thiết kế primer chuyên biệt để nhận diện vi tảo nhóm thraustochytrid

Thông qua nghiên cứu này, với chín dòng vi tảo được cung cấp thông qua kỹ thuật sinh học phân tử đã nhận diện được các dòng vi tảo thuộc nhóm Thraustochytrium và Schizochytrium bằng hai

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THỜ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THIẾT KẾ PRIMER CHUYÊN BIỆT ĐỂ NHẬN DIỆN

VI TẢO NHÓM THRAUSTOCHYTRID

LỚP: CNSHTT K36

Cần Thơ, Tháng 12/2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THỜ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THIẾT KẾ PRIMER CHUYÊN BIỆT ĐỂ NHẬN DIỆN

VI TẢO NHÓM THRAUSTOCHYTRID

LỚP: CNSHTT K36

Cần Thơ, Tháng 12/2014

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

(ký tên) (ký tên) Trần Thị Xuân Mai Nguyễn Lam Minh DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

Xin chân thành cảm tạ sự hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của ThS Trần Thị Xuân Mai Cảm ơn cô đã nhiệt tình chỉ dạy và truyền đạt những kinh nghiệm, kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Xin cảm ơn sự hỗ trợ và giúp đỡ của các cán bộ quản lý phòng thí nghiệm Công Nghệ Gen Thực Vật của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

Cảm ơn các anh chị học viên cao học và các bạn sinh viên trong phòng thí nghiệm Công Nghệ Gen Thực Vật đã nhiệt tình giúp đỡ trong quá trình thực hiện đề tài

TÓM LƯỢC

Vi tảo là đối tượng nhận được nhiều sự quan tâm trong sản xuất các acid béo không no nhiều nối đôi như Omega3 và Omega6, đặc biệt là acid docosahexaenoic (DHA) và acid eicosapentaenoic (EPA) Việc nhận diện nhóm vi tảo biển dị dưỡng này bằng phương pháp truyền thống còn gặp nhiều khó khăn Bằng quan sát hình thái vi tảo dưới kính hiển vi, bước đầu nhận diện chín dòng vi tảo được cung cấp là thuộc nhóm thraustochytrid Thông qua nghiên cứu này, với chín dòng vi tảo được cung cấp thông qua kỹ thuật sinh học phân tử đã nhận diện được các dòng vi tảo thuộc nhóm Thraustochytrium và Schizochytrium bằng hai cặp mồi chung được thiết kế dựa trên trình tự vùng gen mã hóa 18S rRNA của một số loài vi tảo bao gồm Thraustochytrium kinnei, Thraustochytrium pachydermum, Thraustochytrium striatum, Thraustochytrium multirudimentale, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium aggregatum, Schizochytrium minutum, Schizochytrium limacinum và Schizochytrium aggregatum Bước đầu nhận diện cả 9 dòng vi tảo thuộc Thraustochytrium và Schizochytrium, trong đó có 2 dòng vi tảo là M19 và D14 thuộc nhóm Thraustochytrium và 7 dòng còn lại thuộc Schizochytrium dựa trên cặp mồi chuyên biệt nhận diện dòng Schizochytrium Hơn thế nữa, trong nghiên cứu này, 3 dòng vi tảo được giải trình tự bằng cặp mồi chung với kích thước khoảng 1000bp là B3, M6 và D14 Dựa vào phân tích cây phả hệ và kết quả BLAST từ NCBI cho thấy dòng B3 và M6 có quan hệ rất gần với dòng Schizochytrium và Aurantiochytrium (trong đó dòng B3 đồng hình cao với Schizochytrium sp SKA10 ở mức độ 79% và dòng M6 đồng hình

ở mức 98% với Schizochytrium sp KRT1), và dòng D14 thuộc nhóm Thraustochytrium, đồng hình ở mức 93% với Thraustochytrium sp BP3.2.2 Bằng các cặp mồi chung và cặp mồi chuyên biệt trong nghiên cứu này đã giúp việc nhận diện nhanh các dòng vi tảo thuộc nhóm thraustochytrid

Từ khóa: Acid béo không no, Schizochytrium, Thraustochytrium, vi tảo dị

dưỡng

MỤC LỤC

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

TỪ VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Giới thiệu về vi tảo 2

2.1.1 Giới thiệu sơ lược về vi tảo 2

2.1.2 Hệ thống phân loại vi tảo 2

2.1.3 Vi tảo biển dị dưỡng thraustochytrid 6

2.2 Sản xuất acid béo không no nhiều nối đôi từ vi tảo dị dưỡng thraustochytrid 8

2.2.1 Giới thiệu 8

2.2.2 Khả năng sản xuất acid béo không no bằng vi tảo thraustochytrid 9

2.2.3 Thị trường cho acid béo không no nhiều nối đôi 10

2.2.4 Tiềm năng của thraustochytrid 11

2.3 Giới thiệu kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 13

2.3.1 Sơ lược về kỹ thuật PCR 13

2.3.2 Các giai đoạn của một phản ứng PCR: 14

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 15

2.4 Kỹ thuật điện di trên gel agarose 16

2.4.1 Nguyên lý 16

2.4.2 Các thiết bị và thành phần cần thiết cho điện di 18

2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến điện di 18

2.5 Thiết kế mồi 19

2.5.1 Những điều cần chú ý trong thiết kế mồi 19

2.5.2 Các phần mềm thiết kế mồi 20

2.6 Xây dựng cây phả hệ bằng phần mềm MEGA 6.0 22

2.7 Các nghiên cứu trước đây về các dòng vi tảo Thraustochytrid 23

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN 25

3.1 Phương tiện nghiên cứu 25

3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 25

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ 25

3.1.4 Hóa chất 26

3.2 Phương pháp 26

3.2.1 Quy trình nuôi tăng sinh khối vi tảo 26

3.2.2 Quy trình trích DNA vi tảo bằng CTAB 27

3.2.3 Phản ứng PCR 28

3.2.4 Phân tích sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trên gel agarose 29

3.2.5 Phân tích các trình tự bằng phương pháp xây dựng cây phả hệ 30

3.3 Bố trí thí nghiệm 30

3.3.1 Thiết kế các đoạn mồi PCR 30

3.3.2 Thực hiện phản ứng PCR để kiểm tra tính đặc hiệu của mồi 30

3.3.3 Thực hiện giải trình tự các dòng vi tảo phân lập 31

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 Quan sát các dòng vi tảo dưới kính hiển vi: 32

4.2 Kết quả thiết kế mồi 34

4.2.1 Hai cặp mồi chung Thraustochytrium và Schizochytrium 34

4.2.2 Cặp mồi nhận biết dòng Schizochytrium: 36

4.2.3 Cặp mồi nhận diện vi tảo Thraustochytrium striatum 37

4.2.4 Cặp mồi nhận diện vi tảo Thraustochytrium aureum 38

4.3 Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi thiết kế bằng kỹ thuật PCR: 38

4.3.1 Kết quả PCR của mồi Thraus-Schi1 (khoảng 500bp) 38

4.3.2 Kết quả PCR của mồi Thraus-Schi2 (khoảng 1000bp) 40

4.3.3 Kết quả PCR của mồi chuyên biệt nhận diện dòng Schizochytrium (khoảng 600bp) 41

4.3.4 Kết quả PCR của mồi chuyên biệt nhận diện Thraustochytrium striatum 42

4.3.5 Kết quả PCR của mồi chuyên biệt nhận diện Thraustochytrium aureum 43

4.4 Giải trình tự 43

4.5 Xây dựng cây phả hệ: 46

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Đề nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Các thông số điện di DNA bằng gel agarose 18

Bảng 2 So sánh thời gian xử lý của 4 phương pháp NJ, MP, ML và BI 23

Bảng 3 Các dòng vi tảo và nguồn gốc các dòng vi tảo đã phân lập 25

Bảng 4 Thành phần môi trường NM-5 27

Bảng 5 Chu kỳ nhiệt cho cặp mồi Thraus-Schi1 28

Bảng 6 Chu kỳ nhiệt cho cặp mồi Thraus-Schi2 28

Bảng 7 Chu kỳ nhiệt cho cặp mồi Schi 29

Bảng 8 Chu kỳ nhiệt cho cặp mồi Thraus striatum 174F và 705R 29

Bảng 9 Chu kỳ nhiệt cho cặp mồi Thaus aureum 171F và 716R 29

Bảng 10 Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các dòng vi tảo phân lập 33

Bảng 11 Chu kỳ nhiệt tối ưu hóa cho mồi Thraus-Schi2 40

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Độ khuếch đại của phản ứng PCR 13

Hình 2 Các giai đoạn của phản ứng PCR 14

Hình 3 Kết quả quan sát 9 dòng vi tảo dưới kính hiển vi 32

Hình 4 Vùng đồng hình thứ nhất giữa các dòng Thraustochytrium và Schizochytrium 35

Hình 5 Vùng đồng hình thứ hai giữa các dòng Thraustochytrium và Schizochytrium 35 Hình 6 Vùng đồng hình thứ ba giữa các dòng Thraustochytrium và Schizochytrium 36 Hình 7 Primer forward để nhận biết Schizochytrium 36

