phân lập và nhận diện một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột từ nước thải lò bún lệ châu, thành phố sóc trăng

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHƯƠNG TRÌNH TIÊN TIẾN PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN MỘT SỐ DÒNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC (CHƯƠNG TRÌNH TIÊN TIẾN)

PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN MỘT SỐ DÒNG

VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY TINH BỘT TỪ NƯỚC THẢI LÒ BÚN LỆ CHÂU, THÀNH PHỐ SÓC TRĂNG

PGS.TS NGUYỄN HỮU HIỆP CHẾ MINH NGỮ

MSSV: 3102760

Lớp: CNSH Tiên Tiến K36

Cần Thơ, tháng 12/2014

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC (CHƯƠNG TRÌNH TIÊN TIẾN)

PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN MỘT SỐ DÒNG

VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY TINH BỘT TỪ NƯỚC THẢI LÒ BÚN LỆ CHÂU, THÀNH PHỐ SÓC TRĂNG

PGS.TS NGUYỄN HỮU HIỆP CHẾ MINH NGỮ

MSSV: 3102760

Lớp: CNSH Tiên Tiến K36

Cần Thơ, tháng 12/2014

PHẦN KÝ DUYỆT

NGƯỜI HƯỚNG DẪN SINH VIÊN

PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp Chế Minh Ngữ

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

Cha mẹ, người ngày đêm tảo tần lo cho tôi đầy đủ trong suốt bốn năm đại học PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp, Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh Học Vi sinh vật-Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học-Đại học Cần thơ, người đã tận tình hướng dẫn tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp cũng như truyền dạy cho tôi những đạo lý, kiến thức và kinh nghiệm sống quý báo giúp tôi trưởng thành và có ích hơn trong cuộc sống

ThS Trần Thị Xuân Mai, cố vấn học tập lớp Công nghệ sinh học tiên tiến khóa

36, người luôn quan tâm theo dõi quá trình học tập và rèn luyện của tôi

Ths Mai Thi, Giám đốc Trung tâm Quan trắc Tài nguyên và Môi trường tỉnh Sóc Trăng, người đã hỗ trợ phần lớn vật tư thí nghiệm cũng như tạo điều kiện thực tập thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Chị Dương Ngọc Thúy, Trưởng phòng Trung tâm Quan trắc Tài nguyên và Môi trường tỉnh Sóc Trăng, người giúp tôi có những số liệu quý giá về nước thải của lò bún

Lệ Châu, thành phố Sóc Trăng

Chị Trần Trà My và chị Nguyễn Thị Thúy Duy, cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh vật-Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học-Đại học Cần Thơ, những người luôn nhắc nhở và đôn đúc tôi thực hiện luận văn đúng tiến độ

Tập thể các anh chị và các bạn làm việc trong phòng thí nghiệm Vi sinh vật, những người cùng tôi chia sẽ những khó khăn trong quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng xin gửi đến tất cả lời chúc sức khỏe và an lành!

Cần thơ, ngày 12 tháng 12 năm 2014

Chế Minh Ngữ

TÓM TẮT

Từ mẫu nước thải của lò bún Lệ Châu, Thành phố Sóc Trăng, 24 dòng vi khuẩn

đã được phân lập trên môi trường chuyên biệt với nguồn carbon duy nhất là tinh bột (1%) Tất cả những dòng vi khuẩn này đều có hoạt tính catalase và chỉ 2 trong số đó

có khả năng sinh acid Số dòng vi khuẩn có khả năng di động trên môi trường bán lỏng là 19 dòng và số dòng vi khuẩn Gram (+) là 5 dòng Tám trong số 24 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp amylase Những dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp amylase tốt là D2, D15 và D16 Dòng D15 và D16 được chọn để khảo sát sự tăng trưởng và giải trình tự vùng gen 16S rRNA Kết quả giải trình tự được so sánh trên ngân hàng dữ liệu NCBI cho thấy dòng D15 là Bacillus cereus với độ tương đồng 97%

và dòng D16 là Bacillus flexus với độ tương đồng 89% Hai loài vi khuẩn này đều có khả năng phân hủy tinh bột rất tốt và có thể được ứng dụng để xử lý nước thải chứa tinh bột

Từ khóa: Amylase, Bacillus cereus, Bacillus flexus, lò bún và tinh bột

MỤC LỤC

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Sơ lược về nước thải công nghiệp 2

2.1.1 Nước thải công nghiệp và ảnh hưởng của nước thải công nghiệp 2

2.1.2 Đặc điểm của nước thải công nghiệp 2

2.2 Các phương pháp xử lý nước thải (Dương Nguyên Khang, 2014) 2

2.2.1 Các phương pháp xử lý 2

2.2.2 Phương pháp vi sinh hiếu khí (Lê Phi Nga và Schwitzguebels, 2014) 3

2.3 Sơ lược về nước thải từ cơ sở sản xuất bún 5

2.3.1 Giới thiệu về bún và nghề làm bún 5

2.3.2 Quy trình sản xuất bún tươi 6

2.3.3 Nước thải từ cơ sở sản xuất bún 7

2.3.4 Lò bún Lệ Châu 7

2.4 Sơ lược về tinh bột 8

2.4.1.Tính chất vật lý và trạng thái tự nhiên 8

2.4.2 Cấu trúc phân tử của tinh bột 8

2 5 Hệ enzyme amylase và sự phân hủy tinh bột 10

2.5.1 Hệ enzyme amylase 10

2.5.3 Phân loại enzyme amylase (Marc et al., 2002) 10

2.5.4 Tính chất của emzyme amylase 10

2.5.5 Cơ chế phân hủy tinh bột 11

2.6 Một số chi vi khuẩn phân hủy tinh bột 12

2.6.1 Vi khuẩn Bacillus sp 12

2.6.2 Vi khuẩn Lactobacillus sp 13

2.6.3 Một số dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột khác 13

2.6.4 Một số ứng dụng của vi khuẩn phân hủy tinh bột 14

2.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 14

2.7.1 Trong nước 14

2.7.2 Ngoài nước 15

2.8 Các phương pháp vi sinh 15

2.8.1 Phương pháp hộp trải (Nguyễn Văn Minh, 2008) 15

2.8.2 Phương pháp đếm sống nhỏ giọt (Hoben và Somasegaran, 1982) 15

2.8.3 Phương pháp giếng thạch (Umesh et al., 1989) 16

2.8.4 Phương pháp thử nghiệm catalase (Nguyễn Lân Dũng, 2006) 16

2.8.5 Phương pháp thử Methyl red (Nguyễn Lân Dũng, 2006) 16

2.9 Kỹ thuật PCR và phương pháp giải trình tự 17

2.9.1 Kỹ thuật PCR 17

2.9.2 Giải trình tự 18

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Phương tiện nghiên cứu 21

3.1.1 Địa điểm nghiên cứu và tiến độ thực hiện 21

3.1.2 Vật liệu 21

3.1.3 Dụng cụ và thiết bị 21

3.1.4 Hóa chất và môi trường 22

3.2 Phương pháp nghiên cứu 24

3.2.1 Phân lập vi khuẩn từ mẫu 24

3.2.2 Đo kích thước vi khuẩn (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002) 25

