Thu nhận phlorotannin từ rong mơ (sargassum) tại nha trang khánh hòa và thử nghiệm sử dụng phlorotannin làm thực phẩm chức năng chống oxy hóa (full)

Khảo sát ảnh hưởng của dung môi và phương pháp chiết đến khả năng chiết phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa .... Ảnh hưởng của dung môi và phương pháp chiết đến hàm lượng phlorotann

i

MỤC LỤC

TRANG MỤC LỤC I DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT III DANH MỤC CÁC BẢNG IV DANH MỤC CÁC HÌNH V

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 4

1.1 RONG NÂU 4

1.2 GIỚI THIỆU VỀ PHLOROTANNIN 6

1.3 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ PHLOROTANNIN 12

1.4 CƠ CHẾ CHỐNG OXY HÓA CỦA PHLOROTANNIN 21

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ PHLOROTANNIN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 22 1.6 ỨNG DỤNG SẤY PHUN TẠO BỘT CHỨA HOẠT CHẤT CHỐNG OXY HÓA 26

1.7 KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG PHLOROTANNIN TRONG ĐỒ UỐNG 27

1.8 GIỚI THIỆU MỘT SỐ QUY TRÌNH SẢN XUẤT ĐỒ UỐNG 29

1.9 GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT THANH TRÙNG 32

CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 ĐỐI TƯỢNG 34

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.2.1 Phương pháp phân tích 34

2.2.2 Phương pháp tinh chế 36

2.2.3 Phương pháp đánh giá cảm quan 37

2.2.4 Phương pháp định lượng vi sinh vật 38

2.2.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm 38

2.3 HÓA CHẤT VÀ CÁC THIẾT BỊ CHỦ YẾU ĐÃ SỬ DỤNG 54

ii

2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 55

CHƯƠNG III - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 56

3.1 NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT PHLOROTANNIN TỪ RONG MƠ S SERRATUM 56

3.1.1 Xác định dung môi chiết rút phlorotannin 56

3.1.2 Xác định nồng độ dung dịch ethanol sử dụng chiết rút phlorotannin 60

3.1.3 Xác định tỷ lệ dung dịch chiết so với nguyên liệu rong 63

3.1.4 Xác định nhiệt độ chiết 66

3.1.5 Xác định thời gian chiết 69

3.1.6 Xác định pH dung dịch chiết 72

3.2 TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT PHLOROTANNIN THEO PHƯƠNG PHÁP BOX-BEHNKEN 76

3.3 NGHIÊN CỨU CÔ ĐẶC DỊCH CHIẾT PHLOROTANNIN TỪ RONG MƠ S SERRATUM 82

3.4 NGHIÊN CỨU TINH CHẾ PHLOROTANNIN BẰNG KỸ THUẬT TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ SẮC KÝ LỌC GEL SEPHADEX LH 20 84

3.5 THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PHLOROTANIN TỪ RONG MƠ S SERRATUM BẰNG KỸ THUẬT SẤY PHUN 95

3.6 ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA CHẾ PHẨM PHLOROTANNIN 116

3.7 THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG PHLOROTANNIN TRONG SẢN XUẤT ĐỒ UỐNG 117

3.8 SẢN XUẤT THỬ VÀ ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM ĐỒ UỐNG PHLOROTANNIN THEO THỜI GIAN BẢO QUẢN 135

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 143

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 145

TÀI LIỆU THAM KHẢO 147

PHỤ LỤC 1

: tốc độ tăng trưởng hàng năm : dung môi : nguyên liệu

: 2,4-dimethoxybenzaldehyde : hoạt tính bắt gốc tự do

: khối lượng khô

: ethyl acetate : ethanol : phương pháp sử dụng áp lực thủy tĩnh cao : sắc ký lỏng cao áp

: Hiệp hội Thông tin thực phẩm quốc tế : nấm men - nấm mốc

: polyvinylpolypyrolidone : hàm lượng phlorotannin

: hoạt tính khử sắt

: chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (Supercritical fluid extraction)

: carbon dioxide siêu tới hạn

: hoạt tính chống oxy hóa tổng

: tiêu chuẩn Việt Nam : thực phẩm chức năng : tia cực tím (UVC: bước sóng < 280 nm; UVB: 315-280 nm) : vi sinh vật

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Danh mục các loài rong thu mẫu tại Vịnh Nha Trang 4

Bảng 1.2 Bảng tính chất của một số dung môi phổ biến 13

Bảng 1.3 Hoạt tính bắt gốc tự do ở một số loài rong trên thế giới 23

Bảng 1.4 Hoạt tính chống oxh hóa của một số loài rong Sargassum 23

Bảng 1.5 Hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết và phân đoạn từ loài 25

Bảng 2.1 Hệ số quan trọng của các chỉ tiêu 37

Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện chiết phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa 45 Bảng 3.1 Thiết kế thí nghiệm biến mã theo mô hình Box-behnken và kết quả 76

Bảng 3.2 Thí nghiệm lặp lại ở điểm tối ưu và kết quả 76

Bảng 3.3 Sự thay đổi một số chỉ tiêu của dịch chiết phlorotannin trước và sau khi cô đặc 82 Bảng 3.4 Tóm tắt quá trình tinh sạch phlorotannin 85

Bảng 3.5 Khối lượng chuột bạch thí nghiệm sau 7 ngày nuôi ở các chế độ khác nhau.………… 116

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ xanthan gum - carrageenan đến CQTB của sản phẩm 122

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đồng hóa đến độ màu sản phẩm 127

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của điều kiện thanh trùng đến kết quả kiểm tra vi sinh ở đồ uống 129

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của thời gian thanh trùng đến độ màu sản phẩm 130

Bảng 3.10 Kết quả kiểm nghiệm cảm quan sản phẩm nước giải khát phlorotannin 135

Bảng 3.11 Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của đồ uống 135

Bảng 3.12 Kết quả phân tích vi sinh và kim loại nặng trong đồ uống theo thời gian và điều kiện bảo quản 137

Bảng 3.13 Kết quả phân tích hàm lượng phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa trong đồ uống theo thời gian và điều kiện bảo quản 138

Bảng 3.14 Kết quả phân tích độ màu đồ uống theo thời gian và điều kiện bảo quản 139 Bảng 3.15 Chi phí nguyên vật liệu cho sản phẩm nước giải khát phlorotannin 141

v

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Một số cấu trúc của phlorotannin 9

Hình 1.2 Tái tổ hợp nhóm acetate 10

Hình 1.3 Sự tạo vòng của chuỗi triketide để hình thành phloroglucinol 11

Hình 1.4 Mô hình phlorotannin liên kết cộng hóa trị với acid alginic của màng tế bào tảo nâu 11

Hình 1.5 Một số sản phẩm giàu phlorotannin trên thị trường thế giới 28

Hình 1.6 Quy trình chung sản xuất nước giải khát có gaz 29

Hình 1.7 Sơ đồ quy trình sản xuất nước ép quả không chứa gaz 31

Hình 1.8 Sơ đồ quy trình sản xuất nước giải khát pha chế lên men 32

Hình 2.1 Vị trí nghiên cứu mùa vụ sinh trưởng của rong mơ S serratum tại Nha Trang 31

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 39

Hình 2.5 Khảo sát ảnh hưởng của dung môi và phương pháp chiết đến khả năng chiết phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa 41

Hình 2.6 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng chiết phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa 41

Hình 2.7 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ DM:NL đến khả năng chiết phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa 42

Hình 2.8 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa 42

Hình 2.9 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng chiết phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa 43

Hình 2 10 Khảo sát ảnh hưởng của pH dung môi đến khả năng chiết phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa 43

Hình 2.11 Khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết đến khả năng chiết phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa 44

