TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN NGUYỄN THỊ TRÚC GIANG ĐẶC ĐIỂM HUYẾT HỌC CỦA CÁ BỐNG KÈO Pseudapocryptes lanceolatus Bloch & Schneider, 1801 BỆNH XUẤT HUYẾT NUÔI TRONG AO Ở BẠC
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THUỶ SẢN
NGUYỄN THỊ TRÚC GIANG
NGHIÊN CỨU VỀ SỰ KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA VI
KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ KÈO (Pseudapocryptes lanceolatus)
BỆNH XUẤT HUYẾT
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN
2014
Trang 2TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THUỶ SẢN
NGUYỄN THỊ TRÚC GIANG
ĐẶC ĐIỂM HUYẾT HỌC CỦA CÁ BỐNG KÈO (Pseudapocryptes
lanceolatus Bloch & Schneider, 1801) BỆNH XUẤT HUYẾT NUÔI
TRONG AO Ở BẠC LIÊU VÀ SÓC TRĂNG
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs Ts ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH
2014
Trang 3ĐẶC ĐIỂM HUYẾT HỌC CỦA CÁ BỐNG KÈO (Pseudapocryptes lanceolatus Bloch &
Schneider, 1801) BỆNH XUẤT HUYẾT NUÔI TRONG AO Ở BẠC LIÊU VÀ SÓC
TRĂNG
Nguyễn Thị Trúc Giang và Đặng Thị Hoàng Oanh*
Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ
* Email: dthoanh@ctu.edu.vn
ABSTRACT
This study was carried out to figure out the change of hematological characteristics of mudskipper
(Pseudapocryptes lanceolatus Bloch & Schneider , 1801) which were collected in Bac Lieu and Soc
Trang province The fish samples were collected from 3 healthy ponds (30 samples) and 8 diseased ponds (70 samples) with hemorrhagic clinical sign is dorsal, pectoral and pelvic fin and curved body Bblood samples were collected from both diseased and heathy fish for hematological analysis Results revealed that the density of red blood cells in diseased decreased compared with healthy one However, there was a significant increase in the density of neutrophils , monocytes , platelets and lymphocytes in the diseased fish compared with healthy specimens
Keywords: Pseudapocryptes lanceolatus, hematology, hemorrhagic disease
Title: Hematological characteristics of mudskipper (Pseudapocryptes lanceolatus Bloch & Schneider,
1801) with hemorrhagic diseases cuktured in ponds in Bac Lieu and Soc Trang province
TÓM TẮT
Đề tài được thực hiện nhằm tìm hiểu sự thay đổi huyết học của cá bống kèo vẩy nhỏ
(Pseudapocryptes lanceolatus Bloch & Schneider, 1801) được thu ở 2 tỉnh Bạc Liêu và Sóc Trăng
Các mẫu cá được thu từ 3 ao cá khỏe (30 mẫu) và 8 ao cá bệnh (70 mẫu) với dấu hiệu bệnh lý là xuất huyết vây lưng, vây ngực, vây bụng và cong thân Mẫu máu được thu để phân tích các chỉ tiêu huyết
Trang 4học Kết quả phân tích cho thấy mật độ tế bào hồng cầu ở cá có dấu hiệu bệnh lý giảm so với cá khỏe Đồng thời, có sự gia tăng mật độ các loại bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân, tiểu cầu và lympho
ở các mẫu cá có dấu hiệu bệnh lý so với các mẫu cá khỏe
Từ khóa: Cá bống kèo Pseudapocryptes lanceolatus, huyết học, bệnh xuất huyết
I GIỚI THIỆU
Cá kèo là đối tượng nuôi mang lại hiệu quả kinh tế và sức thu hút đầu tư lớn bởi chất lượng thịt cá thơm ngon Cá kèo là loài ăn tạp thiên về thực vật trong tự nhiên, thức ăn của chúng là tảo
khuê và bùn bã hữu cơ (Trần Đắc Định và ctv., 2002) Cá bống kèo khi nuôi thương phẩm trong