3.2.3 Kiểm tra khả năng di động của vi khuẩn (Nguyễn Lân Dũng, 2006) 26

3.2.4 Nhuộm Gram (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002) 26

3.2.5 Kiểm tra catalase 27

3.2.6 Kiểm tra Methyl red 27

3.2.7 Thí nghiệm kiểm tra hoạt tính amylase (Nguyễn Lân Dũng, 2006) 27

3.2.8 Sự tăng trưởng của vi khuẩn theo thời gian 29

3.2.9 Khuếch đại vùng gene 16S rRNA 30

3.2.10 Giải trình tự 32

3.2.11 Xử lý kết quả thí nghiệm 32

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

4.1 Kết quả phân lập và đặc điểm hình thái 33

4.1.1 Kết quả phân lập 33

4.1.2 Đặc điểm hình thái 34

4.2 Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn 39

4.3 Kết quả kiểm tra hoạt tính amylase 42

4.4 Sự tăng trưởng của vi khuẩn theo thời gian 44

4.5 Kết quả giải trình tự vùng gene 16S rRNA 45

4.5.1 Kết quả điện di 45

4.5.2 Kết quả nhận diện 46

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC 54

Phụ lục 1 Các bảng và hình 54

Bảng 10: Đường kính trung bình vòng halo và khuẩn lạc

Bảng 11: Hiệu số trung bình D-d

Bảng 12: Kết quả đếm mật số

Hình 26: Mật số ban đầu của dòng D16

Hình 27: Mật số của dòng D16 sau 12 giờ

Phụ lục 2 Kết quả thống kê

a) Sự tăng trưởng của 2 dòng vi khuẩn D15 và D16

b) Kết quả kiểm tra hoạt tính amylase

Phụ lục 3 Kết quả giải trìh tự và định danh vi khuẩn

a) Trình tự gene 16S rRNA dòng D15

b) Trình tự gene 16S rRNA dòng D16

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Kết quả phân tích mẫu nước thải lò bún Lệ Châu 8

Bảng 2: Bố trí thí nghiệm xác định mật số vi khuẩn 29

Bảng 3: Thành phần các chất trong một phản ứng PCR 31

Bảng 4: Các giai đoạn của phản ứng PCR 31

Bảng 5: Đặc điểm khuẩn lạc của 24 dòng vi khuẩn đã phân lập được 34

Bảng 6: Đặc điểm tế bào vi khuẩn của 24 dòng vi khuẩn đã phân lập được 36

Bảng 7: Kết quả kiểm tra các đặc tính sinh hóa 39

Bảng 8: Những dòng vi khuẩn có hoạt tính amylase 43

Bảng 9: Kết quả nhận diện vi khuẩn 46

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Quá trình sinh tổng hợp của vi khuẩn 3

Hình 2: Chất ô nhiễm bị biến đổi trực tiếp 4

Hình 3: Chất ô nhiễm bị biến đổi gián tiếp 5

Hình 4: Quy trình sản xuất bún tươi từ gạo tẻ 6

Hình 5: Nước thải từ làng bún gây ô nhiễm kênh rạch xung quanh 7

Hình 6: Cấu trúc phân tử amylose (French, 1973) 8

Hình 7: Cấu trúc phân tử amylopectin (French, 1973) 9

Hình 8: Cơ chế phân hủy tinh bột (Marc et al., 2002) 11

Hình 9: Vi khuẩn Bacillus cereus 12

Hình 10: Vi khuẩn Lactobacillus amylovorus (Nakamura, 1981) 13

Hình 11: Sự chuyển hóa glucose bởi vi khuẩn 16

Hình 12: Khoảng đổi màu của Methyl red 16

Hình 13: Vị trí các giếng trên môi trường kiểm tra hoạt tính amylase 28

Hình 14: Một số dạng khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được 33

Hình 15: Khả năng chuyển động của vi khuẩn trong môi trường bán lỏng 37

Hình 16: Hình nhuộm Gram vi khuẩn với độ phóng đại 1000 lần 38

Hình 17: Hoạt tính catalase của dòng D10 (+) 40

Hình 18: Hoạt tính catalase của dòng D8 (++) 40

Hình 19: Hoạt tính catalase của dòng D20 (+++) 40

Hình 20: Kết quả kiểm tra Methyl red 41

Hình 21: Kết quả kiểm tra hoạt tính amylase của dòng vi khuẩn D15 42

Hình 22: Kết quả kiểm tra hoạt tính amylase của dòng vi khuẩn D15 42

Hình 23: Mật số của 2 dòng vi khuẩn D15 và D16 ở các thời điểm 44

Hình 24: Đường tăng trưởng của 2 dòng vi khuẩn D15 và D16 theo thời gian 45

Hình 25: Phổ điện di DNA của 2 dòng vi khuẩn D15 và D16 45

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

16S rRNA 16S ribosomal Ribonucleic Acid

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

BOD Biochemical Oxygen Demand

CFU Colony forming unit

COD Chemical Oxygen Demand

DNA Deoxyribo Nucleic Acid

HCM Hồ Chí Minh

LB Luria Broth

PCR Polymerase Chain Reaction

QCVN Quy chuẩn Việt Nam

VK Vi khuẩn

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Nghề làm bún là một nghề sản xuất thực phẩm thuộc nhóm nghề truyền thống có mặt ở nhiều nơi trên cả nước Nghề làm bún giữ vai trò cung cấp thực phẩm cho xã hội, góp phần làm đa dạng văn hóa ẩm thực và giải quyết việc làm cho người dân

Bên cạnh đó, nghề này đã và đang gây ô nhiễm môi trường nước xung quanh nơi sản xuất Nước thải từ việc sản xuất bún có hàm lượng tinh bột cao và việc thải trực tiếp loại nước thải này vào môi trường đã gây ra ô nhiễm nặng nề môi trường nước xung quanh một số cơ sở, làng nghề sản xuất bún ở nước ta Nguyên nhân ô nhiễm là

do tinh bột bị các vi sinh vật trong môi trường lên men yếm khí sinh ra những chất độc hại như metan, hydro sunfua, v.v Việc ô nhiễm này sẽ gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người và vật nuôi, hệ thủy sinh và mạch nước ngầm Do đó, việc xử lý nước thải ở các cơ sở sản xuất bún rất bức thiết