Hình 2.12 Bố trí thí nghiệm nhiệt độ cô đặc dịch chiết chứa phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa 45

vi

Hình 2.13 Bố trí thí nghiệm xác định chất trợ sấy 46

Hình 2.14 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ chất trợ sấy 47

Hình 2.15 Bố trí thí nghiệm xác định áp suất bơm 47

Hình 2.16 Bố trí thí nghiệm xác định tốc độ bơm 48

Hình 2.17 Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ đầu vào 48

Hình 2.18 Sơ đồ quy trình dự kiến sản xuất nước giải khát phlorotannin 49

Hình 2.19 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ đường phối trộn 50

Hình 2.20 Bố trí thí nghiệm xác định ngưỡng cảm vị đường bổ sung 50

Hình 2.21 Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ acid ascorbic và acid citric kết hợp được ưa thích 51

Hình 2.22 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ xanthan gum bổ sung 51

Hình 2.23 Bố trí thí nghiệm ngưỡng cảm quan xanthan gum bổ sung 52

Hình 2.24 Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ carrageenan và xanthan gum kết hợp được ưa thích 52

Hình 2.25 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng phlorotannin 53

Hình 2.26 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ và thời gian đồng hóa thích hợp 53

Hình 2.27 Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thanh trùng thích hợp 54

Hình 3.1 Ảnh hưởng của dung môi và phương pháp chiết đến hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa của chất chiết thu nhận từ rong mơ S serratum 56

Hình 3.2 Ảnh hưởng của dung môi và phương pháp chiết đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của chất chiết thu nhận từ rong mơ S serratum 57

Hình 3.3 Ảnh hưởng của dung môi và phương pháp chiết đến hoạt tính khử sắt của chất chiết thu nhận từ rong mơ S serratum 57

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hàm lượng phlorotannin chiết từ rong mơ S serratum 60

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hoạt tính oxy hóa tổng của dịch chiết từ rong mơ S serratum 60

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hoạt tính khử sắt của dịch chiết từ rong mơ S serratum 61

vii

Hình 3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng phlorotannin

của dịch chiết thu nhận từ rong mơ S serratum 63

Hình 3.8 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết thu nhận từ rong mơ S serratum 63

Hình 3.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hoạt tính khử sắt của dịch chiết thu nhận từ rong mơ S serratum 64

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng phlorotannin của dịch chiết thu nhận từ rong mơ S serratum 66

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết phlorotannin thu nhận từ rong mơ S serratum 66

Hình 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính khử sắt của dịch chiết phlorotannin thu nhận từ rong mơ S serratum 67

Hình 3.13 Ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng phlorotannin thu nhận từ rong mơ S serratum 69

Hình 3.14 Ảnh hưởng thời gian đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết thu nhận từ rong mơ S serratum 69

Hình 3.15 Ảnh hưởng thời gian chiết đến hoạt tính khử sắt của dịch chiết thu nhận từ rong mơ S serratum 70

Hình 3.16 Ảnh hưởng pH dung môi chiết đến hàm lượng phlorotannin thu nhận từ rong mơ S serratum 73

Hình 3.17 Ảnh hưởng pH dung môi chiết đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết thu nhận từ rong mơ S serratum 73

Hình 3.18 Ảnh hưởng pH dung môi chiết đến hoạt tính khử sắt của dịch chiết thu nhận từ rong mơ S serratum 73

Hình 3.19 Mô hình minh họa 3D 77

Hình 3.20 Ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng phlorotannin của dịch chiết 80

Hình 3.21 Ảnh hưởng của số lần chiết đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết 80

Hình 3.22 Ảnh hưởng của số lần chiết đến hoạt tính khử sắt của dịch chiết 80

viii

Hình 3.23 Hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn

dịch cô đặc bằng các dung môi khác nhau 85

Hình 3.24 Sắc ký đồ dịch phlorotannin từ rong mơ S serratum cô đặc qua cột lọc gel Sephadex LH 20, cột 2x25cm, 10ml/phân đoạn 85

Hình 3.25 Dịch chiết ethanol trên sắc ký bản mỏng trước khi phun thuốc thử 88

Hình 3.26 Dịch chiết ethanol trên sắc ký bản mỏng sau khi phun thuốc thử 88

Hình 3.27 Phân đoạn ethyl acetate trên sắc ký bản mỏng sau khi phun thuốc thử 88

Hình 3.28 LC/MS của dịch chiết 89

Hình 3.29 LC/MS của phân đoạn n-hexan 89

Hình 3.30 LC/MS của phân đoạn chloroform 89

Hình 3.31 LC/MS của phân đoạn 89

Hình 3.32 LC/MS của phân đoạn 89

Hình 3.33 LC/MS của phân đoạn nước còn lại sau cùng 90

Hình 3.34 Sơ đồ quy trình tinh chế phlorotannin từ rong mơ S serratum 93

Hình 3.35 Ảnh hưởng của chất trợ sấy đến hàm lượng phlorotannin có trong chế phẩm sau sấy 95

Hình 3.36 Ảnh hưởng của chất trợ sấy đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của chế phẩm sau sấy 96

Hình 3.37 Ảnh hưởng của chất trợ sấy đến hoạt tính khử sắt của chế phẩm sau sấy 96

Hình 3.38 Ảnh hưởng của tỷ lệ maltodextrin bổ sung đến hàm lượng phlorotannin của chế phẩm bột phlorotannin sau sấy 99

Hình 3.39 Ảnh hưởng của tỷ lệ maltodextrin bổ sung đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của chế phẩm bột phlorotannin sau sấy 100

Hình 3.40 Ảnh hưởng của tỷ lệ maltodextrin bổ sung đến hoạt tính khử sắt của chế phẩm bột phlorotannin sau sấy 100

Hình 3.41 Ảnh hưởng của tỷ lệ maltodextrin bổ sung đến hoạt tính khử sắt của chế phẩm bột phlorotannin sau sấy 100

Hình 3.42 Ảnh hưởng của áp suất bơm đến hàm lượng phlorotannin của chế phẩm phlorotannin sau sấy 104

ix

Hình 3.43 Ảnh hưởng của áp suất bơm đến hàm lượng phlorotannin của chế phẩm phlorotannin sau sấy 104 Hình 3.44 Ảnh hưởng của áp suất bơm đến hoạt tính khử sắt của chế phẩm phlorotannin sau sấy 105 Hình 3.45 Ảnh hưởng của áp suất bơm đến hoạt tính bắt gốc tự do của chế phẩm phlorotannin sau sấy 105 Hình 3.46 Ảnh hưởng của tốc độ bơm nhập liệu tới hàm lượng phlorotannin của chế phẩm phlorotannin sau sấy phun 107 Hình 3.47 Ảnh hưởng của tốc độ bơm nhập liệu tới hoạt tính chống oxy hóa của chế phẩm phlorotannin sau sấy phun 108 Hình 3.48 Ảnh hưởng của tốc độ bơm nhập liệu tới hoạt tính khử sắt của chế phẩm phlorotannin sau sấy phun 108 Hình 3.49 Ảnh hưởng của tốc độ bơm nhập liệu tới hoạt tính bắt gốc tự do của phlorotannin trong chế phẩm sau sấy phun 108 Hình 3.50 Ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào đến hàm lượng phlorotannin của bột chế phẩm phlorotannin thu được sau sấy phun 111 Hình 3.51 Ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của bột chế phẩm phlorotannin thu được sau sấy phun 111 Hình 3.52 Ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào đến hoạt tính khử sắt của bột chế phẩm phlorotannin thu được sau sấy phun 111 Hình 3.53 Ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào đến hoạt tính bắt gốc tự do của bột chế phẩm phlorotannin thu được sau sấy phun 112

Hình 3.54 Quy trình sấy phun thu nhận bột phlorotannin từ dịch chiết rong mơ S serratum 115

Hình 3.55 Ảnh hưởng của tỷ lệ acid citric đến tổng điểm cảm quan chung 118 Hình 3.56 Ảnh hưởng của tỷ lệ đường bổ sung đến tổng điểm cảm quan chung của sản phẩm 119 Hình 3.57 Ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp acid citric - acid ascorbic bổ sung đến tổng điểm cảm quan chung của sản phẩm 120

x

Hình 3.59 Ảnh hưởng của tỷ lệ phlorotannin bổ sung đến chất lượng cảm quan của

sản phẩm đồ uống 124

Hình 3.60 Ảnh hưởng của hàm lượng phlorotannin bổ sung đến hoạt tính chống

oxy hóa của sản phẩm đồ uống 124

Hình 3.61 Ảnh hưởng của thời gian đồng hóa đến tổng điểm cảm quan chung của sản phẩm 126

