khảo sát ảnh hưởng của chất điều hõa sinh trưởng và nước dừa lên sự sinh trưởng và phát triển của mô sẹo măng tây xanh (asparagus officinalis l )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÕA SINH TRƯỞNG VÀ NƯỚC DỪ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÕA SINH TRƯỞNG VÀ NƯỚC DỪA LÊN SỰ SINH TRƯỞNG

VÀ PHÁT TRIỂN CỦA MÔ SẸO MĂNG TÂY XANH

(Asparagus officinalis L.)

MSSV: 3102822

LỚP: CNSH K36

Cần Thơ, tháng 05/2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÕA

SINH TRƯỞNG VÀ NƯỚC DỪA LÊN SỰ SINH TRƯỞNG

VÀ PHÁT TRIỂN CỦA MĂNG TÂY XANH

(Asparagus officinalis L.)

MSSV: 3102822

LỚP: CNSH K36

Cần Thơ, tháng 05/2014

PHẦN KÝ DUYỆT

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức chuyên môn cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường Xin gửi lời cám ơn đến các thầy cô, cán bộ của Viện, đặc biệt là cô Nguyễn Thị Liên hướng dẫn, quan tâm và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin cảm ơn cha mẹ, anh chị và các bạn đã khuyến khích và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi xin kính chúc quý thầy cô, anh chị cùng các bạn sinh viên dồi dào sức khỏe

và công tác tốt

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

Nguyễn Hoàng Khuyên

TÓM LƢỢC

Đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và nước dừa lên sự sinh trường và phát triển mô sẹo măng tây xanh (Asparagus officinalis L.)” được tiến hành nhằm xác định các môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của mô sẹo măng xanh góp phần làm cơ sở cho công tác nhân giống và cải thiện giống Các

mô sẹo được cấy vào môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng (BA 0-2 mg/l kết hợp NAA 0-1 mg/l), môi trường có bổ sung nước dừa (0-200 ml/l) và môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng (BA 0,5 mg/l kết hợp IBA 0-0,3 mg/l) Kết quả thí nghiệm cho thấy ở thời điểm 30 ngày sau khi cấy môi trường MS có bổ sung BA 0,5mg/l và NAA 0,5 mg/l được chọn để nhân cụm mô sẹo măng tây xanh với đường kính gia tăng tương đối của mô sẹo 200,67% Mô sẹo phát triển tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung nước dừa 200ml/l Tuy nhiên, nghiệm thức cho hiệu quả kinh tế là nghiệm thức có bổ sung nước dừa 150 ml/l cho đường kính gia tăng tương đối của mô sẹo là 162% Ở thời điểm 60 ngày sau khi cấy, môi trường MS có bổ sung

BA 0,5 mg/l và IBA 0,1 mg/l cho số chồi nhiều nhất đạt 33,67 chồi/cụm với chiều dài 13,52 mm/chồi

Từ khóa: Chất điều hòa sinh trưởng, mô sẹo măng tây xanh , nước dừa, phát triển, tái sinh chồi

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

TỪ VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2 1 Nguồn gốc và đặc tính thực vật của măng tây 2