Hiện nay có nhiều phương pháp xử lý nước thải nhưng khi xét về cơ sở khoa học thì gồm có phương pháp vật lý, phương pháp hóa học và phương pháp sinh học Vì nước thải của các cơ sở sản xuất bún chứa nhiều tinh bột (chất hữu cơ dễ phân hủy) nên sử dụng phương pháp sinh học-vi sinh (bioremediation) để xử lý là phù hợp nhất Phương pháp vi sinh có các ưu điểm như thân thiện với môi trường, rẻ tiền và hiệu quả

xử lý cao Để có thể ứng dụng phương pháp vi sinh vào xử lý nước thải ở cơ sở sản xuất bún thì bước đầu tiên là phân lập những dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột mạnh từ chính nước thải đó Vì vậy đề tài “Phân lập và nhận diện một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột từ nước thải lò bún Lệ Châu, Thành phố Sóc Trăng” được thực hiện

1.2 Mục tiêu

Phân lập và nhận diện được một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột

từ nước thải lò bún Lệ Châu, TP Sóc Trăng

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về nước thải công nghiệp

2.1.1 Nước thải công nghiệp và ảnh hưởng của nước thải công nghiệp

Nước thải công nghiệp là nước được thải ra sau khi đã sử dụng hoặc được tạo ra trong một quá trình công nghệ và không còn giá trị trực tiếp đối với quá trình đó hay

Nước thải công nghiệp là một trong những nguyên nhân chính gây ô nhiễm môi trường nước

Công cuộc công nghiệp hóa đất nước đã và đang xúc tiến các hoạt động sản xuất công nghiệp Điều đó kéo theo sự gia tăng lượng nước thải công nghiệp vào môi trường nước khiến sự ô nhiễm môi trường nước ngày càng trầm trọng Ô nhiễm môi trường nước đã và đang ảnh hưởng tiêu cực đến khỏe con người và vật nuôi, hệ thủy sinh và nguồn nước ngầm, v.v Điển hình nhất là vụ ô nhiễm sông Thị Vải do nước thải không qua xử lý của nhà máy Vedan-Đồng Nai năm 2009, khiến hoạt động nuôi trồng, đánh bắt thủy sản của người dân trong phạm vi 2.000ha bị thiệt hại nặng nề (Vũ Thị Hương Lan, 2010)

2.1.2 Đặc điểm của nước thải công nghiệp

Nước thải công nghiệp khác nhau về thành phần và lượng phát thải tùy thuộc vào loại hình và quy mô sản xuất Nước thải công nghiệp thường chứa ion kim loại nặng (trong sản xuất và khai thác kim loại), chất hữu cơ (trong sản xuất thực phẩm) hoặc chất độc (sản xuất thuốc trừ sâu, phân bón, v.v.) Thành phần và lượng phát thải cũng

là hai tiêu chí để lựa chọn phương pháp và quy mô xử lý phù hợp

2.2 Các phương pháp xử lý nước thải (Dương Nguyên Khang, 2014)

2.2.1 Các phương pháp xử lý

Vì nước nước thải công nghiệp rất đa dạng nên có cũng nhiều phương pháp xử lý phù hợp với các loại nước thải đó Tuy nhiên, căn cứ vào cơ sở khoa học ta có thể chia làm ba nhóm như sau: phương pháp vật lý, phương pháp hóa học và phương pháp sinh học

Phương pháp vật lý sử dụng các lực vật lý như trọng trường, ly tâm để tách các hóa chất không hòa tan ra khỏi nước thải Phương pháp này đơn giản, rẻ tiền, hiệu quả

xử lý chất lơ lửng cao Các công trình xử lý cơ học được sử dụng rộng rãi trong xử lý nước thải là: lắng, lắng cao tốc, lọc, bay hơi, tách khí , v.v

Phương pháp hóa học sử dụng hóa chất để xử lý nước thải như keo tụ, clo javel, thuốc sát trùng, v.v Các công trình xử lý hóa học thường kết hợp với các công trình

xử lý vật lý Mặc dù có hiệu quả cao, nhưng phương pháp xử lý hóa học thường đắt tiền và tạo thành các sản phẩm phụ độc hại cho môi trường

Phương pháp sinh học gồm có phương pháp vi sinh hiếu khí (bioremediation), phương pháp thực vật (phytoremediation) và phương pháp ủ kỵ khí metan (bioconversion) Trong đó phương pháp vi sinh hiếu khí liên quan mật thiết với đề tài đang nghiên cứu Mục đích của phương pháp vi sinh hiếu là lên men phân hủy các chất

quả cao, tận dụng được các sản phẩm phụ làm phân bón (bùn hoạt tính) và thân thiện với môi trường

2.2.2 Phương pháp vi sinh hiếu khí (Lê Phi Nga và Schwitzguebels, 2014)

Hình 1: Quá trình sinh tổng hợp của vi khuẩn

(Lê Phi Nga và Schwitzguebels, 2014) Quá trình sinh tổng hợp của vi khuẩn cần có nguồn dinh dưỡng và nguồn năng lượng từ môi trường chúng sống Nguồn năng lượng của vi khuẩn thường là các chất

-) và nguồn dinh dưỡng là những chất cung cấp các nguyên tố thiết yếu

như C, O, N, P và những nguyên tố vi lượng Sau khi tham gia vào quá trình sinh tổng hợp, những chất này được chuyển hóa thành chất nhận điện tử

Một số quá trình sinh tổng hợp của vi khuẩn gây ô nhiễm khi chất nhận điện tử là các chất gây ô nhiễm

Vi khuẩn được dùng để xứ lý nước thải khi chúng sử dụng các chất có trong nước thải làm nguồn dinh dưỡng (nguồn carbon) hoặc nguồn năng lượng hoặc sản phẩm sinh ra từ quá trình sinh tổng hợp của chúng có thể tác dụng làm biến đổi chất ô nhiễm

Trong quá trình xử lý, chất ô nhiễm bị biến đổi trực tiếp hoặc gián tiếp Biến đổi trực tiếp là những chất ô nhiễm bị biến đổi bên trong tế bào thông qua quá trình sinh tổng hợp Biến đổi gián tiếp diễn ra bên ngoài tế bào vi khuẩn khi những chất ô nhiễm tác dụng với các chất nhận điện tử

Hình 2: Chất ô nhiễm bị biến đổi trực tiếp

(Lê Phi Nga và Schwitzguebels, 2014)

Hình 3: Chất ô nhiễm bị biến đổi gián tiếp

(Lê Phi Nga và Schwitzguebels, 2014)