Hình 8 Primer reverse để nhận biêt Schizochytrium 37

Hình 9 Primer forward nhận biết Thraustochytrium striatum 37

Hình 10 Primer reverse nhận biết Thraustochytrium striatum 37

Hình 11 Primer forward để nhận biết Thraustochytrium aureum 38

Hình 12 Primer reverse để nhận biết Thraustochytrium aureum 38

Hình 13 Kết quả sản phẩm PCR bằng cặp mồi Thraus-Schi1 được điện di trên gel 1,5% Agarose 39

Hình 14 Kết quả điện di trên gel Agarose 1,5% với mồi Thraus-Schi2 40

Hình 15 Kết quả điện di trên gel Agarose của mồi Thraus-Schi2 ở nhiệt độ bắt mồi là 52°C 41

Hình 16 Kết quả điện di trên gel Agarose với 9 dòng vi tảo bằng mồi Thraus-Schi2 41 Hình 17 Kết quả sản phẩm PCR với mồi Schi điện di trên gel 1,5% Agarose 42

Hình 18 Kết quả BLAST từ NCBI của dòng B3 44

Hình 19 Kết quả BLAST từ NCBI của dòng D14 45

Hình 20 Kết quả BLAST từ NCBI của dòng M6 46

Hình 21 Cây phả hệ của dòng B3 47

Hình 22 Cây phả hệ của dòng M6 48

Hình 23 Cây phả hệ của dòng D14 49

Hình 24 Cây phả hệ chung cho 3 dòng vi tảo B3, M6 và D14 50

TỪ VIẾT TẮT

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Thraustochytrid là nhóm vi tảo biển dị dưỡng phổ biến được biết đến như là nguồn cung cấp dồi dào các hợp chất hoạt động sinh học có giá trị Chúng thường được tìm thấy ở các vùng biển và vùng cửa sông bao gồm các tầng nước và tầng đáy, ở vùng nhiệt đới lẫn ôn đới Nhóm vi tảo này thường bám vào một số sinh vật không xương sống, rong rêu hay những lá cây rụng ở rừng ngập mặn Thraustochytrid đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy lá cây rụng do có khả năng tiết ra một lượng cao những enzyme phân giải chẳng hạn như enzyme cellulase và polygalacturonase Thông qua quá trình này, vi tảo thraustochytrid đã cung cấp nguồn dinh dưỡng dồi dào cho sự sinh sôi và phát triển của nhiều loài cá và giáp xác ở vùng rừng ngập mặn Trong những nghiên cứu gần đây đã cho thấy nhiều loài vi tảo thuộc Thraustochytrid

có khả năng sản xuất những hợp chất sinh học quý bao gồm: acid béo không no nhiều nối đôi (PUFA: Polyunsaturated Fatty Acid) ví dụ như acid docosahexaenoic (DHA)

và acid eicosapentaenoic (EPA), nhóm vi tảo này cũng là đối tượng lý tưởng để sản xuất carotenoid và nhiên liệu sinh học diesel

Để mô tả thraustochytrid, người ta có thể dựa trên hình thái của chúng cũng như các đặc điểm phát triển bao gồm sự phát triển các túi bào tử, mạng lưới ngoài chất, sự hình thành các bào tử động, độ dày của vỏ tế bào, sự hình thành sắc tố, hay sự di chuyển của các bào tử động trong khoảng thời gian sau khi được phóng thích ra Theo nhiều nghiên cứu cho thấy chỉ có thể quan sát dưới điều kiện chuẩn như quan sát trong điều kiện nuôi cấy có chứa phấn thông và nước biển để xác định các vi sinh vật này

Do sự khác biệt về môi trường dinh dưỡng dẫn đến sự không ổn định trong biểu hiện hình thái đặc trưng của vi tảo Điều đó dẫn đến những khó khăn trong việc nhận diện

vi tảo dựa trên hình thái tế bào Để giải quyết khó khăn đó, đề tài “Thiết kế primer để nhận diện các dòng vi tảo thraustochytrid” đã được thực hiện nhằm giúp việc nhận diện nhanh các dòng vi tảo này ở Việt Nam trở nên dễ dàng hơn so với phương pháp truyền thống trước đây

1.2 Mục tiêu

Thiết kế được cặp mồi đặc hiệu nhận biết các dòng vi tảo thraustochytrid

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về vi tảo

2.1.1 Giới thiệu sơ lược về vi tảo

Vi tảo là tất cả những giống tảo có kích thước hiển vi Vi tảo chiếm khoảng 2/3

số lượng giống tảo trên thế giới

Theo Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Hoài Hà (2006), sinh vật được chủ yếu được chia ra thành 6 giới

- Giới Archezoa: gồm các Nguyên sinh chưa có ty thể, bao gồm Pelomyxa,

Giardia

- Giới Protozoa (Động vật nguyên sinh): bao gồm 14 ngành Nguyên sinh- trong

đó có Hypermastigotes, Euglenoides, Slime molds (Nấm nhầy), Choanoflagellates, Dinoglagellates, Ciliates, Apicomplexans, Rhizopods, Heliozoans, Foraminiferans, và Radiolarians

- Giới Chromista: gồm 10 ngành Nguyên sinh, trong đó có Tảo nâu (Phaeophyta)

và Tảo silic (Diatoms )

- Giới Fungi (Nấm): bao gồm nấm và 1 ngành Nguyên sinh sống hoại sinh là ngành Chytridiomycota

- Giới Plantae (Thực vật): bao gồm Thực vật và 5 ngành Nguyên sinh (nhiều Tảo

lục như Volvox, Ulva, Spirogyra và Tảo đỏ (Rhodophyta)

- Giới Animalia (Động vật)

2.1.2 Hệ thống phân loại vi tảo

2.1.2.1 Ngành tảo lông roi (Heterokontophyta)

Trước đây các đại diện của ngành này thuộc bộ Tảo vàng dạng monat của lớp Tảo vàng trong ngành Tảo vàng Nhưng do sự khác biệt về siêu cấu trúc và về thành phần sắc tố nên Hibberd và Leedale đã tách thành một lớp riêng có tên là Eustigmatophyceae (Hibberd và Leedale, 1971) Ở đây các lớp của ngành Tảo vàng theo Leedale đều nâng thành ngành, do vậy lớp này cũng nâng thành ngành Theo Gordon ngành này còn là ranh giới giữa Nấm và Tảo (Gordon và Giovannoni, 1996) Một khác biệt rõ rệt nhất của ngành này với các ngành trong hướng tiến hoá sắc tố vàng và có roi lệch là động bào tử có điểm mắt gồm các hạt nhỏ không đều nhau gắn ở đỉnh trước của động bào tử, sát với roi, nhưng không có màng tách biệt như điểm mắt

ở Tảo mắt Động bào tử giống amíp, luôn có một roi hướng về phía trước và có hai hàng lỏng Khác biệt về siêu cấu trúc của ngành này là thể golgi không có ở tế bào chuyển động Khác biệt nữa là sắc tố violaxanthin là một trong các sắc tố chính của ngành lại không có ở các ngành khác và chỉ có diệp lục a với b carotin chứ không có diệp lục b Tế bào dinh dưỡng khi già có thể có nhiều nhân và vài thể màu Động bào

tử trần và hơi có dạng amíp

Một số chi thường gặp: Thraustochytrium, Aplanochytrium, Japonochytrium,

Schizochytrium và Ulkenia (Hoàng Thị Lan Anh et al., 2010)

Trong đó một số loài trong hai chi Thraustochytrium, Schizochytrium được coi là

những đối tượng tiềm năng để sản xuất thực phẩm chức năng và thực phẩm bổ sung

Một số đại diện chính: Porphyridium, Rhodella (Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn

Hoài Hà, 2006)

2.1.2.3 Ngành tảo lục (Chlorophyta)

Tảo lục là ngành lớn và rất đa dạng, phân biệt với các ngành tảo khác ở chỗ luôn

có màu lục giống như ở thực vật (Lothar et al., 2004)

Tổ chức cơ thể: đơn bào, tập đoàn hay đa bào hình sợi đơn, phân nhánh hay hình

bản mỏng, có khi có cấu tạo cộng bào (tản hình ống thông trong chứa nhiều nhân)

(Lothar et al., 2012)

Một số đại diện thường gặp: Chlamydomonas, Chlorella, Chlorococcus,

Closterium, Volvox, Hydrodyction, Spirogyra (Tatyana et al., 2006)

