ứng dụng phương pháp arisa (automated ribosomal intergenic spacer analysis) trong phân tích sự biến động và đa dạng của cộng đồng vi khuẩn sống tự do ở vịnh tachibana theo thời gian

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ARISA AUTOMATED

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ARISA (AUTOMATED RIBOSOMAL INTERGENIC SPACER ANALYSIS) TRONG PHÂN TÍCH SỰ BIẾN ĐỘNG VÀ ĐA DẠNG CỦA CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN SỐNG TỰ DO Ở VỊNH

TACHIBANA THEO THỜI GIAN

PGS.TS NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG NGUYỄN THI ̣ ĐỖ QUYÊN PGS TS WADA MINORU MSSV: 3092435

LỚP: CNSH TT K35

Cần Thơ, 09/2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ARISA (AUTOMATED RIBOSOMAL INTERGENIC SPACER ANALYSIS) TRONG PHÂN TÍCH SỰ BIẾN ĐỘNG VÀ ĐA DẠNG CỦA CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN SỐNG TỰ DO Ở VỊNH

TACHIBANA THEO THỜI GIAN

PGS.TS NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG NGUYỄN THI ̣ ĐỖ QUYÊN

LỚP: CNSH TT K35

Cần Thơ, 09/2014

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

PGS.TS NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG Nguyễn Thị Đỗ Quyên DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………

………

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM TẠ

Luận văn tốt nghiệp đại học là cột mốc đánh dấu sự phát triển về mặt kiến thức

và kỹ năng của sinh viên Để hoàn thành tốt, sinh viên cần phải vận dụng tất cả các kiến thức và hiểu biết mình tích lũy được trong suốt quá trình học tập Chính vì vậy, tôi vô cùng trân trọng những kiến thức đã tiếp thu được trong 4 năm học tại Viện NC

và PT Công nghệ Sinh học-Trường Đại học Cần Thơ cũng như một năm học tập tại trường Nagasaki, Nhật Bản Tôi xin gửi những lời cảm ơn chân thành nhất đến với:

Cha mẹ, những người đã dìu dắt và định hướng tôi đến với con đường nghiên cứu khoa học vô cùng bổ ích này

Thầy, Cô đã giảng dạy và tạo lập nền tảng kiến thức vững chắc cho tôi trong suốt 4 năm đại học

Cô Ngô Thị Phương Dung và thầy Wada Minoru (Khoa Thủy Sản, Đại học Nagasaki, Nhật Bản) là cán bộ hướng dẫn thực hiện luận văn của tôi Cô và thầy không chỉ giảng dạy về lý thuyết mà còn truyền vốn kinh nghiệm thực hành vô cùng quý báu cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Thầy Huỳnh Xuân Phong là cố vấn học tập của lớp tôi đã quan tâm và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập

Cuối cùng, xin cảm ơn tất cả các bạn cùng làm việc trong phòng thí nghiệm Thực Phẩm cũng như các bạn làm việc trong Khoa Thủy Sản, Đại học Nagasaki, Nhật Bản đã không ngại khó khăn và luôn giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Cần Thơ, ngày 12 tháng 08 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thi ̣ Đỗ Quyên

TÓM LƢỢC

Sự tương tác phức tạp của các yếu tố không gian và thời gian gây tác động mạnh mẽ đến cấu trúc và chức năng của quần xã vi khuẩn sống tự do trong môi trường biển Luận văn này đã đề cập trực tiếp đến sự biến động của cộng đồng vi khuẩn sống tự do tại vịnh Tachibana, Nhật Bản bằng cách ứng dụng phương pháp Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis (ARISA) Các mẫu DNA của vi khuẩn được thu thập và lưu trữ từ mùa xuân đến đầu mùa hè (tháng tư, tháng năm, và tháng sáu) trong khoảng thời gian từ năm 2009 đến năm 2012, đã được sử dụng cho nghiên cứu này Trong số các yếu tố được phân tích như tháng, năm và độ sâu, thì năm được xem là nhân tố quan trọng nhất trong việc làm biến động quần xã vi khuẩn sống tự do (ANOSIM, Global R = 0.422, p = 0,1%) Đặc biệt, các tháng trong năm