2.3 Sơ lược về nước thải từ cơ sở sản xuất bún

2.3.1 Giới thiệu về bún và nghề làm bún

Bún là một loại thực phẩm truyền thống phổ biến trong cả nước chỉ sau cơm, phở (wikipedia) Bún được làm từ gạo tẻ qua những công đoạn rất công phu Bún gồm có hai loại là bún tươi và bún khô, trong đó bún tươi phổ biến hơn Các món ăn từ bún tươi rất đa dạng và được phân thành hai loại là bún nước và bún khô Một số món bún nước nổi tiếng như bún nước lèo ở Sóc Trăng, bún cá ở An Giang, bún thang ở Hà Nội, v.v

Nghề làm bún thuộc nhóm ngành nghề truyền thống có từ lâu đời Những cơ sở sản suất bún có mặt hầu hết ở các tỉnh thành trong cả nước với những quy mô lớn nhỏ khác nhau Vai trò của nghề làm bún là cung cấp nguồn thực phẩm cho xã hội, làm đa dạng văn hóa ẩm thực Việt Nam và góp phần giải quyết việc làm cho người dân Tuy nhiên, hiện nay nghề làm bún cũng gặp phải một số khó khăn trong vấn đề an toàn thực phẩm và ô nhiễm môi trường

2.3.2 Quy trình sản xuất bún tươi

Hình 4: Quy trình sản xuất bún tươi từ gạo tẻ

(Tống Thành Trung, 2010) Quá trình ngâm nhằm làm mềm hạt gạo để quá trình nghiền bột được dễ dàng hơn Quá trình ngâm còn là giai đoạn để vi khuẩn lactic lên men sinh acid

Quá trình nghiền ướt làm cho hạt gạo nhuyễn hơn và tinh bột không bị biến tính Làm ráo là để tách bớt nước chuẩn bị cho quá trình hồ hóa

Quá trình hồ hóa sơ bộ nhằm hồ hoá một phần tinh bột nhằm tạo cho khối bột một độ đặc nhất định khi tiến hành nhào

Nhào nhằm phá vỡ khối hạt, tạo điều kiện cho hạt tinh bột liên kết với nước làm cho khối bột trở nên đặc và chắc hơn

Quá trình ép đùn nhằm định hình cho bún, đồng thời làm chín một phần bún do tác động của nhiệt độ sau khi ra khỏi khuôn ép

Quá trình luộc nhằm làm bún chín hoàn toàn

Quá trình làm nguội nhằm làm các sợi tinh bột sắp xếp lại và ổn định chất lượng tạo sợi của chúng

Quy trình làm bún khô cũng tương tự như làm bún tươi nhưng có thêm giai đoạn tái hấp, sấy khô và đóng gói

2.3.3 Nước thải từ cơ sở sản xuất bún

Từ quy trình sản xuất, ta thấy rằng nước thải từ việc sản xuất bún sẽ chứa phần lớn chất hữu cơ là tinh bột hòa tan Nếu không được xử lý trước khi thải ra môi trường thì sẽ gây ô nhiễm do tinh bột hòa tan bị lên men yếm khí Hiện nay, một số làng nghề,

cơ sở sản xuất bún đã gây ô nhiễm nặng môi trường xung quanh nơi sản xuất, chẳng hạn như lò bún Ô Sa (Thừa Thiên Huế), làng bún Phú Đô (Hà Nội), v.v

Hình 5: Nước thải từ làng bún gây ô nhiễm kênh rạch xung quanh

(http://tainguyenmoitruong.com.vn/lang-bun-phu-do-bao-gio-het-o-nhiem.html)

2.3.4 Lò bún Lệ Châu

Đây là là lò bún nổi tiếng ở TP Sóc Trăng vì bún ở đây dai ngon đặc biệt Lò Bún cũng là nguồn cung ứng chủ yếu lượng bún sĩ và lẻ cho người dân trong địa bàn thành phố Vì được ưa chuộng nên lượng bún được sản xuất và bán ra của lò hằng ngày là khá lớn Do lượng bún được sản xuất lớn nên lượng nước thải phát ra của lò bún cũng khá lớn trong khi lò bún chưa có hệ thống xử lý nước thải và thải trực tiếp ra sông thông qua hệ thống cống Theo kết quả phân tích của Trung tâm Quan trắc Tài nguyên và Môi trường TP Sóc Trăng 4/2014 thì mẫu nước thải của lò bún Lệ Châu có

nồng độ chất hữu cơ cao, thể hiện qua giá trị BOD5 và COD Trong đó giá trị BOD5cao gấp khoảng 40 lần còn COD cao gấp khoảng 15 lần so với giá trị giới hạn B đối với nước thải công nghiệp (QCVN 40: 2011) (Bảng 1). Với nồng độ chất hữu cơ cao

như vậy thì khả năng gây ô nhiễm môi trường nước khi thải trực tiếp nước thải ra sông

là rất lớn Vì vậy việc xử lý nước thải của lò bún Lệ Châu là rất cần thiết

Bảng 1: Kết quả phân tích mẫu nước thải lò bún Lệ Châu

Chỉ tiêu Hàm lượng QCVN 40: 2011 (cột B)

- COD là lượng oxy cần để oxy hoá toàn bộ các chất hoá học trong nước

- BOD là lượng oxy cần thiết để oxy hoá các hợp chất hữu cơ dễ phân huỷ bởi vi sinh vật)

(Nguồn: Trung tâm Quan trắc Tài nguyên và Môi trường Tp Sóc Trăng, 14/4/2014)

2.4 Sơ lược về tinh bột

2.4.1.Tính chất vật lý và trạng thái tự nhiên

Tinh bột là chất rắn vô định hình, màu trắng, không tan trong nước nguội

trong các loại hạt (gạo, mì, ngô, v.v.), củ (khoai, sắn, v.v.) và quả (táo, chuối, v.v.)