ao, có thể nuôi bằng thức ăn công nghiệp ngoài lượng thức ăn tự nhiên trong ao (Phạm Văn Khánh, 2006) Nhiều mô hình nuôi đã được hình thành như mô hình bán thâm canh, quảng canh, luân canh tôm-cá, muối-cá (Lê Kim Yến, 2005), ở một số tỉnh như Long An, Bến Tre, Trà Vinh, đặc biệt
là Bạc Liêu và Sóc Trăng Song, khi mô hình nuôi được thâm canh hóa cùng với việc tăng mật độ thì vấn đề dịch bệnh xảy ra thường xuyên hơn và là mối đe dọa cho nghề nuôi cá kèo
Trong điều kiện ở Việt Nam hiện nay, những tài liệu nghiên cứu về đối tượng cá kèo vẩy nhỏ còn ít, chỉ tập trung vào một số đặc điểm sinh học như phân loại, hình dạng cấu tạo, tính ăn và đặc điểm phân bởi các tác giả như: Mai Đình Yên (1992), Nguyễn Hữu Phụng (1997), Mohsin và Ambak (1996), Rainboth (1996),… gần đây có một số nghiên cứu của Hứa Thái Nhân (2004), Võ Thành Toàn (2005), Lê Kim Yến (2005), Nguyễn Hùng Tính (2007), Trần Thị Thanh Lý (2010) tập trung điều tra nghiên cứu về vấn đề nguồn lợi, nuôi cá kèo thương phẩm, tập tính di cư,… Do đó, còn nhiều vấn đề liên quan đến cá kèo vẩy nhỏ chưa được nghiên cứu Vì vậy, nhằm hoàn thiện sự hiểu biết về
cá kèo và ngăn ngừa một số bệnh nói chung, sự thay đổi về đặc điểm huyết học khi bệnh xuất huyết
xảy ra trên cá kèo nói riêng nên đề tài “ Đặc điểm huyết học của cá bống kèo (Pseudapocryptes
Trang 5lanceolatus Bloch & Schneider, 1801) bệnh xuất huyết nuôi trong ao ở Bạc Liêu và Sóc Trăng” được
thực hiện
II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Phương pháp thu mẫu
Những ao nuôi được chọn để thu mẫu là ao nuôi cá kèo thương phẩm khoảng 3-4 tháng đại diện cho các vùng nuôi và mô hình nuôi chủ yếu thuộc tỉnh Bạc Liêu vàSóc Trăng nơi có nghề nuôi
cá kèo phát triển Chọn 11 ao, trong đó 8 ao có biểu hiện của bệnh xuất huyết thu 70 mẫu cá bệnh và
3 ao cá không bệnh thu được 30 mẫu Mẫu máu được thu tại chỗ để làm kính phết máu, cố định mẫu sau đó đưa về phòng thí nghiệm tiếp tục tiến hành xác định các chỉ tiêu huyết học Cá được sát trùng bằng cồn (700) quanh khu vực lấy máu Máu được lấy ở động mạch chủ đuôi (Houston, 1990), dùng ống tiêm tiệt trùng 1ml lấy máu (Lượng máu tối thiểu là 0,3ml)
2.2 Định lượng hồng cầu (Natt & Herrick, 1952)
Hút 10µl máu được cho vào ống nghiệm nhựa có chứa 1990µl dung dịch Natt & Herrick Lắc nhẹ cho đều ống nghiệm Mật độ hồng cầu được xác định bằng buồng đếm hồng cầu thông qua sự quansát dưới kính hiển vi quang học (40X) Đầu tiên xem ở vật kính 10X, định vị 5 vùng đếm (Vùng
ký hiệu chữ
C), đưa vào giữa thị trường, chuyển sang vật kính 40X Mật độ hồng cầu được tính theo công thức: C
x 10 x 5 x 200 (tb/mm3) với C là tổng số hồng cầu trên 5 vùng đếm
2.3 Định lượng và định loại các tế bào bạch cầu
Mẫu máu đã được cố định trên lame được nhuộm bằng dung dịch nhuộm Wright & Giemsa
(Chinabut và ctv., 1991) Theo thứ tự như sau: (1) nhuộm với dung dịch Wright trong 3-5 phút; (2)
ngâm trong dung dịch pH 6,2 – 6,8 trong 5 -6 phút; (3) nhuộm với dung dịch Giemsa trong 20 – 30 phút; (4) ngâm trong dung dịch pH 6,2 trong 15 – 30 phút; và (5) rửa sạch lại bằng nước cất, để mẫu
Trang 6khô tự nhiên và đọc mẫu Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính X100 Định loại các tế bào máu theo
Chinabut và ctv., (1991)
Tổng bạch cầu (TBC) (Hrubec & ctv., 2000)
Đếm tổng số hồng cầu và bạch cầu trên 1.500 tế bào hồng cầu trên mẫu nhuộm Tổng bạch cầu được xác định bằng công thức: TBC (tb/mm3) = (số bạch cầu x mật độ hồng cầu trên buồng đếm) / số hồng cầu trên mẫu