2011 (ANOSIM, Global R = 0,969, p = 2,9%) đã có tác động đáng kể vào sự thay đổi của quần xã vi khuẩn Bên cạnh đó, tùy thuộc vào từng năm, các đoạn ribosomal ITS như 234 bp, 235 bp, 215 bp hoặc 216 bp chiếm tỷ lệ cao nhất trong toàn bộ cấu trúc quần xã Trong bốn năm (2009-2012), hai đoạn ribosomal ITS 234 bp (được cho là có nguồn gốc từ Pseudomonas) và 216 bp (được cho là có nguồn gốc từ Actinobacteia) chiếm ưu thế nhất vì tần suất xuất hiện trong toàn bộ cấu trúc quần xã rất cao Vì thế,

cả hai chi vi khuẩn được xem có vai trò quan trọng trong môi trường biển

Từ khóa: ARISA, Actinobacteia, Pseudomonas, ribosomal ITS

MỤC LỤC

Trang

KÝ TÊN HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM TẠ i

TÓM LƯỢC ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Biển Ariake và vịnh Tachibana 3

2.2 Quần xã vi khuẩn sống tự do trong môi trường biển (Zhang et al., 2007) 4

2.3 Vùng 16S – 23S rDNA (ribosomal intergenic spacer regions (rITS)) 5

2.4 Phương pháp rRNA intergenic spacer analysis (RISA) 7

2.5 Phương pháp Automated ribosomal intergenic spacer analysis (ARISA) (Brown et al., 2005) 7

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

3.1 Nguyên vật liệu 9

3.2 Phương pháp nghiên cứu 11

3.2.1 Quy trình chung 11

3.2.2 ARISA-PCR 11

3.2.3 ARISA sốc nhiệt 12

3.2.4 Phân tích DNA của mẫu 12

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 13

4.1 Ảnh hưởng của số tháng mùa hè đến sự biến động quần xã vi khuẩn ở

biển 13

4.2 Ảnh hưởng của năm (2009-2012) đến sự biến động quần xã vi khuẩn ở biển 13

4.3 Ảnh hưởng của độ sâu đến sự biến động quần xã vi khuẩn ở biển 14

4.4 Ảnh hưởng của 2 nhân tố (tháng và độ sâu) của mỗi năm đến sự biến động quần xã vi khuẩn ở biển 15

4.5 Đa dạng chiều dài đoạn rITS và sự biến động về số lượng trong mỗi mẫu 20 4.6 Những thay đổi của những đoạn rITS quan trọng trong từng năm 25

4.7 Những thay đổi của những đoạn rITS quan trọng nhất trong 4 năm 27

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30

5.1 Kết luận 30

5.2 Đề nghị 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 PHỤ LỤC PL-1

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1 Mẫu nước biển ở điểm nghiên cứu A6 10

Bảng 2 Các thành phần và số lượng cho một phản ứng PCR 11

Bảng 3 Các thành phần và số lượng cho một phản ứng ARISA sốc nhiệt 12

Bảng 4 Tập hợp những đoạn rITS quan trọng nhất của mỗi mẫu 24

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Biển Ariake 3

Hình 2 Vịnh Tachibana 4

Hình 3 Nhóm vi khuẩn sống sống tự do (trái) và nhóm sống cố định (phải) 5

Hình 4 Sự sắp xếp các vùng chức năng tại rITS 6

Hình 5 Phương pháp Automated ribosomal intergenic spacer analysis (ARISA) 8

Hình 6 Quy trình chung 11

Hình 7 Cluster và MDS diagrams phần trăm giống nhau của 24 mẫu (ANOSIM, Global R=0.085, p=11.4%, Stress = 0.07) 13

Hình 8 Cluster và MDS diagrams phần trăm giống nhau của 24 mẫu (ANOSIM, Global R=0.422, p=0.1%, Stress = 0.07) 14

Hình 9 Cluster và MDS diagrams phần trăm giống nhau của 24 mẫu (ANOSIM, Global R= -0.151, p=99.4%, Stress = 0.07) 15

Hình 10 Cluster và MDS diagrams phần trăm giống nhau của 5 mẫu (ANOSIM, Global R= 0.188, p= 33.3%, stress = 0) 15

Hình 11 Cluster và MDS diagrams phần trăm giống nhau của 5 mẫu (ANOSIM, Global R= 0, p= 60%, stress = 0) 16