2.4.2 Cấu trúc phân tử của tinh bột

Hình 6: Cấu trúc phân tử amylose (French, 1973)

a) Các gốc α-glucose nối với nhau bởi lien kết α-1,4-glycoside b) Mô hình phân tử amylose

Tinh bột là hỗn hợp của hai polisaccarit: amylose và amylopectin Cả hai đều có công thức phân tử là (C6H10O5)n trong đó C6H10O5 là gốc α-glucose và n nằm trong khoảng 1000- 4000 (đối với amylose) và 2000 – 20000 (đối với amylopectin)(French, 1973) Trong các loại tinh bột thương mại (gạo, ngô, v.v.) amylose chiếm khoảng 25%

và amylopectin chiếm khoảng 75% khối lượng tinh bột (French, 1973)

Trong phân tử amylose các gốc α-glucose nối với nhau bởi liên kết

xo (Hình 6b) (French, 1973)

sự liên kết giữa C1 của chuỗi này với C6 của chuỗi kia qua nguyên tử O (gọi là liên kết α-1,6-glycoside) (French, 1973)

Hình 7: Cấu trúc phân tử amylopectin (French, 1973)

a) Liên kết α-1,4-glycoside và liên kết α-1,6-glycoside b) Mô hình phân tử amylopectin

2 5 Hệ enzyme amylase và sự phân hủy tinh bột

người đầu tiên dùng B subtilis và B mesentericus cho việc sản xuất α-amylase cho

mục đích kinh tế bằng việc sử dụng những sinh vật lên men lớn và LSF (Liquid State Fermentation – sự lên men trong trạng thái lỏng)

Amylase được ứng dụng rộng rãi trong đời sống Trong ngành công nghiệp thực phẩm, amylase được sử dụng trong sản xuất bánh mì, tương, mạch nha, bột ngọt, v.v Trong ngành dệt, các chế phẩm amylase được dùng để tẩy lớp hồ bột trên mặt vải làm cho vãi mềm, mịn Trong sản xuất rượu bia, amylase được dùng trong giai đoạn đường hóa tinh bột Ngoài ra amylase còn được dùng trong chế biến dược phẩm

2.5.3 Phân loại enzyme amylase (Marc et al., 2002)

Có 6 loại enzyme amylase được xếp vào hai nhóm: endoamylase và exoamylase Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase và khử gián tiếp là oligo-1,6-glucosidase và transglucosidase Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide Exoamylase gồm có β-amylase và γ-amylase Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide

2.5.4 Tính chất của emzyme amylase

*Tính đặc hiệu: enzyme amylase phân cắt các liên kết α-1,4-glycoside và

α-1,6-glycoside trong quá trình phân hủy tinh bột hoặc glycogen (dạng dự trữ của tinh bột ở động vật) Amylase chỉ xúc tác phân hủy tinh bột và glycogen mà không thủy phân các

cơ chất khác kể cả cellulose (cũng có liên kết 1,4-glycoside)

*Tính chất vật lý và hóa học: enzyme amylase dễ tan trong nước, trong dung

dịch muối và rượu loãng Các amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino

acid khác nhau, mỗi loại amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng Hoạt động của enzyme amylase chịu ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và nồng độ muối Amylase hoạt

động trong vùng pH 3.5-8.5 và phần lớn amylase hoạt động tối ưu ở pH=6 (Agić et al.,

với dung dịch muối NaCl 0,5M (Robyt, 2005)

*Chất ức chế: Hầu hết các enzyme amylase đều bị kiềm hãm bởi các kim loại

nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+ (Tapan, 2006) Nguyên nhân là do các kim loại này làm thay đổi cấu trúc phân tử của các emzyme amylase làm mất đi chức năng của chúng

2.5.5 Cơ chế phân hủy tinh bột

Hình 8: Cơ chế phân hủy tinh bột (Marc et al., 2002)

Trong dung dịch hồ tinh bột, α-amylase phân cắt ngẫu nhiên liên kết glycoside từ đầu khử trong phân tử tinh bột tạo thành các dextrin hoặc glucose Enzyme này phân hủy cả tinh bột thô nhưng rất chậm

α-1,4-Khác với α-amylase, tiến trình phân cắt liên kết α-1,4-glycoside của enzyme amylase bắt đầu từ đầu không khử tạo thành maltose Trong quá trình phân cắt liên tục nếu gặp liên kết α-1,4-glycoside kế cận liên kết α-1,6-glycoside thì nó sẽ ngưng cắt Vì

β-vậy sản phẩm của quá trình phân hủy tinh bột bởi β-amylase thường là hỗn hợp của các dextrin có chứa liên kết α-1,6-glycoside (gọi là β-dextrin) và maltose

Tương tự β-amylase, γ-amylase phân cắt liên kết α-1,4-glycoside từ đầu không khử Quá trình này lặp lại nhiều lần cho ra sản phẩm cuối cùng là β-glucose γ-amylase cũng có thể phân cắt các liên kết α-1,6-glycoside nhưng rất chậm

Enzyme pullulanase tham gia vào giai đoạn dextrin hóa với vai trò phân cắt liên kết α-1,6-glycoside trong phân tử tinh bột

Transglucosidase có tác dụng thủy phân maltose thành glucose Ngoài ra transglucosidase còn có thể tổng hợp izomaltose, izomaltosetriose và panose (tức chuyển gốc glucose gắn vào phân tử glucose khác hoặc phân tử maltose bằng liên kết α-1,6-glycoside để tạo thành panose và izomaltose)

Oligo-1,6-glucosidase phân cắt liên kết α-1,6-glycoside trong isomaltose, panose

và các dextrin thành các phân tử đường có thể lên men được

2.6 Một số chi vi khuẩn phân hủy tinh bột

Trong môi trường tự nhiên có nhiều loài vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột thuộc các chi như như Bacillus, Lactobacillus, Pseudomonas, v.v (Nguyễn Hữu Hiệp

và Nguyễn Thị Hải Lý, 2012) Những loài vi khuẩn này tiết ra các loại enzyme trong

hệ enzyme amylase để phân hủy tinh bột thành những hợp chất đơn giản hơn (như glucose) để đáp ứng quá trình sinh tổng hợp của chúng

vi khuẩn có sức sống cao, dễ nuôi cấy và có khả năng có khả năng phân hủy tinh bột

tốt (Sanjoy et al., 2009 Một số loài vi khuẩn khác thuộc chi này cũng có khả năng phân hủy tinh bột như Bacillus subtilis (Konsula et al., 2003), Bacillus megaterium (Mary et al., 1980) và Bacillus flexus (Jian et al., 2009)

2.6.2 Vi khuẩn Lactobacillus sp

Lactobacillus sp là những loài vi khuẩn Gram dương, kỵ khí không bắt buộc

hoặc vi hiếu khí, hình que, di chuyển thụ động và không tạo bào tử Lactobacillus sp

có mặt trong các thực phẩm lên men (như sữa chua, phó-mat, dưa cải, v.v.), trong dạ dày, đường sinh dục của người và động vật có vú…Ngoài khả năng lên men lactic,

một số loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus có khả năng phân hủy tinh bột mạnh Trong số đó phải kể đến Lactobacillus amylovorus (Nakamura, 1981 )(Hình 10),

Lactobacillus rnanihotivorans (Morlon-Guyot et al., 1998), và Lactobacillus amylophilus (Vishnu et al., 2000), v.v Chúng có khả năng tiết ra enzyme α-amylase

và một số enzyme khác để chuyển hóa tinh bột thành những sản phẩm có chứa acid lactic