Hình 3.62 Ảnh hưởng của nhiệt độ đồng hóa đến tổng điểm cảm quan chung của sản phẩm 126

Hình 3.63 Ảnh hưởng của thời gian đồng hóa đến hoạt tính chống oxy hóa của sản phẩm 127

Hình 3.64 Ảnh hưởng của nhiệt độ đồng hóa đến hoạt tính chống oxy hóa của sản phẩm 128

Hình 3.65 Ảnh hưởng của thời gian thanh trùng đến tổng điểm cảm quan chung của

MỞ ĐẦU

Rong nâu (Phaeophyta) là loại rong giàu các chất có hoạt tính sinh học như

lamilaran, fucoidan, alginate, phlorotannin, … Các chất này có nhiều hoạt tính sinh học, trong đó đáng chú ý là hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm…

Ngành rong nâu (Phaeophyta) có nhiều họ như: Alariaceae, Fucaceae và

Sargassaceae Ở Việt Nam, chi rong mơ (Sargassum) thuộc họ rong mơ

(Sargassaceae) được biết là chi rong có sản lượng lớn và có giá trị cao, do chi rong

này có chứa nhiều hoạt chất sinh học có giá trị như fucoidan, laminaran, alginate, phlorotannin,… Trong đó đáng chú ý là phlorotannin - một hợp chất chuyển hóa thứ cấp kiểu hỗn hợp phenolic Phlorotannin có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau như: hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, chống khối u, ngừa ung thư,… Hoạt tính chống oxy hóa của phlorotannin là một trong những hoạt tính được nghiên cứu nhiều nhất và phlorotannin được biết đến là chất chống oxy hóa không độc tính và an toàn với con người cũng như có khả năng ngăn ngừa bệnh tim mạch Ngày nay do sự phát triển của xã hội, con người ngày càng phải đối mặt với nhiều mối nguy như ô nhiễm môi trường, stress,… làm phát sinh các gốc tự do trong cơ thể gây ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe Do vậy, con người có xu thế tìm kiếm, khai thác và sử dụng các chất tự nhiên có hoạt tính chống oxy hóa, có khả năng hỗ trợ cơ thể đào thải các gốc tự do giúp tăng cường sức khỏe Do vậy, phlorotannin từ rong mơ đã được các nhà nghiên cứu quan tâm

Vùng biển Nha Trang có nguồn lợi rong mơ Sargassum phong phú và đa dạng

về số lượng, chủng loại Mặt khác, rong mơ ở vùng biển Nha Trang được cho rằng

có chứa các hoạt chất sinh học như fucoidan, phlorotannin, alginate,… với hàm

lượng cao Do vậy việc nghiên cứu “Nghiên cứu thu nhận phlorotannin từ rong

mơ Sargassum serratum tại Nha Trang và thử nghiệm sử dụng trong đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa” là cần thiết

Mục tiêu của Luận án:

- Nghiên cứu thu nhận phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa từ rong mơ

(Sargassum serratum) thu hoạch ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa

- Thử nghiệm sử dụng phlorotannin trong đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa

Nội dung của Luận án:

1) Nghiên cứu tách chiết và tối ưu hóa quá trình thu nhận phlorotannin từ rong mơ (Sargassum serratum) thu hoạch ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa 2) Bước đầu phân đoạn và tinh sạch phlorotannin thu nhận từ rong mơ (S serratum) 3) Nghiên cứu sấy phun để thu nhận bột phlorotannin từ dịch chiết rong mơ S serratum 4) Đánh giá độc tính của phlorotannin thu từ rong mơ S serratum

5) Thử nghiệm sử dụng phlorotannin trong đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án

Ý nghĩa khoa học

Lần đầu tiên nghiên cứu một cách toàn diện về phlorotannin của rong mơ

(Sargassum serratum) thu hoạch ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa từ nghiên cứu

tối ưu hóa quá trình tách chiết đến tinh sạch, thử nghiệm độc tính trên chuột, nghiên cứu sấy phun để tạo bột chế phẩm phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa cao và thử nghiệm sản xuất đồ uống phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa Do vậy, kết quả nghiên cứu của Luận án có ý nghĩa khoa học cao Kết quả này góp phần khẳng định giá trị của nguồn lợi rong biển Việt Nam Mặt khác, kết quả của luận án còn là tài liệu tham khảo phục vụ cho nghiên cứu và giảng dạy trong lĩnh vực nghiên cứu

các chất tự nhiên từ rong biển

Ý nghĩa thực tiễn của luận án

Kết quả nghiên cứu của luận án là cơ sở để các doanh nghiệp sản xuất thực phẩm phát triển thương mại hóa một số sản phẩm từ phlorotannin thu nhận từ rong

mơ (Sargassum serratum) thu hoạch ở vùng biển Nha Trang

Tính mới của luận án

- Luận án lần đầu tiên nghiên cứu thu nhận và đánh giá được hàm lượng

phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa từ rong mơ (Sargassum serratum) thu

hoạch ở vùng biển Nha Trang

- Luận án lần đầu phân đoạn và tinh sạch đƣợc phlorotannin từ rong mơ

(Sargassum serratum) với độ tinh sach lên tới 92%

- Luận án lần đầu áp dụng kỹ sấy phun và sử dụng các chất mang trong sấy

phun để sản xuất bột chế phẩm phlorotannin từ rong mơ (Sargassum serratum) cũng nhƣ sử dụng chế phẩm phlorotannin thu đƣợc trong sản xuất đồ uống chống

oxy hóa

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 RONG NÂU

Hiện nay, trên thế giới rong nâu đã xác định được khoảng 6.000 loài, chia làm

03 ngành rong chính là rong lục (Chlorophyta), rong nâu (Phaeophyta) và rong đỏ

(Rhodophyta) [64] Trong các loại rong kể trên thì rong nâu là một trong số các loài thực vật biển có thể tự tái tạo và là nguồn tài nguyên có thể cung cấp các chất có hoạt tính sinh học quý báu như fucoidan, laminaran, polyuromannan, alginate,… và các chất chuyển hóa thứ cấp như alkaloid, phlorotannin, acetogenin và terpene Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới, có điều kiện tự nhiên thuận lợi cho rong biển phát triển Theo thống kê, nước ta có khoảng 794 loài rong biển, phân bố ở vùng biển phía Bắc 310 loài, miền Nam 484 loài và 156 loài tìm thấy ở cả hai miền [10] Trong đó, 24 loài đã được sử dụng cho sản xuất các chế phẩm công nghiệp,

18 loài dùng làm dược liệu, 30 loài làm thực phẩm, 10 loài làm thức ăn gia súc Các

đối tượng quan trọng là: rong Câu (Gracilaria), rong mơ (Sargassum), rong Đông (Hypnea), và rong Bún (Enteromorpha) Rong mơ Sargassum được phân loại:

Hiện tại ở vùng biển Nha Trang có 20 loài rong nâu Sargassum (bảng 1.1)

Bảng 1.1 Danh mục các loài rong thu mẫu tại Vịnh Nha Trang [17]

Rong nâu Sargassum serratum được lựa chọn nghiên cứu có đặc điểm phân

loại và đặc điểm sinh học như sau:

Sargassum serratum N H Dai - Mơ gai

Loài rong này đã được công bố và định danh bởi Nguyễn Hữu Đại và Nguyễn Hữu Trí (2002) [13], Nguyễn Hữu Đại (2007) [14]

Rong mịn mọc thành bụi cao 40-80 cm trên một đĩa bám hình nón, nhỏ 5-6

mm nhưng rất chắc Trụ chính hình trụ, trơn, cao 2-4 mm, mang 3-7 nhánh chính Nhánh chính hình trụ 0,5-1 mm đường kính