2.1 1 Nguồn gốc của măng tây xanh 2

2.1 2 Đặc tính thực vật của măng tây xanh 3

2 2 Phân loại 3

2 3 Giá trị dinh dưỡng và giá trị dược liệu 4

2.3.1 Giá trị dinh dưỡng 4

2.3.2 Giá trị dược liệu 5

2 4 Phương pháp nhân giống măng tây truyền thống 5

2 5 Phương pháp nuôi cấy mô 6

2.5.1 Đôi nét về nuôi cấy mô 6

2.5.2 Thành phần môi trường nuôi cấy 7

2 6 Sơ lược về mô sẹo 13

2 7 Các nghiên cứu liên quan 14

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 16

3 1 Phương tiện 16

3.1 1 Thời gian và địa điểm 16

3.1 2 Dụng cụ, thiết bị 16

3.1 3 Nguyên vật liệu thí nghiệm 16

3.1 4 Hóa chất 16

3.1 5 Điều kiện thí nghiệm 17

3 2 Phương pháp 17

3.3 Bố trí thí nghiệm 17

3.3.1 Thí nghiệm 1: Hiệu quả của sự kết hợp BA-NAA lên sự sinh trưởng của mô sẹo măng tây xanh 17

3.3.2 Thí nghiệm 2: Hiệu quả của sự kết hợp BA-IBA lên sự tái sinh chồi từ mô sẹo măng tây 18

3.3.3 Thí nghiệm 3: Hiệu quả của nước dừa lên sự sinh trưởng của mô sẹo măng tây xanh 19

3.4 Xử lý số liệu 20

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

4.1 Thí nghiệm 1: Hiệu quả của sự kết hợp giữa BA-NAA lên sự sinh trưởng của mô sẹo măng tây xanh 21

4.2 Thí nghiệm 2: Hiệu quả của sự kết hợp BA-IBA lên sự tái sinh chồi từ mô sẹo măng tây 24

4.3 Thí nghiệm 3: Hiệu quả của nước dừa lên sự sinh trưởng của mô sẹo măng tây xanh 27

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO 31

PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần môi trường trong nghiên cứu

Phụ lục 2: Kết quả thí nghiệm

Phụ lục 3: Kết quả thống kê

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1: Giá trị dinh dưỡng trong chồi măng tây tươi (100 g) 4

Bảng 2: Nhu cầu các chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy 11

Bảng 3: Một số chất dinh dưỡng có trong nước dừa (100 g) 13

Bảng 4: Tỉ lệ nồng độ BA-NAA bổ sung trong môi trường 18

Bảng 5: Tỉ lệ nồng độ BA-IBA trong môi trường 19

Bảng 6: Hàm lượng nước dừa bổ sung vào môi trường 20

Bảng 7: Hiệu quả của sự kết hợp tỉ lệ BA-NAA lên đường kính gia tăng tương 22

đối của mô sẹo măng tây xanh 22

Bảng 8: Kết quả khảo sát hiệu quả của sự kết hợp BA- IBA lên sự tái sinh chồi ở thời điểm 60 ngày sau khi cấy 25

Bảng 9: Hiệu quả của nước dừa lên đường kính gia tăng tương đối (%) mô sẹo măng tây xanh 28

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1 Măng tây xanh 2

Hình 2 Mô sẹo măng tây 16

Hình 3 Màu sắc mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy 24

Hình 4 Chồi măng tây trên môi trường có BA-IBA 26

TỪ VIẾT TẮT

2,4-D: 2,4- diclorophenociacetic acid

ATP: Adenosine triphosphate

BA: 6-benzyl adenin

CAM: Crassulacean acid metabolism

DNA: Deoxyribonucleic acid

IAA: Indoacetic acid

IBA: indole-3-butyric acid

MS: Skoog & Murashige (1962)

NAA: α-Naphthalene acetic acid

NSKC: Ngày sau khi cấy

NT: Nghiệm thức

TDZ: Thidiazuron

RNA: Ribonucleic acid

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Măng tây là một loại rau được dùng làm thức ăn và dược liệu Theo Phạm Hoàng

Hộ (2000), măng tây được trồng để lấy măng ăn, còn lá măng tây dùng để trang trí Ngoài ra, măng tây còn có vai trò dược liệu, giúp cơ thể lợi tiểu, phục sức cho tim, trị

tê thấp, ung thư và chữa một số bệnh khác

Trên thế giới, măng tây được trồng nhiều vùng trên thế giới như ở châu Âu (Đức, Tây Ban Nha, Ý, ), châu Á (Trung Quốc, Thái Lan, Đài Loan, ), châu Mỹ (Hoa Kỳ, Peru, Mexico, ), châu Úc và châu Phi