Hình 10: Vi khuẩn Lactobacillus amylovorus (Nakamura, 1981)

2.6.3 Một số dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột khác

Ngoài những loài vi khuẩn kể trên, những loài vi khuẩn sau đây cũng có khả

năng tiết ra hệ enzyme amylase phân hủy tinh bột Actinomyces sp là những loài vi khuẩn Gram dương, kỵ khí không bắt buộc (trừ A meyeri làm một vi khuẩn kỵ khí bắt buột), không tạo nội bào tử, hình que (wikipedia) Cytophaga sp là những loài vi

khuẩn Gram âm, kỵ khí bắt buộc, dạng que, cũng có khả năng tiết amylase để phân

Gram dương, hiếu khí, di chyển tích cực, dạng tròn, tìm thấy nhiều ở đất trồng

(Jeong-Hwa Choi, 2007) Dyadobacter soli là loài vi khuẩn Gram âm, không di chuyển, hiếu

khí, dạng que, được tìm thấy ở các bãi rác ở Biển Đông (Myungjin Lee et al., 2010)

Một số loài xạ khuẩn cũng có khả năng phân hủy tinh bột (wikipedia)

2.6.4 Một số ứng dụng của vi khuẩn phân hủy tinh bột

Trong đời sống, vi khuẩn phân hủy tinh bột được ứng dụng từ rất lâu trong chế biến các thực phẩm hằng ngày như sữa chua, cải muối, v.v Một số vi khuẩn phân giải tinh bột cũng góp phần phần trong quá trình lên men rượu từ chính cơ chất đó

Trong việc bảo vệ môi trường, những vi khuẩn phân hủy tinh bột mạnh được dùng để tạo các chế phẩm xử lý rác thải hoặc nước thải có chứa cơ chất tinh bột (như nước thải ở những cơ sở sản xuất bột, lò bún, lò bánh, v.v.)

Trong sản xuất, vi khuẩn phân giải tinh bột có tiềm năng rất lớn trong việc sản xuất enzyme amylase, hệ enzyme có giá trị về kinh tế lẫn khoa học Ưu điểm của việc sản xuất enzyme amylase từ vi khuẩn là rẻ, sinh sản nhanh, dễ nuôi cấy và thân thiện với môi trường

2.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Việc xử lý nước thải bằng phương pháp vi sinh đã và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu Hầu hết những nghiên cứu đều có điểm chung trong việc phân lập là tìm kiếm những dòng vi sinh vật có khả năng phân hủy các chất hữu cơ từ chính nguồn nước thải chứa nhiều chất hữu cơ đó Những nghiên cứu đó cũng cho kết quả rất khả quan vì đa phần đã tìm được những vi sinh vật mong muốn

2.7.1 Trong nước

Năm 2012, Nguyễn Hữu Hiệp và Nguyễn Thị Hải Lý đã thực hiện thành công trong nghiên cứu phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột tại làng nghề sản xuất bột gạo tại thị xã Sa Đéc, tỉnh Đồng Tháp Nghiên cứu cho kết quả 4

đến 97% lượng tinh bột có trong nước thải chỉ sau 24 giờ

Năm 2010, Vũ Thị Hương Lan phân được 6 dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột mạnh từ nước thải sản xuất nui Các dòng này đều xử lý tốt nước thải từ nhà máy sản xuất nuôi Sau khi xử lý, giá trị COD của nước thải sản suất nuôi giảm từ 76-88% so với giá trị ban đầu

Năm 2013, Phạm Thị Ngọc Lan et al đã phân lập và tuyển chọn được 2 dòng vi

khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột mạnh từ bùn ao nuôi tôm ở đầm Sam-Chuồn, Thừa Thiên Huế Hai dòng này có thể phân hủy tốt protein, lipid và cellulose Điều đó cho thấy tiềm năng xử lý nước ô nhiễm ở những ao nuôi tôm, nơi có nhiều chất thải hữu cơ như tinh bột, cellulose, protein và lipid

2.7.2 Ngoài nước

Planococcus donghaensis, một dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột được phân lập từ

vùng biển phía đông Hàn Quốc bởi Jeong-Hwa et al (2007)

Myungjin et al (2010) đã phân lập được dòng vi khuẩn Dyadobacter soli có khả

năng phân hủy tinh bột mạnh từ đất ruộng

Arvinder et al (2012) đã phân lập được 6 dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột mạnh

từ cánh đồng trồng khoai tây

SulaimanvA Alrumman et al (2014) đã phân lập được dòng vi khuẩn Bacillus

axarquiensis trong nước thải của nhà máy chế biến khoai tây Saudi Snack Foods

Company Vi khuẩn này được ứng dụng để xử lý nước thải của nhà máy đó

2.8 Các phương pháp vi sinh

2.8.1 Phương pháp hộp trải (Nguyễn Văn Minh, 2008)

Phương pháp này dùng que trải trải đều mẫu lên môi trường đĩa để tách riêng biệt các tế bào vi khuẩn Các tế bào vi khuẩn này sẽ phát triển thành những khuẩn lạc riêng biệt (nhìn rõ bằng mắt thường) Vì khuẩn lạc là một tập đoàn vi sinh vật sinh ra

từ một tế bào hay bào tử của vi sinh vật (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002) nên những khuẩn lạc riêng biệt có đặc điểm khác nhau (trên cùng môi trường) sẽ là những dòng vi khuẩn khác nhau

2.8.2 Phương pháp đếm sống nhỏ giọt (Hoben và Somasegaran, 1982)

Phương pháp này dùng để đếm số lượng tế bào vi khuẩn sống trong một thể tích nhất định dung dịch chứa vi khuẩn Khi nhỏ một thể tích nhất định dung dịch chứa vi khuẩn lên môi trường đặc, các tế bào vi khuẩn sống sẽ phát triển thành các khuẩn lạc riêng biệt Dựa vào số khuẩn lạc, chúng ta sẽ tính được số lượng tế bào vi khuẩn sống trong dung dịch ban đầu

2.8.3 Phương pháp giếng thạch (Umesh et al., 1989)

Phương pháp này dùng để chọn ra những dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột dựa vào đường kính vòng halo không bắt màu với dung dịch Lugol xung

Tinh bột hòa tan trong môi trường đặc tạo phức với dung dịch Lugol tạo màu tím xanh Những vi khuẩn phân hủy tinh bột sẽ tiết ra hệ enzyme amylase phân hủy tinh bột xung quanh khuẩn lạc Tinh bột khi đã bị phân hủy bởi hệ enzyme amylase thì không thể tạo phức màu tím xanh với dung dịch Lugol nữa Đây là cơ sở để xác định những vi khuẩn phân hủy tinh bột