2.1.2.4 Ngành tảo vàng ánh (Chrysophyceae)

Ngành này gồm nhiều loài có hình thái đa dạng (các hình amip, monad, hạt, tập đoàn palmella, sợi, bản, cây ) Dạng chuyển động thường có một hay hai lông roi (không đều nhau) Sắc tố trong tế bào là chlorophyl a và c, carotenoid và xantophin Màu tảo thay đổi từ vàng kim, vàng xanh hay nâu xanh Sản phẩm tạo thành không

phải là tinh bột mà là leucosin Một số không có thành tế bào Nhiều loài có thành tế bào và vỏ giáp Thành tế bào và vỏ giáp là cellulose và pectin, có thể có thấm hay không thấm silic Phần lớn phân bố chủ yếu ở các thủy vực nước ngọt chưa bị ô nhiễm

có mức dinh dưỡng trung bình hay nghèo, có khí hậu lạnh hay mát Phần lớn có đời sống tự dưỡng, phù du, một số loài dị dưỡng Ít gặp các loài sống trong đất ẩm hay ở đáy nước Sinh sản bằng cách phân chia tế bào, sinh sản vô tính bằng động bào tử Chỉ rất ít loài có sinh sản hữu tính đẳng giao Hợp tử hình thành thường có dạng túi, thành túi nhiễm silic vững chãi nên có thể giúp chúng vượt được qua các điều kiện bất lợi (Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Hoài Hà, 2006)

Nhiều loài tảo vàng ánh là thức ăn cho các động vật phù du Khi nước nhiều chất hữu cơ hay giàu đạm, tảo vàng ánh có thể gây ra hiện tượng “nước nở hoa” (algal bloom), gây mùi tanh thối (Lombardi và Vieira, 1998)

Một số chi thường gặp: Chrysostephanosphaera, Chromulina, Chrysidiastrum

catenatum… (Croome and Tyler, 1985)

2.1.2.5 Ngành tảo silic (Bacillariophyceae)

Tảo silic có cấu tạo đơn bào sống đơn độc hay thành tập đoàn dạng palmella, dạng sợi, dạng chuỗi, dạng zic-zắc, dạng dải, dạng sao, dạng ống, dạng cây Kích thước thay đổi từ vài mm đến 1 mm Tế bào có nhân lưỡng bội Đặc điểm của ngành tảo này là có thành tế bào gồm hai mảnh vỏ Lớp trong là pectin, lớp ngoài là oxid silic Hai mảnh vỏ như hai cái nắp của một cái hộp nhỏ lắp khít vào nhau, bên trong chứa tế bào chất Nhiều tảo silic có cấu trúc hoa văn trên mặt vỏ Hoa văn cấu tạo bởi các lỗ nhỏ hay các rãnh nhỏ Có khi có các khe hở Một số có khả năng di động nhờ

nội chất chuyển động trong các khe trên thành tế bào (Raschke, 1993)

Tảo silic có màu vàng lục hay vàng nâu Loại tảo silic trung tâm có sắc lạp hình hạt, hình đĩa nhỏ, gồm nhiều đĩa Loại tảo silic lông chim có sắc lạp lớn hình phiến chữ H hay hình sao, có 1-2 cái Một số ít có nhiều đĩa nhỏ Không có hạt pyrenoid, một số ít có hạt pyrenoid trần không có bao tinh bột Sản phẩm đồng hóa từ CO2 là lipid và chrysolaminaran, thường tụ lại thành các giọt chất dự trữ màu da cam Ngoài

ra còn có các giọt volutin màu xanh da trời Trong tế bào tảo silic còn thấy có ty thể,

bộ máy Golgi, các tấm thylakoid quang hợp, lục lạp (chloroplast)

Tảo silic có số loài nhiều thứ hai sau tảo lục Chúng phân bố rộng rãi: trên thân cây ở đỉnh núi cao, trên đất, đá ẩm, mọi thủy vực nước ngọt, nước lợ, nước mặn Có

thể gặp tảo silic ở cả đáy biển sâu tới hàng nghìn mét Trong nước thành phần tảo silic

là phong phú nhất ở độ sâu 5-30 m, nhưng sinh khối lại thường đạt mức cao nhất ở độ sâu 20-50 m Khi sống bám tảo silic tạo nên một lớp trơn màu nâu Trong các thủy vực nước ngọt tảo silic lông chim chiếm ưu thế về thành phần loài nhưng khi nồng độ muối tăng tỷ lệ tảo silic lông chim giảm so với tảo silic trung tâm Trong các thủy vực nước ngọt tảo silic là thành phần chính của năng suất sơ cấp Trong các biển và đại

dương tảo silic chiếm ưu thế cả về sinh khối lẫn thành phần loài (Prasad et al., 1990)

Một số chi thường gặp: Stephanodiscus astrea, Triceratium distinctum,

Chaetoceros muelleri, Biddulphia aurita, Attheya zachariasii, Melosira distans…

(Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Hoài Hà, 2006)

2.1.2.6 Ngành Tảo vàng lục (Xanthophyceae)

Tảo vàng lục thường gặp trong các thủy vực nước ngọt có độ dinh dưỡng trung bình hay nghèo Chúng có đời sống phù du hay sống bám Một số loài sống trên đất hay trên thân cây ẩm ướt (Marie và Larrance, 1976)

Tảo vàng lục không có chlorophyll b và sản phẩm đồng hóa CO2 là leucosin và lipid Tảo vàng lục không có sắc tố fucoxanthin Hình thái tảo vàng lục rất đa dạng: hình monad, hình amip, hình hạt Sống đơn độc hay thành tập đoàn Một số có dạng sợi đơn hay phân nhánh, dạng ống thông suốt chứa nhiều nhân Thành tế bào cấu tạo bởi cellulose Thành tế bào nguyên vẹn, trừ chi Tribonema thành tế bào gồm hai mảnh Sắc lạp có từ hai đến sáu trong mỗi tế bào, có hình khay Thành phần sắc tố gồm có chlorophyll a, c, carotenoid, xanthophyll Tản thường có màu vàng lục (Giuseppe và Gijsbert, 2005)

Một số chi phổ biến: Vaucheria, Tribonema, Botrydium,… (Paul et al., 1997)

2.1.2.7 Ngành Tảo nâu (Phaeophyta)

Tảo nâu sống ở biển và là thành phần chủ yếu ở đáy các đại dương (Sylvia, 1968)

Tản đa bào hình sợi hay hình bản, bám vào đá ở dưới nước nhờ rễ giả, hay sống trôi nổi nhờ các phao chứa khí Tản thường có kích thước lớn, có khi dài hàng chục đến hàng trăm mét (Robert, 1976)

Vách tế bào bằng cellulose, bên ngoài hóa nhày hoặc thấm chất pectin, các acid alginates Tế bào chứa một nhân và nhiều thể màu hình đĩa hay hình hạt Chất màu

ngoài diệp lục a và c còn có fucoxantin (màu nâu), carotin Tùy theo tỉ lệ chất màu mà màu của tản thay đổi từ màu vàng lục đến nâu (Paula và Oliveira, 1982)

Một số chi thường gặp: Laminaria, Sargassum, Padina… (Michael và Susan,

1976)

2.1.2.8 Ngành Tảo mắt (Euglenophyta)

Tảo mắt sống riêng rẽ, tế bào kiểu monad có một hay hai lông roi Thành tế bào chỉ là chất nguyên sinh đậm đặc lại do đó hình dạng có thể thay đổi Lông roi nằm ở đầu trước, xuất phát từ điểm gốc (nằm ở trong nguyên sinh chất hay trong không bào)

và đi qua một phần lõm dài gọi là họng Họng thông với một không bào dự trữ lớn, xung quanh thông với một số không bào co bóp (contractile vacuole) Không bào co bóp làm nhiệm vụ thải nước và các chất bài tiết, điều hòa áp suất thẩm thấu Điểm mắt (stigma, eye spot) màu đỏ làm nhiệm vụ cảm quang Nhân nằm ở phần sau của tế bào Lục lạp (chloroplast) hình khay hay hình phiến nằm rải rác hay tập trung, có khi xếp thành hình sao Sắc tố có chlorophyll a và b, còn có cả carotenoid Sản phẩm đồng hóa

CO2 là paramylon và lipid Thường thấy có cả ty thể và các hạt pyranoid Tảo mắt thường sinh sản bằng phương pháp phân đôi hay bằng cách tạo túi có thành dầy hay bao dầy Chưa phát hiện thấy sinh sản hữu tính ở tảo mắt

Tảo mắt chủ yếu phân bố ở các thủy vực nước ngọt, chúng ưa môi trường giàu dinh dưỡng, giàu chất hữu cơ Một ít loài sống được ở môi trường nước lợ có nồng độ muối dưới 0,5% Phần lớn tảo mắt có đời sống tự dưỡng nhưng cũng có loài dị dưỡng (không có sắc tố quang hợp) Các váng màu xanh, vàng, đỏ, nâu trong các ao tù thường là váng tảo mắt

Một số chi thường gặp: Euglena viridis, Euglena gracilis, Euglena polymorpha,

Menoidium tortuosum,… (Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Hoài Hà, 2006)

2.1.3 Vi tảo biển dị dưỡng thraustochytrid

Thraustochytrid là nhóm vi tảo biển dị dưỡng thuộc ngành Heterokonta (Ngành Tảo lông roi), giới Chromista Thraustochytrid thường được tìm thấy ở các hồ nước mặn cũng như ở vùng biển và vùng nước lợ ven biển, một số còn được tìm thấy ở các tầng đại dương (Schneider 1977, Moss 1986, Raghukumar et al 1990) Phương pháp