Từng loại bạch cầu (Hrubec & ctv., 2000)
Đếm tổng số bạch cầu bằng 200 tế bào bạch cầu Mật độ từng loại bạch cầu (tb/mm3) = (số lượng mỗi loại BC x mật độ TBC)/200
2.4 Xử lý số liệu
Số liệu thí nghiệm được xử lý bằng Excel và SPSS Sau đó so sánh khác biệt giữa ao khỏe và
ao có dấu hiệu bệnh nhờ độ lệch chuẩn
Trang 73 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Dấu hiệu bệnh lý bên ngoài
Hình 1.Cá kèo khỏe và cá kèo bệnh (A) Cá bệnh, (B) Cá bị xuất huyết ở vây bụng, (C) Cá bị lồi mắt,
(D) Cá khỏe
Cá bệnh bơi lội lờ đờ, tấp mé, bỏ ăn, bên ngoài xuất huyết ở các vi ngực, vi bụng, vi hậu môn,
vi đuôi; xuất huyết ở mặt bụng, hai bên thân, nắp mang và cuống đuôi Ngoài ra, cá còn bị cong thân, mắt lồi, u nhọt ở thân và nắp mang (Hình 1A, 1B và 1C) Cá không phản ứng hoặc phản ứng rất chậm với tiếng động Trong khi, cá khỏe: bơi lội nhanh nhẹn, phản ứng nhanh với tiếng động, các vây không bị mòn rách, trên thân không có vết loét, xuất huyết hay những vùng da bị mất màu, mang
cá đỏ tươi sáng bóng (Hình 1D)
Trang 83.2 Dấu hiệu bệnh lý bên trong
Khi giải phẫu cá khỏe thấy gan có màu trắng kem, tỳ tạng, thận và tim có màu đỏ đậm Cấu trúc các cơ quan rắn chắc, không có biểu hiện sưng to hoặc nhũn, không có dịch trong xoang nội quan (Hình
2A) nhưng khi giải phẫu cá có biểu hiện bệnh quan sát thấy một số cơ quan nội tạng như gan bị xuất huyết (Hình 2B)
Hình 2.Giải phẫu cá khỏe và cá bệnh (A) Cá khỏe, (B) Cá bệnh: gan cá bị xưng, xuất huyết
3.3 Kết quả huyết học
Hồng cầu
Hình thái: Khi quan sát trên buồng đếm Neubauer hay trên tiêu bản đều thấy hầu hết là các tế bào
hồng cầu và có thể phân biệt rõ được hồng cầu với các tế bào khác Hồng cầu có hình tròn hay hình oval, có một nhân tròn nằm giữa tế bào chất, nhân bắt màu tím đậm, tế bào chất rất lớn so với nhân và
có màu xám xanh, phân chia rõ ràng với nhân (Hình 3) Đây là dạng hồng cầu trưởng thành phù hợp
với các miêu tả của Hibiya (1982), Chinabut et al (1991), cũng phù hợp với mô tả hồng cầu cá trong
nghiên cứu của Nguyễn Thị Thúy Liễu (2008), Cao Ngọc Trâm (2010), Phạm Thanh Hương (2006), Dương Văn Nhí (2009), Nguyễn Thành Tân (2011), Bùi Thị Diễm My (2012) Không quan sát thấy
tế bào hồng cầu không nhân, hồng cầu đa nhân, không nhân và rất ít thấy hồng cầu tiền trưởng thành
Trang 9Một số nghiên cứu về hồng cầu cho rằng hồng cầu giảm do nhiều nguyên nhân, cơ chế thiếu máu ở
cá do hồng cầu bị vỡ, chu kì sống rút ngắn hay quá trình chuyển hóa chất sắt bị hạn chế (Phạm Thị Phương Tiến, 2008) Cá trê bị ngộ độc gây ra sự thiếu máu do sự sưng phồng và hủy hoại hồng cầu
Tỉ lệ máu cá biến động theo phương thức sống, trạng thái sinh lý của cơ thể cá và thay đổi theo môi trường sống Cá vận động nhiều lượng máu sẽ nhiều hơn cá vận động ít Tỉ lệ máu gia tăng theo tuổi
và giai đoạn thành thục của cá Cá sống trong điều kiện dinh dưỡng tốt thì lượng máu nhiều hơn so với cá thể cùng loài sống trong điều kiện dinh dưỡng kém (Evans, 1997, trích dẫn bởi Đỗ Thị Thanh Hương, 2010)
Hình 3.Tế bào hồng cầu cá kèo khỏe
Bảng 1 Sự khác nhau về số lượng hồng cầu ở cá kèo khỏe và cá kèo bệnh xuất huyết
Ao Mật độ hồng cầu (tế bào x 106/mm3)
Trang 10Ao 11 15,2 ± 0,05