Phương pháp giếng thạch dùng đầu côn thủy tinh đục các lỗ giếng và nhỏ vi khuẩn vào đó Sau thời gian phát triển đầy đủ, vi khuẩn phân hủy tinh bột sẽ tạo một vòng sáng halo Đường kính của vòng sáng càng lớn thì vi khuẩn phân hủy tinh bột càng mạnh

2.8.4 Phương pháp thử nghiệm catalase (Nguyễn Lân Dũng, 2006)

Phương pháp này dùng để xác định vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí không bắt buộc

lạc

2.8.5 Phương pháp thử Methyl red ( Nguyễn Lân Dũng, 2006)

Trong môi trường glucose-phosphate, vi khuẩn sẽ chuyển hóa glucose thành các acid như acid lactic, acid acetic và acid formic Chính những axit này làm giảm pH của môi trường

Hình 11: Sự chuyển hóa glucose bởi vi khuẩn

2.9 Kỹ thuật PCR và phương pháp giải trình tự

2.9.1 Kỹ thuật PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật sinh học phân tử cho phép nhân bản một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen DNA của cơ thể sinh vật thành nhiều bản sao Kỹ thuật này được phát minh bởi Kary Mullis năm1958 tại công ty Cetus

* Nguyên lý của kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR tuân thủ những nguyên tác cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể sinh vật:

- Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho enzyme helicase

- Kết hợp với enzyme DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp DNA mới trong môi trường thích hợp

- Hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chuyên biệt chủ động

Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt Đây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao

Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp, giai đoạn kéo dài:

- Giai đoạn biến tính (denaturation): tách chuỗi DNA từ sợi đôi thành 2 sợi đơn

độ tăng lên sẽ phá vỡ các liên kết hydro giữa hai mạch của phân tử DNA Trước chu

kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn Thời gian ở giai đoạn này khoảng 1-2 phút

- Giai đoạn bắt cặp (annealing): gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ xuống để mồi có thể gắn vào sợ DNA đơn Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến

không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện Thời gian bắt cặp từ 1-2 phút

- Giai đoạn kéo dài (extension): tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống Nó bắt đầu bắm vào và hoạt động dọc theo sợi DNA Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA polymerasse Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại

Các đoạn DNA mới được hình thành lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo

Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ, tính

* Phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert (1997)

Giải trình tự bằng phương pháp hóa học được Maxam và Gilbert tìm ra năm 1997 Phương pháp gồm có 4 bước:

- Đánh dấu một đầu của đoạn DNA cần phải giải trình tự bằng một gốc phospho

P)

- Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu này với chất hóa học có thể làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai base của nucleotide trên đoạn DNA Các chất hóa học được dùng là dimethylsulphate (biến đổi G), hydrazine (biến đổi T và C), hỗn hợp hydrazine và NaCl (làm biến đổi C), acid (làm biến đổi G và A) và NaOH (biến đổi A và C) Như vậy, trong giai đoạn này phải dùng ít nhất 4 ống nghiệm và trong mỗi ống nghiệm, DNA được xử lý với một lượng rất giới hạn của một trong các chất hóa học nêu trên

để mỗi ống nghiệm chỉ có chứa các đoạn DNA mà trên mỗi đoạn DNA này chỉ có một

vị trí nucleotide đặc hiệu với chất hóa học là bị biến đổi

- Các nucleotide bị biến đổi sẽ được lấy ra khỏi mạch khung đường phosphate

mất phân tử base vì phân tử này bị lấy ra khỏi mạch khung

- Điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghệm trên 4 hàng của một gel polyacrylamide biến tính để các mạch đơn di chuyển trong gel không bị biến đổi trong quá trình diện di Sau khi điện di, các mạch đơn sẽ bị dừng tại các vị trí khác nhau, tùy thuộc mạch đơn này dài ngắn khác nhau, theo suốt chiều dài của gel Áp gel đã chạy điện di này lên một gel nhạy tia X, các vị trí dừng lại của các mạch đơn trên gel điện di

vạch trên film, ta có thể đọc được trình tự của các nucleotide trong đoạn DNA

Phương pháp hóa học rất khó thực hiện vì cần phải xác định khá nhiều thông số tối ưu cho thí nghiệm, nhất là phải xác định nồng độ giới hạn của các chất hóa học sao cho khi xử lí mẫu DNA thì trên mỗi đoạn DNA chỉ có một base bị biến đổi để ứng với

Chính vì sự phức tạp này mà phương pháp hóa học hiện nay ít được sử dụng

* Phương pháp phản ứng chuỗi của Sanger (1997)

Phương pháp gồm có 3 bước:

- Chèn các đoạn DNA cần phải giải trình tự vào một vector là phage hay plasmid tại một vị trí mà trình tự chuỗi của vị trí này đã được định rõ Đưa các vector mang đoạn chèn này vào tế bào vi khuẩn để nhân bản Sau đó tách chiết và tinh khiết các vector từ vi khuẩn để thành các vector tự do

- Dùng các đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của vector tại vị trí chèn đoạn Thêm vào ống phản ứng DNA polymerase và 4 loại nucleotide tự do (dNTP) và một lượng rất giới hạn ddNTP Phản ứng được thực hiện trong 4 ống và mỗi ống cho một loại ddNTP khác nhau DNA polymerase sẽ kéo các dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA chèn trên vector và sự tổng hợp mạch đơn

sẽ bị dừng lại tại vị trí mà ddNTP được kéo vào thay vì dNTP Lý do sự tổng hợp bị dừng lại là vì ddNTP có cấu trúc hóa học bị mất đi gốc OH tại vị trí carbon thứ 3 của đường deoxyribose mà gốc OH ở vị trí này là nơi dNTP kế tiếp gắn vào Nhờ vậy trong ống phản ứng có các mạch đơn DNA có chiều dài khác nhau tương ứng với các

vị trí trình tự các nucleotide trên đoạn DNA gốc

- Để giải trình từ người ta diện di DNA tổng hợp trên gel polyacrylamide biến

vạch điện di bằng kỹ thuật xạ ký tự ghi và từ các vạch này giải được trình tự của đoạn DNA

Phương pháp phản ứng chuỗi của Sanger có ưu điểm là nhanh chóng và đơn giản hơn nhiều so với phương pháp hóa học nên hiện nay phương pháp này được sử dụng rộng rãi

* Giải trình tự bằng máy tự động (automatic sequencer)