để nhận diện nhanh thraustochytrid là đếm trực tiếp tế bào bằng thuốc nhóm huỳnh quang acriflavine Thuốc nhuộm này giúp phân biệt giữa thraustochytrid với những

sinh vật đơn bào nhân thực khác Acriflavine nhuộm cả DNA và vách tế bào (làm từ polysaccharide sulfate) có màu đỏ và màu xanh lá cây dưới ánh sáng xanh tím, trong khi các vi sinh vật nhân thực khác chỉ thể hiện màu xanh lá cây (Naganuma et al., 1998) Thraustochytrium và Schizochytrium là hai chi điển hình của nhóm vi tảo này

Tế bào của chúng thường có hình cầu hay hình ovan, mạng lưới ngoại chất (ectoplasmic net) xuất phát phần lớn từ một quan bào độc nhất được gọi là sagenogenetosome trên bề mặt tế bào Mạng lưới ngoại chất đó chính là sự kéo dài

mở rộng của màng tế bào, và thường được xem là rễ giả (rhizoid) của nhóm vi tảo này (Bongiorni et al., 2005) Mạng lưới ngoại chất này có chứa các enzyme ngoại bào có khả năng phân hủy các chất hữu cơ để hấp thụ vào tế bào (Bremer, 1976; Coleman và Vestal, 1987) Sự hiện diện của mạng lưới ngoại chất với những enzyme phân hủy cho thấy được vai trò quan trọng trong việc phân giải các hợp chất, đặc biệt

là vách tế bào thực vật của nhóm vi tảo này trong hệ sinh thái (Bremer, 1995; Bremer

và Talbot, 1995; Valiela 1995)

Hơn thế nữa, thraustochytrid đóng góp giá trị dinh dưỡng cao trong lưới thức ăn Thraustochytrid có chứa hàm lượng cao các acid béo không no nhiều nối đôi như acid docosahexaenoic (DHA) và acid docosapentaenoic (Nakahara et al., 1996) Những hợp chất này không tự tổng hợp bởi các động vật, và cần được cung cấp bởi các sinh vật khác như thraustochytrid (Fell và Newell, 1998) Bằng nghiên cứu của mình, Aki et al (2003) đã cho thấy rằng thraustochytrid là một trong những nhóm vi tảo có khả năng sản xuất ra các sắc tổ carotenoid Trong nghiên cứu của Yamaoka et al (2004), chủng

vi tảo Thraustochytrium sp CHN-1 có thể sản xuất ra các đồng phân của sắc tố astaxanthin giúp chúng phản ứng với ánh sáng đèn LEDs màu xanh Trong quá trình tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy, Arafiles et al (2011) đã cho thấy chủng Thraustochytrium sp SB04 sản xuất chủ yếu các acid béo không bão hòa chuỗi ngắn với oleic acid (18:1) chiếm tới 71% acid béo tổng số Burja et al (2007) đã sử dụng phương pháp phản ứng chuyển hóa ester (transesterification) cho sự chiết xuất acid béo để chủng Thraustochytrium sp ONC-T18 có thể sản xuất ra trên 700 mg/g lipid với 165 mg/g DHA, ngoài ra còn có một số lipid khác như myristic, palmitic, palmitoleic và oleic acid Trước đó, chủng vi tảo này cũng được cho thấy đã sản xuất

ra các carotenoid và xanthophyll gồm astaxanthin, zeaxanthin, canthaxanthin, echinenone, và beta-carotene sau khi được phân lập bởi Burja et al (2006)

2.2 Sản xuất acid béo không no nhiều nối đôi từ vi tảo dị dưỡng thraustochytrid 2.2.1 Giới thiệu

Các acid béo không no nhiều nối đôi được chia làm 2 loại chính là omega 6 và omega 3 Trong nhóm omega 6, acid arachidonic [AA; 20:4 (n-6)] đặc biệt quan trọng

vì nó là tiền chất sinh tổng hợp của nhiều hợp chất thuộc protasglandins (acid béo không no ở các mô) và eicosanoids Acid eicosapentaenoic [EPA; 20:5 (n-3)] và acid docohexaenoic [DHA; 22:6 (n-3)] là 2 acid béo omega 3 được quan tâm nhiều trong thời gian gần đây và được coi như là những acid béo thiết yếu Nhóm omega 3 được biết đến với khả năng làm giảm nguy cơ mắc bệnh xơ vữa động mạch vành, đột quỵ,

và bệnh viêm khớp dạng thấp (Kinsella, 1987) Những bằng chứng về những lợi ích của acid béo không no omega 3 đối với sức khỏe của con người được nghiên cứu bởi Takahata et al (1998) DHA cần thiết cho sự phát triển của các mô thần kinh ở trẻ sơ sinh, đặc biệt là mắt và não Vai trò của những acid béo không no nhiều nối đôi này trong việc chống lại những chứng rối loạn khác (ví dụ như hen suyễn, chứng khó đọc, trầm cảm và một số loại ung thư) được khẳng định trong nhiều nghiên cứu trước đây (Simopoulos, 1989; Takahata et al., 1998)

Tầm quan trọng của việc cung cấp đầy đủ và thích hợp nhiều loại acid béo không

no nhiều nối đôi trong khẩu phần ăn của người và gia súc ngày càng được hiểu rõ, chính vì thế mà nhu cầu của những thành phần này trong chế độ ăn uống cũng tăng theo Hiện nay, dầu cá và một số dòng vi tảo là những nguồn cung cấp acid béo không

no nhiều nối đôi chủ yếu trong công nghiệp Mặc dù vậy, nguồn dầu cá có thể không

ổn định bởi sự biến động và suy giảm của một loại thủy sản Điều đáng quan tâm ở đây là sự thiếu hụt lượng dầu cá trong tương lai do nhu cầu về dầu omega 3 tăng cao trên thế giới (Tacon, 1995; Ward, 1995) Vi tảo quang dưỡng cũng được coi như là nguồn cung cấp các acid béo không no nhiều nối đôi trong sự phát triển của nghề thủy sản (Volkman et al., 1989), với những ứng dụng trong việc sản xuất dưỡng phẩm (bổ sung vào khẩu phần ăn)

So sánh với các loài sinh vật khác, việc tổng hợp omega 3 và omega 6 của thraustochytrid và những loài vi tảo dị dưỡng khác có khả năng cung cấp nhiều acid béo không no nhiều nối đôi dễ dàng hơn và ít tốn chi phí hơn Trong những năm gần đây, việc sử dụng vi sinh vật dị dưỡng như là nguồn acid béo không no nhiều nối đôi được quan tâm ngày càng nhiều (Ratledge, 1993) Vi sinh vật dị dưỡng không đòi hỏi

những yếu tố cần thiết trong nuôi cấy như sinh vật quang dưỡng (ví dụ ánh sáng, CO2)

và có tiềm năng thay thế nguồn cung cấp thương mại truyền thống acid béo không no nhiều nối đôi Acid arachidonic được sản xuất từ một số loài nấm (Sajbidor et al., 1990; Gandhi và Weete, 1991) Một số vi khuẩn được nghiên cứu có khả năng tạo ra EPA và DHA (Nichols et al., 1993; Jostensen và Landfald, 1997) Trong thủy sản, nhu cầu trong việc tìm ra nguồn cung cấp acid béo không no cho thức ăn của ấu trùng cũng như con trưởng thành đã dẫn đến việc coi những vi khuẩn có khả năng cung cấp acid béo không no như là một công cụ trong việc làm dồi dào luân trùng (Brachionus plicatilis, một loài được dùng để làm thực phẩm sống cho ấu trùng cá có vây) (Watanabe et al., 1992; Nichols et al., 1996; Lewis et al., 1998b)

2.2.2 Khả năng sản xuất acid béo không no bằng vi tảo thraustochytrid

Tầm quan trọng của DHA trong chế độ dinh dưỡng của con người cũng như động vật được chú ý rất nhiều trong suốt 1 thập kỉ qua (Simopoulos, 1989; Takahata et al., 1998) Điều này đã thúc đẩy những nghiên cứu về nguồn cung cấp thay thế hướng đến loại acid béo này Nhiều bài báo cáo lo ngại rằng việc sản xuất acid béo không no nhiều nối đôi bằng thraustochytrid chỉ có thể sản xuất được duy nhất DHA bởi vì đây

là acid béo không no nhiều nối đôi có hàm lượng cao nhất được sản xuất bởi những vi tảo thraustochytrid đã được nghiên cứu từ trước đến nay Mặc dù vậy, một số bằng chứng cho thấy một vài dòng thraustochytrid cũng có khả năng sản xuất những loại acid béo không no nhiều nối đôi khác Yokochi et al (1997) đề nghị dựa vào thành phần acid béo của những dòng thraustochytrid sản xuất DHA chia thraustochytrid ra thành 6 nhóm tách biệt là DPA (22:5 n-6)/DHA; EPA/DHA; EPA/DPA/DHA; AA/EPA/DHA; LA (18:2 n-6)/AA/DPA/DHA; và LA/AA/EPA/DHA Lewis et al (1998a) đã phân lập được một số dòng thraustochytrid với thành phần acid béo có sự khác biệt lớn, gồm 1 chủng (ACEM E) có khả năng sản xuất AA lên đến 30% tổng lượng acid béo (TFA) và không có acid béo không no nhiều nối đôi nào vượt quá 10% tổng lượng acid béo