Ở nước ta măng tây được trồng ở nhiều địa phương như ở Nghệ An, Bình Thuận, thành phố Hồ Chí Minh, Bến Tre và một số địa phương khác Mặc dù đây là loại cây trồng còn khá mới so với những giống cây trồng khác nhưng măng tây đang góp phần giúp tăng thu nhập cho nông dân Ngày nay, nhu cầu giống cây để mở rộng diện tích canh tác của nhiều người tăng nhưng giá cả hạt giống còn cao Vì thế việc sử sụng các hạt từ các cây lai để làm giống là khó tránh khỏi Điều này làm cho cây con tạo ra không đồng đều về mặt di truyền và có thể mang mầm bệnh Kết quả là năng suất của măng tây giảm đáng kể Trong khi đó, việc nhân giống măng tây bằng phương pháp nuôi cấy mô có thể khắc phục tình trạng trên vì đây là phương pháp cho hệ số nhân giống cao, tạo được số lượng lớn cây con sạch bệnh trong thời gian ngắn

1.2 Mục tiêu đề tài

Đề tài “Khảo sát hiệu quả của chất điều hòa sinh trưởng và nước dừa lên sự sinh

trưởng và phát triển của mô sẹo măng tây xanh (Asparagus officinalis L.)” nhằm tìm

ra môi trường thích hợp để nhân mô sẹo măng tây xanh Từ đó làm nguyên liệu cho công tác tạo giống măng tây xanh

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2 1 Nguồn gốc và đặc tính thực vật của măng tây

2.1 1 Nguồn gốc của măng tây xanh

( https://www.google.com.vn/search?q=hinh+anh+mang+tay+xanh, 4/8/2013)

Trên thế giới

Trên thế giới, măng tây được trồng đầu tiên ở khu vực Địa Trung Hải

Vào đầu thế kỷ XI, măng tây cũng được nhắc đến như một loại rau trong tu viện

ở Pháp và sau đó được trồng ở Đức

Thế kỷ XVI, măng tây được trồng nhiều ở Anh và Pháp

Thế kỷ XVII, măng tây được trồng ở Hoa Kỳ

Thế kỷ XIX, măng tây trắng được biết đến ở Hà Lan

Ngày nay, măng tây được trồng phổ biến trên thế giới như châu Âu, châu Á, châu Phi, châu Úc, châu Mỹ Một số quốc gia có sản lượng măng tây cao như: Trung Quốc, Pháp, Hoa Kỳ, Tây Ban Nha,…

Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, măng tây được trồng ở một số tỉnh (thành phố) như: Nghệ An, Bình Thuận, Đà Lạt, thành phố Hồ Chí Minh Hiện nay có hai giống măng tây được trồng ở nước ta là măng tây xanh (giống F California 500) và măng tây trắng (giống F MaryWashington) (http://www.rauhoaquavn.vnspx?ID=45&LangID=1ID, 4/8/2013)

2.1 2 Đặc tính thực vật của măng tây xanh

Theo Đặng Minh Quân (2009) măng tây là cây thân cỏ Thân măng tây đứng, cao khoảng 1-2 m, có mang các cành hình lá biến đổi thành lá kim Măng tây sinh sản hữu tính Hoa măng tây đơn tính, có cả hoa đực và hoa cái trên cùng một cây Hoa rất nhỏ,

có màu vàng và mọc thành cụm 1-4 hoa ở nách lá Theo Caborali et al (1993) hoa măng tây xanh ở giai đoạn đầu là lưỡng tính nhưng sau đó trở thành đơn tính Hoa cái hình thành do nhị hoa bị tiêu biến, còn ở hoa đực nhụy hoa ngừng phát triển nhưng không tiêu biến

Quả có màu đỏ, nhỏ và có đường kính 6-10 mm Mỗi quả có 3 ngăn, mỗi ngăn

có 5-6 hạt màu đen Hạt có vỏ cứng Quả măng tây độc hại đối với con người

Thân rễ măng tây là nơi dự trữ chất dinh dưỡng, có nhiều chồi và nhiều rễ con giúp cây hấp thụ hơi nước