Lá trên thân chính thường dài khoảng 0,7-1,5 mm, rộng 5-7mm Mép lá có nhiều răng cưa to, nhọn không đều, gân lá không rõ, huyệt rõ và nằm rải rác Lá trên các nhánh bên và nhánh chót chỉ dài 0,5-1 cm, rộng 1,5-3 mm, có hình mũi mác,

nhiều răng cưa nhọn

Phao rất nhiều, nhỏ hình xoan, kích thước 1-2 mm, thường mang 1 đến vài gai trên đầu hay cánh nhỏ (Hình 1.1)

Rong khác gốc Cây đực có đế đực

hình trụ, có u, phân nhánh, dài 0,5-2 cm

Cây cái có đế ngắn hơn 3-5 mm, hình trụ

dẹp, phân nhánh, có gai Rong khô có

màu nâu đậm

Sinh học và sinh thái: Rong mọc thành

quần thể dày, trên đá tảng và trên san hô

chết từ vùng triều thấp trở xuống, là loài

phân bố cao nhất trong các quần thể

rong mơ ở các bãi triều đáy cứng Rong

trưởng thành rất sớm từ tháng 3-4

Khoảng giữa tháng 8 đã thấy xuất hiện

1.2 GIỚI THIỆU VỀ PHLOROTANNIN

1.2.1 Đặc điểm cấu trúc phlorotannin

Phlorotannin được tìm thấy trong rong nâu có các đơn vị cơ bản là phloroglucinol (1,3,5-trihydroxybenzene) [172], [189] Kích thước phân tử của chúng dao động trong khoảng 126 Da - 650 kDa [174] Phlorotannin có khối lượng phân tử thấp, trung bình và cao đều chứa các đơn vị phenyl và phenoxy [74], [174] Theo Singh và cộng sự (2006) các phân tử phlorotannin chứa các đơn vị phloroglucinol với các kiểu liên kết khác nhau và phổ biến ở các loài sinh vật biển, nhất là trong rong nâu và rong đỏ [174] La Barre S và cộng sự (2010) cho rằng các kiểu liên kết đặc trưng xuất hiện trong cấu trúc của phlorotannin như: liên kết ether, liên kết phenyl, liên kết ether và liên kết phenyl, liên kết dibenzodioxin [104]

1.2.2 Phân loại

Dựa trên đặc điểm liên kết trong cấu trúc của phlorotannin, người ta chia phlorotannin thành 4 nhóm sau: fuhalol and phlorethol (phlorotannin với liên kết ether), fucol (với liên kết phenyl), fucophloroethol (với liên kết ether và liên kết phenyl) và eckol (với liên kết dibenzodioxin) [104]

* Phlorotannin với liên kết ether

Phlorotannin thuộc lớp này chủ yếu bao gồm fuhalol và phlorethol Ragan và Jamieson sử dụng phương pháp khối phổ để phân tích cấu trúc của phlorotannin và nhận thấy các đơn vị cơ bản của fuhalol và phlorethol được liên kết với nhau thông qua liên kết ether [146] Hiện các nhà khoa học đã thu nhận được một số hợp chất

fuhalol, phlorethol và hydroxyphlorethol từ rong nâu Carpophyllum spp (C mascalocarpum và C angustifolium) và Sargassum spp (S spinuligerum và S muticum) Triacetate của phloroglucinol được phát hiện ở rong nâu Himanthalia elongata [155]

Phlorotannin mạch thẳng như acetate của 2-hydroxyphloroglucinol, diphlorethol, bifuhalol, trifuhalol A, hydroxytetraphlorethol, hydroxypentaphlorethol và hydroxyhexaphlorethol Những hợp chất này đã được

tìm thấy từ loài C mascalocarpum Diphlorethol và trifuhalol tồn tại ở trong các loài Halidrys siliquosa và Laminaria ochroleuca Phlorotannin mạch thẳng như

hydroxytrifuhalol A, dihydroxytetraphlorethol A và dihydroxytetraphlorethol B có

nguồn gốc từ rong nâu Sargassum spinuligerum [155]

Phlorotannin mạch nhánh chẳng hạn như các dạng acetate của trifuhalol C, trifuhalol D, trifuhalol A, pentaphlorethol A, hexafuhalol A, deshydroxyheptafuhalol A, heptafuhalol A, octafuhalol A và nonafuhalol A, các

hợp chất này được tìm thấy từ C mascalocarpum; hydroxypentafuhalol B,

hydroxyheptafuhalol A, hydroxytrifuhalol B (596), deshydroxytetrafuhalol B (597), hydroxyheptafuhalol B (598), heptafuhalol B (599), hydroxypentafuhalol A (600), pentafuhalol B (601), deshydroxyfuhalol B (602), nonafuhalol B (603),

pentaphlorethol A (604) thu nhận từ loài S spinuligerum và trifuhalol B thu nhận từ loài S muticum chứa (615) [155]

Loài Carpophyllum mascalocarpum chứa các chất thuộc nhóm phlorethofuhalol như pentafuhalol A, phlorethopentafuhalol A,

phlorethopentafuhalol B và diphlorethopentafuhalol A Loài C angustifolium chứa

hỗn hợp trihydroxyphlorethol như trihydroxyheptaphlorethol A (620),

trihydroxyoctaphlorethol A (621) và trihydroxyoctaphlorethol B (622) [155]

Ngoài fuhalol và phlorethol, pseudofuhalol cũng là nhóm hợp chất được biết

Pseudofuhalol được tách chiết từ loài S spinuligerum, được mô tả như isomer của fuhalol với nhóm chức khác nhau Loài Bifurcaria bifurcata có chứa bifuhalol và pentafuhalol Những phân đoạn dịch chiết của loài Chorda filum đã acetyl hóa đều

chứa isofuhalol Triphlorethol và những chất tương tự đã được chlorin hóa đều được

xác định có nguồn gốc từ loài Laminaria ochroleuca [155]

* Phlorotannin với liên kết phenyl

Phlorotannin có liên kết phenyl chủ yếu là các chất thuộc nhóm fucol Các đơn vị phloroglucinol của fucol liên kết với nhau thông qua liên kết phenyl Loài

Himanthalia elongata và một số loài rong nâu có chứa difucol (656) Difucol được sulfat hóa là difucol-2-O-sulfate (657) và difucol-4,4-di-O-sulfate (658), những chất này có nguồn gốc từ Pleurocarpus gardneri Trifucol (659) và trifucol đã sulfat hóa

là trifucol-2-O-sulfate (660) và trifucol-2,2- di-O-sulfate (661), chúng có nguồn gốc

ở nhiều loại rong khác nhau, như Analipus japonicus, Bifurcaria bifurcata, Fucus vesiculosus và Himanthalia elongata Tetrafucol A (662) và tetrafucol đã halogen

hóa là 5-chlorotetrafucol A (663) và 5 - bromotetrafucol A (664), chúng được phân

lập từ Analipus japonicus [155]

* Phlorotannin với liên kết ether và phenyl [155]

Các hợp chất phlorotannin chứa liên kết ether và phenyl chủ yếu là

fucophlorethol Các loài Fucus vesiculosus, Cystoseira baccata và Analipus japonicus có chứa fucophlorethol A, fucophlorethol B và fucophlorethol C Loài Cystoseira baccata có chứa fucodiphlorethol B và fucodiphlorethol D và loài Laminaria ochroleuca chứa fucodiphlorethol C

Fucoheptaphlorethol A và fucopentaphlorethol A có nguồn gốc từ loài

Cystoseira granulata Loài Carpophyllum maschalocarpum có chứa fucophlorethol

Hydroxyfucodiphlorethol, bisfucotriphlorethol, hydroxybisfucotriphlorethol,

terfucopentaphlorethol, terfucohexaphlorethol, hydroxyterfucophlorethol, quaterfucononaphlorethol và bisfucopentaphlorethol A đều tồn tại trong loài