Hình 12 Cluster và MDS diagrams phần trăm giống nhau của 4 mẫu (ANOSIM, Global R= 1, p= 33.3%, stress = 0) 17

Hình 13 Cluster và MDS diagrams phần trăm giống nhau của 4 mẫu (ANOSIM, Global R= -0.5, p= 100%, stress = 0) 17

Hình 14 Cluster và MDS diagrams phần trăm giống nhau của 8 mẫu (ANOSIM, Global R= 0.969, p= 2.9%, stress = 0) 18

Hình 15 Cluster và MDS diagrams phần trăm giống nhau của 8 mẫu (ANOSIM, Global R= -0.479, p= 90.5%, stress = 0) 18

Hình 16 Cluster và MDS diagrams phần trăm giống nhau của 7 mẫu (ANOSIM, Global R= -0.009, p= 45.7%, stress = 0) 19

Hình 17 Cluster và MDS diagrams phần trăm giống nhau của 7 mẫu (ANOSIM, Global R= -0.074, p= 57.1%, stress = 0) 20

Hình 18 Sự đa dạng các chiều dài đoạn rITS và sự biến động về số lượng trong mỗi mẫu năm 2009 20

Hình 19 Sự đa dạng các chiều dài đoạn rITS và sự biến động về số lƣợng trong mỗi

mẫu năm 2010 21

Hình 20 Sự đa dạng các chiều dài đoạn rITS và sự biến động về số lƣợng trong mỗi mẫu năm 2011 22

Hình 21 Sự đa dạng các chiều dài đoạn rITS và sự biến động về số lƣợng trong mỗi mẫu năm 2012 23

Hình 22 Những thay đổi của những đoạn rITS quan trọng năm 2009 25

Hình 23 Những thay đổi của những đoạn rITS quan trọng năm 2010 26

Hình 24 Những thay đổi của những đoạn rITS quan trọng năm 2011 26

Hình 25 Những thay đổi của những đoạn rITS quan trọng năm 2012 27

Hình 26 Những thay đổi của những đoạn rITS quan trọng nhất trong 4 năm 28

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Theo Fisher và Tripplet (1991), phương pháp Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis (ARISA) là một kỹ thuật mới trong việc phân tích DNA Chiều dài của vùng Intergenic Transcibed Spacer (ITS) giữa các gen 16S -23S rDNA vốn đặc trưng và khác nhau giữa các sinh vật nhân sơ Phương pháp ARISA dựa trên sự không đồng nhất chiều dài này bằng cách sử dụng PCR nhằm khuếch đại toàn bộ vùng Intergenic Transcibed Spacer (ITS) với độ dài đặc trưng của các loài vi sinh vật hiện diện trong mẫu Phương pháp này cũng tương tự như Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), nhưng đặc biệt là trong việc ly trích DNA và phản ứng PCR, mồi oligonucleotide huỳnh quang được sử dụng Bước điện di sau đó được thực hiện với một hệ thống laser tự động nhằm phát hiện các đoạn DNA huỳnh quang Trong quá khứ, ARISA chỉ được sử dụng để hiển thị sự đa dạng của các vi sinh vật trong đất, nhưng ngày nay, nó đã được ứng dụng để phân tích sự đa dạng vi sinh vật trong nhiều lĩnh vực, bao gồm cả môi trường biển

Biển Ariake nói chung và vịnh Tachibana nói riêng được xem là một trong những vùng biển giàu tiềm năng kinh tế của tỉnh Nagasaki Các vùng biển này nổi tiếng với nhiều bãi bùn lớn nhất Nhật Bản nhờ vào số lượng lớn các con sông mang theo một lượng cát khổng lồ ra biển Vì sự biến động đáng kể của thủy triều và đất đai màu mỡ, đây không chỉ là những bãi bùn với nhiều chủng loại cá, tôm hùm và ngọc trai, mà còn

là nơi thích hợp cho việc trồng rong biển với số lượng lớn

Do những giá trị về kinh tế cũng như sinh thái to lớn, biển Ariake và vịnh Tachibana đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên khắp Nhật Bản, đặc biệt là Đại học Nagasaki Có thể nói rằng luận văn này là một phần trong những dự án khoa học "Phân tích cấu trúc quần xã vi khuẩn sống tự do ở biển Ariake bằng phương pháp ARISA, Cloning và Flow Cytometry" Luận văn này đã tập trung vào cấu trúc quần xã

vi khuẩn sống tự do, đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực sinh địa hóa ở đại dương Biển Ariake có nhiều điểm lấy mẫu quan trọng như A6, A11, A15, và C9 Tất cả chúng đã được nghiên cứu về quần xã vi khuẩn từ năm 2009 đến nay Trong đó, A6 (Vĩ độ 32,6o; kinh độ 130.033o