Dựa vào sự đa dạng về thành phần acid béo không no nhiều nối đôi của thraustochytrid được nghiên cứu từ trước đến nay, một số loại acid béo không no hiếm khác cũng có thể được sản xuất từ nhóm vi tảo này

2.2.3 Thị trường cho acid béo không no nhiều nối đôi

Có những dự đoán cho rằng thị trường cho loại dầu từ thraustochytrid sẽ có tác động lớn nhất ở thị trường mà từ trước đến nay thuộc về loại dầu giàu acid béo không

no trích từ cá biển

Gần đây, thị trường tiềm năng trên thế giới cho sản phẩm dầu cá trải rộng từ những sản phẩm thô nhiều dầu cho thức ăn gia súc đến dầu thực phẩm chất lượng cao được sử dụng như là chất phụ gia và dưỡng phẩm, cũng như những loại dầu tinh sạch cao và ngay cả những loại acid béo dùng trong công nghiệp dược

Hiện tại, nguồn thương mại chủ yếu của dầu giàu acid béo không no nhiều nối đôi là dầu cá Sản lượng dầu cá toàn thế giới hàng năm duy trì ở khoảng 1,3 triệu tấn trong 10 năm qua, và dường như không có sự tăng lên (Tacon, 1997) Tổ chức bột cá

và dầu cá thế giới công bố rằng việc bổ sung dầu cá vào trong thức ăn thủy sản sẽ tăng lên từ 380.000 tấn năm 1994 đến 582.000 tấn năm 2001 và 1.133.000 tấn năm 2010 Điều này gây ra sự thiếu hụt nguồn cung cấp dầu cá dẫn đến nhu cầu cho nguồn thay thế dầu cá tăng cao

Dầu cá được thêm vào trong thức ăn thủy sản đóng vai trò như là nguồn dinh dưỡng cũng như nguồn acid béo không no nhiều nối đôi (New và Csavas, 1995) Những nghiên cứu đáng chú ý đang được thực hiện trên thế giới là một động lực để tìm kiếm nguồn thay thế thịt cá và dầu cá trong thức ăn thủy sản Mặc dù vậy, những nghiên cứu này bị tác động bởi yêu cầu dinh dưỡng bắt buộc của nhiều loại cá biển về acid béo không no nhiều nối đôi mạch dài (LCPUFA: ví dụ EPA và DHA) Những loại dầu động vật và thực vật rẻ với hàm lượng thấp các acid béo không no nhiều nối đôi mạch dài có thể sẽ được sử dụng rộng rãi như là nguồn thay thế trong một số loại thức

ăn thủy sản Nếu điều này diễn ra, nhu cầu dinh dưỡng của những loài thủy sản được nuôi trồng có thể đòi hỏi những nguồn khác Nhiều loài thủy sản nuôi trồng yêu cầu khoảng 1% đến 2% wt/wt LCPUFA (Rees et al., 1994; Salhi et al., 1994) Pike và Barlow (1999) đã đưa ra rằng ngành nuôi trồng thủy hải sản cá có vây sẽ cần khoảng 2

x 106 tấn thức ăn trong năm 2010 Số liệu này chỉ ra yêu cầu đầy tiềm năng đối với loài cá có vây này là khoảng ít nhất 20.000 tấn LCPUFA một năm

Ranh giới không rõ ràng bao quanh thị trường dưỡng phẩm gây khó khăn trong việc xác định quy mô của thị trường này Việc kinh doanh dầu có nguồn gốc hải sản đạt 55 triệu đô la tại Mỹ năm 1996 (Molyneaux và Chong, 1998), chiếm khoảng 20%

doanh thu từ các cửa hàng bán lẻ thực phẩm chức năng Ở Anh, dầu cá chiếm khoảng 29% (140 triệu đô la) trong tổng số doanh thu dưỡng phẩm hàng năm (Mukherjee, 1999) Phân tích nhận thức và kiến thức của khách hàng cho thấy tỉ lệ omega 3 đóng góp lớn vào nhận thức thị trường và thị trường tiềm năng

Thị trường sữa bột cho trẻ sơ sinh ở Tây Âu tăng lên từ 81.500 tấn năm 1988 lên đến 103.933 tấn năm 1994 Sự tăng lên này là nhờ vào việc bổ sung dầu giàu acid béo không no nhiều nối đôi vào trong sữa bột Hàm lượng bổ sung của dầu giàu acid béo không no được xác định để đạt được hàm lượng DHA trong sữa bột khoảng 0,1% đến 0,2% wt/wt Từ đó có thể suy ra được nhu cầu hàng năm cho thị trường sữa bột châu

Âu lên đến 100 đến 200 tấn DHA

Nhiều loại thực phẩm và nước giải khát đã được bổ sung DHA và một số acid béo không no nhiều nối đôi khác xuất hiện trên thị trường Mukherjee (1999) đã báo cáo về sự xuất hiện của những sản phẩm giàu acid béo không no như bánh mì, trứng

và nước ngọt ở Châu Âu và Nhật Bản Bánh mì được bổ sung dầu cá ngừ tinh sạch đã thành công trong việc thâm nhập vào thị trường thay thế ở Úc Nhờ vào nhận thức mới của cả khách hàng và nhà chức trách về tầm quan trọng của hàm lượng thích hợp các acid béo không no nhiều nối đôi trong chế độ dinh dưỡng, có thể nói rằng nhu cầu về sản phẩm giàu acid béo không no sẽ tăng cao

2.2.4 Tiềm năng của thraustochytrid

Việc nuôi cấy thraustochytrid với quy mô lớn có tiềm năng rất lớn Liệu các sản phẩm chiết xuất từ thraustochytrid có thể phù hợp với thị trường hay không sẽ được xác định bởi khả năng của chúng ta trong việc sản xuất, tinh sạch hoặc làm phong phú thêm các loại dầu để đáp ứng nhu cầu thị trường

Những ứng dụng khác từ dầu thraustochytrid đang được nghiên cứu sâu hơn

Monsanto đang sản xuất dầu chiết xuất từ Schizochytrium sp với công nghệ hợp tác

cùng OmegaTech Loại dầu này hiện đang được sử dụng làm thức ăn cho gà đẻ trứng công nghiệp để tạo ra trứng chứa nhiều DHA và đang được nghiên cứu thêm cho các ứng dụng khác trong ngành thực phẩm (Fitch Haumann, 1999)

Ratledge (1993) cho rằng nhu cầu tăng cao về việc PUFA tinh sạch (ví dụ như các loại dầu chỉ chứa EPA hoặc DHA) có thể trở thành động lực thúc đẩy bất kì loại dầu vi sinh thành công về mặt thương mại Dầu chiết xuất từ cá và vi tảo thường có thành phẩn acid béo phức tạp và khó có thể chiết tách các acid béo với độ tinh sạch

cao (>98%) Trái ngược với đó, dầu sản xuất từ một số loài thraustochytrid có thành

phần acid béo tương đối đơn giản (ví dụ như Schizochytrium limacinum; Yokochi et

al., 1998) và có thể thuận lợi hơn trong việc tinh sạch tiết kiệm kinh phí

Thraustochytrid rõ ràng là một đối tượng mới và đầy tiềm năng Những bước quan trọng sau đây cần được thảo luận (Lewis et al., 1999):

Đầu tiên là việc thu thập, chọn lọc và duy trì các dòng có khả năng sản xuất PUFA Rất nhiều dòng có tiềm năng trong việc sản xuất thương mai dầu chứa nhiều DHA đã được phân lập Tuy nhiên, nếu thraustochytrid được phân lập và tối ưu hóa để cho năng xuất cao hơn, thành phần PUFA hấp dẫn hơn hoặc ít phổ biến nhưng lại là loại PUFA đang cần thì nhu cầu cho những dòng đã phân lập và các hợp chất này này

có thể sẽ tăng lên

Thứ hai, hiệu quả sản xuất PUFA phải được tối ưu hóa Các loại và số lượng PUFA được sản xuất bởi các chủng cá nhân của thraustochytrid dễ dàng được điều chỉnh bằng việc thay đổi điều kiện nuôi cấy Nâng cao thành phần PUFA bằng việc sử dụng kỹ thuật phân tử cũng có thể được cân nhắc Những thị trường khác nhau sẽ có nhu cầu về các chủng sản xuất ở mức cao PUFA tính cả về mặt sinh khối (ví dụ như khối lượng PUFA sản xuất được/khối lượng sinh khối) hoặc thể tích (ví dụ như khối lượng PUFA sản xuất được/thể tích môi trường lên men)

Thứ ba, điều kiện thích hợp cho việc lưu trữ lâu dài các tế bào vi sinh vật và sản phẩm của chúng cần phải được xác định Hình thức và mức độ ổn định sinh khối của thraustochytrid và của các loại dầu sẽ là yếu tố chính trong việc xác định sự phù hợp của các sản phẩm trong việc sử dụng làm phụ gia thực phẩm