Himanthalia elongata

* Phlorotannin với liên kết dibenzodioxin [155]

Phlorotannin chứa liên kết đặc trƣng dibenzodioxin trong cấu trúc phân tử là

các chất thuộc nhóm eckol và carmalol [1], [4] Loài Eisenia arborea có chứa eckol

(681), 4-bromoeckol (682), 4-iodoeckol (683), 7-hydroxyeckol (684), 3-phloroeckol (685), bromo-3- phloroeckol (686) và iodo-3-phloroeckol (687) Hỗn hợp 681 phân

lập từ Ecklonia kurome Loài Eisenia arborea có chứa bieckol nhƣ 9,9-bieckol (688) và 7,7-dihydroxy-7,9-bieckol (689) Loài E kurome có chứa 2-phloro-6,6 - bieckol (690) Những eckol khác bao gồm dioxinodehydroeckol (691), 7,7-bieckol

(692), 7,9-bieckol (693), 8,4-dieckol (694), 7,2-bieckol (695) và fucofuroeckols A–

C (696–698) có nguồn gốc từ Eisenia arborea

Phloroglucinol Tetrafuhalol A Tetraphlorethol B Tetrafucol A

Fucodiphlorethol A Eckol Diphlorethohydroxycarmalol

[118]

Hình 1.2 Một số cấu trúc của phlorotannin [147]

Nhóm hydroxyl của phlorotannin là nguồn cung cấp hydrogen rất lớn cho các phản ứng oxy hóa khử Hydrogen đƣợc giải phóng từ nhóm hydroxyl của

phlorotannin sẽ tương tác với oxygen và nitrogen hoạt động của chất oxy hóa, làm phá vỡ chu trình sản sinh gốc tự do mới Sự tương tác giữa nhóm hydroxyl của phlorotannin với electron π của vòng benzen tạo ra tính chất đặc trưng của phân tử

phlorotannin

1.2.3 Sinh tổng hợp phlorotannin

Phlorotannin được hình thành bằng cách polyme hóa các đơn vị cơ bản là phloroglucinol (1,3,5-tryhydroxybenzene) thông qua con đường acetate-malonate [172], [189] Con đường acetate-malonate (polyketide) có thể được thực hiện do hỗn hợp enzyme sinh tổng hợp kiểu polyketide [40] Con đường chính xác cho sự sinh tổng hợp phlorotannin hiện chưa được biết rõ [35] Bước đầu tiên của quá trình sinh tổng hợp phlorotannin được cho là 2 phân tử acetyl coenzyme A kết hợp với carbon dioxide thành malonyl coenzyme A (Hình 1.3)

Hình 1.3 Sự sinh tổng hợp nhóm acetate [211]

Chuỗi polyketide được biến đổi bằng cách khép vòng giữa các phân tử và loại bỏ nước để tạo ra hệ thống vòng hexacyclic (Hình 1.4) Triketide là sản phẩm của quá trình tạo vòng nhưng không ổn định và bị chuyển hóa thành các chất thơm

có tính ổn định hơn - phloroglucinol Phloroglucinol thuộc nhóm phenol và chúng

có chứa 3 nhóm hydroxy [211] Những nhân tố được sinh ra trong quá trình sinh tổng hợp sau này là chưa được biết đến

Hình 1.4 Sự tạo vòng của chuỗi triketide để hình thành phloroglucinol [211] 1.2.4 Vai trò chính của phlorotannin

Theo Michael và cộng sự (2006) chỉ ra rằng phlorotannin có chức năng làm tăng tính liên kết và độ chắc cho thành tế bào Phlorotanin của tảo nâu được tìm thấy trong các physod của tế bào [120] Phlorotanin trở thành thành phần của tế bào rong nâu khi physod kết hợp với màng tế bào và phlorotannin sẽ tạo phức với acid alginic [164]

Hình 1.5 Mô hình phlorotannin liên kết cộng hóa trị với acid alginic của màng

tế bào tảo nâu

- Màng tế bào tảo nâu chủ yếu gồm các polysaccharid như: acid alginic, muối của acid alginic và fucan (polysaccharide sunfat) Các hợp chất phenol liên kết với nhau thông qua các liên kết: liên kết kỵ nước, liên kết hydro, liên kết ion và liên kết cộng hóa trị Liên kết giữa màng tế bào và phlorotanin là liên kết este [155]

- Tảo nâu tiết ra phlorotanin để phòng vệ đối với động vật ăn tảo [39], [198]

- Phlorotannin hấp thụ bước sóng UV, chủ yếu là UVC và một phần UVB, với cực đại tại 195 nm và 265 nm [136], [147]

- Sinh khối của rong nâu là rất lớn và đa dạng, song thành phần cấu trúc và tính chất của các chất chứa trong đó lại chưa được nghiên cứu nhiều Vì vậy rong nâu được sử dụng như nguồn cung cấp các hợp chất có hoạt tính sinh học cao cũng

bị hạn chế

- Cũng như các hợp chất phenol khác, phlorotannin hoạt động như một chất

chống oxy hóa bằng cách góp phân tử hydro phản ứng với gốc tự do cao, do đó ngăn cản triệt để sự hình thành gốc tự do Khả năng chống oxy hóa phụ thuộc vào

số lượng và sự sắp xếp các nhóm hydroxyl, mức độ cấu trúc của liên hợp, cũng như

sự có mặt của electron cho và electron nhận trong nhóm thế vào cấu trúc vòng

1.3 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ PHLOROTANNIN 1.3.1 Phương pháp tách chiết phlorotannin

Hiện cơ sở tách chiết và tinh chế phlorotannin như sau:

1.3.1.1 Cơ sở lý thuyết của quá trình tách chiết

Phương pháp chiết là phương pháp thu lấy một hay nhiều chất từ hỗn hợp đã lựa chọn, cô lập và tinh chế các cấu tử có trong hỗn hợp thành những cấu tử riêng Quá trình chiết gồm hai giai đoạn như sau:

Giai đoạn 1: dung môi thấm ướt lên bề mặt nguyên liệu, sau đó dung môi

thấm sâu vào bên trong nguyên liệu do quá trình thẩm thấu Khi dung môi đã thấm sâu vào trong nguyên liệu, các hoạt chất hòa tan trong dung môi chiết sẽ hòa tan vào dung môi chiết

Giai đoạn 2: Các chất hòa tan trong dung môi chiết sẽ thực hiện khuếch tán ra

ngoài màng tế bào ra dung môi ngoài nguyên liệu cho đến khi cân bằng nồng độ chất tan ở dung môi trong và ngoài nguyên liệu

- Dung môi dùng để chiết các hợp chất ra khỏi nguyên liệu rất đa dạng và thay

đổi tùy theo bản chất của mỗi loại nguyên liệu Cơ sở lựa chọn dung môi chiết xuất

là tính phân cực của hợp chất tự nhiên chứa trong nguyên liệu và của dung môi

- Dung môi có thể chia thành hai loại: phân cực và không phân cực, độ phân cực được tính bằng hằng số điện môi, hằng số điện môi của dung môi phản ánh sơ

bộ tính phân cực của dung môi Tính phân cực mạnh của nước được lấy làm chuẩn,

ở 20°C, hằng số điện môi là 80,10

Bảng 1.2 Bảng tính chất của một số dung môi phổ biến

trong chiết xuất hợp chất tự nhiên [21]

* Chất tan trong nước và dung môi phân cực

Các chất điện ly như các muối vô cơ đều tan trong dung môi phân cực Các hợp chất hữu cơ phân cực nói chung không ion hóa, nhưng nếu chúng có chứa các nhóm hoặc nguyên tử mang điện âm, chúng có thể hình thành cầu nối hydro với phân tử nước và tan được trong nước Những nhóm có khả năng tạo cầu nối hydro như: - OH, CO, NO, NH2, và các halogen gọi là nhóm phân cực Phân tử nào càng

có nhiều nhóm phân cực thì phân tử ấy càng dễ hòa tan trong nước Nhưng nếu phân tử có mạch hydro carbon càng dài thì độ hòa tan càng giảm