Cây măng tây thích hợp với vùng khí hậu nhiệt đới có nhiệt độ trung bình

25-33oC và có thể sống 25-30 năm trong điều kiện pH thích hợp nhất là 6,5 hoặc cao hơn một chút Đất trồng thích hợp là đất thịt pha sét, giàu chất hữu cơ, lớp đất mặt sâu và

ẩm vừa (Võ Văn Chi, 2003)

Chi (Genus): Asparagus

Loài (Species): Asparagus officinalis L

(http://www.botanyvn.com/cnt.officinalis&t=sciname, 4/8/2013)

2 3 Giá trị dinh dưỡng và giá trị dược liệu

Bảng 1: Giá trị dinh dưỡng trong chồi măng tây tươi (100 g)

Ngoài giá trị dinh dưỡng, măng tây còn được sử dụng như dược liệu do măng tây

có nhiều đặc tính sinh học khác nhau như chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống tổn thương gan (Negi et al., 2010) Người Hy Lạp và La Mã đã biết dùng măng tây trị đau răng và ngừa ong chích

Ngoài ra, măng tây có chứa chất asparagine là một chất lợi tiểu khá tốt, có khả năng phân cắt các sạn từ acid oxalic và acid urid tồn đọng tại bắp thịt và thận để loại ra khỏi cơ thể theo đường tiểu nên tốt cho người bị sạn thận Lượng nước và chất xơ giúp nhuận trường và trị được táo bón

Tại Trung Hoa, rễ măng tây được dùng trị ho ngứa cổ, ho ra máu, sưng cổ họng

và táo bón Theo Trung dược, rễ măng tây có vị đắng, tính ấm có tác dụng nhuận phế, trấn khái, khử đàm và sát trùng Các hợp chất trong măng tây có khả năng ngăn ngừa suy tĩnh mạch, bảo vệ tim, phòng ung thư, ngăn ngừa những bệnh liên quan đến đường tiêu hóa Tuy nhiên những người bị viêm khớp cấp tính và bệnh thần kinh không nên

ăn măng tây (http://www.tvvn.org/forum/showthread.php/G-T%C3%82Y, 4/8/2013)

2 4 Phương pháp nhân giống măng tây truyền thống

Măng tây thường được nhân giống bằng hạt Hạt măng tây được ngâm trong nước lạnh sau đó ủ trong tro trấu Sau khoảng 5 ngày hạt sẽ nảy mầm sau đó chuyển hạt sang bịch ươm có đất và phân hữu cơ Sau khi ươm 3 tháng, cây cao khoảng 25-30 cm thì có thể đem trồng

Măng tây cũng có thể nhân giống bằng rễ Rễ giống được chọn từ những cây trưởng thành khỏe mạnh từ một năm tuổi trở lên Sau khi trồng khoảng 4-6 tháng là có măng thu hoạch Phương pháp này thích hợp cho việc nhân giống ở quy mô nhỏ nhưng

khi ở quy mô lớn rất tốn kém vì tiền vốn mua măng tây giống (http://rausach.com.vn/forum_posts.asp?tle=cch-m-ging-cy-mng-ty#13725, 4/8/2013)

2 5 Phương pháp nuôi cấy mô

2.5.1 Đôi nét về nuôi cấy mô

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là sự nuôi cấy vô trùng các mô các tế bào, mô và

cơ quan trên môi trường nuôi cấy được xác định rõ thành phần Việc nuôi cấy được duy trì dưới các điều kiện được kiểm soát

Nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được Haberlant (1902) nghiên cứu đầu tiên Từ đó đến nay, lĩnh vực này phát triển nhanh chóng, đóng góp vào sự phát triển của sinh học

và nông nghiệp hiện đại

Ở Việt Nam, nuôi cấy mô đã được nghiên cứu hơn 30 năm Nhiều phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia, các trung tâm công nghệ sinh học với các trang thiết bị hiện đại ở các thành phố lớn như Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh và nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực được xây dựng ở các trường đại học, viện nghiên cứu, sở khoa học và công nghệ của tỉnh, thành phố Nuôi cấy mô ở nước ta đã đạt được một số thành tựu chủ yếu trong vi nhân giống cây cảnh, cây nông nghiệp, cây lâm nghiệp và dược liệu Hiện nay có nhiều vấn đề trong nghiên cứu nuôi cấy mô và tế bào thực vật như vi nhân giống, tạo phôi soma, tạo hạt tổng hợp, sản xuất các chất biến dưỡng thứ cấp,…đang được quan tâm nhằm tạo ra những giống mới đáp ứng những yêu cầu khác nhau

Cơ sở của nuôi cấy mô tế bào thực vật :

 Tính toàn năng của tế bào: mỗi tế bào đều mang lượng thông tin di truyền đầy

đủ của cơ thể và có khả năng phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi

 Khả năng biệt hoá: sự biến đổi một tế bào từ trạng thái tế bào phôi thành tế bào thể hiện một chức năng riêng biệt nào đó

 Khả năng phản biệt hóa: khả năng một tế bào đã biệt hóa có thể quay lại tế bào ban đầu sinh ra chúng-tế bào phôi

Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010) phương pháp này có một số ưu điểm như:

 Cho hệ số nhân chồi cao, rút ngắn thời gian nhân giống

 Tạo ra những cây con sạch bệnh

 Tạo được cây con đồng nhất về mặt di truyền

2.5.2 Thành phần môi trường dùng trong nuôi cấy mô

Khoáng đa lượng

Nitrogen

Theo Bùi Trang Việt (2002) nitrogen là thành phần của các acid amin, nucleotide, coenzyme Nitrogen có trong môi trường nuôi cấy ở dạng hữu cơ và vô cơ Nitrogen

vô cơ được tìm thấy dưới dạng NO3- và NH4+ Trong quá trình tạo phôi vô tính ở

Medicago sativa cần sự bổ sung NH4+ bên ngoài với lượng nhỏ nhất là 12,5 mM (Walker and Sato, 1981) Trong khi đó nitrogen hữu cơ có thể gặp ở dạng amino acid hoặc các polyamine Theo Vũ Văn Vụ (1999) sự kết hợp hai nguồn nitrogen giúp mẫu giảm được sự thiếu hụt nitrogen và giúp mẫu sinh trưởng tốt hơn

Phosphor

Phosphor là thành phần của một số đường phosphate, acid nucleic, nucleotide, coenzyme Phosphor trong nuôi cấy mô thường dùng ở dạng H2PO4-, HPO42- và PO43-(Cao Phi Bằng và Nguyễn Như Khanh, 2008)

Potassium

Potassium có vai trò trong sự cân bằng ion, cử động khí khẩu (Bùi Trang Việt, 2002) Potassium cũng làm tăng tính thấm của thành tế bào đối với các chất khác, làm tăng cường độ quang hợp và ảnh hưởng mạnh đến hô hấp (Vũ Văn Vụ et al., 1998) Potassium được cây hấp thụ dưới dạng K+

(Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Magnesium

Magnesium là thành phần của chlorophyll có chức năng hoạt hóa các enzyme trong hô hấp, quang hợp và sinh tổng hợp acid nucleic (Nguyễn Bảo Toàn, 2010) Cây hấp thụ magnesium dưới dạng Mg2+ (Bùi Trang Việt, 2002)

Calcium

Calcium là thành phần của vách tế bào, màng tế bào, cofactor cho một số enzyme liên quan đến sự thủy phân ATP và phospholipids Cây hấp thụ calcium dưới dạng

Ca2+ (Bùi Trang Việt, 2002)

Sulfur

Sulfur là thành phần của một số acid amin như cystein, methionin, biotin Sulfur được cây hấp thu dưới dạng SO42- (Bùi Trang Việt, 2002)

Sodium

Sodium liên quan đến sự tái sinh phosphoenolpyruvat trong thực vật C4 và CAM

và thay thế kali trong một số chức năng (Cao Phi Bằng và Nguyễn Như Khanh, 2008)