Các giá trị trong cùng một cột (a, b, c, d ) có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) và ngược lại
Bạch cầu
Hình thái: Quan sát được 4 loại tế bào bạch cầu ở cá kèo là tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch
cầu trung tính và tiểu cầu (Hình 4) Không tìm thấy bạch cầu toan tính và bạch cầu kiềm tính và không có sự khác biệt về hình dạng của các loại bạch cầu giữa cá khỏe và cá bệnh Trên cá trê lai
(Clarias batrachus) nhiều nghiên cứu cũng chỉ tìm được 4 loại bạch cầu như trên trong máu cá mà không thấy bạch cầu ưa bazơ và bạch cầu ưa eosin (Chinabut et al.,1991, Đoàn Nhật Phương, 2007;
Nguyễn Thị Thúy Liễu, 2008) Trong nghiên cứu của Trần Hồng Ửng (2003) và Phạm Thanh Hương (2006) trên cá tra bệnh vàng da cho thấy ngoài những loại bạch cầu kể trên còn có sự xuất hiện của bạch cầu ưa bazơ và bạch cầu ưa eosin Bạch cầu ưa eosin cùng với tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính, tiểu cầu cũng được tìm thấy trên cá rô phi (Oreochoromis Hybrid) (Hrubec
et al., 2000, trích dẫn bởi Nguyễn Thị Kiều 2011)
Trang 11
Hình 4 Các loại bạch cầu (A) Bạch cầu đơn nhân, (B) Tiểu cầu, (C) Bạch cầu trung tính, (D) Tế bào
Lympho
Số lượng tổng bạch cầu: Kết quả phân tích cho thấy, mật độ bạch cầu ở cá thu từ các ao có dấu hiệu
bệnh lý (như ao 1, 3, 5, 7) khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0.05) với 3 ao cá khỏe Tuy nhiên, ở các
ao 2,
4, 6, 8 thì mật độ bạch cầu ở cá khác biệt không ý nghĩa thống kê với các ao cá khỏe (P>0.05) (Bảng 2)
Mật độ bạch cầu thu ở các ao khỏe trung bình 25,8x104 tb thấp hơn so với các ao có dấu hiệu bệnh lý 44,8x104 tb Sự tăng lên của bạch cầu là cơ chế để vật chủ chống lại mầm bệnh xâm nhập, bạch cầu của cá luôn tăng lên ở cá nhiễm bệnh, nhiễm độc ở giai đoạn đầu và giảm dần ở thời điểm về sau do
sự suy yếu miễn dịch (Yildiz, 1998; Balfry et al., 1994; Vosyliene, 1999; trích dẫn bởi Nguyễn Thị
Kiều, 2011)
Bảng 2: Sự khác nhau về số lượng bạch cầu ở cá kèo khỏe và cá kèo bệnh xuất huyết
Ao Mật độ bạch cầu (tế bào x 104/mm3)
Trang 12Các giá trị trong cùng một cột (a, b, c, d ) có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,05) và ngược lại
Bạch cầu trung tính: Bạch cầu trung tính có vai trò trong phản ứng viêm, ngoài ra cũng có khả năng
thực bào trước khi đại thực bào được huy động đến nên bạch cầu trung tính còn gọi là tiểu thực bào
Sự gia tăng về tỉ lệ và số lượng bạch cầu trung tính cho thấy hoạt động của hệ bạch huyết gia tăng để tiêu diệt các vi sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể (Ellis, 1988) Trên tiêu bản có thể bạch cầu trung tính đặc trưng bởi nhân nhỏ bắt màu xanh đậm và nằm lệch về một góc tế bào Kết quả này cho thấy bạch cầu trung tính ở cá kèo cũng tương tự như bạch cầu trung tính ở cá tra (Dương Thành Long, 2008) Thỉnh thoảng bắt gặp bạch cầu trung tính phân thùy rõ Tế bào chất có hạt dạng lưới, màu hồng nhạt, viền tế bào thường nhạt hơn so với bạch cầu đơn nhân, đôi khi rất khó nhìn thấy tế bào chất Theo Grizzle và Rogers (1976) (Trích bởi Nguyễn Thị Kiều) cho biết bạch cầu trung tính với nhân phân thùy, hạt trong tế bào chất rõ và bạch cầu trung tính với nhân tròn lệch tâm, tế bào chất khó nhìn thấy
là hai dạng trưởng thành và tiền trưởng thành của bạch cầu trung tính