Thực nghiệm cho thấy, nếu phân tử có mạch nhánh và số cacbon của mạch chính không quá 5 hoặc 6 thì phân tử đó sẽ tan được trong nước nếu nhóm phân cực trong phân tử đó có khả năng hình thành liên kết hydro với phân tử H2O Nếu phân

tử có nhiều nhóm phân cực (2 nhóm trở lên) thì tỷ lệ này giảm xuống Một nhóm phân cực có 3 hoặc 4 cacbon trong mạch thì phân tử ấy tan được trong nước

Các hợp chất hữu cơ không chứa nhóm phân cực gọi là các chất không phân cực Các chất không phân cực đều tan trong ete và dung môi không phân cực Đồng thời chúng không tan trong nước và các dung môi phân cực khác Các chất mà phân

tử chỉ có một nhóm phân cực yếu cũng có thể tan trong ete Hầu hết các chất hữu cơ tan trong nước thì đều không tan trong ete Nếu chất vừa tan trong nước vừa tan trong ete thì chất đó phải là chất không ion hóa, có số cacbon không quá 5, có một nhóm phân cực tạo dây nối hydro nhưng không phải là nhóm phân cực mạnh

Dựa vào tính phân cực của dung môi và của nhóm hợp chất có thể đoán sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn chiết

- Trong phân đoạn chiết ete và ete dầu sẽ có các hydro cacbua béo hoặc thơm, các thành phần của tinh dầu như monoterpen, các chất không phân cực như chất béo, carotene, các sterol, các chất màu thực vật và chlorophyl

- Trong dịch chiết chloroform sẽ có mặt sesquiterpen, diterpen, cumarin, quinol, các aglycol do glucid thủy phân tạo ra, một số ancaloid bazo yếu

- Trong dịch chiết cồn sẽ có mặt glucoside, ancaloid, flavonol, các hợp chất phenolic khác, nhựa, acid hữu cơ, tannin

- Trong dịch chiết nước sẽ có các glucoside, tannin, đường, các hợp chất cacbonhydrate đại phân tử (pectin, nhầy, gôm), các protein thực vật và muối vô cơ

* Yêu cầu về dung môi trong quá trình chiết xuất

Dung môi dùng cho quá trình chiết phải được lựa chọn cẩn thận và đảm bảo các yêu cầu sau:

- Dung môi hòa tan chất đang nghiên cứu

- Dễ dàng được tách ra khỏi dịch chiết

- Có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu)

- Không độc, không dễ bốc cháy

- Có độ nhớt kém để không làm cản trở quá trình khuếch tán

- Các dung môi cần có độ tinh khiết nhất định để không là ảnh hưởng đến kiệu quả và chất lượng của dịch chiết

Trong thực tế một số dung môi bán trên thị trường thường có lẫn một số chất dẻo như các diankylphtalate, tri-n-butyl acetylcitrate và tributylphosphate Các chất này có thể lẫn do quá trình sản xuất và bảo quản Methanol và chloroform thường chứa dioctylphtalate, di-2-etylhexyl phalate Các chất này làm sai lệch kết quả phân lập trong quá trình nghiên cứu

1.3.1.1 Phương pháp chiết tách truyền thống

Tách chiết bằng dung môi là quá trình tách và phân ly các chất, dựa vào quá trình chuyển chất ở nguyên liệu sang môi trường lỏng không hòa tan với môi trường ban đầu chứa chất cần chiết; nhằm nâng cao nồng độ của chất cần nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu

* Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt (Percolation)

- Phương pháp ngấm kiệt là một trong những phương pháp trích ly được sử dụng phổ biến nhất không đòi hỏi nhiều thao tác cũng như thời gian Nguyên liệu được cho vào bình ngấm kiệt và rút nhỏ giọt dịch chiết phía dưới bình, đồng thời bổ sung thêm dung môi ở phía trên bình sao cho dung môi luôn ngập bề mặt nguyên liệu khoảng 3 - 4cm Phương pháp này chiết kiệt hoạt chất từ nguyên liệu và tiết kiệm dung môi Tuy nhiên, vẫn còn thủ công, năng suất thấp, phức tạp hơn phương pháp ngâm dầm và tốn dung môi [178]

* Chiết bằng phương pháp ngâm chiết (Maceration)

Phương pháp ngâm chiết là ngâm nguyên liệu trong dung môi và sau thời gian nhất định sẽ tiến hành lọc lấy dung môi Trong quá trình chiết có thể kết hợp khuấy trộn và tuần hoàn dịch để tăng cường hiệu quả chiết Ngâm chiết có thể ngâm tĩnh,

ngâm động, ngâm nóng, ngâm lạnh, ngâm một hoặc nhiều lần tùy thuộc vào điều kiện chiết nguyên liệu Phương pháp đơn giản nhất, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản

và rẻ tiền Nếu chiết nhiều lần thì dịch chiết loãng, tốn dung môi và thời gian chiết Phương pháp này thao tác thủ công và không hiệu quả bằng các phương pháp hiện đại [32]

* Tách chiết bằng bình chiết Soxhlet hay chiết hồi lưu

Chiết hồi lưu là một trong những phương pháp chiết truyền thống Sự hồi lưu (hoàn lưu) là sự chuyển chất trở lại môi trường phản ứng thông qua hệ thống ngưng

tụ Cơ sở của phương pháp là tách các chất ở nhiệt độ sôi của dung môi ra khỏi nguyên liệu, thuật ngữ gọi là "reflux" Ví dụ: khi tiến hành phản ứng este hóa giữa acid và alcol thì alcol có nhiệt độ sôi thấp sẽ bị bay hơi Nhằm tránh sự thất thoát alcol thì lắp một ống sinh hàn trên đầu của bình phản ứng, để hơi alcol khi thoát ra gặp lạnh sẽ ngưng tụ và trở về bình phản ứng Quá trình đó được gọi là quá trình hồi

lưu Phương pháp này có ưu điểm là sử dụng một lượng ít dung môi mà vẫn có thể

chiết kiệt được hoạt chất Sự chiết xuất tự động liên tục nên nhanh chóng Nhược điểm của phương pháp này là không chiết xuất được một lượng lớn mẫu nên chỉ

thích hợp cho việc nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

Hiếm khi dung môi là nước được sử dụng trong phương pháp này Mặc dù trích ly với nước đơn giản, dễ làm, không tốn kém và nước là dung môi phân cực mạnh nên có thể hòa tan một số hoạt chất phân cực tự nhiên, nhưng nhiệt độ sôi của nước cao (1000C) và áp suất hơi nhỏ nên có thể phá hủy hoạt chất Do vậy, ethanol hoặc methanol thường được sử dụng như dung môi chiết [115], [135], [158]

1.3.1.2 Một số phương pháp chiết tách khác

Các phương pháp chiết tách mới mang lại nhiều ưu điểm đáng kể như: giảm lượng dung môi sử dụng, giảm chất thải, dung môi xanh, độ chọn lọc cao, dễ thu hồi, giảm thời gian tách chiết, an toàn, hiệu quả, dễ tự động

* Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (Supercritical fluid extraction: SFE)

Phương pháp này thay thế cho các phương pháp chiết thông thường sử dụng

dung môi hữu cơ như: n-hexane, dichloromethane, chloroform và những dung môi khác thường được sử dụng trong chiết công nghiệp Phương pháp SFE cho phép chiết các chất một cách nhanh chóng, tự động, chọn lọc, không gây cháy nổ và tránh việc sử dụng một số lượng lớn các dung môi độc

Dung môi chủ yếu sử dụng trong phương pháp này là carbon dioxide siêu tới hạn (SC-CO2) SC-CO2 thân thiện với môi trường, độc tính thấp, tương thích với chế biến thực phẩm, dễ dàng tách ra khỏi các chất hòa tan Phương pháp SC-CO2 lý tưởng cho việc chiết xuất các sản phẩm từ nguyên liệu thực vật Ngoài ra, phương pháp này cho phép thu được chất cần chiết và loại dung môi mà không cần sử dụng thêm hóa chất [135]

Ở Việt Nam, các nghiên cứu ban đầu về việc sử dụng CO2 siêu tới hạn để tách các dịch chiết quý đã được tiến hành tại viện Hóa học công nghiệp Việt Nam, viện Dược liệu Tuy nhiên, mọi nghiên cứu vẫn chỉ ở quy mô phòng thí nghiệm, chưa thể triển khai dạng công nghiệp vì khó sản xuất thiết bị kiểu này ở quy mô lớn

* Phương pháp chiết sử dụng sóng siêu âm

Đây là kỹ thuật chiết rẻ tiền, đơn giản và hiệu quả Sóng siêu âm thường được

sử dụng để cải thiện việc chiết lipid, protein và các hợp chất phenolic từ thực vật

Khảo nghiệm quá trình chiết xuất các hợp chất phenol từ Folium eucommiae sử

dụng sóng siêu âm và thu được hiệu quả hơn so với chiết chất bằng cách gia nhiệt,

bổ sung enzyme hỗ trợ chiết tách Sóng siêu âm có khả năng phá vỡ màng tế bào của nguyên liệu, do đó giúp cho sự xâm nhập của dung môi vào bên trong tế bào dễ dàng hơn Ngoài ra siêu âm còn có tác dụng khuấy trộn mạnh dung môi, do đó làm tăng sự tiếp xúc của dung môi và cải thiện đáng kể hiệu suất chiết [105] Phương pháp này cần chi phí đầu tư ban đầu lớn và thời gian tách chiết cũng nhanh

* Phương pháp chiết sử dụng năng lượng lò vi sóng

Phương pháp chiết sử dụng lò vi sóng có thể duy trì các điều kiện nhẹ và đạt được hiệu quả vượt trội khi chiết Dưới tác dụng của lò vi sóng, nước trong thực vật

bị nóng lên nhanh chóng, áp suất bên trong tăng đột ngột làm các mô chứa dịch

chiết vỡ ra, dịch chiết thoát ra bên ngoài, lôi cuốn theo hơi nước sang hệ ngưng tụ Hiệu suất có thể bằng hoặc cao hơn những phương pháp khác nhưng thời gian chiết rất ngắn Dịch chiết thu được có có mùi tự nhiên Sản phẩm phân hủy trong dịch chiết tự nhiên giảm đi, tiết kiệm thời gian, năng lượng, chi phí Tuy nhiên chỉ áp dụng được cho các nguyên liệu có tuyến dịch chiết nằm ngay sát bề mặt lá Năng lượng chiếu xạ lớn sẽ làm cho một số cấu phần trong dịch chiết phân hủy [32], [105] Phương pháp này cần đầu tư chi phí lớn, nhưng thời gian tách chiết nhanh

* Phương pháp dùng chất lỏng ion

Chất lỏng ion hóa được nghiên cứu để có thể sử dụng rộng rãi cho các phản ứng và quá trình hóa học, kể cả phản ứng hydro hóa, phản ứng xúc tác sinh học và các phản ứng điện hóa Ngoài ra chất lỏng ion hóa có thế được sử dụng cho quá trình tách các sản phẩm sinh ra bằng con đường sinh học (lên men) như: ethanol, acetone hay buthanol Đặc trưng của chất lỏng ion hóa thường được tạo thành từ cation hữu cơ chứa Nito hoặc Photpho và các amoni vô cơ Chất lỏng ion hóa đang được nghiên cứu để thực hiện từ phòng thí nghiệm sang quy mô lớn Hỗn hợp isome hóa cũng đã được sản xuất trong dung dịch ion hóa ở phòng thí nghiệm [69] Phương pháp này chi phí cao, có khả năng tốt trong việc hòa tan tất cả các chất và là dung môi không nước

* Phương pháp sử dụng enzyme

Một số nghiên cứu đã sử dụng enzyme hỗ trợ trong quá trình chiết polyphenol, chẳng hạn sử dụng enzyme để hỗ trợ chiết dịch nho trên quy mô phòng thí nghiệm hay nghiên cứu khả năng giải phóng acid ferulic từ khoai lang của ba loại enzyme thương mại Ultraflo L, Viscozyme L và amylase Tỷ lệ giải phóng acid ferulic được tối ưu khi sử dụng Ultraflo L (1%), trong khi Viscozyme L là hiệu quả nhất để acid vanillic và vani thoát ra Do đó, những enzyme này có ích cho việc sản xuất acid ferulic và các hợp chất phenol từ khoai lang [55], [91] Phương pháp này chi phí cao, nhưng thân thiện môi trường

* Phương pháp sử dụng áp lực thủy tĩnh cao (HHP)

Phương pháp chiết này rất hữu ích trong chiết các hợp chất phenolic từ thực

vật Phương pháp này sử dụng áp suất thủy tĩnh cao trong khoảng (1.000 – 8.000 bar) không có nhiệt và làm việc trên hiện tượng truyền khối Dưới tác động của áp suất, tính thấm của tế bào tăng lên, dẫn đến hiện tượng khuếch tán các thành phần của tế bào theo thuyết truyền khối và dịch chuyển pha Phương pháp này cần đầu tư thiết bị máy móc rất đắt tiền và các nghiên cứu sử dụng phương pháp này trong chiết tách phenolic đã được tổng quan bởi Ali và cộng sự (2013) [59], [63], [135]

1.3.2 Phân tích định lượng phlorotannin

Phương pháp so màu để xác định các tổng các hợp chất phenolic được sử dụng để định lượng phlorotannin trong rong nâu [35] và chất chuẩn là monomer phloroglucinol [184] Phương pháp này dựa trên sự phá hủy phlorotannin thành các đơn vị phloroglucinol thông qua sự phá vỡ liên kết [164] Cơ sở của phép đo là định lượng nồng độ tổng của nhóm hydroxyl phenolic hiện diện trong dịch chiết [148], [211]

* Phương pháp Folin-Ciocalteau xác định tổng hợp chất phenolic

Phương pháp này dựa trên phản ứng oxi hóa khử giữa phlorotannin và hỗn hợp phosphotungstat - phosphomolybdat Hỗn hợp này cũng có thể được sử dụng trong việc xác định tyrosine - protein [67], [68], [211] Lithium sulphate được thêm vào để loại bỏ kết tủa Nhiều nghiên cứu cũng đã sử dụng phương pháp này để định lượng phlorotannin [30], [66], [109], [181], [199]

* Phương pháp DMBA xác định tổng hợp chất phenolic

Phương pháp DMBA là phương pháp sử dụng 2,4-dimethoxybenzaldehyde thay thế cho Folin trong định lượng phlorotannin Bản chất của phương pháp này cũng dựa trên phản ứng oxy hóa khử [36], [184] Phương pháp này chủ yếu định lượng nhóm hợp chất phenolic liên kết với 2,4-dimethoxybenzaldehyde ở vị trí 1, 3

và 1, 3, 5 và dấu hiện nhận biết là sản phẩm màu hồng [184] Cơ sở hóa học của phản ứng giữa DMBA và hợp chất phenolic chẳng hạn như phloroglucinol hấp dẫn điện tử đối với aldehyde trong môi trường acid mạnh Độ nhạy của phản ứng phụ thuộc vào một phần cấu trúc của aldehyde [48]

Sự thay đổi trong phản ứng của các phân đoạn phlorotannin khác nhau với DMBA là lớn hơn so với các phương pháp khác Sự thay đổi trong những phản ứng

phản ánh sự khác biệt trong những cấu trúc khác nhau của phlorotannin Hạn chế của phương pháp này là DMBA là có thể hình thành chromophore với một số chất chuyển hóa không phân cực và chính điều này làm hạn chế khả năng phân tích các hợp chất phenolic trong phương pháp sử dụng DMBA [184]