Cấu tạo của một máy giải trình tự tự động gồm hai phần chính yếu: phần điện di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di Phần diện di có thể là một gel hay một ống mao quản chứa gel Phần phát hiện vạch điện di là những con mắt cảm quan và một chùm tia laser đi qua trước nó Nguyên tắc hoạt động của máy này là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ Từ các đỉnh của các cường độ sáng này máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA Ngày nay, người ta có thể dùng 4 loại huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện được chỉ trong một ống nghiệm và khi giải trình tự chỉ cần điện di trên một hàng mà không cần phải trên 4 hàng như trước đây

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm nghiên cứu và tiến độ thực hiện

Phủ, Phường 6, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng)

Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học của trường Đại học Cần Thơ

Luận văn được tiến hành trong 4 tháng (8/2014-11/2014)

3.1.2 Vật liệu

Biên Phủ, Phường 6, TP Sóc Trăng, Tỉnh Sóc Trăng)

Yêu cầu khoa học: nước thải chứa nhiều tinh bột và lò bún này chưa từng sử dụng bất cứ chế phẩm vi sinh nào để xử lý nước thải

Chọn lấy mẫu nước thải đang trong giai đoạn phân hủy Lấy nước thải từ độ sâu 30-0cm

Thu 500ml nước thải, trữ trong chai thủy tinh có nắp vặn vô trùng Đặt chai chứa mẫu trong thùng xốp, cho nước đá vào để bảo quản mang về phòng thí nghiệm

3.1.3 Dụng cụ và thiết bị

3.1.3.1 Dụng cụ

- Đĩa petri thủy tinh

- Ống nghiệm chịu nhiệt có nắp vặn dung tích 10ml

- Que cấy thép, que trải thủy tinh

- Đèn cồn

- Ống đong nhựa 1000ml, ống đong thủy tinh 200ml

- Micropipette 1000-5000µl, micropipette 100-1000µl, micropipette 20-200µl, micropipette 2-20µl

- Các loại đầu côn nhựa chịu nhiệt, đầu côn thủy tinh chịu nhiệt

- Tube eppendorf

- Chai thủy tinh chịu nhiệt có nắp vặn loại 1000ml, 500ml, 250ml và 100ml

- Lam và lamen

*Hóa chất dùng trong thí nghiệm nhận diện vi khuẩn phân hủy tinh bột

- Pepton, cao nấm men, agar, tinh bột

* Hóa chất kiểm tra đặc tính sinh hóa

- Dung dịch H2O2 3%

- Thuốc thử Methyl red: Methyl red 0,1g, ethanol 95% 300ml vào nước cất vừa

đủ 500ml

* Hóa chất nhuộm Gram

- Dung dịch fuchsin: fuchsin 1g, ethanol 95% 100ml, dung dịch phenol 5% 100ml

- Phẩm nhuộm crystal violet:

+ Dung dịch A: crystal violet (85%) 20g, ethanol 95% 100ml

+ Pha dung dịch A trong nước với tỷ lệ 1:10 ta có hỗn hợp C Trộn B với C theo

tỷ lệ 4:1 ta được phẩm nhuộm crystal violet

- Ethanol 70%, Nước cất hai lần vô trùng

*Môi trường phân lập (Shengwei et al., 2012)

NaCl 1,43g/l, NH4Cl 0,15g/l, MgSO4.7H2O 0,037g/l, CaCl2.2H2O 0,017g/l, tinh bột 10g/l, Agar 20g/l (3g/l cho môi trường bán lỏng), cyclohexamide 0,1g/l (khi trải mẫu), nước cất vừa đủ 1 lít, chuẩn pH =7-7,2

- Chức năng: là môi trường chuyên biệt dùng để phân lập vi khuẩn phân hủy tinh bột với nguồn carbon là tinh bột

- Cách chuẩn bị môi trường:

+ Môi trường đĩa: Cho một ít nước cất vào chai thủy tinh chịu nhiệt có nắp vặn Hòa tan các khoáng chất và cao nấm men Bổ sung tinh bột và agar Cho nước cất đến thể tích cần dùng Đun trên bếp từ gia nhiệt cho đến khi tinh bột chuyển thành dạng hồ hoàn toàn Vặn nắp chai (không vặn quá chặt) và đem khử trùng nhiệt ướt ở 121oC, 1atm trong 20 phút, để nguội đến khoảng 80o

C rồi phân phối 15-20ml vào mỗi đĩa petri (loại 80x15 mm) (tiến hành trong tủ cấy vô trùng) Khi hơi nước bay hơi hết thì

úp ngược, cho vào túi nylon buột miệng, trữ qua đêm trong tủ ủ ở 30oC để kiểm tra những đĩa bị nhiễm vi sinh vật từ môi trường bên ngoài

+ Môi trường ống nghiêng: cách chuẩn bị cũng tương tự như môi trường phân lập đĩa nhưng phân phối khoảng 4-5ml vào ống chịu nhiệt có nắp vặn 10ml rồi mới

đem khử trùng Khử trùng xong thì tiến hành nghiêng ống Trữ qua đêm trong tủ ủ ở

30oC để kiểm tra những đĩa bị nhiễm vi sinh vật từ môi trường bên ngoài

* Môi trường kiểm tra hoạt tính amylase (Nguyễn Lân Dũng, 2006)

- Thành phần: Peptone 5g/l, cao nấm men 3g/l, NaCl 5g/l, agar 20g/l, tinh bột 20g/l, nước cất vừa đủ 1 lít và chuẩn pH =7-7,2

- Chức năng: dùng để nhận diện những dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột

- Cách làm môi trường: tương tự như cách làm môi trường phân lập đĩa nhưng

* Môi trường LB (Luria Broth ) (Ronald, 2010)

- Thành phần: Tryptone 10g/l, NaCl 10g/l, cao nấm men 5g/l, nước cất vừa đủ 1lít và chuẩn pH =7-7,2

- Dùng để nuôi tăng sinh vi khuẩn

- Cách chuẩn bị môi trường: Cho một ít nước cất vào cốc thủy tinh Bổ sung các

4-5ml vào ống chịu nhiệt có nắp vặn 10ml rồi đem khử trùng

*Môi trường glucose - phosphate ( Nguyễn Lân Dũng, 2014)

-Thành phần: Peptone 5g/l, glucose 5g/l, K2HPO4 5g/l, nước cất vừa đủ 1lít và chuẩn pH=7-7,2

- Dùng để kiểm tra khả năng sinh acid của vi khuẩn khi môi trường có glucose

- Cách chuẩn bị môi trường: Tương tự như cách chuẩn bị môi tường LB

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phân lập vi khuẩn từ mẫu

*Trãi mẫu

- Pha loãng mẫu 102 lần, 10 3 lần, 104 lần và 105 lần

- Trải đều 0,1ml mẫu ở các nồng độ lên môi trường phân lập đĩa bằng que trải thủy tinh