Kết quả phân tích, mật độ bạch cầu trung tính của cá kèo dao động khoảng 4,5x104 tb/mm3 đến 28x104 tb/mm3 Mật độ bạch cầu trung tính của cá kèo khỏe là 5,4x104 tb thấp hơn so với cá có dấu hiệu bệnh lý, trung bình khoảng 16,1x104 tb/mm3 và mật độ bạch cầu trung tính ở ao khỏe khác biệt
có ý nghĩa thống kê so với các ao cá bị xuất huyết (P<0,05) như ở các ao 1, 2, 3, 7 Theo kết quả của Phạm Thanh Hương (2006) và Cao Thị Ngọc Trâm (2010) thì trên cá tra bệnh vàng da có mật độ từng loại bạch cầu tăng lên rất đáng kể so với cá khỏe
Bạch cầu đơn nhân: Bạch cầu đơn nhân là tế bào tham gia vào hệ thống miễn dịch không đặc hiệu
với vai trò thực bào, tiêu diệt kháng nguyên và đặc biệt là khả năng trình diện kháng nguyên và để thực hiện bước khởi đầu của quá trình đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Bạch cầu đơn nhân có nhân lớn, lệch tâm, hình dạng và kích thước nhân thường thay đổi Nhân bắt màu xanh đen không đồng nhất, tế bào chất xanh nhạt và trong tế bào chất có những không bào nhỏ
Trang 13Kết quả định lượng bạch cầu đơn nhân của cá kèo ở các ao cho thấy mật độ bạch cầu đơn nhân chiếm khoảng 2x104 – 8x104 tb/mm3 Ở 3 ao cá khỏe, mật độ bạch cầu đơn nhân khác nhau có ý nghĩa thống
kê với các ao có dấu hiệu bệnh lý (trừ ao 4) (p<0,05) Mật độ bạch cầu đơn nhân ở ao cá khỏe thì thấp hơn mật độ bạch cầu đơn nhân ở ao có dấu hiệu bệnh lý Theo báo cáo kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác về loại bạch cầu này trên cá tra như Nguyễn Thị Thúy Liễu (2008) mật độ bạch cầu đơn nhân ở cá tra khỏe là 2,7x103 tb/mm3 và trên cá tra bệnh mủ gan 5x103 tb/mm3; Phạm Thị Phương Tiến (2008) khi thực hiện đề tài huyết học của cá bị bệnh trắng mang, trắng gan thì mật độ bạch cầu đơn nhân là 1,24x104 tb/mm3 ở cá bệnh và ở cá khỏe là 2,59x104 tb/mm3 Như vậy, kết quả số lượng bạch cầu đơn nhân này tương đương với các nghiên cứu khác trên cá tra khỏe Theo Trần Liên Minh (2004) (Trích bởi Nguyễn Thị Kiều) cho rằng bạch cầu đơn nhân còn non không có khả năng thực bào, khi trưởng thành có kích thước lớn bào tương có chứa nhiều lyzosom và ty thể, thời kỳ này gọi
là đại thực bào có chức năng bảo vệ cơ thể bằng cách thực bào, khả năng đại thực bào lớn hơn nhiều
so với bạch cầu trung tính, mỗi đại thực bào có khả năng ăn tới 100 vi khuẩn, các hồng cầu già, bạch cầu đã chết, ký sinh trùng và mô hoại tử Do đó, chúng giữ vai trò quan trọng trong các bệnh nhiễm trùng mãn tính, còn đại thực bào có chứa nhiều lysosom chứa các men phân hủy protein, tiêu diệt vi khuẩn và các vật lạ Ngoài ra, lyzosom của các đại thực bào còn chứa một lượng lớn men lipase có khả năng tiêu hóa màng lipid của vi khuẩn đặc biệt kháng cồn, kháng acid Đại thực bào có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc khởi động quá trình miễn dịch kích thích dòng lympho bào T và B, để lympho bào B tạo kháng thể chống lại các tác nhân xâm nhập Như vậy, số lượng bạch cầu đơn nhân
ở các ao có dấu hiệu bệnh lý đều tăng cao so với cá khỏe
Tế bào lympho: Tế bào lympho có nhân to tròn bắt màu tím sẫm, nhân chiếm gần hết tế bào Tế bào
chất chỉ là một vành mỏng bao quanh nhân Kích thước trung bình của tế bào lympho có sự khác biệt giữa các loài Theo Houston (1990) đường kính trung bình của tế bào lympho ở cá diếc là 7,4 - 8,4µm (trích bởi Phạm Thanh Hương, 2006), đường kính của tế bào lympho của cá tra 12 - 14µm (Trần