Cuối cùng, việc tách chiết dầu và công nghệ tinh sạch phải được phát triển để đáp ứng nhu cầu thị trường về mặt tiết kiệm kinh tế và vận chuyển PUFA an toàn đến người tiêu dùng Điểm mấu chốt cho tương lai trong ngành công nghệ sinh học của các loại dầu thraustochytrid sẽ là khả năng cạnh tranh của chúng so với các loại dầu giàu PUFA khác Các ví dụ nêu trên chỉ ra rằng việc nuôi cấy thraustochytrid với quy mô lớn cho mục đích thương mại là, hoặc sẽ sớm khả thi về mặt kinh tế Tuy nhiên, sự thành công về mặt thương mại của các sản phẩm dầu với giá trị tăng thêm mà thị trường sẵn sàng trả tiền vẫn chưa được chứng minh

2.3 Giới thiệu kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

2.3.1 Sơ lược về kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR là một kỹ thuật hiện đại mang tính cách mạng do Kary Mullis phát triển năm 1983 Dựa vào đặc tính của enzyme DNA polymerase, kỹ thuật PCR được dùng để tổng hợp một mạch DNA mới bổ sung dựa trên mạch khuôn có sẵn Trong phản ứng PCR cần có đoạn mồi (primer) cung cấp đầu 3’-OH tự do để thêm nucleotide đầu tiên vào, vì DNA polymerase chỉ có thể gắn nucleotide vào đầu 3’-OH có sẵn Chính đặc điểm này giúp các nhà khoa học dễ dàng hơn trong việc nhân số lượng trình

tự đặc biệt cần thiết Kết thúc phản ứng PCR, hàng triệu bản sao chép của trình tự mong muốn được tạo thành

Taq DNA polymerase (từ Thermus aquaticus), trong khi đó Pfu DNA polymerase

(trích từ Pyrococcus furiosus) thì được dùng rộng rãi bởi tính chính xác cao trong việc

sao chép DNA Mặc dù 2 enzyme này có sự khác biệt, nhưng cả hai đều thích hợp cho phản ứng PCR bởi: 1) chúng có khả năng tạo thành mạch DNA mới dựa trên mạch khuôn DNA và các đoạn mồi (primer), 2) chúng có khả năng chịu nhiệt tốt Thành phần khác cũng khá quan trọng là các đoạn mồi (primer) Chúng là những đoạn nhỏ DNA mạch đơn, có trình tự bổ sung đối với trình tự mục tiêu Enzyme DNA polymerase bắt đầu tổng hợp mạch DNA mới tại điểm cuối của đoạn mồi, nơi có đầu 3’-OH tự do Bên cạnh các thành phần trên, các nucleotide tự do (dNTP hay deoxynucleotide triphosphate) cũng được cung cấp, gồm các loại A,T, G và C cần thiết cho việc tổng hợp mạch DNA mới Dung dịch đệm (Buffer) cung cấp môi trường hóa

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechPCR, ngày 14/10/2013)

2.3.2 Các giai đoạn của một phản ứng PCR

Hình 2 Các giai đoạn của phản ứng PCR

(Nguồn: Vierstraete, A 1999)

Giai đoạn khởi đầu: làm nóng nhiệt độ khoảng 94-96°C, và giữ từ 1 đến 9 phút

Giai đoạn này chỉ dành cho DNA polymerase cần nhiệt hoạt hóa

Giai đoạn biến tính: Đây là giai đoạn đầu tiên trong chu trình, gia nhiệt từ

94-980C trong 20 đến 30 giây Chính nhiệt độ cao tạo nên sự thay đổi trong mạch khuôn DNA bằng cách bẻ gãy liên kết Hydro giữa các base bổ sung Kết quả của giai đoạn này là tạo thành các phân tử DNA mạch đơn

Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ giảm xuống còn 50-65°C trong 20 đến 40 giây cho

phép các đoạn mồi gắn vào DNA mạch đơn được dùng làm khuôn mẫu Nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn Tm của đoạn mồi được dùng từ 3 đến 5°C Liên kết hydro DNA-DNA chỉ tạo thành khi trình tự đoạn mồi rất trùng khớp với trình tự mạch khuôn Sau

đó, enzyme DNA polymerase bám vào và bắt đầu hình thành DNA mới

Giai đoạn kéo dài: Đây là giai đoạn cuối cùng của một chu trình PCR, nhiệt độ

giai đoạn này phụ thuộc vào loại enzyme DNA polymerase được dùng Đối với Taq polymerase thì nhiệt độ tối ưu nhất là khoảng 75 đến 80°C, và nhiệt độ thường dùng là 72°C Ở giai đoạn này, DNA polymerase tổng hợp mạch DNA mới bổ sung với mạch khuôn bằng cách thêm các dNTPs vào mạch khuôn từ đầu 5’ đến 3’ Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào loại enzyme được dùng cũng như chiều dài mạch khuôn cần nhân lên

Giai đoạn kéo dài cuối cùng: giai đoạn này diễn ra ở 70 đến 74°C trong 5 đến

15 phút sau chu trình cuối cùng của PCR để đảm bảo rằng các mạch đơn DNA đều được kéo dài

Giai đoạn trữ: nhiệt độ từ 4 đến 15°C để trữ trong thời gian ngắn (Shafique,

2012)

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất của một phản ứng PCR Dưới đây là một số yếu tố chủ yếu ảnh hưởng đến phản ứng PCR:

- Điều kiện sạch sẽ của phòng thí nghiệm

Việc đảm bảo điều kiện phòng thí nghiệm sạch sẽ là rất quan trọng vì phản ứng PCR có thể phát hiện được những phân từ DNA mạch đơn Trong khi thao tác nên sử dụng gang tay sạch, phải đảm bảo các ống tube, pipet và các dung dịch đã được khử

trùng Nhiều người thường chuẩn bị riêng cho mình những dụng cụ cần thiết cho phản ứng PCR để tránh dùng chung (Phillip, n.d.)

- DNA khuôn mẫu và các đoạn mồi

Một việc vô cùng quan trọng nhằm đảm bảo hiệu suất của phản ứng PCR là phải đảm bảo DNA khuôn mẫu và đoạn mồi phải tinh sạch và không bị đứt gãy Tỉ lệ các thành phần trong hỗn hợp PCR cũng rất quan trọng đến hiệu suất phản ứng Nồng độ tối ưu của đoạn mồi thường trong khoảng từ 0,1 đến 0,6 µmol/l Tỉ lệ DNA khuôn mẫu

đa dạng tùy vào loại DNA được dùng Trong những trường hợp chỉ có 1 lượng nhỏ DNA, có thể tăng số lượng chu kỳ để có lượng sản phẩm nhiều hơn Luôn luôn kiểm tra các đoạn mồi mới bằng phản ứng đối chứng dương để đảm bảo các đoạn mồi đáp ứng yêu cầu dưới điều kiện thí nghiệm mới (Phillip, n.d.)

- Hoạt tính của enzyme

Việc lựa chọn enzyme cũng ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng Các loại taq enzyme cũ thường được các phòng thí nghiệm thay thế bằng những loại enzyme mới

có hoạt tính cao hơn Nồng độ MgCl2 cũng ảnh hưởng đến kết quả PCR Ion Mg2+ tạo phức với dNTPs nhằm giúp cho enzyme polymerase có thể nhận biết được Tỉ lệ cân bằng giữa 4 loại dNTPs cũng sẽ làm giảm sự sai sót của enzyme polymerase trong quá trình phản ứng Bên cạnh đó, các thành phần phụ khác như betaine, BSA, DMSO,… cũng ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme và hiệu suất phản ứng (Phillip, n.d.)

- Loại máy điều nhiệt phản ứng PCR

Một vài loại máy có thể kém chính xác hơn trong việc giữ cho nhiệt độ chính xác như mong muốn Các ống tube PCR có vỏ mỏng được thiết kế để vừa khít với các khe trong máy điều nhiệt PCR cũng giúp tối ưu hóa nhiệt độ phản ứng (Phillip, n.d.)

- Thiết lập chu kỳ phản ứng

Thời gian, nhiệt độ, và số chu kỳ đóng vai trò quyết định trong việc đảm bào phản ứng PCR thực hiện tốt Giai đoạn nhiệt độ đầu tiên phải đủ lâu để DNA biến tính hoàn toàn và chu kỳ đủ lâu để ngăn chăn các DNA tự hồi tính (Phillip, n.d.)

2.4 Kỹ thuật điện di trên gel agarose

2.4.1 Nguyên lý

Điện di là một kỹ thuật được sử dụng để tách biệt và đôi khi để tinh sạch các đại phân tử (đặc biệt là protein và acid nucleic) khác nhau về kích thước, điện tích hoặc

cấu trúc Chính vì thế, nó là một trong những kỹ thuật được sử dụng rộng rãi trong sinh hóa và sinh học phân tử Khi các phân tử mang điện được đặt vào điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực âm hoặc cực dương tùy thuộc vào điện tích của chúng Khác với protein, cái mà có thể mang lưới điện tích âm hoặc lưới điện tích dương, acid nucleic chỉ mang điện tích âm do các gốc phosphate, và vì thế chúng hướng về phía cực dương (Colorado State University n.d.)