), nằm ở vịnh Tachibana, được xem là một trong những địa điểm nghiên cứu lý tưởng nhất vì ít chịu tác động của microplankton cũng như vi sinh vật biển khác (Ohta, 2013)

1.2 Mục tiêu đề tài

Bằng kỹ thuật ARISA, phân tích sự biến động và đa dạng của cộng đồng vi khuẩn sống tự do ở vịnh Tachibana trong 3 tháng liên tiếp (Tháng tƣ, tháng năm, và tháng sáu) trong khoảng thời gian bốn năm (2009-2012)

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Biển Ariake và vịnh Tachibana

Biển Ariake (有 明海) là một vùng biển nông bao quanh bởi bốn tỉnh Fukuoka, Saga, Nagasaki, Kumamoto Tất cả các tỉnh này đều nằm trên đảo Kyushu (九州), phía nam Nhật Bản Đây là vùng biển lớn nhất ở Kyushu Điểm sâu nhất của nó chỉ khoảng 50 m, và thủy triều cao nhất là 4 m Có một lượng lớn bùn cát và các chất dinh dưỡng phong phú chảy ra biển từ hơn 10 con sông, bao gồm sông Chikugo (sông lớn nhất ở đảo Kyushu), Honmeigawa, Kashimagawa, Shiotagawa, Kadokawa, Kase, Yabegawa, Suwa, Kikuchigawa, Shirakawa, và Midorikawa Diện tích lưu vực của dòng sông là khoảng 8.000 km ² và nhiều gấp năm lần diện tích biển Bên cạnh đó, một lượng lớn trầm tích, cát sỏi, muối vô cơ và chất dinh dưỡng hữu cơ chảy vào trong vùng khép kín của biển đặc biệt là vào mùa hè

Vịnh Tachibana (橘 湾), nằm ở phần bên ngoài biển Ariake, phía tây đảo Kyushu, được

mô tả như là một khu vực tiếp giáp giữa cửa sông và biển, kết nối với biển Ariake qua một eo biển hẹp được trình bày trong hình 2 Biển Ariake chứa một lượng lớn nước ngọt từ các sông như Chikugo, Kikuchi, Midori, và Rokkaku Cửa biển Ariake không quá rộng so với diện tích của nó, và có dòng thủy triều rất mạnh thường được tạo ra xung quanh khu vực miệng, được gọi là eo biển Hayasaki Phía ngoài eo biển Hayasaki, khu vực bao quanh bởi đảo Amakusa-Shimoshima, bán đảo Shimabara và bán đảo Nagasaki được gọi là vịnh Tachibana Trên toàn vịnh, năng suất sinh học là khá lớn và hoạt động đánh bắt thủy sản rất phát triển (Matsuno et

al 1999) Do đó, sự hiểu biết về cấu trúc và chức năng của quần xã vi sinh vật khá quan trọng trong việc tìm hiểu các quy trình sinh địa hóa tại vùng biển này

Hình 1 Biển Ariake

Vì những lý do trên, vịnh Tachibana đã thu hút nhiều sự chú ý của các nhà khoa học Nhật Bản, đặc biệt là các nhà nghiên cứu của Đại học Nagasaki Họ đã có nhiều nghiên cứu cũng như các dự án khác nhau, góp phần thúc đẩy mạnh mẽ nghề cá và nuôi trồng thủy sản

2.2 Quần xã vi khuẩn sống tự do trong môi trường biển (Zhang et al., 2007)

Quần thể vi khuẩn, bao gồm cả vi khuẩn tự dưỡng và dị dưỡng, là những sinh vật quan trọng kiểm soát quá trình sản xuất cũng như tiêu thụ các chất hữu cơ trong môi trường biển, góp phần hình thành vòng tuần hoàn vật chất trong đại dương (DeLong và Karl, 2005) Với sự phát triển nhanh chóng của kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu sinh thái biển, các nhà khoa học

cố gắng kết hợp các chi tiết về sự đa dạng vi khuẩn, sinh lý học và sinh thái học vào các mô hình hải dương học và sinh hóa trong môi trường cụ thể (Hollibaugh et al, 2000; Fuhrman et al., 2006; Paerl et al, 2002)

Trong hầu hết các môi trường nước, vi khuẩn sống trong vùng nước mở của đại dương được chia làm 2 nhóm: nhóm sống cố định và nhóm sống tự do Theo Morel (1990), vi khuẩn sống tự do đã được xác định là vi sinh vật phổ biến trong đại dương (Ferguson và Rublee, 1976; Sieburth et al., 1978) với những tác động sinh hóa liên quan đến các dòng chảy bên trong đại dương (Cho và Azam, 1988) Với kích thước dao động trong khoảng 0,2 đến 1μm

và sự phong phú về số lượng từ 1011 đến 1013 tế bào trong mỗi m3, bacterioplankton có thể hình thành một phần khá lớn của carbon hữu cơ, đặc biệt là ở khu vực nghèo dinh dưỡng mà chúng dường như giảm dần số lượng ít đột ngột hơn so với sinh vật phù du Tuy nhiên, vi khuẩn sống tự do thường nhỏ hơn, ít phong phú và ít chức năng hoạt động hơn so với các vi khuẩn sống cố định tại cùng một vị trí (Caron et al., 1982; Acinas et al., 1999) Ở các đại dương, trong quần xã vi khuẩn, vi khuẩn sống tự do thường nhỏ hơn, nhưng số lượng lại tương đối nhiều so với vi khuẩn sống cố định

Tachibana Bay

Hình 2 Vịnh Tachibana

Vì các vi sinh vật có tính đa dạng cao, tốc độ tăng trưởng nhanh và vai trò quan trọng cho đối với chu trình dinh dưỡng ở đại dương, nên chúng là những sinh vật biểu thị trực tiếp

và rất nhạy cảm về tình trạng hiện tại cũng như sự thay đổi của hệ sinh thái (Paerl et al., 2002) Cuối cùng, sự hiểu biết về sự biến động của quần xã vi khuẩn sống tự do rất cần thiết cho việc nhận biết vai trò của chúng trong các hệ sinh thái biển Kể từ khi những chủng vi khuẩn này

đa ̣t được đô ̣ đa da ̣ng cực cao , tốc đô ̣ phát triển nhanh và đóng vai trò thiết yếu cho chu trình dinh dưỡng , có thể thấy rằng chúng là những vật chỉ thị một cách trực tiếp và nhạy cảm cho sự thay đổi và tình tra ̣ng của hê ̣ sinh thái (Paerl et al , 2002) Thêm vào đó , kiến thức về sự linh đô ̣ng của quần thể vi khuẩn sống tự do rất cần thiết cho viê ̣c hiểu biết vai trò của chúng trong hê ̣ sinh thái biển

2.3 Vùng 16S – 23S rDNA (ribosomal intergenic spacer regions (rITS))

Theo Garcia-Martinez (1999), sinh vật nhân sơ (Prokaryote) có gen mã hóa cho các RNA khác nhau của một ribosome sẽ hình thành một operon như một đơn vị phiên mã Số lượng các operon của một loài nhất định phụ thuộc nhiều vào tốc độ tăng trưởng của nó Vì nhu cầu protein cần được tổng hợp nhiều hơn ở một số giai đoạn như khi vào kỳ đầu phân chia tế bào, nên các operon thường nằm ở cả hai bên của điểm bắt đầu sao chép (Origin of replication), mặc dù đối với nhiều loài vị trí chính xác của operon trong bộ gen vẫn chưa biết Như trong hình bên dưới, sự sắp xếp các gene phổ biến nhất cho các tiểu đơn vị khác nhau trong operon theo thứ tự là 16S-23S-5S (Gürtler và Stanisich, 1996; Pisabarro, 1998 và Roth, 1998) Điều này có nghĩa rằng giữa vùng gene 16S và 23S, và giữa 23S và 5S, là vùng rITS

có chiều dài biến thiên

Kích thước của ITS có thể thay đổi đáng kể từng vào từng loài khác nhau, và thậm chí giữa các operon khác nhau trong một tế bào, trong trường hợp của nhiều operon (Condon et al., 1995) Sự thay đổi trong chiều dài này chủ yếu là do sự hiện diện của một số đơn vị chức

Hình 3 Nhóm vi khuẩn sống sống tự do (trái) và nhóm sống cố định (phải)

(Silvia el al., 1999)

năng giữa các operon như gene tRNA, hiện diện trong hầu hết các vi sinh vật được nghiên cứu trong một hoặc hai mỗi rITS (Gürtler và Stanisich, 1996 và Normand et al, 1996)

Đơn vị chức năng khác trong vùng rITS bao gồm các trình tự nhận biết các enzym như ribonuclease III (Bram et al., 1980), tham gia vào quá trình hình thành ribosome trưởng thành Một trình tự khác liên quan đến việc nhận biết các enzyme được gọi là boxA, với một vai trò như một antiterminator trong quá trình phiên mã (Harvey et al., 1988 và Berg et al., 1989) Các trình tự nhận biết ribonuclease III ở đầu 5 'và 3' trong khi boxA thường nằm ở giữa vùng ITS Mặc dù các vùng này là rất quan trọng cho việc góp phần thực hiện đúng chức năng các operon, nhưng chúng không phải là vùng được bảo tồn ở tất cả các vi sinh vật, mà chỉ có ở các vi sinh vật có liên quan chặt chẽ Trong mọi trường hợp, các đơn vị chức năng trong vùng ITS thường không hơn 50% toàn bộ kích thước của nó Phần còn lại của vùng ITS bao gồm các trình tự không cần thiết liên quan đến trình tự các trình tự được chèn hoặc xóa thường xuyên, chẳng hạn như rsl trong một số operon của E coli (Condon et al., 1995) Nếu trình tự này biến mất do đột biến thì vẫn không ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của vi khuẩn

Tuy nhiên, trong một loài đặc trưng hoặc giữa các dòng có quan hệ mật thiết, thì vùng rITS được bảo tồn, đặc biệt liên quan đến các nucleotide alignable (Anton et al., 1998 và Pérez-Luz

et al., 1998) do vị trí của chúng nằm giữa hai gene được bảo tồn Mặt khác, các vùng rITS của các dòng có mối quan hệ mật thiết thường phân ra ở mức độ nucleotide không alignable nên

Hình 4 Sự sắp xếp các vùng chức năng tại rITS (Garcı ́a-Martı́nez,1999)

rITS

có thể phản ánh các trình tự được chèn hoặc xóa thường xuyên (Garcia-Martinez et al., 1996) Những khác biệt này có thể được sử dụng cho việc mô tả các dòng và có thể cực kỳ hữu ích trong dịch tễ học hoặc công nghệ sinh học (Amann et al., 1995)

2.4 Phương pháp rRNA intergenic spacer analysis (RISA)

Theo Fisher và Tripplet (1991), RISA là một phương pháp phân tích di truyền nhằm dự đoán về sự đa dạng và thành phần gene của quần xã vi sinh vật RISA ban đầu được sử dụng

để để nghiên cứu sự đa dạng vi sinh vật trong đất và gần đây là sự đa dạng vi sinh vật trong vùng rễ và môi trường biển Phương pháp này liên quan đến việc khuếch đại PCR từ DNA tổng số quần xã vi khuẩn của vùng rITS trong operon rRNA, mồi oligonucleotide với mục tiêu là các vùng được bảo tồn giữa các genes 16S và 23S Các vùng 16S -23S có thể mã hóa RNA vận chuyển (tRNA) tùy thuộc vào từng loài vi khuẩn, hiển thị sự khác biệt đáng kể trong cả chiều dài và trình tự nucleotide Cả hai sự biến đổi này đã được sử dụng rộng rãi để phân biệt các chủng vi khuẩn và giữa các loài có mối quan hệ mật thiết Trong RISA, sự không đồng nhất về chiều dài của rITS được ứng dụng Sản phẩm PCR được thực hiện điện di trong một gel polyacrylamide, và DNA được nhìn thấy bằng cách nhuộm bạc Kết quả là một dải các band phức tạp cung cấp dữ liệu di truyền của một quần xã vi sinh vật cụ thể, với mỗi băng DNA tương ứng với ít nhất là một vi sinh vật trong quần xã ban đầu

Mặc dù RISA cung cấp dữ liệu tương đối nhanh chóng về thành phần DNA của quần xã

vi sinh vật, nhưng trong thực tế diện di với gel polyacrylamide khá tốn thời thời gian và phức tạp Ngoài ra, do việc nhuộm bạc là một phương pháp ít nhạy cảm trong phát hiện DNA, vì thế không khả quan cho việc thu một lượng lớn sản phẩm PCR cần thiết để phân tích di truyền Những hạn chế của các phương pháp này đã dẫn đến sự ra đời một phiên bản cải tiến mới của RISA, hay được gọi là RISA tự động (Automated ribosomal intergenic spacer analysis (ARISA))

2.5 Phương pháp Automated ribosomal intergenic spacer analysis (ARISA) (Brown et al., 2005)

Để phân tích một số lượng mẫu lớn hiệu quả hơn, các nhà vi sinh vật học đã sử dụng kỹ thuật phân tích DNA như Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) (Muyzer et al., 1993) và Terminal Testriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) (Avaniss-Aghajani

et al., 1994) Tuy nhiên, gần đây việc sử dụng kỹ thuật phân tích DNA mới Automated ribosomal intergenic spacer analysis (ARISA) đã trở nên rộng rãi (Fisher và Triplett, 1999) Trong ARISA, chiều dài của vùng rITS của sinh vật nhân sơ giữa các gene 16S-23S rDNA vốn biến thiên giữa các loài ARISA đã ứng dụng sự không đồng nhất chiều dài này bằng

cách sử dụng PCR khuếch đại toàn vùng đó, và cho ra các đoạn DNA có độ dài đặc trưng của đơn vị phân loại hiện diện trong mẫu Như phương pháp phân tích di truyền dựa trên PCR khác, kết quả ARISA dễ bị sai khác trong quá trình khuếch đại PCR

Hình 5 Phương pháp Automated ribosomal intergenic spacer analysis (ARISA)

Như được đề cập ở phần trên, những hạn chế của các phương pháp RISA đã dẫn đến

sự ra đời của ARISA Mặc dù các bước ban đầu như của ly trích DNA và khuếch đại PCR cũng giống như trong RISA, nhưng PCR được tiến hành với một mồi oligonucleotide được gắn huỳnh quang và bước điện di sau đó được thực hiện với một hệ thống laser tự động, nhằm phát hiện đoạn DNA huỳnh quang Phương pháp ARISA-PCR có thể tạo ra các đoạn DNA có chiều dài lên đến 1.400 bp Cuối cùng, vì những ưu điểm quan trọng trên, ARISA đã được ứng dụng trong việc phân tích sự biến động và đa dạng của quần xã vi khuẩn tự do ở vịnh Tachibana theo thời gian

3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

• Bề mặt với độ sâu là 0m

• Chl được định nghĩa là cường độ cao nhất của tự động huỳnh quang từ sắc tố quang hợp tại chỗ

• Mid1 với độ sâu là 5m

• Mid2 là khảng giữa độ sâu của vịnh

• Mặt đáy được tính là 5m phía trên bề mặt trầm tích đáy

- Các mẫu được thu bằng cách sử dụng chai 12 L Niskin Lần lọc đầu tiên qua mắc lưới 20 micromet, sau đó liên tục lọc qua 0.22 micron Sterivex Filters sử dụng cho việc ly trích DNA Các bộ lọc này được giữ lạnh ở nhiệt độ -20 C cho đến khi sử dụng

* Quy trình ly trích DNA đối với 0.22 micron Sterivex Filters là Puregene Kit

* Phương pháp Automated rRNA intergenic spacer analysis (ARISA)

- ARISA được thực hiện bằng cách sử dụng cặp mồi phổ biến (Universal Primer) (ITSf và ITSr) với trình tự của như sau:

ITSf: 5'-ACA GTCGTA AGGTAGCCGTA-3'

ITSr: 5'-GCCAAGGCATCCACC-3'

- Hỗn hợp cần cho phản ứng PCR bao gồm các thành phần sau: Đệm PCR, MgCl2, dNTP, primer, Taq polymerase và mẫu DNA

- Các đoạn DNA khác nhau được nhận biết bằng cách sử dụng hệ thống Applied Biosystems

® 3730/3730xl DNA Analyzer và kết quả electropherograms được phân tích bởi phần mềm Peak Scanner V1.0

- Các thiết bị khác, hóa chất và các phần mềm trong phòng thí nghiệm cũng đã được sử dụng trong luận văn này Chi tiết được mô tả bên dưới

- Toàn bộ quá trình phân tích di truyền quần xã vi khuẩn với ARISA được thể hiện trong hình

6 và chi tiết được trình bày ở trang sau

Bảng 1 Mẫu nước biển ở điểm nghiên cứu A6

Năm Tháng Độ sâu ID của mẫu

Sáu

Mid1 307 Mid2 309 Bottom 311

2012

Tư

Mid1 711 Mid2 713 Bottom 715

Năm

Mid1 779 Mid2 781 Bottom 783

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Quy trình chung phân tích mẫu nước biển ở vịnh Tachibana (Wada et al 2013)

Hình 6 Quy trình chung phân tích mẫu nước biển ở vịnh Tachibana 3.2.2 ARISA-PCR

- Chuẩn bị Master mix với các thành phần và số lượng như sau:

Mồi xuôi (Forward primer) (10pmol/ µL) 1

Mồi ngược (Reverse primer) (10pmol/ µL) 1

Kết quả

- Chia đều Master mix vào mỗi tube (11.5µL/tube)

- Thêm vào các tubes 1µL template DNA

- Chạy phản ứng PCR

3.2.3 ARISA sốc nhiệt

- Chuẩn bị Master Mix như sau:

Bảng 3 Các thành phần và số lượng cho một phản ứng ARISA sốc nhiệt

- Chia đều Master mix vào mỗi tube (14.3µL / tube)

- Thêm vào các tubes 0.8µL template DNA

- Thực hiện sốc nhiệt trên thermal cycler (95℃, 2 min)

- Khi sốc nhiệt kết thúc, nhanh chóng đặt mẫu vào vào nước đá

3.2.4 Phân tích DNA của mẫu

Lần lượt sử dụng các thiết bị và phần mềm phân tích như sau:

- Applied Biosystems® 3730/3730xl DNA Analyze

- Peak Scanner Software v1 (Phân tích Electropherograms)

- Excel 2010

- Primer v6

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Ảnh hưởng của số tháng mùa hè đến sự biến động quần xã vi khuẩn ở biển

Như được thể hiện ở Hình 7, các quần xã vi khuẩn chia thành 3 nhóm riêng biệt dựa trên các tháng trong năm: tháng 4, tháng 5 và tháng 6

Thông qua ANOSIM, Global R xấp xỉ 0 và p > 5%, vì vậy sự tương đồng giữa các mẫu thường là như nhau Nói cách khác, không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê giữa các mẫu theo tháng Nguyên nhân của kết quả này có thể do các yếu tố môi trường giống nhau giữa các tháng trong năm như nhiệt độ, độ mặn, ánh sáng mặt trời…

Tuy nhiên, trong so sánh cặp, đặc biệt giữa tháng 6 và tháng 4, R = 0.255 (R lớn hơn Global R) và p < 5% (p = 1.3%), điều này chỉ ra rằng giữa 2 tháng có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê 5% Lý do của sự khác biệt này có thể vì điều kiện môi trường khác nhau giữa cuối mùa xuân và đầu mùa hè

4.2 Ảnh hưởng của năm (2009-2012) đến sự biến động quần xã vi khuẩn ở biển

Từ hình 8 có thể thấy, các quần xã vi khuẩn phân tách thành 3 nhóm khác nhau dựa trên các năm: 2009, 2010, 2011 và 2012 Có thể thấy rất rõ là Global R lớn hơn 0 nhiều và p < 5%,

vì vậy, các mẫu của từng năm khác nhau về mặt thống kê Trong trường hợp này, kết quả cho thấy năm là biến số quan trọng nhất, ảnh hưởng rất lớn đến sự biến động quần xã vi khuẩn ở biển Nguyên nhân chính được cho là do sự thay đổi đáng kể của các yếu tố môi trường qua các năm

Hình 7 Cluster và MDS diagrams phần trăm giống nhau của 24 mẫu

(ANOSIM, Global R=0.085, p=11.4%, Stress = 0.07)

Month

June May April

Similarity

20 40 60 80 203

959 961

995997

1049 1051

2D Stress: 0.07