Chloride

Chloride cần cho sự phân chia tế bào của lá và rễ, điều hòa quá trình đóng mở khí khẩu và đóng vai trò quan trọng trong quá trình quang phân ly nước (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Khoáng vi lƣợng

Bor

Bo liên quan đến quá trình tổng hợp acid nucleic, sự vận chuyển carbohydrate (Bùi Trang Việt, 2002), điều hòa hoạt động của enzyme phenolase, biến dưỡng acid phenolic và tổng hợp lignin (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Cây hấp thu molypden dưới dạng MoO42- (Cao Phi Bằng và Nguyễn Như Khanh, 2008)

Copper

Copper tham gia hoạt hóa một số enzyme trong hô hấp và trong vận chuyển điện

tử (Nguyễn Bảo Toàn, 2010)

Ferric thường tạo phức hợp với các thành phần khác khi pH môi trường thay đổi Phức hợp này thường mất khả năng giải phóng ferric cho các nhu cầu trao đổi chất trong tế bào Trong nuôi cấy mô ferric dùng dưới dạng phức hợp với Ethylene Diamin Tetraacetic Acid vì các phức chất này giải phóng ferric trong một phạm vi pH khá rộng (Lê Trần Bình et al., 1997)

Nguồn carbonhydrate

Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng

nhưng một số trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ điều kiện ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp Do đó cần đưa vào môi trường nguồn cacbon hữu cơ Lượng chất hữu cơ cao sẽ hạn chế việc hấp thu nước của mô cây Ngược lại, hàm lượng chất hữu cơ thấp sẽ gây ra hiện tượng thủy tinh thể (Vũ Văn Vụ

et el , 2006) Nguồn cacbon thường dùng là sucrose với nồng độ là 1-6%, tùy mục đích nuôi cấy (Lâm Ngọc Phương và Lê Minh Lý, 2012) Ngoài sucrose có thể dùng thêm một số nguồn cacbon khác như glucose, maltose, lactose, galactose và cả những dạng polysaccharide như tinh bột, pectine, dextrin Các loại rượu như ethanol, methanol hoặc acid hữu cơ thì rất độc không phù hợp cho tế bào

Vitamin

Các loại mô và tế bào thực vật có khả năng tổng hợp các loại vitamin nhưng thường không đủ về lượng do đó cần bổ sung từ bên ngoài (Lê Trần Bình et al., 1997)

Vitamin B1 (Thiamin)

Là chất cần thiết cho môi trường nuôi cấy Khi bị hấp khử trùng ở điều kiện nhiệt

độ cao vitamin B1 sẽ bị nhiệt phân thành pyrimidin và thiazol nhưng tế bào có khả năng tổng hợp lại

Nicotinic acid

Nicotinic acid được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhưng cũng không cần thiết đối với một số mẫu cấy Nồng độ nicotinic acid thường dùng trong nuôi cấy là 0,1-5mg/l

Vitamin B6 (Pyridoxin, Adernin)

Vitamin B6 là tiền chất của pyrdoxalphosphat, cofactor của nhóm enzyme như carboxylase và transaminase

Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010) có nhiều loại auxin tổng hợp được sử dụng trong nuôi cấy mô hiện nay như: α-Naphthalene acetic acid (NAA), indoacetic acid (IAA), 2,4- diclorophenociacetic acid (2,4-D), indole-3-butyric acid (IBA),

Cytokinin

Theo Hoàng Đức Cự (2006) cytokinin có vai trò kích thích sự phân chia tế bào Cytokinin kích thích hình thành cành nhánh và ức chế sự hình thành rễ Ngoài ra, cytokinin cũng có tác dụng kìm hãm sự vàng của lá

Theo Vũ Văn Vụ et al (2006) một số loại cytokinin có thể dùng trong nuôi cấy

mô là 6-benziaminopurin (BA), Thidiazuron (TDZ), kinetin,…

Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin giúp tạo cây hoàn chỉnh từ mô sẹo Nồng độ auxin tăng và nồng độ cytokinin giảm sẽ tạo rễ ở mô sẹo (Mineo, 1990; Vũ Văn Vụ, 1999) Khi sử dụng auxin và cytokinin cần tuân theo liều lượng cho phép Sự vượt quá mức có thể gây ra biến dị về dòng cây, khác biệt về kiểu hình hoặc gây ra hiện tượng thủy tinh thể Hậu quả là cây con khó sống khi thuần dưỡng ở môi trường bên ngoài

(Lâm Ngọc Phương và Lê Minh Lý, 2012)

Bảng 2: Nhu cầu các chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô

Chất điều hòa sinh trưởng Nồng độ sử dụng (mg/l)

Auxin

2,4 D NAA IBA

0,2-5 0,1-5 5-20

Cytokinin

Kinetin

BA

0,1-2 0,1-2

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2000)

Agar

Agar được sử dụng làm chất tạo đông cho môi trường nuôi cấy Agar không phản ứng với các chất trong môi trường nên được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy Nồng độ agar thường dùng là 6-8 g/l khi pH môi trường đạt 5,6-5,8 Nếu nồng độ agar cao sẽ

làm cho môi trường cứng và hạn chế sự phát triển của mô sẹo hay bộ phận thực vật được nuôi cấy Tuy nhiên, nồng độ agar cao lại hạn chế được hiện tượng thủy tinh thể (Lâm Ngọc Phương, 2010)

pH

Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010) pH ảnh hưởng đến sự hòa tan khoáng trong môi trường và ảnh hưởng đến sự tạo gel của agar pH thường nằm trong phạm vi từ 5,5-6,0 pH<5,5 thì môi trường khó chuyển sang dạng gel Ngược lại, pH>6 thì môi trường rất cứng (Vũ Văn Vụ et al., 2006) Ngoài ra, sự hấp thu và bền vững của một số chất cũng phụ thuộc vào pH môi trường như NAA, vitamin, hợp chất sắt (Nguyễn Đức Thành, 2000)

Thành phần bổ sung không xác định

Nhằm kích thích sự phát triển của mẫu cấy, môi trường nuôi cấy có thể được bổ sung một số thành phần dinh dưỡng không xác định như nước dừa, dịch khoai tây, dịch chiết nấm men, chuối nghiền (Nguyễn Bảo Toàn, 2010) Những thành phần không xác định được bổ sung vào môi trường nhằm cung cấp thêm acid amin, peptide, carbonhydrate, acid béo, chất điều hòa sinh trưởng và vitamin Nồng độ chất hữu cơ không xác định bổ sung vào môi trường nuôi cấy tùy thuộc vào loài thực vật nuôi cấy Nước dừa rất phổ biến, giá cả tương đối thấp nên được dùng để bổ sung vào môi trường nuôi cấy một số chất hữu cơ cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây Nước dừa có chứa các acid amin, đường, RNA, DNA, myo-inositol, auxin, cytokinin (http://www.wattpad.com/809284-nuoi-cay-mo?p=4, 4/8/2013) Thể tích nước dừa thường dùng bằng 15-20% thể tích môi trường (Nguyễn Đức Lượng, 2001)

Bảng 3: Một số chất dinh dưỡng có trong nước dừa (100 g)

Cacbonhydrat Fat

Protein Folate Niacin Pantothenic acid Riboflavin Pyridoxin Thiamine Vitamin C Sodium Potassium Calcium Iron Magiesium

3,71g 0,2 g 0,72 g

3 µg 0,08 mg 0,043 mg 0,057 mg 0,032 mg 0,03 mg 2,4 mg

105 mg

250 mg

24 mg

40 mcg 0,29 mg

( Nguồn: http://www.nutrition-and-you.com/coconut-water.html, 4/8/2013)

2 6 Sơ lược về mô sẹo

Mô sẹo là tế bào vô tổ chức có hình dạng không xác định, được hình thành từ vết thương hay xử lý chất điều hoà sinh trưởng như auxin và cytokinin Mô của nhiều loài thực vật có khả năng tạo mô sẹo Một số mô có khả năng phân chia nhanh hơn những

mô khác (Nguyễn Đức Lượng, 2000; Rhitu, 2007)

Theo cấu trúc, mô sẹo được chia làm hai loại: mô sẹo xốp và mô sẹo cứng Mô sẹo xốp có các tế bào với nhân nhỏ, tế bào chất loãng và không bào to Ngược lại, mô sẹo cứng gồm các tế bào chắc, nhân to, tế bào chất đậm và không bào nhỏ (Vũ Văn

Vụ, 1999; Nguyễn Đức Lượng, 2000) Khả năng tái sinh là đặc tính khác nhau quan

trọng giữa hai loại mô sẹo này Ở mô sẹo xốp, khả năng này mất đi sớm hơn so với mô sẹo cứng (Vũ Văn Vụ, 1999)

Theo màu sắc, mô sẹo có nhiều màu khác nhau như vàng, trắng, xanh (Nguyễn Bảo Toàn, 2010; Nguyễn Đức Lượng, 2000)

Mô sẹo phát triển không theo quy luật nhưng có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi hoặc phôi để tạo cây hoàn chỉnh Sự phân chia mô sẹo chịu ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng có trong môi trường nuôi cấy

Nuôi cấy mô sẹo phải chú ý đến thời gian cấy chuyển, thường là 3-5 tuần vì lúc này chất dinh dưỡng trong môi trường đã hết và môi trường cũng bị khô (Rhitu, 2007) Tuy nhiên, khi cấy chuyển mô sẹo nhiều lần thì xu thế tạo cơ quan sẽ giảm Nguyên nhân có thể là do hình thành các tế bào đa bội, lệch bội hoặc mất các yếu tố di truyền (Nguyễn Đức Thành, 2000)

Mô sẹo có nhiều ứng dụng trong nuôi cấy mô như nghiên cứu quá trình tạo cơ

quan ở thực vật, nhân giống in vitro cho hiệu quả hơn các phương pháp khác, thu nhận

các hoạt chất sinh học, nuôi cấy huyền phù tế bào và làm nguyên liệu nuôi cấy tế bào đơn cho chọn lọc dòng tế bào (Hoàng Thị Thu, 2007)

Phương pháp nuôi cấy mô sẹo cho hệ số nhân giống cao hơn các phương pháp khác Ngoài ra trong quá trình nuôi cấy mô sẹo có thể tạo biến dị soma Đây là cơ sở

để nghiên cứu, áp dụng cải thiện giống (Nguyễn Đức Lượng, 2000)

2 7 Các nghiên cứu liên quan

Ngoài nước

Theo Dipak và Sumitra (1985) khi nuôi cấy A racemous trên môi trường MS+1

mg/l BA+ 0,5 mg/l NAA cho chiều dài chồi 5 cm sau 40 ngày cấy Mẫu cấy tạo rễ trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l IBA sau 25 ngày nuôi cấy

Theo Rafail và Khitam (2012) cho biết môi trường MS+BA 0,5 mg/l + NAA 0,2

mg/L thích hợp nhất cho sự tái sinh chồi từ mô sẹo của A densiflorus với số chồi là

28,13 chồi/mẫu và chiều dài chồi là 6,9 cm/chồi Nồng độ IBA 1,25 mg/l cho hiệu quả tạo rễ cao nhất với trung bình 12,4 rễ và chiều dài trung bình 4,98 cm

Trong nước

Theo Phạm Hoàng Nam (2012) môi trường MS bổ sung sung BA 0,05 mg/l kết hợp NAA 0,05 mg/l cho số chồi cao hơn (4,4333 chồi/cụm) môi trường có bổ sung NAA 0,1 mg/l kết hợp KIN 0,1 mg/l (3,1chồi/cụm) khi sử dụng mẫu cấy là đoạn thân

có chồi bên