phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase từ mắm cá cơm, mắm cá linh, mắm cá sặc

Đánh giá và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase từ các dòng vi khuẩn phân lập được .... Một số đặc tính hình thái, sinh hóa của các dòng vi khuẩn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN

CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME COLLAGENASE

TỪ MẮM CÁ CƠM, MẮM CÁ LINH, MẮM CÁ SẶC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

TS BÙI THỊ MINH DIỆU PHẠM THÁI VY

MSSV: 3102796

LỚP: CNSH KHÓA 36

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN

CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME COLLAGENASE

TỪ MẮM CÁ CƠM, MẮM CÁ LINH, MẮM CÁ SẶC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

TS BÙI THỊ MINH DIỆU PHẠM THÁI VY

MSSV: 3102796

LỚP: CNSH KHÓA 36

Cần Thơ, tháng 05 năm 2014

PHẦN KÝ DUYỆT

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài luận văn

Ts Bùi Thị Minh Diệu đã tận tình hướng dẫn, quan tâm và giúp đỡ tôi đến khi hoàn thành

đề tài luận văn

Tập thể các thầy cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại Trường Đại học Cần Thơ Tập thể cán bộ và sinh viên trong phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thực vật, phòng Hóa sinh thực phẩm đã tạo điều kiện, hỗ trợ về các trang thiết bị cần thiết cho quá trình thực hiện đề tài cũng như chia sẻ kinh nghiệm, động viên giúp tôi hoàn thành tốt đề tài luận văn này

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

Sinh viên thực hiện

Phạm Thái Vy

TÓM LƯỢC

Collagen có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực thực phẩm, y học, dược phẩm và mỹ phẩm Trên thực tế, collagen là loại protein quan trọng trong cấu trúc cơ thể động vật như da, xương Việt nam, với lợi thế là quốc gia có nền nông - ngư nghiệp phát triển, hàng năm thải ra môi trường hàng tấn phụ - phế phẩm (Theo Tổng cục thống kê, tính đến tháng 4 năm 2014 là 86.340 tấn phụ - phế phẩm cá Tra/Basa ) nên việc tận dụng collagen

từ cơ thể động vật, đặc biệt là nguồn phế thải trong quá trình sản xuất thủy sản sẽ đem lại giá trị kinh tế Hiện nay, việc tách chiết collagen bằng phương pháp sinh học đang được chú trọng đầu tư, nghiên cứu Một trong những bước nghiên cứu đầu tiên là tìm kiếm nguồn sinh vật sản xuất enzyme collagenase hiệu quả Hệ vi sinh vật chứa một lượng enzyme collagenase khá phong phú Do đó, việc chọn ra những dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase là một bước khởi đầu cần thiết Từ ba mẫu mắm

cá cơm, mắm cá linh và mắm cá sặc đã phân lập được 41 dòng vi khuẩn hiếu khí có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase trên hai loại môi trường gelatin (giai đoạn phân lập) và collagen (giai đoạn sau khi tách ròng) Đa số khuẩn lạc có dạng không đều, độ nổi mô, dạng bìa nguyên, màu trắng đục Vi khuẩn có thời gian phát triển trung bình, phần lớn là hình cầu Dựa vào kết quả kích thước vòng phân giải khi cho dịch enzyme thô

vi khuẩn tương tác với cơ chất collagen, dưới tác động của thuốc thử TCA 35%, xác định được 19 trong số 41 dòng vi khuẩn phân lập được cho hoạt tính enzyme collagenase Hoạt tính enzyme được xác định bằng phương pháp Ninhydrin và được đo qua bốn ngày, dòng CV41 cho hoạt tính cao nhất (2,85 U/ml) ở ngày thứ hai, tiếp theo là dòng CV37 (hoạt tính 2,03 U/ml) ở ngày thứ hai và dòng CV32 (hoạt tính 2 U/ml) ở ngày thứ ba Cả

ba dòng vi khuẩn CV32, CV37, CV41 đều thuộc nhóm Gram âm, di động nhưng hình dạng khác nhau; dòng CV32 và CV37 hình cầu, dòng CV41 hình que ngắn Ba dòng vi khuẩn đều phản ứng dương tính với thử nghiệm amylase và catalase; phản ứng âm tính với thử nghiệm Methyl Red và Voges Proskauer Thử nghiệm Indol, dòng CV37 cho phản ứng dương tính, dòng CV32 và CV41 cho phản ứng âm tính

Từ khóa: Collagen, enzyme collagen, gelatin, mắm cá cơm, mắm cá linh, mắm cá

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

TỪ VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Sơ lƣợc về collagen 2

2.1.1 Giới thiệu sơ lƣợc về collagen 2

2.1.2 Cấu trúc của collagen 2

2.1.2.1 Cấu trúc phân tử của collagen 2

2.1.2.2 Thành phần acid amin 3

2.1.3 Phân loại collagen 5

2.1.4 Ứng dụng của collagen 5

2.1.4.1 Trong công nghiệp thực phẩm 6

2.1.4.2 Trong y học và dƣợc phẩm 7

2.1.4.3 Trong mỹ phẩm 7

2.1.5 Sơ lƣợc về gelatin 8

2.2 Sơ lƣợc về enzyme collagenase 9

2.2.1 Định nghĩa enzyme collagenase 9

2.2.2 Nguồn enzyme collagenase và một số tính chất cơ bản 10

2.2.2.1 Enzyme collagenase của mô 10

2.2.2.2 Enzyme collagenase của vi sinh vật 11

2.2.3 Một số tính chất của enzyme collagenase 14

2.2.3.1 Kích thước và cấu trúc phân tử 14

2.2.3.2 Độ bền enzyme 14

2.2.3.3 Tính đặc hiệu của enzyme 15

2.2.4 Một số ứng dụng của enzyme collagenase 16

2.2.4.1 Trong nghiên cứu tách chiết collagen 16

2.2.4.2 Trong công nghiệp thực phẩm 17

2.2.4.3 Trong y học, dược phẩm và mỹ phẩm 19

2.2.5 Tình hình nghiên cứu enzyme collagenase trên thế giới và Việt Nam 21

2.2.5.1 Nghiên cứu enzyme collagenase trên thế giới 21

2.2.5.2 Nghiên cứu enzyme collagenase ở Việt Nam 22

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Thời gian, địa điểm 23

3.2 Phương tiện nghiên cứu 23

3.2.1 Vật liệu thí nghiệm 23

3.2.2 Thiết bị và hóa chất 23

3.2.2.1 Thiết bị 23

3.2.2.2 Hóa chất 24

3.3 Phương pháp nghiên cứu 25

3.3.1 Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase trên môi trường Czapek cải tiến 25

3.3.2 Đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase của các dòng vi khuẩn phân lập được 27

3.3.3 Xác định hoạt tính enzyme collagenase của các dòng vi khuẩn mạnh được tuyển chọn 28

3.3.4 Xác định một số đặc tính hình thái và sinh hóa của các dòng vi khuẩn mạnh được tuyển chọn 30

3.3.4.1 Xác định một số đặc tính hình thái 30

3.3.4.2 Xác định một số đặc tính sinh hóa 31

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

từ mắm cá cơm, mắm cá linh và mắm cá sặc 32

4.1.1 Số lượng dòng vi khuẩn phân lập được 32

4.1.2 Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được 32

4.2 Đánh giá và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase từ các dòng vi khuẩn phân lập được 34

4.3 Hoạt tính enzyme collagenase của các dòng vi khuẩn mạnh được tuyển chọn 37

4.4 Một số đặc tính hình thái, sinh hóa của các dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase mạnh được tuyển chọn 39

4.4.1 Đặc tính hình thái 39

4.4.2 Đặc tính sinh hóa 40

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42

5.1 Kết luận 42

5.2 Đề nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1 HÌNH ẢNH

1 Một số thiết bị, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực hiện thí nghiệm

2 Một số hình ảnh trong quá trình thực hiện thí nghiệm

PHỤ LỤC 2: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH VI KHUẨN

PHỤ LỤC 3 ĐỒNG NHẤT MẬT SỐ VI KHUẨN

PHỤ LỤC 4 SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM

PHỤ LỤC 5 KẾT QUẢ THỐNG KÊ

1 Kết quả thống kê xác định đường kính vòng phân giải

2 Kết quả thống kê xác định hoạt tính enzyme collagenase

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1 Thành phần phần trăm mỗi bộ ba acid amin trong phân tử collagen 3

Bảng 2 Kết cấu chuỗi và sự phân bố của các loại collagen trong cơ thể người 5

Bảng 3 Thành phần phần trăm các acid amin thu được khi thủy phân 100g gelatin 9

Bảng 4 Một số enzyme collagenase có nguồn gốc từ mô 11

Bảng 5 Một số enzyme collagenase có nguồn gốc từ vi sinh vật 13

Bảng 6 Thành phần hóa chất môi trường Czapek cải tiến 24

Bảng 7 Thành phần môi trường tăng sinh 24

Bảng 8 Nồng độ pha loãng 26

Bảng 9 Nồng độ pha dung dịch leucine 29

Bảng 10 Thành phần hóa chất dựng đường chuẩn leucine 29

Bảng 11 Số lượng dòng vi khuẩn theo nguồn gốc phân lập 32

Bảng 12 Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được 32

Bảng 13 Hoạt tính enzyme collagenase theo thời gian của các dòng vi khuẩn mạnh được tuyển chọn 38

Bảng 14 Kết quả nhuộm Gram của ba dòng vi khuẩn được tuyển chọn 39

Bảng 15 Kết quả thử nghiệm một số đặc tính sinh hóa của ba dòng vi khuẩn được tuyển chọn 40

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1 Cấu trúc phân tử collagen 2

Hình 2 Sự hình thành chuỗi xoắn ốc nội phân tử và giữa các chuỗi polypeptide 3

Hình 3 Trật tự sắp xếp của các acid amin trong phân tử collagen 4

Hình 4 Cấu trúc sợi collagen 4

Hình 5 Hanamai Collagen 6

Hình 6 Một số mỹ phẩm chứa collagen 8

Hình 7 Cấu trúc Gly - X - Y của phân tử gelatin 9

Hình 8 Pseudomonas sp., C Histolyticum và Aspergillus oryzae 13

Hình 9 Bệnh co cứng Dupuytren 19

Hình 10 Các bước trong giai đoạn nhuộm Gram 31

Hình 11 Hình thái khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn 34

Hình 12 Vòng phân giải của các dòng vi khuẩn có hoạt tính enzyme collagenase 35

Hình 13 Biểu đồ thể hiện khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase của các dòng vi khuẩn 36

Hình 14 Kết quả nhuộm Gram của ba dòng vi khuẩn được tuyển chọn 40

Hình 15 Kết quả một số đặc tính sinh hóa của ba dòng vi khuẩn được tuyển chọn 41

PCR Polymerase Chain Reaction

SDS - PAGE Sodium Dedocyl Sulfate - Gel Polyacrylamide

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Collagen là protein quan trọng và chiếm lượng khá cao trong cấu trúc của cơ thể động vật (khoảng 30% tổng lượng protein trong cơ thể động vật có xương sống là collagen) Đặc biệt, collagen có ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, y học, dược phẩm hay mỹ phẩm Vì vậy, việc khai thác nguồn collagen tự nhiên từ động vật

sẽ mang lại tiềm năng kinh tế rất lớn Tuy nhiên, collagen thường được sử dụng dưới dạng collagen thủy phân, trong khi collagen từ cơ thể động vật là loại protein khó phân giải Enzyme collagenase chính là lựa chọn thích hợp nhất để phân giải collagen, enzyme collagenase là enzyme duy nhất có khả năng phân giải collagen khi cơ chất ở trạng thái tự nhiên

Hiện nay, collagen trên thị trường đa phần được tách chiết theo phương pháp hóa học (sử dụng acid acetic), việc tách chiết collagen bằng enzyme collagenase (phương pháp sinh học) đang trở thành đề tài rất được quan tâm, nghiên cứu Bởi vì, so với phương pháp hóa học, tách chiết collagen bằng phương pháp sinh học không những tạo ra sản phẩm an toàn, chất lượng mà còn giảm bớt ô nhiễm môi trường khi hạn chế được lượng lớn hóa chất dùng trong sản xuất Vấn đề đặt ra là tìm được nguồn enzyme collagenase hiệu quả để ứng dụng vào việc tách chiết collagen; và hệ vi sinh vật có thể xem như một nguồn thích hợp để sản xuất enzyme collagenase Dựa vào sự đa dạng vốn có của hệ vi sinh vật nên khả năng tạo ra nguồn enzyme collagenase hiệu quả sẽ rất lớn

Nhiều vi sinh vật đã được phát hiện có khả năng sinh tổng hợp enzyme

collagenase như Clostridium, Bacillus subtilis, Vibrio hay Pseudomonas, phần lớn đều

được phân lập từ đất (Kawahara, 1993) Với mắm cá, loại thực phẩm dùng phổ biến trong bữa ăn của người Việt Nam, được chế biến theo phương pháp truyền thống với thành phần chính là cá và muối sẽ là nguồn lý tưởng để phân lập vi sinh vật có khả

năng sinh tổng hợp enzyme collagenase hiệu quả Vì vậy, đề tài “Phân lập và tuyển

chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase từ mắm cá cơm, mắm

cá linh, mắm cá sặc” được thực hiện

1.2 Mục tiêu đề tài

Đề tài được thực hiện với mục tiêu phân lập để tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về collagen

2.1.1 Định nghĩa collagen

Collagen được xếp vào nhóm các protein cứng dạng sợi: sợi collagen

Collagen là loại protein cấu trúc chính yếu, chiếm khoảng 30% tổng lượng protein có trong cơ thể ở các động vật có xương sống (Harper, 1980) Collagen có nhiều trong gân, da, xương, hệ thống mạch máu của động vật và có mặt trong các màng liên kết bao quanh cơ Khoảng 10% protein trong cơ ở động vật có vú là collagen, các protein ngoại bào (khoảng 90% trong gân, xương và khoảng 20% trong da) có chứa collagen Collagen có tác dụng giống như một chất keo liên kết các tế bào lại để hình thành các mô và cơ quan nền tảng trong cơ thể

2.1.2 Cấu trúc của collagen

2.1.2.1 Cấu trúc phân tử của collagen

Phân tử collagen (hay còn gọi là tropocollagen) là một protein hình trụ, dài

khoảng 300nm, đường kính khoảng 1,5nm

Hình 1 Cấu trúc phân tử sợi collagen

(*Nguồn: http://luanvan.co/luan-van/trich-ly-collagen-va-ung-dung-354/ ngày 02/09/2013)

Nó bao gồm 3 chuỗi polypeptide cuộn lại với nhau Mỗi chuỗi cuộn thành đường xoắn ốc theo hướng từ phải sang trái với 3 gốc trên một vòng xoắn Ba chuỗi này xoắn lại với nhau theo hướng từ trái sang phải tạo thành đường bộ ba xoắn ốc Mỗi chuỗi polypeptide có trọng lượng phân tử khoảng 100kDa (Seifter và Harper, 1971), tạo nên tổng trọng lượng phân tử collagen khoảng 300kDa (Harper, 1980) Chuỗi  được cấu

tạo bởi khoảng 1000 amino acid, các chuỗi  khác nhau ở thành phần amino acid (1,

Hình 2 Sự hình thành chuỗi xoắn ốc nội phân tử và giữa các chuỗi polypeptide

(*Nguồn: http://collagenlagi.blogspot.com/2013/03/cau-truc-phan-tu-cua-collagen.html ngày 29/05/2014)

2.1.2.2 Thành phần acid amin

Trong collagen chứa rất ít hoặc không chứa cysteine và tryptophan, giàu thành phần glycine, proline và hydroxyproline, collagen là một trong số ít protein có chứa hydroxylysine Hydroxyproline là một acid amin đặc trưng của collagen mà các protein khác không có (Harper, 1980) Trong phân tử collagen chứa khoảng 33% glycine, 12% proline và 11% hydroxyproline Các acid amin sắp xếp trong chuỗi xoắn

ốc theo các dãy với sự phân bố như sau:

(*Nguồn: Lodish et al., 2000)

Trong đó, I là acid amin proline hoặc hydroxyproline, X là các acid amin khác Glycine chiếm 1/3 trong tổng số các acid amin và nó được phân bố một cách đều đặn tại vị trí mỗi 1/3 trong xuyên suốt phân tử collagen Do glycine có các nhánh phụ nhỏ nhất nên sự lặp lại của nó cho phép các chuỗi polypeptide kết hợp chặt chẽ với nhau

Hình 3 Trật tự sắp xếp các acid amin trong phân tử collagen

(*Nguồn: http://collagenlagi.blogspot.com/2013/03/cau-truc-phan-tu-cua-collagen.html ngày 29/05/2014)

Ngoài ra, trong phân tử collagen còn có những vùng gồm khoảng 9 - 26 acid amin tại các điểm đầu mút amin hay carboxyl của chuỗi Các vùng này không sáp lại với cấu trúc xoắn ốc và được gọi là telopeptide

Glycine đóng một vai trò hết sức quan trọng trong cấu trúc sợi siêu xoắn của collagen Tropocollagen liên kết với nhau theo kiểu đầu nối đuôi hình thành các collagen fibril (collagen sợi nhỏ) Các collagen fibril này bó lại với nhau hình thành sợi collagen siêu cáp - collagen fiber Vì thế collagen rất chắc, dai và bền

a) Cấu trúc khái quát 3 sợi xoắn của collagen b) Phân tử collagen

c) Collagen fibril đường kính từ 10 - 300nm

d) Collagen fibril bó lại với nhau hình thành sợi collagen siêu cáp - collagen fiber, đường kính từ 0,5 - 3μm

(*Nguồn: http://collagenlagi.blogspot.com/2013/03/cau-truc-phan-tu-cua-collagen.html

2.1.3 Phân loại collagen

Tính tới thời điểm hiện tại, có 42 loại chuỗi polypeptide được nhận dạng Chúng được mã hóa bởi 41 loại gen khác nhau, tạo thành 27 loại collagen

Hơn 90% collagen trong cơ thể là các collagen loại I, II, III và IV Collagen loại I

là phổ biến nhất và thường ở trong các mô liên kết như da, xương, gân Collagen loại

II hầu như tồn tại ở các mô sụn Collagen loại III lại phụ thuộc rất lớn vào độ tuổi của động vật (da heo còn trẻ chứa 50%), theo thời gian tỷ lệ này giảm từ 5 - 10% Collagen loại IV là thành phần chính cấu tạo nên màng tế bào Các loại collagen khác chỉ hiện diện với lượng rất ít và chỉ ở một vài cơ quan đặc biệt Những bệnh tật liên quan đến collagen là do sự khuyết tật về gen ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp, sự sắp xếp cũng như các quá trình khác trong sự sản sinh collagen một cách không bình thường

Hiện tại, có ít nhất khoảng 13 loại collagen đã được tách chiết Chúng khác nhau

về chiều dài của chuỗi xoắn ốc cũng như kích cỡ và bản chất của những phần không xoắn ốc

Bảng 2 Kết cấu chuỗi và sự phân bố của một số loại collagen trong cơ thể người

Loại collagen Nhóm Kết cấu chuỗi Phân bố

 1[VI]  2[VI]  4[VI]

(*Nguồn: Lodish et al., 2000)

2.1.4 Ứng dụng của collagen

Collagen có rất nhiều ứng dụng trong công nghiêp thực phẩm, mỹ phẩm, y học

và dược phẩm Collagen thường được sử dụng dưới dạng collagen thủy phân Collagen thủy phân được gọi là collagen hydrolysate Tùy theo mức độ thủy phân mà collagen

2.1.4.1 Trong công nghiệp thực phẩm

Collagen được dùng làm vỏ bao xúc xích, màng bọc kẹo, làm nguyên liệu để sản xuất một số loại thực phẩm dinh dưỡng, thực phẩm chức năng Trong các sản phẩm pho-mát, người ta thêm vào một hàm lượng collagen hydrolysate thích hợp nhằm ngăn chặn sự mất nước Ngoài ra, trong sản phẩm bơ sữa, collagen đóng vai trò quan trọng trong việc tạo độ mịn, độ sánh cho sản phẩm, cũng như thay thế hàm lượng chất béo trong các loại thực phẩm này

Trong sản phẩm kẹo dẻo, sự có mặt của collagen hydrolysate cung cấp cho sản phẩm độ dẻo, dai và mềm do chúng ngăn chặn sự kết tinh của đường Các sản phẩm như vỏ kẹo có chứa từ 0,5 - 1% hàm lượng collagen hyrolysate với vai trò làm giảm sự tan chảy

Trong công nghiệp sản xuất kẹo mứt, collagen hydrolysate được sử dụng làm chất tạo gel, chất kết dính, chất tạo độ xốp, làm chậm quá trình tan kẹo trong miệng Trong các sản phẩm như thịt hộp, thịt nguội collagen hydrolysate chiếm từ 1 - 5%, giữ hương vị tự nhiên cho thực phẩm, đồng thời cũng là chất kết dính giúp cho việc tạo thành sản phẩm dễ dàng hơn

Trong công nghiệp sản xuất rượu bia và nước hoa quả, collagen hydrolysate (chứa từ 0,002 - 0,15%) sử dụng như chất làm trong Nhờ vậy, sản phẩm khi làm ra có màu sắc trong suốt và óng ánh

Collagen có khả năng hấp thụ nước gấp 5 - 10 lần thể tích của nó nên được sử dụng trong công nghiệp sản xuất đồ hộp để tránh hiện tượng rỉ nước

Hình 5 Hanamai Collagen

(*Nguồn: chiet-xuat-tu-ca.html ngày 02/09/2013)

www.hangngoainhap.com.vn/33-hanamai-collagen-cua-nhat-collagen-dang-bot-2.1.4.2 Trong y học và dƣợc phẩm

Collagen là một vật liệu có khả năng phân hủy sinh học, có tính tương thích sinh học cũng như khả năng cầm máu nên có thể được chế tạo thành các dạng khác nhau, là một loại vật liệu sinh học lý tưởng cho sản xuất các sản phẩm y học Màng collagen được sử dụng cho hàng loạt những ứng dụng như chất bịt kín sinh học và cải thiện tính đáp ứng sinh học đối với những mô cấy Collagen được sử dụng như một hệ thống phân hủy sinh học cho ra các loại thuốc bao gồm thuốc tránh thai, thuốc kháng sinh, insullin, hormone tăng trưởng Collagen được sử dụng rộng rãi trong phẫu thuật thẩm

mỹ, chữa lành vết thương cho các bệnh nhân bị bỏng, tái tạo xương và nhiều mục đích khác thuộc lĩnh vực y khoa, phẫu thuật, chỉnh hình Collagen còn được dùng trong việc xây dựng cấu trúc da nhân tạo để chữa trị cho các vết bỏng nghiêm trọng

Collagen còn được sử dùng để sản xuất bao con nhộng cứng và mềm, chúng được dùng để bảo vệ thuốc khỏi những nhân tố có hại như ánh sáng hay oxy Thành phần chính của vỏ bao thuốc là collagen và các tá dược khác như glycerol hay sorbitol, những chất hoạt động bề mặt, chất màu cho phép, hương liệu Viên thuốc với vỏ bao collagen đảm bảo cho người bệnh có thể nuốt viên thuốc một cách dễ dàng

2.1.4.3 Trong mỹ phẩm

Collagen tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ các đặc tính cơ học của da như sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm, làm cho da mịn màng, tươi tắn và trẻ trung Collagen giúp duy trì độ ẩm tối ưu cho tế bào Ngoài ra, collagen còn đảm bảo sắc tố da, làm sáng màu da, đàn hồi và thúc đẩy quá trình lão hóa của cơ thể Collagen có vai trò quan trọng giúp cải thiện cấu trúc da, kích thích quá trình tái tạo của làn da, phục hồi

tế bào da bị thương tổn

Chính vì vậy collagen được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất các sản phẩm như kem dưỡng da cao cấp, dầu gội, các sản phẩm dưỡng tóc cũng như các loại sữa tắm

Collagen hydrolysate là thành phần trong các sản phẩm mặt nạ dưỡng da, chúng kết hợp với các tinh chất trong mật ong, dầu ôliu, tinh dầu hoa hồng có tác dụng dưỡng

ẩm cho da, tái tạo làn da mệt mỏi, bảo vệ da khỏi các tác nhân tia tử ngoại, khói bụi, hóa chất Vì thế da được trẻ hóa, tươi tắn

Dưới tác dụng của các tác nhân tia tử ngoại, thuốc nhuộm tóc, thuốc duỗi tóc, tóc

dễ bị tổn thương, chẻ ngọn, mất đi vẻ bóng mượt Trong các sản phẩm chăm sóc tóc

thường có bổ sung một lượng collagen hydrolysate có tác dụng bảo vệ cho tóc, phục hồi hư tổn tóc

Collagen còn được dùng trong điều trị phục hồi, thường được sử dụng trong trường hợp da bị tổn thương hay giai đoạn tái tạo sau khi điều trị nám, mụn trứng cá, sẹo, rạn da và tiêu da thừa sau khi giảm béo

L - proline của các chuỗi peptide

Gelatin có cấu trúc gần giống với collagen, hay phân tử gelatin là một phần trong phân tử collagen Cấu trúc phân tử gelatin chứa 18 acid amin liên kết với nhau theo một trật tự xác định, tuần hoàn, tạo nên chuỗi polypeptide với khoảng 1000 đơn vị, hình thành nên cấu trúc bậc I Cấu trúc thường gặp của gelatin là Gly - X - Y (với X chủ yếu là nhóm proline, còn Y là nhóm hydroxyproline) Cứ 3 chuỗi polypeptide xoắn lại theo hình xoắn ốc tạo nên cấu trúc bậc II Ở cấu trúc bậc III, chuỗi xoắn đó tự xoắn quanh nó, tạo nên cấu trúc phân tử dạng dây thừng, gọi là “proto fibril”

Trong phân tử gelatin có một số nhóm mang điện tích: carboxyl, imiazole, amino, guanidine Tỷ lệ các nhóm này ảnh hưởng đến pH và pI của gelatin Ngoài ra,

số lượng nhóm không mang điện tích như các nhóm hydroxyl (serine, threonine, hydroxyproline, hydroxylysine, tyrosine) và các nhóm peptide (- CO - NH -) quy định khả năng tạo liên kết hydro, quy định cấu trúc phân tử

Bảng 3 Thành phần phần trăm các acid amin thu đƣợc khi thủy phân 100g gelatin

(*Ghi chú: *: Acid amin không thay thế)

(*Nguồn: Lodish et al., 2000))

Hình 7 Cấu trúc Gly - X - Y của phân tử gelatin

(*Nguồn: http://s4.zetaboards.com/BioFood_Tech/topic/9128063/1/ ngày 07/01/2014)

2.2 Sơ lƣợc về enzyme collagenase

2.2.1 Định nghĩa enzyme collagenase

Enzyme collagenases là enzym phá vỡ các liên kết peptide trong cấu trúc phân tử collagen dạng Poly - L - proline đặc trưng trong vùng xoắn của collagen ở trạng thái tự nhiên (Seifter và Harper, 1971), xúc tác quá trình thủy phân collagen

Collagen tự nhiên + H2O peptides và/hoặc những đoạn dài hơn Định nghĩa này bao gồm các enzyme có thể tác động đến vùng xoắn và chỉ cắt chuỗi xoắn ở một liên kết peptide duy nhất cũng như các enzyme có khả năng cắt các liên kết peptide ở các vị trí khác nhau trong vùng xoắn Theo định nghĩa này, vị trí cắt của các enzyme không được quy định là phải ở trong vùng không có cực hay vùng có

Enzyme collagenase

cực của chuỗi xoắn Như vậy, các enzyme có khả năng tác dụng trong vùng cực nằm trong vùng xoắn của collagen cũng được xem là enzyme collagenase

Trong hệ thống phân loại enzyme, enzyme collagenase được coi là một phân nhóm của nhóm metalendopeptidase E.C.3.4.24.3

2.2.2 Nguồn enzyme collagenase và một số tính chất cơ bản

Enzyme collagenase có thể được thu nhận từ các sinh nhật nhân chuẩn, cũng như

từ các sinh vật nhân sơ Khi xem xét toàn bộ các loại enzyme collagenase được phát hiện, có thể chia thành hai nhóm chính: nhóm thứ nhất bao gồm các enzyme thu được

từ sinh vật nhân chuẩn có chứa collagen trong cơ thể như là một cấu tử chính của mô (các loài động vật), nhóm enzyme này được gọi là enzyme collagenase của mô và nhóm thứ hai là các enzyme collagenase được tổng hợp từ vi sinh vật khi trong cơ thể của chúng không chứa collagen, được gọi là enzyme collagenase của vi sinh vật (Seifter và Harper, 1971)

2.2.2.1 Enzyme collagenase của mô

Enzyme collagenase giữ vai trò sinh lý rất quan trọng trong sự phát triển của động vật, được tìm thấy ở da, dưới lớp biểu bì da, trong xương, sụn, trong các khối nối

bị viêm và trong các mô bị bệnh (ví dụ trong khối u ký sinh) Enzyme collagenase tồn tại trong cơ thể dưới dạng tiền enzyme (Seifter và Harper, 1971)

Enzyme collagenase trong cơ thể động vật thường thể hiện hoạt tính theo quá trình đổi mới các mô, tại các thời điểm xác định trong tiến trình phát triển cơ thể Một

số loại enzyme collagenase của mô có liên quan tới cơ chế sửa chữa mô, tách các collagen bị tổn thương và thúc đẩy sự tái sinh và làm lành vết thương

Hầu hết các enzyme collagenase của người từ các mô khác nhau đều có đặc tính gần tương tự nhau và tồn tại ở dạng tiềm enzyme Năm 1981, các nhà khoa học đã tinh chế và nghiên cứu enzyme collagenase từ da người Năm 1986, cấu trúc bậc nhất của enzyme này đã được xác định (Goldberg et al., 1986) Nhiều nghiên cứu về enzyme collagenase từ da người còn được tiến hành xa với mục đích xác định các tác nhân tổng hợp enzyme collagenase lưu trữ tại chỗ (In situ) nhằm tăng cường quá trình đổi mới các mô bị thương (Whitham et al., 1986)

Theo Tsutsumi et al (1998), enzyme collagenase của mô thực vật từ quả kiwi là phát hiện gần đây nhất về enzyme collagenase Theo tác giả, enzyme này được coi như

một tác nhân mới để sử dụng trong quá trình làm mềm thịt cùng với các enzyme protease khác

Bảng 4 Một số enzyme collagenase có nguồn gốc từ mô

STT Nguồn gốc Cơ chất và phân tích Đặc tính

1 Tadpole,

Rana catesbiana

Collagen (chế biến từ da cá dưới dạng nhầy), gelatin, peptide tổng hợp

pH tối ưu: pH 8,0 - 9,0; cần

có mặt ion Ca; bị ức chế bởi EDTA, cysteine, serum

2 Từ mô nguyên bào sợi

của chuột và của các tế

bào Hela

Được phân tích bằng sự thủy phân peptide; PZ-Pro-Leu-Gly- Pro-D-Arg.OH tạo màu vàng

3 Bạch cầu ở người, mô

nguyên thủy

Collagen nguyên thủy (chế biến

từ da cá dưới dạng nhầy); C - peptide giải phóng từ gel

pH 7,6; chất ức chế EDTA, cysteine

4 Mô bì ở người Collagen nguyên thủy (chế biến

từ da cá dưới dạng nhầy); C - peptide giải phóng từ gel; phân tích sự ức chế của gel

pH 7,0 - 8,0; chất ức chế EDTA, cysteine, huyết thanh người

5 Từ các mô xương của

người, dê, chuột

Collagen nguyên thủy (chế biến

từ da cá dưới dạng nhầy); C - peptide giải phóng từ gel

pH 7,6; chất ức chế EDTA và huyết thanh người

7 Từ dạ con của chuột, mô

bì bị bệnh của người, vết

thương đang lên da non,

từ mô xương của chuột

đang lớn, chỗ viêm lợi

của người, …

Collagen nguyên thủy (chế biến

từ da cá dưới dạng nhầy); sự ức chế gel

8 Từ tuyến gan tụy của

Uca pugilator

Collagen nguyên thủy (chế biến

từ da cá dưới dạng nhầy); 14C - peptide giải phóng từ gel

(*Nguồn: Tô Kim Anh, 2004)

2.2.2.2 Enzyme collagenase của vi sinh vật

Trong ngân hàng dữ liệu enzyme, nhóm enzyme collagenase vi sinh vật được xếp vào nhóm enzyme thủy phân có mã hiệu phân loại EC.3.4.24.3 mà đại diện là enzyme

collagenase của Clostridium histolyticum Vì thế, ngoài tên gọi enzyme collagenase vi

sinh vật chúng còn có tên gọi khác là enzyme collagenase clostridium histolyticum, clostridiopeptidase A, enzyme collagenase A, collagenase I

Vi sinh vật không chứa collagen nhưng trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật, các nhà nghiên cứu đã thu được enzyme collagenase vào năm 1937 (Seifter và Harper, 1971) Dựa vào đó, có thể đưa ra nhận định sự có mặt enzyme collagenase trong môi trường nuôi cấy do hai chức năng liên quan: chức năng liên quan tới cơ chế ký sinh của vi sinh vật vào tế bào chủ và chức năng liên quan tới cơ chế dinh dưỡng của vi sinh vật

Chức năng đầu của enzyme collagenase ở các vi sinh vật thuộc giống Clotridium,

các enzyme này làm yếu và phân giải các màng chắn mô liên kết của tế bào chủ Trong nhiều trường hợp, tế bào chủ hỗ trợ cho chức năng này của enzyme collagenase bằng cách sản sinh ra enzyme elastase và enzyme polysaccaridase, thậm chí cả enzyme phospholipase, làm rối loạn các mô của màng tế bào Hầu hết chúng đều thuộc nhóm enzyme ngoại bào thực sự, nghĩa là chúng được tiết ra ngoài môi trường và không có mặt trong dịch thủy phân của tế bào

Chức năng thứ hai của enzyme collagenase thể hiện phổ biến ở đa số vi sinh vật

có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase (chức năng dinh dưỡng) Enzyme collagenase phân cắt phân tử collagen thành các đoạn peptide nhỏ hơn, tạo điều kiện cho các enzyme peptidase phân cắt tiếp tục các đoạn peptide này thành các acid amin,

để cung cấp cho vi sinh vật

Năm 1937, Maschmann là người đầu tiên phát hiện ra Clostridium histolyticum,

tác giả cho biết sự khác nhau giữa hoạt tính enzyme gelatinase lên collagen biến tính

và enzyme collagenase tác dụng trực tiếp lên collagen (Seifter và Harper, 1971) Tiếp

đó, nhiều tác giả liên tục công bố những công trình nghiên cứu về các chế phẩm enzyme collagenase mà sau này được biết đến với tên gọi clostridiopeptidase A (Seifter và Harper, 1971), clostridiopeptidase B hay enzyme collagenase A và enzyme collagenase B, hai loại enzyme đầu tiên dưới dạng thương phẩm Đến năm 1962, hầu

hết nghiên cứu đều tập trung vào tinh chế enzyme collagenase của C histolyticum

Những năm sau này, enzyme collagenase của các vi sinh vật cũng được công bố

Điển hình là của vi sinh vật biển Vibrio B - 30 (Joseph, 1978) và Achomobacter iophapus (Billes và Keil, 1976)

Ngoài enzyme collagenase từ những vi sinh vật điển hình trên, còn có thể tìm

thấy enzyme collagenase từ một số vi sinh vật khác như Pseudomonas marinoglutinosa (Hanada et al., 1973), Pseudomonas sp (Hisano et al., 1989), Bacillus alvei DC - 1 (Kawahara et al., 1993), Bacillus cereus (Kaulo et al., 1987), Streptomyces sp (Endo et al., 1987), Cytophaga sp L43 - 1 (Sasagawa et al., 1993)

Hầu hết các vi sinh vật này được phân lập từ đất và một số từ hệ vi sinh vật biển

Hình 8 Pseudomonas sp., C Histolyticum và Aspergillus oryzae

(*Nguồn: http://www.foodprocessing-technology.com/projects/kikkoman/kikkoman2.html ngày 29/05//2014)

Bảng 5 Một số enzyme collagenase từ một số nguồn vi sinh vật

Enzyme Nguồn gốc Cơ chất và phân tích Đặc tính

Collagenase Bacillus subtilis Collagen không tan gelatin MW: 125000 Chất ức chế

EDTA, trypsine, iodoacetamide, acid odoacetic, 2-β-

mecaptoethanol và DFP

Collagenase Clostridium

histolyticum

Collagen tự nhiên, phenylazobenzyloxycarbonyl

4 Pro 4 Leu 4 Gly 4 Pro 4 D 4 Arg Cần có mặt của Zn, Ca

MW: 105000 (từ các tiểu phần có trọng lượng là 24 và 28 kDa)

Collagenase

A

Clostridium histolyticum

Collagen, gelatin, peptide tổng hợp: Z-Gly-Pro-Gly- Gly-Pro-Ala.OH

MW: 105000 Phụ thuộc Ca, cần

Zn Sản phẩm phân cắt cơ chất tạo ra các peptide đầu NH 2 -Gly Collagenase

B

Clostridium histolyticum

Gelatin; không thủy phân collagen; có thể thủy phân peptide tổng hợp: Z-Gly-Pro- Gly-Gly-Pro-Ala.OH

MW: 57400 Phụ thuộc Ca, cần

Zn Sản phẩm phân cắt cơ chất tạo ra các peptide đầu NH 2 -Gly

Pleudocolla Clostridium Gelatin; không thủy phân

- genase histolyticum collagen; có thể thủy phân

peptide tổng hợp: Gly-Gly-Pro-Ala.OH

Z-Gly-Pro-Collagenase Aspergillus

oryzae

Hemoglobin, peptide tổng hợp, N-acetyl Tyrosine ethyiester, gelatin, collagen nguyên thủy (chế biến từ da

cá dưới dạng nhầy)

MW: 20000 Hoạt động không cần ion kim loại, pH tối ưu là 9,0 -10

(*Nguồn: Tô Kim Anh, 2004)

2.2.3 Một số tính chất của enzyme collagenase

2.2.3.1 Kích thước và cấu trúc phân tử enzyme collagenase

Enzyme collagenase là những protein có kích thước phân tử lớn và cấu trúc phân

tử không giống nhau Ngày nay, dựa vào tiến bộ khoa học, phương pháp xác định cấu trúc phân tử của enzyme là phương pháp điện di trên SDS - PAGE (Sodium Dodecyl

hành khi enzyme ở dạng tinh khiết

Cấu trúc phân tử enzyme collagenase có thể được hình thành bởi các đơn vị Enzyme collagenase A có kích thước phân tử 100kDa được phát hiện có 4 đơn vị không có hoạt tính enzyme với tổng trọng lượng mỗi phần là 25kDa (Seifter và

Harper, 1971), Vibrio B có 30 đơn vị, bao gồm 2 đơn vị có kích thước phân tử không

giống nhau 24kDa và 28kDa (Merkel và Dreisbach, 1975) Một số enzyme collagenase

vi sinh vật cũng như enzyme collagenase của mô tồn tại dưới dạng isozyme như phức

hợp enzyme collagenase của C histolyticum:  - enzyme collagenase (68kDa),  - enzyme collagenase (115kDa),  - enzyme collagenase (79kDa),  - enzyme collagenase (110kDa),  - enzyme collagenase (125kDa),  - enzyme collagenase

(100kDa) (Bond và Van Wart, 1984) Aspergillus alginoliticus chứa ba dạng isozyme

có kích thước phân tử khác nhau là 110kDa, 90kDa và 70kDa (Tsugita et al., 1986)

Trong môi trường nuôi cấy của Streptomyces sp các nhà khoa học cũng phân tách

được hai dạng isozyme có trọng lượng phân tử gần giống nhau là 90kDa và 90kDa - 110kDa (Endo et al., 1987)

2.2.3.2 Độ bền của enzyme

Phần lớn các enzyme collagenase được phát hiện có khoảng pH hoạt động ở

chúng cũng không vượt quá mức pH kiềm Chẳng hạn enzyme collagenase của

Bacillus alvei DA - 1 được phát hiện là hoạt động trong vùng pH acid yếu cho tới

trung tính (pH 4,5 - 7,0), hoạt tính mạnh nhất ở pH 6,0 nhưng khi pH 4,0 vi khuẩn này

giảm hơn 30% hoạt tính (Kawahara et al., 1993) Dòng vi khuẩn Klebseilla pneumoniae CNL3, ở pH 4,0 gần 90% hoạt tính được giữ lại (Warinda

Suphatharaprateep et al., 2011) Theo Nakayama et al (2000), tìm được dòng vi khuẩn chịu nhiệt có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase trong môi trường acid (pH < 4,8), hoạt tính enzyme mạnh nhất ở pH 3,9 và mất hoàn toàn hoạt tính ở pH 5,8 Đây được xem là enzyme đầu tiên trong số các enzyme collagenase đã được biết đến có

khả năng hoạt động trong vùng acid yếu

Nhiệt độ hoạt động của các enzyme collagenase theo nhiều nghiên cứu thường dưới nhiệt độ 40oC Dòng Bacillus sp hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 37oC (Gupta et al.,

2005), đối với Microbacterim liquefaciens nhiệt độ tối ưu trong khoảng nhiệt độ 37 -

42oC (Kanayama et al., 2005) Các enzyme này thường bị giảm hoạt tính khi tăng nhiệt

độ lên hoặc trên 45oC (Sasagawa et al., 1993) Trường hợp Bacillus cereus hoạt tính

enzyme collagenase giảm 50% khi nhiệt độ khoảng 55 - 60oC (Singh et al., 1994), đặc

biệt trường hợp enzyme collagenase của Vibrio B - 30, enzyme này bị mất tới 94%

hoạt tính khi tăng nhiệt độ lên 45oC (Merkel và Dreisbach, 1978) Tuy nhiên, vẫn phát hiện được một số dòng vi khuẩn hoạt động trên mức nhiệt độ 45oC như enzyme

collagenase của dòng Bacillus subtilis FS-2 phân lập từ nước mắm hoạt động tốt nhất

ở nhiệt độ 50o

C (Nagano et al., 1999)

2.2.3.3 Tính đặc hiệu của enzyme collagenase

Hầu hết các enzyme collagenase có tính đặc hiệu cao đối với collagen Đa phần các enzyme tách được không kèm theo hoạt tính với casein hoặc hemoglobin, ngoại

trừ trường hợp enzyme collagenase của Pseudomonas sp., hai hoạt tính enzyme

collagenase và enzyme caseinase luôn đi kèm chung với nhau

Enzyme collagenase của vi khuẩn có khả năng phân cắt tốt hơn so với các enzyme collagenase khác của mô Enzyme clostridiopeptidase có thể tác động đến 200

vị trí trên chuỗi xoắn trong khi enzyme collagenase chỉ có thể phân cắt tại một vị trí của chuỗi xoắn (Seifter và Harper, 1971)

Enzyme collagenase của C histolyticum có khả năng mở chuỗi xoắn ở liên kết X

- Glycine trong trình tự Gly - Pro - Y (Takeuchi et al., 1992) Tương tự, enzyme

collagenase của Vibrio B - 30 theo cùng một trình tự như enzyme collagenase của C histolyticum Tuy nhiên, enzyme này có khả năng phân cắt nhiều loại collagen khác nhau tốt hơn enzyme của C histolyticum (Peterkofsky, 1982)

2.2.4 Một số ứng dụng của enzyme collagenase

Các khả năng của enzyme collagenase đều dựa trên tính đặc hiệu cao của enzyme khi nó chỉ phân cắt những liên kết peptide nhất định trên phân tử collagen mà không làm ảnh hưởng đến các protein khác Các chế phẩm enzyme collagenase có thể sử dụng được hoặc ở dạng tinh khiết hoặc ở dạng chế phẩm không hoàn toàn tinh khiết hay có chứa các enzyme protease khác khi mục tiêu là phân hủy một phần cơ chất collagen và protein nói chung Do không ở dạng tinh khiết, đòi hỏi các enzyme collagenase này phải không chứa các chất có độc tính và đạt đủ mức độ an toàn cho việc sử dụng, đặc biệt là khi sử dụng trong thực phẩm

Theo Gallop (1957), enzyme collagenase được dùng để phân cắt collagen thành các chuỗi xoắn phục vụ cho nghiên cứu quá trình hình thành cấu trúc xoắn của collagen Bên cạnh những nghiên cứu về cấu trúc phân tử collagen, enzyme collagenase còn được dùng trong việc xác định collagen cho phép khẳng định bản chất collagen của protein được tổng hợp (Seifter và Harper, 1971)

Cũng giống như collagen, enzyme collagenase có khá nhiều ứng dụng trong các ngành công nghi ệp như: thực phẩm (làm m ềm thịt, cải thiện cảm quan của thit ̣), công nghiệp hóa chất, nghiên cứu tách chiết collagen và đặc biệt là trong y học, dược phẩm,

mỹ phẩm (làm vỏ thuốc, da nhân tạo)

2.2.4.1 Trong nghiên cứu tách chiết collagen

Nghiên cứu ứng dụng enzyme collagenase để tách chiết collagen từ nhiều nguyên vật liệu như gia súc, gia cầm, nhất là từ các phụ phẩm phế thải trong ngành chế biến thủy sản (cá da trơn, tôm) đang được nhiều nhà khoa học quan tâm, vì thành phần chính trong những phụ - phế phẩm này (nhiều nhất là da và xương) là collagen Đặc biệt, collagen từ thủy sản được đánh giá có khả năng ứng dụng cao không những trong ngành thực phẩm mà còn trong ngành mỹ phẩm và dược phẩm (Meena et al., 1999 và Bryan Jeunet al., 2002) Để cuối cùng tạo ra sản phẩm an toàn, giá thành hợp lý với người sử dụng, đồng thời góp phần làm giảm lượng lớn chất phế thải tránh ô nhiễm môi trường và mang lại nguồn lợi kinh tế lớn

2.2.4.2 Trong công nghiệp thực phẩm

a Làm mềm và cải thiện chất lượng thịt

Cấu trúc phân tử của collagen và tương tác của nó với các cấu tử khác trong mô liên kết là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới đặc tính cấu trúc của thịt và sản phẩm thịt (Bailey, 1984) Các liên kết chéo trong phân tử collagen tăng theo tỉ lệ thuận so với độ tuổi động vật và vì thế làm tăng độ rắn chắc của thịt (Lê Ngọc Tú et al., 1994) Một trong những giải pháp làm tăng độ mềm của thịt là phân cắt cấu trúc xoắn của phân tử collagen, làm duỗi mạch protein để đạt được cấu trúc và độ mềm mong muốn, không kèm theo sự phân cắt các sợi myosin

Các enzyme được dùng làm mềm thịt từ trước tới nay thường là papain, bromelain, ficin, trong đó papain được xem là enzyme hiệu quả nhất do có khả năng tác động lên các vùng xoắn đầu mạch trong phân tử collagen (Brocklehurt et al., 1981) Tác dụng cơ bản của những enzyme này là hoạt động thuỷ phân protein không đặc hiệu và phân cắt toàn bộ phân tử protein Vì thế, việc sử dụng các loại enzyme này hoặc không có mấy tác dụng trong cải thiện thịt chứa nhiều collagen, hoặc ngược lại,

có thể gây ra hiện tượng phân cắt quá mức cấu trúc của thịt và tạo ra thịt chất lượng không tốt Rất nhiều công nghệ tiến bộ được áp dụng để cải thiện thịt sau khi làm mềm bằng các loại enzyme này Mặc dù vậy, cấu trúc thịt nhận được sau quá trình làm mềm vẫn không đạt được yêu cầu về cấu trúc, hoặc quá cứng, hoặc quá mềm làm giảm chất lượng cảm quan thịt Hương vị thịt bị biến đổi, đôi khi bị biến đổi đến mức không thể chấp nhận được Với việc không có khả năng tác động lên collagen khi sử dụng các chế phẩm enzyme này nên khả năng cải thiện chất lượng thịt cho hiệu quả thấp (đối với thịt chứa nhiều collagen)

Khả năng sử dụng enzyme collagenase làm mềm, nâng cao chất lượng thịt đã được thử nghiệm và công bố trong một số nghiên cứu gần đây Enzyme collagenase đặc biệt hiệu quả trong trường hợp nâng cao khả năng khai thác và tận dụng thịt chứa nhiều collagen như thịt bò, cá hồi Khai thác ưu thế này có sử dụng enzyme collagenase cho phép để sản xuất ngay cả các sản phẩm cao cấp như xúc xích hoặc bít-tết, nâng cao giá trị của sản phẩm tạo ra

Ngày nay, cùng với sự gia tăng dân số, nhu cầu về số lượng và chất lượng thực phẩm ngày càng lớn (trong đó có các loại thịt) Thịt bò là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao và được tiêu thụ mạnh ở nhiều nước, nhất là ở các nước phương Tây

Để nâng cao hơn nữa mức tiêu thụ loại thịt này cần có công nghệ làm mềm thịt tạo ra các sản phẩm thịt cấu trúc được nâng cao chất lượng từ thịt bò

b Biến đổi cấu trúc protein

Trong công nghiệp thực phẩm, các enzyme protease được dùng để thay đổi cấu trúc protein nhằm cải biến một số tính chất dinh dưỡng hoặc chức năng của chúng Vai trò của enzyme ở đây là thực hiện phản ứng thủy phân từng phần, làm biến đổi cấu trúc protein Enzyme collagenase là một trong số những enzyme protease được dùng với mục đích biến đổi cấu trúc protein để đạt được hiệu quả mong muốn Khi bị biến đổi một phần, các tính chất chức năng và cảm quan của protein được cải thiện như khả năng giữ nước, khả năng nhũ tương hóa, tạo bọt, độ dai,…

c Hiện tượng dị ứng thực phẩm và khả năng sử dụng enzyme collagenase làm giảm tính dị ứng

Sử dụng enzyme collagenase làm giảm tính gây dị ứng của một số protein thực phẩm Các trường hợp dị ứng thực phẩm thực sự phổ biến trong vòng 15 năm trở lại đây Nhiều báo cáo về hiện tượng này cho thấy số lượng người bị dị ứng do thực phẩm gây nên tăng dần trên quy mô toàn cầu (Furcolo et al., 1996)

Mặc dù tính chất của các protein gây dị ứng còn chưa được xác định đầy đủ, nhưng nói chung các protein gây dị ứng có kích thước phân tử khoảng 10 - 70kDa, có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch (cảm ứng sự sản sinh kháng thể IgE đặc hiệu chất dị ứng) Các protein này khá bền với nhiệt trong quá trình chế biến và ít bị phân cắt bởi các enzyme protease Trong nhiều trường hợp, các chất gây dị ứng được xác định là các protein cụ thể Theo khảo sát, sữa bò, trứng, bột mì, bột gạo và cá là các thực phẩm gây dị ứng thường gặp nhất (Furcolo et al., 1996) Nhóm tác giả Watanabe

et al (1994) đã đề cập đến khả năng tạo ra các sản phẩm không gây dị ứng khi xử lý protein gây dị ứng với enzyme collagenase, cho thấy chúng có tính chất công nghệ thích hợp hơn là khi xử lý với các enzyme protease thông thường khác do các enzyme này phân giải quá mức protein Nghiên cứu này đã mở đường cho ý tưởng sử dụng enzyme collagenase như một công cụ có khả năng trong việc tác động lên cấu trúc protein và làm giảm khả năng gây dị ứng các protein dạng này mà vẫn giữ được các tính chất công nghệ cần thiết của chúng

2.2.4.3 Trong y tế, dƣợc phẩm và mỹ phẩm

Năm 1998, vai trò xúc tác và mục đích của enzyme collagenase trong việc ngăn chặn sự phát triển các khối u do khả năng phân cắt trình tự hexapeptide melphalan Pro

- Gln - Gly - Ile - Mel - Gly tạo thành tripeptide melaphan Ile - Mel - Gly có độc tính

tế bào cao đã được phát hiện (Timar, 1998) Đây được xem như một khả năng hứa hẹn cho sản xuất các chế phẩm thuốc có hoạt tính enzyme collagenase cao để ngăn ngừa khối u

Nhờ khả năng phân cắt đặc hiệu collagen, enzyme collagenase được sử dụng như công cụ hữu ích để phân tách các thành phần cấu trúc trong mô liên kết, phân tách tế bào trong mạng lưới mô liên kết Ngoài ra, enzyme collagenase có thể được sử dụng trong nghiên cứu các tiến trình của một số loại bệnh và cơ chế làm lành vết thương (Seifter và Harper, 1971) Hiện nay, enzyme collagenase đã được công nhận để điều trị bệnh co cứng Dupuytren, sử dụng enzyme collagenase dưới dạng thuốc bôi hoặc các băng viết thương trong điều trị bỏng Enzyme collagenase còn là một loại thuốc để điều trị cho những bệnh nhân nam bị cong dương vật (còn gọi là bệnh Peyronie), được

Cơ quan Quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (FDA) thông qua với công dụng mới của thuốc xiaflex (enzyme collagenase clostridium histolyticum)

Bên cạnh sử dụng enzyme collagenase cho những ứng dụng trên, enzyme collagenase còn là enzyme có khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như công nghiệp da, công nghiệp mỹ phẩm trong sản xuất các loại kem tảy da chết,…

Một số ứng dụng của enzyme collagenase trong y học:

Phân tách mô tế bào: Enzyme collagenase có tầm quan trọng đặc biệt khi phân

tách các mô quá nhiều sợi (thớ), hoặc quá nhạy cảm cho phép sử dụng trypsin, chất mà không ảnh hưởng lên các vật liệu sợi và phá hủy các vật liệu không bền Sự phân tách thường được thực hiện hoặc bằng cách ngâm toàn bộ cơ quan hoặc bằng cách ủ một mẫu nhỏ của mô cùng với enzyme hòa tan Enzyme collagenase đã được ứng dụng

thành công cho việc phân lập rộng rãi và đa dạng các loại tế bào

Phân tách các tế bào tiểu đảo Langerhan của tuyến tụy: Enzyme collagenase ứng

dụng quan trọng trong sự phân lập các tế bào tiểu đảo Langerhan của tuyến tụy khi trong tiểu đảo này có nhiều tế bào khác nhau Trong quá trình này có một số nhân tố giới hạn sự thành công của phương pháp bao gồm những sự khác nhau đáng kể trong việc chuẩn bị cho enzyme collagenase hoạt động, các nhân tố gây độc cho tế bào β - cell và tác dụng của enzyme collagenase lên tính di truyền miễn dịch và tính động học

của tế bào tiểu đảo

Phân lập các tế bào cơ tim: Enzyme collagenase cũng được sử dụng trong việc

phân lập các tế bào cơ tim Sự phân tách các mô được tiến hành bằng cách ngâm nguyên vẹn cơ quan trong dung dịch enzyme, trong đó enzyme collagenase được chọn lựa hoặc một mình hoặc kết hợp với một enzyme khác chẳng hạn enzyme hyaluronidase hoặc trypsin Enzyme collagenase có thể được sử dụng khi phân tách một cách hoàn toàn bằng cách ngâm mô nhỏ vào dịch enzyme

Phân lập các tế bào gan: Các tế bào gan được phân lập sử dụng trong nghiên cứu

các tế bào thúc đẩy sự phát triển của khối u, trong nghiên cứu các cơ chế điều khiển tế bào, trong dược phẩm và các hệ thống phân tích chất gây ung thư Thêm vào đó, phân lập các tế bào gan cho cấy ghép đang được sử dụng như là một mô hình điều trị cho các bệnh nhân bị hỏng chức năng gan hoặc bị sai lệch cơ chế trao đổi chất phụ thuộc

vào gan

Phân lập các tế bào khối u: Toàn bộ các tế bào khối u cần phải được phân lập để

nghiên cứu từ các mô ung thư nhằm mục đích điều chế vaccine để phòng chống ung

Chẩn đoán các tế bào ung thư phổi: Sự tăng enzyme collagenase hoạt động trong

đại thực bào phân lập từ cuống phổi là dấu hiệu chuẩn để chẩn đoán các tế bào ung thư phổi

Phân lập tế bào từ các mô khác: Enzyme collagenase được ứng dụng thành công

trong việc phân lập các tế bào từ mô xương, mô sụn, tuyến giáp trạng, mô buồng trứng, mô dạ con, mô biểu bì, màng trong của tế bào, các tế bào thần kinh và các tế bào khác

2.2.5 Tình hình nghiên cứu enzyme collagenase trên thế giới và Việt Nam 2.2.5.1 Nghiên cứu enzyme collagenase trên thế giới

Trên Thế gới, những nghiên cứu về enzyme collagenase đều chủ yếu tập trung vào tìm kiếm và làm phong phú quỹ gen enzyme từ nhiều nguồn khác nhau Trong thời gian gần đây, các nghiên cứu hướng vào tìm kiếm những nguồn gen biểu thị vốn rất đa dạng trong giới vi sinh vật Từ đây mở ra khả năng thu nhận enzyme collagenase

có hoạt tính enzyme cao bằng công nghệ đơn giản, dễ kiểm soát và chi phí thấp hơn so với việc thu nhận enzyme từ nguồn khác Thêm vào lợi thế của enzyme vi sinh vật thường có khoảng hoạt động rộng hơn và khả năng phân cắt mạnh hơn đối với nhiều enzyme khác

Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase được phát hiện phần

lớn phân lập từ môi trường đất như C histolyticum, P marinoglutinosa, Pseudomonas

sp Tuy nhiên, những vi sinh vật này lại sinh ra độc tố (Kawahara, 1993) Bên cạnh

đó, cũng có một số vi sinh vật như Bacillus cereus CNA1, Klebsiella pneumoniae

CNL3 được phân lập từ những thực phẩm lên men của Châu Á có hoạt tính enzyme collagenase (Warinda Suphatharaprateep et al., 2011) Việc ứng dụng enzyme collagenase trong các lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm hay y học phải là những enzyme collagenase vi sinh vật an toàn, không sinh độc tố, điển hình là dòng vi

khuẩn Bacillus subtilis FS-2 được ứng dụng khá nhiều trong lĩnh vực thực phẩm

Nagano et al (1999) đã tiến hành nghiên cứu tách chiết enzyme collagenase từ dòng

Bacillus subtilis FS-2 và thu được nhiều kết quả khả quan

Qua đó, đảm bảo sản phẩm tạo ra không gây nguy hiểm cho đối tượng sử dụng

Vì vậy, việc nghiên cứu tìm kiếm các nguồn cho enzyme collagenase an toàn, hoạt lực cao với các đặc tính quý đến nay vẫn là mục tiêu nghiên cứu của nhiều nhà khoa học

2.2.5.2 Nghiên cứu enzyme collagenase ở Việt Nam

Ở Việt Nam, có rất nhiều công trình nghiên cứu về enzyme protease đã được công bố và một số kết quả nghiên cứu đã có ứng dụng cụ thể như sử dụng acid protease trong y tế và chăn nuôi (Nguyễn Quỳnh Anh, 1985), trong sản xuất thử pancreatin (Phạm Quốc Thăng et al., 1983), sử dụng enzyme protease trong sản xuất bia, thử nghiệm thay thế enzyme protease - K trong kỹ thuật gen, trong sản xuất nước mắm hay tận dụng phế liệu thủy sản và một số sản phẩm khác Tuy vậy, nghiên cứu về enzyme collagenase lại rất hạn chế và rất ít công trình công bố về vấn đề này Đã có nhiều thử nghiệm sử dụng enzyme collagenase trong điều trị bỏng từ enzyme collagenase thương phẩm tại Viện bỏng Quốc gia, nhưng hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về khả năng thu nhận enzyme collagenase

Năm 2004, Tô Kim Anh đã thực hiện nghiên cứu phân lập, tuyển chọn, tạo chủng giống sinh tổng hợp enzyme collagenase và ứng dụng trong thực phẩm Nghiên cứu này là một nhánh thuộc đề tài nghiên cứu ứng dụng enzyme trong chế biến một số nông sản thực phẩm của Ngô Tiến Hiển (2004) Nghiên cứu đã ghi nhận được những kết quả hữu ích cho việc ứng dụng thu nhận enzyme trong thực phẩm Cụ thể, nghiên

cứu đã tuyển chọn được dòng vi khuẩn Bacillus subtilis FS-2 từ một số thực phẩm lên

men ở khu vực Châu Á và khảo sát các điều kiện ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase Bước đầu xây dựng hoàn chỉnh quy trình thu nhận chế phẩm

enzyme collagenase từ chủng Bacillus subtilis FS-2 tự nhiên, quy trình tinh chế và xác

định đặc tính enzyme collagenase đồng thời phân lập gen mã hóa sinh tổng hợp enzyme collagenase bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Ngoài ra, cũng thu nhận nhiều kết quả khi ứng dụng chế phẩm enzyme collagenase vào sản xuất để kiểm tra tính an toàn của chế phẩm, khả năng phân hủy collagen, khả năng làm mềm thịt, khả năng phân hủy một số protein dị ứng và sử dụng enzyme collagenase trong sản xuất nước mắm bằng cách thăm dò khả năng phân hủy da cá của enzyme

collagenase thương phẩm với enzyme collagenase của Bacillus subtilis FS-2 sau 4

tháng ướp chượp

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: Từ tháng 09/2013 đến tháng 04/2014

Địa điểm: PTN Sinh học phân tử thực vật, PTN hóa sinh thực phẩm thuộc Viện

NC&PT Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

3.2 Phương tiện nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu thí nghiệm

- Mẫu là ba loại mắm cá: mắm cá cơm, mắm cá linh và mắm cá sặc (có nguồn

gốc tại huyện Châu Đốc, tỉnh An Giang)

- Gelatin dùng làm cơ chất phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng

hợp enzyme collagenase

- Collagen dùng làm cơ chất cấy chuyển sau khi đã tách ròng các dòng vi

khuẩn trên cơ chất gelatin

- Máy đo OD Genesye 10UV - Đức

- Máy lắc mẫu New Brunswich Scientific - Hoa Kỳ

- Máy ly tâm Hermle Z160m - Đức

- Máy khuấy từ IKA C-MAG HS7 - Đức

- Nồi khử trùng nhiệt ướt Phinternational - Ý

- pH kế Eutech Instrument - Malaysia

- Tủ cấy vi sinh vật Telstar - Tây Ban Nha

3.2.2.2 Hóa chất

Thành phần môi trường phân lập vi khuẩn:

Tên hóa chất Khối lượng (gram)/lít môi trường

(*Nguồn: Raper và Fennell, 1965)

Bảng 7 Thành phần môi trường tăng sinh

Tên hóa chất Khối lượng (gram)/lít môi trường

(*Nguồn: Raper và Fennell, 1965)

Hóa chất đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase (phương pháp đo vòng phân giải): dung dịch TCA 35% (Trichloroacetic acid), collagen

Hóa chất khảo sát hoạt tính enzyme collagenase: cồn ethanol 50%, dung dịch ninhydrin 2% (pha bằng cồn ethanol 50%), dung dịch Acetic acid 0,1M, dung dịch đệm Tris - HCl 50mM (pH 7,5), leucine, collagen, nước cất khử trùng

Hóa chất nhuộm gram: Crystal violet, Iod, cồn ethanol (70o), Fuchsin và nước cất khử trùng

Hóa chất thử nghiệm sinh hóa:

- Thử nghiệm Amylase: Tinh bột 1%, NaCl 0,1%, dung dịch Iod 0,02N

- Thử nghiệm Catalase: H2O2 3%

- Thử nghiệm Indol:

+ Môi trường Tryptone: Tryptone (20g) trong 1 lít môi trường, pH 6,9 0,2

- Thử nghiệm Methyl Red (MR):

+ Thuốc thử MR 0,02% pha trong cồn 96o với tỉ lệ cồn với nước là 3 : 2, bảo quản nhiệt độ 4oC

+ Môi trường Glucose Phosphate (MR - VP broth): Peptone (7g), KH2PO4 (5g), glucose (5g) trong 1 lít môi trường, pH 6,9 0,2

- Thử nghiệm Voges Proskauer (VP):

+ Thuốc thử KOH 40%

+ Môi trường Glucose Phosphate (MR - VP broth): Peptone (7g), KH2PO4 (5g), glucose (5g) trong 1 lít môi trường, pH 6,9 0,2

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase trên môi trường Czapek cải tiến

Mục đích: Phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme

collagenase phát triển trên hai môi trường chứa gelatin và môi trường chứa collagen

Nguyên tắc: Chọn những khuẩn lạc phát triển được trên môi trường chứa gelatin

sau khi cấy trải, tiến hành cấy chuyển đến khi tách ròng từng dòng vi khuẩn Sau đó, cấy chuyển khuẩn lạc từ môi trường chứa gelatin sang môi trường chứa collagen

Cách tiến hành:

Quy trình phân lập vi khuẩn:

Thu mẫu

 Đồng nhất mẫu

 Pha loãng mẫu

 Cấy trải trên đĩa petri môi trường bổ sung gelatin, ủ nhiệt độ 35oC trong 48 giờ

ở điều kiện hiếu khí

 Cấy chuyển sang đĩa môi trường bổ sung gelatin mới và kiểm tra độ ròng

 Cấy chuyển trên môi trường bổ sung collagen



Quan sát hình thái khuẩn lạc

 Trữ giống vi khuẩn

Lưu ý: Đĩa petri và môi trường phân lập được khử trùng nhiệt ướt ở 121o

C, áp suất 1atm trong 20 phút Khi nhiệt độ khử trùng đã hạ xuống khoảng 70oC - 80oC thì lấy ra và phân phối vào đĩa petri Các thao tác phân phối và để nguội môi trường được tiến hành trong tủ cấy đã được khử trùng bằng tia UV

 Chuẩn bị mẫu

Thu mẫu: Mẫu là ba loại mắm cá: mắm cá cơm, mắm cá linh và mắm cá sặc

Mắm cá được chế biến theo phương pháp thủ công truyền thống với nguyên liệu chính

là cá và muối Mẫu có nguồn gốc ở huyện Châu Đốc, tỉnh An Giang và được mua tại chợ Xuân Khánh, Thành phố Cần Thơ

Đồng nhất mẫu: Cân 5gram mỗi loại mắm cá hòa với 15ml nước cất khử trùng,

lấy 10ml dịch trích mỗi mẫu cho vào bình tam giác có chứa 90ml môi trường tăng sinh chứa gelatin, tất cả đem ủ trong 48 giờ ở nhiệt độ 35oC, lắc 120 vòng/phút

 Pha loãng mẫu

Sau 48 giờ lắc ủ, tiến hành pha loãng mẫu đến nồng độ 10-8

Bảng 8 Nồng độ pha loãng mẫu

Nồng độ pha loãng 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7 10 -8 Thể tích mẫu (µl) 100 100 100 100 100 100 100 100

Thể tích nước cất (µl) 900 900 900 900 900 900 900 900

Tổng thể tích (µl) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000

 Cấy trải vi khuẩn

Chọn 4 nồng độ pha loãng là 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 để tiến hành cấy trải

Dùng micropipette hút 30µl dịch vi khuẩn ở mỗi nồng độ, nhỏ vào giữa đĩa môi trường phân lập vi khuẩn, dùng que trải đều giọt vi khuẩn khắp đĩa thạch và để khô mẫu tự nhiên Úp ngược đĩa petri và ủ nhiệt độ 35oC trong 48 giờ, sau đó tiến hành tách ròng từng khuẩn lạc khác nhau

 Cấy chuyển

Tiến hành cấy chuyển để tách ròng từng khuẩn lạc (tất cả các thao tác đều được thực hiện trong tủ cấy vô trùng bao gồm đồng nhất mẫu, cấy trải, cấy chuyển) Các