Protein và acid nucleic được điện di trong dung dịch hoặc là trong gel Thông thường, gel được sử dụng thành một miếng dày, với nhiều giếng để chứa mẫu Gel sau khi đã được bỏ mẫu vào sẽ được ngâm trong dung dịch đệm điện di để cung cấp các ion tạo dòng điện và một số loại dung dịch đệm có thể được dùng để duy trì pH ở giá trị thích hợp

Hai loại gel thường được sử dụng là gel agarose và gel polyacrylamide

Agarose là một loại đường đa được chiết từ tảo biển Nó thường được dùng với nồng độ từ 0,5 đến 2% Nồng độ agarose cao giúp cho gel cứng hơn Gel agarose dễ sử dụng, chỉ cần pha bột agarose với dung dịch đệm, nấu chảy và đổ vào khuôn Nó cũng không gây độc hại cho cơ thể Gel agarose có vùng phân tích rộng, nhưng lại có mức

độ phân tích thấp Bằng cách thay đổi các nồng độ agarose, chúng ta có thể tách được các đoạn DNA từ 200 đến 50.000 cặp nucleotide bằng kỹ thuật điện di chuẩn (Colorado State University n.d.)

Polyacrylamide là những polymer của acrylamide liên kết với nhau Chiều dài của mạch polymer phù thuộc vào nồng độ acrylamide đã dùng, thường trong khoảng 3,5 đến 20% Gel polyacrylamide rất khó để chuẩn bị so với gel agarose Chúng phải được đổ trong đĩa thủy tinh vì khí oxi trong không khí có thể ức chế quá trình polymer hóa Acrylamide là chất gây hại cho thần kinh nên cần phải được sử dụng cẩn thận Nên sử dụng găng tay một lần khi thao tác với dung dịch acrylamide, và sử dụng khẩu trang khi cân bột Polyacrylamide không độc, nhưng khi đổ gel polyacrylamide nên sử dụng găng tay vì có thể có những phân tử acrylamide tự do Gel polyacrylamide có vùng phân tích nhỏ, nhưng lại có khả năng phân tích cao Đối với DNA, polyacrylamide được sử dụng để phân tích những đoạn DNA có kích thước nhỏ hơn

500 cặp nucleotide Khác với agarose, polyacrylamide thường được dùng để phân tích hỗn hợp protein (Colorado State University n.d.)

2.4.2 Các thiết bị và thành phần cần thiết cho điện di

- Bể điện di và nguồn điện

- Khuôn đổ gel: có kích thước đa dạng và có một miếng nhựa cho phép UV truyền qua

- Thanh lược: được sử dụng trong lúc đổ gel để tạo ra các giếng

- Dung dịch điện di: Tris-acetate-EDTA (TAE) hoặc Tris-borate-EDTA (TBE)

- Dung dịch đệm load mẫu: có thành phần đặc (ví dụ như glycerol) giúp mẫu được giữ ở đáy giếng, và một hay hai loại thuốc nhuộm di chuyển được trong gel cho phép quan sát được bằng mắt thường để xác định thời điểm thích hợp để kết thúc điện

2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến điện di

- Nồng độ agarose: Những nồng độ agarose khác nhau giúp phân tích những đoạn DNA với các kích thước khác nhau Nồng độ cao hỗ trợ phân tích những đoạn nhỏ, trong khi những đoạn DNA lớn cần dùng nồng độ thấp

Bảng 1 Các thông số điện di DNA bằng gel agarose

Hàm lượng agarose (%) trong gel Kích thước DNA mạch thằng (kb) sử dụng có

được sử dụng thường không quá 5V/cm đối với gel (cm là giá trị khoảng cách giữa 2 điện cực, không phải chiều dài gel) (Colorado State University n.d.)

- Dung dịch điện di: đối với điện di DNA, 2 loại thường được sử dụng là TAE và TBE Vận tốc di chuyển của DNA sẽ khác nhau đối với từng loại dung dịch bởi sự khác biệt về thành phần ion Dung dịch điện di không những ổn định pH mà còn cung cấp ion giúp hỗ trợ tính dẫn điện (Colorado State University n.d.)

- Ethidium Bromide: thường được dùng để nhuộm DNA giúp quan sát DNA dễ dàng hơn dưới tia UV °C

2.5 Thiết kế mồi

2.5.1 Những điều cần chú ý trong thiết kế mồi

- Chiều dài đoạn mồi: độ dài tối ưu của một đoạn mồi PCR là 18 – 22 nu Độ dài này đủ dài để đoạn mồi có tính chuyên biệt cao, đủ ngắn để mồi có thể bám vào khuôn mẫu DNA một cách dễ dàng ở nhiệt độ hồi tính

- Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm): là nhiệt độ mà tại đó một nửa DNA mạch kép bị biến tính và tách ra thành 2 mạch đơn Đoạn mồi với nhiệt độ từ 52 – 58°C là tối ưu Nếu nhiệt độ nóng chảy quá cao trên 65C thì mồi sẽ có xu hướng hồi tính thứ cấp Phần trăm GC của trình tự mồi quyết định Tm của đoạn mồi Nhiệt độ nóng chảy của cả 2 mồi xuôi và ngược không được chênh lệch quá 5°C

- Nhiệt độ hồi tính (Ta): nhiệt độ nóng chảy quyết định đến tính ổn định của mạch ghép DNA-DNA và cũng là cơ sở để xác định nhiệt độ hồi tính Nếu nhiệt độ hồi tính quá cao sẽ làm giảm hiệu suất của sản phẩm khuôn DNA-đoạn mồi Nếu nhiệt

độ quá thấp thì sản phẩm sẽ không chuyên biệt gây ra bởi hiện tượng bắt cặp sai

Công thức tính nhiệt độ hồi tính:

Ta = 0,3 x Tm(mồi) + 0,7 Tm (sản phẩm) – 14,9

- Phần trăm GC: phần trăm GC thường trong khoảng 40-60%

- Dấu GC: sự có mặt của G và C ở vị trí 5 nucleotide cuối đầu 3’ của mồi giúp hỗ trợ cho việc bám dính chuyên biệt ở đầu 3’ do liên kết mạnh của G và C Nên tránh nhiều hơn 3 nucleotide G hoặc C ở 5 vị trí cuối ở đầu 3’ của mồi

- Cấu trúc bậc 2 của mồi: sự xuất hiện của cấu trúc bậc 2 do các tương tác nội và ngoại phân tử có thể dẫn đễn hiệu suất PCR giảm Chúng ảnh hưởng đến việc gắn mồi vào khuôn mẫu và vì vậy cản trở việc khuyếch đại DNA

+ Cấu trúc hairpin: Được tạo thành bằng tương tác nội phân tử trong đoạn mồi

+ Tự bắt cặp 2 đoạn mồi (Seft Dimer): được tạo thành bằng tương tác ngoại phân

tử giữa 2 đoạn mồi ở vị trí tương đồng của 2 đoạn mồi cùng loại Thực tế, lượng mồi dùng trong PCR nhiều hơn so với lượng DNA

+ Bắt cặp chéo (Cross Dimer): tạo thành bởi tương tác ngoại phân tử của 2 đoạn mồi khác loại

- Lặp đoạn: đoạn lặp là 1 bộ gồm 2 nucleotide xuất hiện nhiều lần trong trình tự, nên tránh các đoạn lặp trong trình tự của đoạn mồi Ví dụ: ATATATAT… Số lần lặp tối đa có thể chấp nhận được là 2 lần lặp

- Lặp nucleotide: các đoạn mồi với một đoạn dài chỉ chứa một nucleotide nên bị hạn chế vì nó sẽ dẫn đến sự bắt cặp sai của đoạn mồi Tối đa chỉ khoảng 4 nucleotide

/PCR_Primer_Design_Guidelines.htm, ngày 14/06/2014)

2.5.2 Các phần mềm thiết kế mồi

Có nhiều công cụ hỗ trợ cho việc thiết kế đoạn mồi cho phản ứng PCR Những công cụ này giúp giảm chi phí và thời gian thí nghiệm Chẳng hạn như Primer Premier tuân thủ tất cả các tiêu chuẩn thích hợp cho việc thiết kế mồi của phản ứng PCR Những phần mềm như AlleleID và Beacon Designer cũng có thể thiết kế các đoạn mồi

và những đoạn dò cho những khảo nghiệm phức tạp PrimerPlex là một phần mềm dùng để thiết kế mồi ASPE (http://www.premierbiosoft.com/tech_notes /PCR_Primer_Design.html, ngày 14/06/2014) Ngoài ra còn có những trang web cung cấp những công cụ thiết kế mồi trực tuyến như NCBI

2.5.2.1 Primer Premier

Primer Premier là một phần mềm toàn diện trong thiết kế và phân tích mồi PCR Thuật toán tìm kiếm của phần mềm này có thể tìm thấy đoạn mồi thích hợp với nhiệt

độ nóng chảy rất chính xác bằng cách sử dụng thuật toán nhiệt động học lân cận gần nhất Đoạn mồi có thể được kiểm tra về những tính chất như cấu trúc bậc 2, cấu trúc dimer, cấu trúc hairpin, tính tương đồng và tính chất vật lý trước khi cho ra kết quả thích hợp nhất Ngoài ra, phần mềm này có thể được sử dụng để thiết kế mồi cho xác

(http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/index.html, ngày 14/06/2014)

2.5.2.2 Beacon Designer

Phần mềm này có thể dùng để thiết kế mồi cho real time PCR và các mẫu dò Nó được sử dụng rộng rãi trên thế giới bởi các nhà sinh học phân tử để thiết kế mồi cho khảo nghiệm real time PCR Đây là một giải pháp linh hoạt cho thiết kế mồi real time

và mẫu dò (http://www.premierbiosoft.com/molecular_beacons/index.html ngày 14/06/2014 )

2.5.2.3 PrimerPlex

PrimerPlex là một công cụ hiệu quả và tinh vi để thiết kế các đoạn mồi cho khảo nghiệm multiplex Khảo nghiệm multiplex hỗ trợ cho việc nhân lên của một số lượng lớn đối tượng trong 1 phản ứng, tiết kiệm thời gian và chi phí thí nghiệm

PrimerPlex thiết kế các đoạn oligo cho khảo nghiệm multiplex PCR Phần mềm này còn có thể thiết kế các mẫu dò chuyên biệt cho khảo nghiệm lai trực tiếp và mồi cho khảo nghiệm ASPE (http://www.premierbiosoft.com/primerplex/index.html ngày 14/06/2014)

2.5.2.4 DNAClub

So với các phần mềm khác, DNACLub tiện lợi hơn vì nó rất dễ cài đặt, dễ sử dụng và thao tác trên chương trình với những cấu trúc lệnh khá đơn giản Theo Trần Nhân Dũng và Nguyễn Vũ Linh (2011), DNACLub là phần mềm cơ bản nhất trong việc lựa chọn và thiết kế mồi cho phản ứng PCR

Tính năng: loại bỏ trình tự vector, tìm kiếm khung đọc mở, chỉnh sửa trình tự DNA, giải mã thành trình tự protein, bản đồ enzyme, cắt giới hạn, chọn lựa primer,

đánh giá primer (http://sinhhoc.blogspot.com/2011/10/phan-mem-dnaclub.html,

ngày 15/06/2014)

2.5.2.5 FastPCR

Theo Trần Nhân Dũng và Nguyễn Vũ Linh (2011), FastPCR là chương trình thiết

kế mồi được cung cấp miễn phí với các tính năng thiết kế mồi cho PCR, PCR ngược, Real-Time PCR, PCR phức, PCR suy biến… Bên cạnh đó còn có tính năng sắp xếp trình tự chuỗi, phân tích nhóm hay tìm kiếm những trình tự lặp

2.5.2.6 Primer3

Primer3 là chương trình được sử dụng phổ biến để thiết kế mồi (primer) cho phản ứng PCR Đây là chương trình mã nguồn mở, do Steve Rozen và Helen Skaletsky phát triển tại Whitehead Institute và Howard Hughes Medical Institute, USA Primer3 cũng có thể dùng để thiết kế các mẫu dò (probe) và các primer cho giải trình tự Vì PCR được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau nên Primer3 có nhiều các thông số

mà bạn có thể điều chỉnh để tạo ra những primer tốt nhất cho mục đích của bạn (http://sinhhoc.blogspot.com/2012/07/huong-dan-su-dung-primer3-e-thiet-ke.html,

ngày 15/06/2014)

2.6 Xây dựng cây phả hệ bằng phần mềm MEGA 6.0

Phân tích phả hệ là một bộ môn nghiên cứu về mối quan hệ:

- Phương pháp phân tích dựa trên độ dài di truyền (Distance-based Method)

+ Phương pháp này dựa trên mức độ khác nhau về độ dài giữa 2 trình tự được sắp xếp để xây dựng cây phả hệ Phương pháp dựa trên độ dài có thể xây dựng được cây phả hệ thật sự nếu tất cả những phân ly di truyền đều được ghi nhận chính xác trong trình tự

+ Phương pháp UPGMA: thích hợp đối với những loài có họ hàng rất gần

+ Phương pháp Neighbor-joining (NJ): nhanh, thích hợp khi sử dụng nguồn dữ liệu lớn (Hall, 2008)

- Phương pháp phân tích Character-base method

+ Phương pháp này cho phép đánh giá mức độ tin cậy ở từng base bằng sự sắp xếp (alignment) ở mức độ cơ bản của tất cả các vị trí base Có nhiều phương pháp ví

dụ như: Maximum Parsimony (MP), Maximum Likelihood (ML)

+ Maximum Parsimony (MP): gặp vấn đề khi nhánh dài

+ Maximum Likelihood (ML): thống kế hiệu quả nhưng tốc độ chậm khi dữ liệu quá lớn

+ Bayesian Inference (BI): nhanh hơn, trước khi phân bố thước đo phải được chuyên hóa (Hall, 2008)

độ tin cậy cao

Dữ liệu lớn với

độ tin cậy cao

(Nguồn: Hall, 2013)

- Thiết lập độ tin cậy (bootstrap): số lần bootstrap thường trong khoảng

100-2000, số càng lớn độ tin cậy càng cao Chỉ số bootstrap chỉ cho thấy độ tin cậy của từng node trong cây phả hệ chứ không nêu lên độ tin cậy của tất cả các taxon của cây Chỉ số bootstrap >70% được xem xét là đáng tin cậy (Hall, 2013)

2.7 Các nghiên cứu trước đây về các dòng vi tảo Thraustochytrid

Honda et al (1999) đã có những nghiên cứu về trình tự 18S rDNA của một số nhóm thuộc thraustochytrid và đã xây dựng thành công hệ thống cây phát sinh loài Những kết quả đạt được đã thúc đẩy các nghiên cứu sâu hơn về vi tảo thraustochytrid, cũng như mang lại kiến thức nền cho những nghiên cứu về phân lập thraustochytrid bằng dấu phân tử 18S rDNA

Trong thí nghiệm của Mo et al (2002), ba bộ mồi được thiết kế trên vùng 18S rDNA để phân loại những chủng thraustochytrid Với 26 dòng vi tảo phân lập được kiểm tra bằng phương pháp PCR, bài nghiên cứu cho thấy rằng không phải tất cả đều giống nhau về các band PCR, chứng tỏ sự đa dạng trong nhóm vi tảo này Từ đó, Mo đưa ra kết luận rằng dựa vào kỹ thuật PCR trong phân loại vi tảo dựa trên vùng 18S rDNA là một cung cấp hữu hiệu trong việc nghiên cứu vi tảo thraustochytrid

Cavalier-Smith et al (1994) đã cho thấy rằng trình tự 18S rDNA của những dòng

vi tảo có sự khác biệt so với những loài sinh vật nhân thực khác ở chuỗi xoắn 47 trong vùng V9

Theo nghiên cứu của Yang et al (2009) trên các dòng vi tảo ở Đài Loan, những loài vi tảo dị dưỡng có khả năng cung cấp DHA như thraustochytrid có thể được phân

lập, nuôi cấy và phân loại dựa trên vùng trình tự 18S rDNA và những đặc trưng hình thái học Kết quả đạt được là đã phân lập được 25 chủng vi tảo dụ dưỡng ở vùng biển Đài Loan Những chủng này có họ hàng thân thiết với nhau và với họ Thraustochytriaceae dựa trên nghiên cứu trong vùng 18S rDNA

Trong nghiên cứu của Lê Bích Tuyền (2013), 13 dòng vi tảo đã được phân lập từ các mẫu lá đước và bần ở ven biển các tình Cà Mau, Kiên Giang, Trà Vinh Dựa vào các kiểm tra đặc tính trên khuẩn lạc, hình dạng tế bào và khảo sát PCR với mồi chuyên biệt trên vùng 18S rDNA đã xác định các dòng vi tảo này thuộc thraustochytrid Nghiên cứu tiếp theo dựa trên giải trình tự cũng cho thấy rằng dòng D5 (dòng có sản

lượng carotenoid cao nhất) có sự đồng hình 96% đối với trình tự của Thraustochytrium

aurantiochytrium sp B072 Từ đó, cho thấy rằng những giống vi tảo thraustochytrid ở

vùng biển Việt Nam có họ hàng thân thuộc với những giống vi tảo đã được nghiên cứu trên thế giới

Dương Tấn Phát (2013) đã phân lập được 9 dòng vi tảo dị dưỡng dựa trên các mẫu lá thu về từ rừng ngập mặn ở tỉnh Cà Mau Bên cạnh sự nhận diện sơ bộ bằng hình thái, nghiên cứu còn sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử PCR để nhận diện những dòng vi tảo được phân lập bằng cặp mồi chung được thiết kế cho trình tự gen mã hóa 18S rDNA của một số loài thuộc thraustochytrid Dương Tấn Phát (2013) đã kết luận rằng tất cả những dòng vi tảo được phân lập đều có thể thuộc về những loài mục tiêu này