của nấm Linh chi

3.4.2.1 Phân tích định tính một số thành phần dược tính trong thể quả và trong khuẩn ty nuôi cấy chìm của nấm Linh chi

Các thành phần dược tính được phân tích định tính bao gồm triterpenoid, alkaloid

và saponin

a Phân tích định tính thành phần triterpenoid trong thể quả và khuẩn ty nuôi cấy chìm của nấm Linh chi

+ Chiết xuất triterpenoid thô (Chin và Law, 2012):

Mục đích: Chuẩn bị cao chiết cho các bước thí nghiệm tiếp theo

 Nguyên tắc: Sử dụng dung môi có độ phân cực trung bình để chiết xuất triterpenoid

 Cách tiến hành: 2 g bột nấm được ngâm trong 20 mL ethanol 95%, lắc liên

tục trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng Sau 24 giờ, lớp ethanol được tách ra và trữ lại Quy trình được lặp lại 5 lần Sau khi loại bỏ bã chiết bằng cách lọc, dịch chiết được sấy khô

ở 45oC để loại bỏ ethanol

+ Định tính triterpenoid theo phương pháp Liebermann – Burchard (Harborne, 1998):

 Mục đích: Xác định sự hiện diện của hoạt chất triterpenoid trong thể quả

và khuẩn ty nuôi cấy chìm của nấm Linh chi

 Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng của triterpenoid với thuốc thử tạo ra sản phẩm màu tím đỏ (hoặc đỏ nâu hoặc hồng) để nhận biết sự hiện diện của triterpenoid

 Cách tiến hành: Các ống nghiệm được chuẩn bị như Bảng 5 Cao chiết đã sấy khô được hòa tan vào acetic anhydride, đun sôi, làm lạnh H2SO4 đặc được nhỏ từ

từ lên thành ống nghiệm

 Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát màu tím đỏ (đỏ nâu hoặc hồng) để thấy sự hiện diện của triterpenoid Độ đậm nhạt của màu sắc tạo thành trong 2 mẫu cao chiết được quan sát và so sánh với nhau: