khảo sát mầm bệnh vi khuẩn và vi nấm trên cá lóc nuôi thâm canh ở một số tỉnh đồng bằng sông cửu long

THÔNG TIN LUẬN VĂN/LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC, CAO HỌC VÀ NGHIÊN CỨU SINH KHOA THỦY SẢN – TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ channa striata nuôi thâm canh ở An Giang và Đồng Tháp Sinh viên/ học v

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

TRƯƠNG SĨ KHUYẾN

KHẢO SÁT MẦM BỆNH VI KHUẨN VÀ VI NẤM TRÊN CÁ LÓC NUÔI THÂM CANH Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG

SÔNG CỬU LONG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

TRƯƠNG SĨ KHUYẾN

KHẢO SÁT MẦM BỆNH VI KHUẨN VÀ VI NẤM TRÊN CÁ LÓC NUÔI THÂM CANH Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG

SÔNG CỬU LONG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Th.s NGUYỄN THỊ THU HẰNG

2014

THÔNG TIN LUẬN VĂN/LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP

ĐẠI HỌC, CAO HỌC VÀ NGHIÊN CỨU SINH KHOA THỦY SẢN – TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

(channa striata) nuôi thâm canh ở An Giang và Đồng

Tháp

Sinh viên/ học viên/ NCS thực hiện (MSSV) 3112969

Nguồn kinh phí

Tóm tắt

Đề tài nhằm khảo sát một số loài vi khuẩn và vi nấm thường gây bệnh trên cá lóc (Channa striata) nuôi

thâm canh trong ao ở An Giang và Đồng Tháp Tổng số có 123 mẫu cá được thu trong thời gian từ tháng 9 đến tháng 10 năm 2014 Mẫu cá có dấu hiệu bệnh lý như bơi lờ đờ, lở loét, xuất huyết, thận và tỳ tạng có nhiều đốm trắng, vây tưa rách Kết quả phân lập được 46 chủng vi khuẩn và định danh được 43 chủng

thuộc giống Pseudomonas dựa vào một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa; Vi nấm phân lập được 5 chủng và dựa

theo đặc điểm hình thái, tốc độ phát triển khuẩn lạc và đặc điểm của sợi nấm và bào tử, theo khóa phân loại

của Coker (1923) đã định danh được 2 chủng thuộc giống Achlya và 3 chủng thuộc giống Geotrichum Với tần suất xuất hiện của vi khuẩn Pseudomonas sp là 93,48%, vi nấm Achlya là 40% và Geotrichum là 60%

(Ghi chú: - Tên File: Họ và tên tác giả - năm – Tên đề tài)

- Tóm tắt đề tài: New Romance, size 10; Trong 1 trang này đối với Đề tài đại học, 1-2 trang đối

với đề tài cao học và NCS; Đầy đủ thông tin mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả, kết luận, ý nghĩa )

1

KHẢO SÁT MẦM BỆNH VI KHUẨN VÀ VI NẤM TRÊN

CÁ LÓC (Channa striata) NUÔI THÂM CANH Ở AN GIANG VÀ

ĐỒNG THÁP

Trương Sĩ Khuyến * và Nguyễn Thị Thu Hằng

*Lớp BHTS K37, Đại học Cần Thơ Email: khuyen112969@student.ctu.edu.vn

ABSTRACT

The aim of the study was to survey some species of bacteria and fungi which

are pathegen of snakehead (Channa striata) in intensive culture system in An

Giang and Dong Thap A total of 123 fish samples were collected from September to Octorber 2014 Fish samples which showed the clinical signs such as leaden swimming, ulcers, hemorrhage, white spots on kidney and spleen, ragged fins The result indicated 46 isolated bacterial strains and 43

strains were identified as Pseudomonas based on some physiological and

biochemical criteria; There were 5 isolated fungal strains According to morphological characteristic, growth rate of colony, charateristic of hyphae and spore, and classification course of Coker (1923), 2 strains of genus

Achlya and 3 strains of genus Geotrichum were identified, with frequency of occurrence of pseudomonas sp was 93.48% and Achlya was 40%, Geotrichum

was 60%

Key word: Channa striata, bacteria, fungi, pseudomonas sp

TÓM TẮT

Đề tài nhằm khảo sát một số loài vi khuẩn và vi nấm thường gây bệnh trên cá

lóc (Channa striata) nuôi thâm canh trong ao ở An Giang và Đồng Tháp

Tổng số có 123 mẫu cá được thu trong thời gian từ tháng 9 đến tháng 10 năm

2014 Mẫu cá có dấu hiệu bệnh lý như bơi lờ đờ, lở loét, xuất huyết, thận và tỳ tạng có nhiều đốm trắng, vây tưa rách Kết quả phân lập được 46 chủng vi

khuẩn và định danh được 43 chủng thuộc giống Pseudomonas dựa vào một số

chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa; Vi nấm phân lập được 5 chủng và dựa theo đặc điểm hình thái, tốc độ phát triển khuẩn lạc và đặc điểm của sợi nấm và bào tử, theo khóa phân loại của Coker (1923) đã định danh được 2 chủng thuộc giống

Achlya và 3 chủng thuộc giống Geotrichum Với tần suất xuất hiện của vi khuẩn Pseudomonas sp là 93,48%, vi nấm Achlya là 40% và Geotrichum là

60%

Từ khóa: Cá lóc (Channa striata), vi khuẩn, nấm, pseudomonas sp

2

1 GIỚI THIỆU

Tại Việt Nam, nuôi trồng thủy sản là một ngành có tốc độ phát triển nhanh, góp phần trong việc nâng cao sản lượng, giá trị xuất khẩu và nền kinh tế cũng như tạo nhiều công ăn việc làm cho người dân, đặc biệt là vùng nông thôn Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng có sản lượng thủy sản lớn đóng góp cho sự phát triển ngành với một số đối tượng nuôi chính như tôm càng xanh, cá tra,… trong đó cá lóc là đối tượng nuôi quan trọng trong cơ cấu đàn

cá nuôi ở Đồng bằng Sông Cửu Long vì đặc điểm kích thước lớn, thịt thơm ngon, sinh trưởng nhanh, giá thành cao, thị trường tiêu thụ ổn định, thức ăn không đòi hỏi chất lượng quá cao (Nguyễn Văn Thường, 2004) Hiện nay, hai

loài cá lóc đen (Channa striata) và cá lóc bông (Channa micropelte) được

nuôi phổ biến ở nhiều tỉnh trong khu vực như An Giang, Đồng Tháp với nhiều hình thức nuôi trong ao đất, nuôi vèo ao, vèo sông, nuôi lồng/bè và bể lót bạt (Lê Xuân Sinh và Đỗ Minh Chung, 2009) Tuy nhiên, với mức độ thâm canh hóa ngày càng cao và sự đa dạng hóa trong mô hình nuôi thì tình hình dịch bệnh ngày càng nhiều, khó kiểm soát gây thiệt hại đáng kể đến kinh tế của hộ nông dân với một số tác nhân chính như vi khuẩn, vi nấm, ký sinh trùng gây ra (Lư Trí Tài, 2010) Lê Xuân Sinh và Đỗ Minh Chung (2010) khi thực hiện khảo sát về tình hình bệnh xảy ra trên cá lóc cho thấy bệnh do ký sinh trùng xuất hiện nhiều nhất (85,9% số hộ nuôi), bệnh vi khuẩn xuất hiện (55,9%), riêng bệnh nấm xuất hiện với tần suất thấp (6,2%) Trong đó, vi nấm thuộc

giống Achyla được cho là tác nhân gây bệnh nấm thủy mi trên cá lóc, cá chép,

và một số loài cá nước ngọt khác (Từ Thanh Dung, 2008) Cũng theo Phạm

Minh Đức và ctv (2012) thì giống vi nấm Geotrichum là tác nhân gây bệnh

nấm nhớt trên cá rô đồng Qua những nghiên cứu trên, có thể nói bệnh cá do vi khuẩn và vi nấm làm tác nhân gây nên thiệt hại lớn cho cá lóc nói riêng và cá nước ngọt nói chung, làm ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế của ngành nuôi trồng thủy sản ở Đồng bằng Sông Cửu Long Do đó nhằm cung cấp thông tin

về tình hình nhiễm bệnh vi khuẩn và vi nấm ký sinh trên cá lóc nuôi thâm

canh nên đề tài “Khảo sát mầm bệnh vi khuẩn và vi nấm trên cá lóc

(Channa striata) nuôi thâm canh ở một số vùng Đồng bằng Sông Cửu

Long” được thực hiện

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm cá lóc

Mẫu cá lóc bệnh được thu từ 14 ao nuôi thâm canh ở Đồng Tháp, 6 ao nuôi thâm canh ở An Giang Mẫu được thu trong khoảng thời gian có cá bệnh xuất

3

hiện ở tháng 9 và tháng 10 năm 2014 Tổng cộng thu được 123 mẫu được ghi nhận dấu hiệu bên ngoài, giải phẫu và quan sát dấu hiệu trên các cơ quan nội tạng Mẫu cá được phân tích tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bệnh học Thủy sản – Khoa Thủy sản – Trường Đại học Cần Thơ

2.2 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn

Phân lập vi khuẩn

Quan sát và ghi nhận dấu hiệu bệnh lý bên ngoài Dùng cồn 70% sát trùng bên ngoài cá, lau sạch, mổ xoang bụng, quan sát và ghi nhận dấu hiệu bên trong Phân lập vi khuẩn bằng cách rạch một đường ở gan, thận và tỳ tạng bằng dao tiệt trùng, dùng que cấy lấy mẫu bệnh phẩm từ điểm vừa rạch và cấy trên môi trường TSA Mẫu cấy được ủ ở nhiệt độ 28oC Sau 24 đến 48 giờ, ghi nhận màu sắc, hình dạng, kích thước khuẩn lạc và tiến hành tách ròng đến khi được đĩa cấy thuần (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011)

Định danh vi khuẩn

Các chỉ tiêu về hình thái, một số chỉ tiều về sinh lý và sinh hóa được chọn để xác định vi khuẩn phân lập được trên cá lóc bệnh theo các chỉ tiêu định danh

vi khuẩn mô tả bởi Barrow và Feltham (1993) Hình dạng, kích thước và tính ròng của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram (Barrow và Feltham, 1993) Đặc điểm sinh lý, sinh hóa được xác định theo cẩm nang của Cowan và Steels (Barrow và Feltham, 1993) và bộ kít API 20E (BioMérieux)

2.3 Phương pháp phân lập và định danh vi nấm

Phân lập vi nấm

Khi quan sát bằng mắt thường phát hiện những dấu hiệu bất thường trên thân

cá, các phần da hoặc cơ bị lở loét thì phân lập như sau: cắt phần nhỏ mẫu bệnh

có đường kính 2mm, rữa mẫu qua nước muối sinh lý vô trùng 3 lần, cấy lên môi trường thạch GYA (1% glucose, 0,25% yeast-extract and 1,5% agar) Sau

đó, thêm 500 µg/ml mỗi loại kháng sinh ampicilin và streptomycin vào xung quanh mẫu bệnh phẩm để hạn chế và diệt vi khuẩn Ủ ở nhiệt độ 25-30oC trong vòng 1-4 ngày Khi nấm phát triển thì cấy truyền sang môi trường, tiếp

tục cấy truyền để có chủng nấm thuần (Hatai et al.,2000)

Định danh vi nấm

Vi nấm được xác định theo khóa phân loại của Coker (1923) Định danh vi nấm căn cứ vào đặc điểm hình thái sợi nấm, cuống (túi) bào tử và hình dạng

bào tử của vi nấm theo mô tả bởi Phạm Minh Đức và ctv (2010)

4

2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng chương trình Microsoft Exel để xử lý số liệu và phương pháp tính tần suất xuất hiện và tỉ lệ cảm nhiễm của vi nấm (vi khuẩn) như sau:

TSXH=(số chủng vi nấm (vi khuẩn) mỗi giống/tổng số chủng phân lập) x 100

Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn hoặc vi nấm(%) = x 100

Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn và vi nấm(%) = x 100

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Dấu hiệu bênh lý

Qua 2 đợt thu mẫu, tổng cộng đã thu được 123 mẫu cá (An Giang: 67 mẫu; Đồng Tháp: 56 mẫu) trong đó có 55 mẫu cá giống và 68 mẫu cá thịt Nhìn chung, các mẫu cá lóc có dấu hiệu bệnh lý như: bơi lờ đờ trên mặt nước, thân xuất hiện những điểm xuất huyết nhỏ li ti, màu sắc nhợt nhạt, vây và xoang miệng xuất huyết (Hình 1A), đặc biệt một số có dấu hiệu bệnh lý nặng hơn như có các vết loét ăn sâu vào cơ, mòn, cụt vi đuôi và xuất hiện các búi bông gòn trên vết loét (Hình 1B và hình 1C) Bên cạnh đó, khi giải phẩu thấy có nhiều đốm trắng trên gan, thận, tỳ tạng và gan có màu đỏ bầm (Hình 1D).Kết quả này tương tự với kết quả nghiên cứu khảo sát mầm bệnh trên cá lóc nuôi

thâm canh ở An Giang và Đồng Tháp của Phạm Minh Đức và ctv (2012)

Nghiên cứu này cũng đã xác định cá lóc nhiễm mầm bệnh vi khuẩn và vi nấm thường có một số dấu hiệu bệnh lý đặc trưng như vảy xù xì, xuất huyết, lở loét, nhiều nhớt, có các đốm đỏ và trắng xuất hiện trên thân, có đốm trắng trên gan, thận và tỳ tạng, nội tạng có mùi hôi… Đồng thời các dấu hiệu cá bơi lờ

đờ, ăn ít; thân, vây và đầu bị xuất huyết, nội quan sẫm màu, có chất dịch màu

đỏ bầm trong xoang bụng ở cá lóc giống trong nghiên cứu của Nguyễn Văn Út (2013)

5

Hình 1: A: Cá lóc bị xuất huyết toàn thân (mũi tên); B và C: Lở loét trên thân, mang, mòn cụt vi đuôi và có búi bông gòn xung quanh loét (mũi tên); D: Gan bầm, có đốm trắng trên gan (mũi tên)

3.2 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn

Kết quả nghiên cứu đã phân lập được 46 chủng vi khuẩn trên cá lóc bị bệnh nuôi thâm canh trong ao, trong đó có 11 chủng được phân lập trên cá giai đoạn giống và 35 chủng được phân lập trên cá thịt Tất cả các chủng vi khuẩn này đều được kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa cơ bản như nhuộm Gram, oxidase, catalase, di động, O/F Tất cả các chủng vi khuẩn đều phát triển sau

48 giờ ở nhiệt độ 28oC với khuẩn lạc màu vàng, tròn lồi, đường kính khuẩn lạc

từ 2-3mm trên môi trường TSA Các chủng đều là vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, di động, hầu hết dương tính với oxiadase (43/46 chủng), có khả năng oxi hóa và lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí Từ kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa cơ bản, dựa vào dấu hiệu bện lý để chọn ra 13 chủng để tiến hành định danh bằng bộ kít API 20E (BioMérieux) (1/13 chủng được phân lập từ cá giống) Kết quả xác định được 10/13 chủng

định danh thuộc nhóm vi khuẩn Aeromonas hydrophila (Bảng 1)

6

Qua Bảng 1 cho thấy 10 chủng vi khuẩn đều cho kết quả dương tính với ADH;

âm tính với ONPG, LDC, ODC, H2S, IND, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY, ARA, một số chỉ tiêu còn lại có sự khác nhau giữa các chủng Mặc dù không hoàn toàn giống nhau ở tất cả các chỉ tiêu, nhưng kết quả đã xác định là vi

khuẩn Aeromonas hydrophila

Ghi chú: Có sự khác nhau ở chỉ tiêu CIT, TDA và GLU của kết quả bộ kít

API 20E giữa 2 chủng vi khuẩn

Hình 2: Kết quả đại diện của 2 chủng vi khuẩn được chọn để định danh bằng bộ kít API 20E

Trước đây, theo báo cáo của Tanasomwan and Saitanu (1979) đã tím thấy vi

khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết do nhiễm trùng máu trên cá

basa nuôi trong bè gỗ Ngoài ra, một số tác giả cũng nhận định chính

A.hydrophila là tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá chép và cá trê trắng giống (Saitanu et al.,1982; Angka, 1990) Theo kết quả nghiên cứu gần đây của László Ardó et al (2008), một số loài vi khuẩn Aeromonas bao gồm A.hydrophila, A.caviae, A.sorbia gây nên bệnh nhiễm trùng máu ở nhiều loại

cá Cá bị bệnh Aeromonas xuất huyết từng vùng ở bụng, xuất hiện từng mảng

đỏ trên cơ thể và các vết thương lưng Xoang bụng chứa dịch đỏ, nội tạng xuất

huyết Như vậy, có thể khẳng định Aeromonas chính là tác nhân gây bệnh xuất

huyết trên cá lóc nuôi ao thâm canh ở An Giang và Đồng Tháp

7

Hình 3: A: Khuẩn lạc Aeromonas hydrophila trên môi trường TSA; B: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila là vi khuẩn Gram âm, hình que

Bảng 1: Các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn thuộc nhóm Aeromonas

hydrophila

Chỉ

tiêu

Chủng vi khuẩn

TN

2.3G

TN 2.4T

TN 4.1G

TN 4.3T

TN 4.3TT

TN 5.1T

TN 5.1TT

HN 6.1T

TN 7.2T

HN 9.2T

ONPG - - - - - - - - - -

ADH + + + + + + + + + + LDC - - - - - - - - - -

ODC - - - - - - - - - -

CIT + + - - - + + + + +

H2S - - - - - - - - - -

URE - - - - + - - - - -

TDA - - - + + - - - - -

IND - - - - - - - - - -

VP + + + + - + + + + + GEL + + + + - + + + + + GLU - + - - - + + + + +

MAN - - - - + - - - - -

INO - - - - + - - - - -

SOR - - - - - - - - - -

RHA - - - - - - - - - -

SAC - - - - - - - - - -

MEL - - - - - - - - - -

8

Chú thích: HN: Hồng Ngự TN: Tam Nông T: Thận, G: Gan, TT: Tỳ tạng

ONPG: Ortho-nitrophenyl galactosidase, ADH: Arginine, LDC: Lysine, ODC: Ornithine, CIT: Sodium Citrate, H2S: Sodium Thiosulphate, URE: Urea, TDA: Tryptophane, IND: Tryptophane, VP: Sodium Pyruvate, GEL: Gelatin, GLU: Glucose, MAN: Mannitol, INO: Inositol, SOR: Sorbitol, RHA: Rhamnose, SAC: Sucrose, MEL: Melibiose, AMY: Amygdalin, ARA: Arabinose

3.3 Kết quả phân lập và định danh vi nấm

Kết quả nghiên cứu đã phân lập được 5 chủng vi nấm trên cá lóc giống thu tại tỉnh An Giang (Không phân lập được trên cá giai đoạn thịt) Dựa vào đặc điểm hình thái, tốc độ phát triển khuẩn lạc và đặc điểm của sợi nấm và bào tử, các

chủng nấm được phân thành 2 giống: nấm bậc thấp Achlya (2 chủng) và nấm bậc cao Geotrichum (3 chủng); kết quả này tương tự với nghiên cứu của Phạm Minh Đức và ctv (2012)

Nhóm 1: Vi nấm Achlya

Sau khi phân lập trên môi trường GYA và nuôi cấy ở 28oC được 4 ngày, các chủng vi nấm bậc thấp có đường kính khuẩn lạc đạt 6,7mm Khuẩn lạc có màu trắng kem đồng nhất; sợi nấm dài, nhô lên khỏi bề mặt môi trường giống như

túi bông gòn (Hình 4A) Các túi động bào tử của chủng vi nấm hình thành

trên đầu mút của sợi nấm không có vách ngăn, có kích thướt tương đương

hoặc lớn hơn so với sợi nấm và phóng thích các bào tử ra ngoài (Hình 4B)

Qua những đặc điểm nêu trên và căn cứ vào khóa phân loại của Coker (1923)

thì 2 chủng vi nấm thuộc giống Achlya

Hình 4: A: Khuẩn lạc có màu trắng kem đồng nhất, sợi nấm dài như túi bông gòn; B: Túi động bào tử to và đang phóng thích bào tử (mũi tên)

B

A