* Phương pháp thử nghiệm liên kết protein

Thử nghiệm này không cho biết hàm lượng tuyệt đối của các hợp chất phenolic như tannin Phản ứng protein - tannin phụ thuộc vào độ dài của chuỗi polyme - tannin và điều kiện phản ứng [211] Phlorotannin được tìm thấy là hình thành liên kết cộng hóa trị với protein; xa hơn, sự kết tủa protein bởi phlorotannin là khác nhau khi thay đổi pH cũng như nồng độ [184]

1.3.3 Tinh chế và chạy phổ để xác định phlorotannin

Hiểu biết thêm về tổng hàm lượng phlorotannin và sự đa dạng của các polymer và oligo của phlorotannin riêng lẻ là rất hữu ích, khi mà hoạt tính sinh học

và chức năng sinh hóa của mỗi loại khác nhau là khác nhau

Sắc ký lỏng cao áp có thể là công cụ phù hợp để phân tích định lượng và định tính phlorotannin Phương pháp hiện đại như khối phổ (MS) và cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), có thể được tích hợp với thiết bị HPLC để phân tích cấu trúc và xác định hỗn hợp với hàm lượng nhỏ nhất trong mẫu [101], [121], [166] Ứng dụng sắc

ký lỏng cũng cho phép phân lập và tinh chế các chất Thực tế rất khó khăn trong việc tinh chế và định lượng phlorotannin, do kích thước, sự tương đồng về cấu trúc

và những phản ứng của chúng với những hỗn hợp khác

Trong nghiên cứu rong nâu, nhiều nghiên cứu sử dụng thiết bị HPLC để phân lập hỗn hợp từ dịch chiết thô Đối với dịch chiết cồn sau khi đã peracetyl hóa, thì tiến hành rửa giải dịch chiết trên cột silica gel với tổ hợp chloroform, hexane, methanol và ethanol Phát hiện phlorotannin ở vùng UV từ 235nm tới 275nm Nhiều nghiên cứu đã sử dụng thiết bị HPLC để phân lập và nghiên cứu sâu hơn về phlorotannin, như fuhalol, deshydroxyfuhalol, phlorotannin sulphat hóa và carmalol [72], [75], [194] Phloroglucinol có độ hấp thụ UV lớn nhất ở bước sóng khoảng 280nm và phân đoạn phlorotannin khoảng 260 nm [82], [185]

Công nghệ phổ biến nhất đối với việc đánh giá cấu trúc của phlorotannin bao gồm phổ 1H và 13C NMR Với những phương pháp này đã nghiên cứu thành công cấu trúc của trên 150 phlorotannin [159], [208] Một phần do sự ion hóa thấp của dẫn xuất acetyl hóa nên việc sử dụng phổ khối trong phân tích phlorotannin đã khá

rõ ràng, [146], [147]

1.4 CƠ CHẾ CHỐNG OXY HÓA CỦA PHLOROTANNIN

Oxy hóa do quá trình stress, sự phá hủy DNA và phản ứng Fenton tạo các chất hoạt động chứa oxy và nitơ (RNS) như: gốc hydroxyl (•OH), hydroperoxide (H2O2), superoxide (O2•-), nitric oxide (NO•), peroxynitrite (ONOO-) và những loại khác là

những nguồn chính của sự oxy hóa trong tế bào, hủy hoại protein, lipid, DNA và gây bệnh Alzheimer [112], [133] Quá trình oxy hóa sẽ hủy hoại các DNA và trở thành một trong các nguyên nhân gây ra ung thư [79], [87] lão hóa và những bệnh thoái hóa thần kinh như Alzheimer và Parkinson [59], [80], [111], [121], [113], các bệnh về tim mạch như: xơ cứng động mạch [183], [203] và là nguyên nhân chính làm chết tế bào và tổn thương mô từ những cơn đau tim và đột quỵ [52], [93] Bởi vậy, việc ngăn ngừa sự oxy hóa do stress gây ra các chất ROS và RNS là có ý nghĩa rất quan trọng trong công tác phòng chống và điều trị bệnh

Cách thức thải gốc tự do của polyphenol

Nhiều cơ chế chống ôxy hóa của polyphenol đối với sự oxy hóa gây ra bởi stress và hệ thống ROS/ RNS cả trong thí nghiệm và trên cơ thể người Cơ chế loại

bỏ gốc tự do của polyphenol là cơ chế được công bố rộng rãi nhất trong hoạt tính chống ôxy hóa của chúng và SciFinder (2008) thống kê có hơn 700 bài báo công bố

về hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol tính từ năm 1995 [167] Trong cơ chế thải gốc tự do, lượng polyphenol thay thế ROS/RNS, chẳng hạn như •OH, O2•, NO•, hoặc OONO thế hệ sau, ngăn ngừa tổn hại tới phân tử sinh học hoặc tạo ra ROS tích cực hơn [46], [47], [54], [70], [81], [100], [125], [128], [196], [202]

Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa tương đương với trolox (TEAC) và thử nghiệm về khả năng hấp thụ oxy gốc tự do (ORAC) cũng như chất thải 2,2-diphenyl -1- picrylhydrazyl (DPPH) thường được dùng để nghiên cứu khả năng bắt gốc của polyphenol [41], [88], [142], [170] Thực tế, polyphenol có nhiều tác dụng sinh lý

khác nhau như: tham gia vào các chu trình có enzyme và chất oxy hóa Việc bắt gốc

có thể là cơ chế để giảm sự oxy hóa do stress, nhưng chúng không ảnh hưởng tới liên kết sắt

Tương tự như các hợp chất phenol khác, phlorotannin hoạt động như chất chống oxy hóa với cơ chế cho phân tử hydro phản ứng với gốc tự do cao, do đó ngăn cản triệt để sự hình thành gốc tự do Khả năng chống oxy hóa phụ thuộc vào số lượng và

sự sắp xếp các nhóm hydroxyl và mức độ cấu trúc của liên hợp, cũng như sự có mặt của electron cho và electron nhận trong nhóm thế vào cấu trúc vòng [155]

Phản ứng của chất chống oxy hóa với gốc tự do:

Chất chống oxy hóa + O2 Chất chống oxy hóa bị oxy hóa

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ PHLOROTANNIN TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

* Tình hình nghiên cứu phlorotannin trên thế giới

Siti A Budhiyanti và cộng sự (2012) công bố khả năng bắt gốc tự do DPPH dao động từ 14,61 ÷ 48,71% và 0,17 ÷ 44,05% tương ứng khi dịch chiết từ thành tế bào và tế bào chất có nồng độ 0,45 mg/ml; hoạt tính khử sắt dao động từ 2,05 ÷ 12,51% và 26,77 ÷ 68,80% tương ứng khi dịch chiết từ tế bào chất và thành tế bào

của một số loài Sargassum thu ở bờ biển Indonesia có nồng độ 0,45 mg/ml được sử

dụng, các dịch chiết này đều chứa phlorotannin [175] Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH với chỉ số oxi hóa EC50 dao động từ 6,64 đến 7,14 mg/ml tương ứng với loài

S ramifolium và S pteropleuron đã được Mayalen Zubia và cộng sự (2007) công

bố [116] Sargassum thunbergii và S fulvellum thể hiện khả năng bắt gốc tự do

tương ứng là 97,41% và 84,66% được chỉ ra bởi tác giả Soo Jin Heo và cộng sự

(2005) [177] Khả năng ức chế oxi hóa lipid của dịch chiết từ rong S siliquastrum

dao động từ 1,34 ± 0,45% đến 98,3 ± 0,19% cũng đã đƣợc tác giả S N LIM (2002) công bố [157] Masaaki Nakai và cộng sự (2006) cũng cho thấy hoạt tính bắt gốc tự

do O2- và .OH [114] và kết quả đƣợc trình bày ở bảng 1.3

Bảng 1.3 Hoạt tính bắt gốc tự do ở một số loài rong trên thế giới

Các tác giả cho thấy trong các loài rong nghiên cứu, loài S ringgoldianum có

khả năng bắt gốc (.OH) đến 78% và (O2-)đến 88,4% Theo tác giả Naja và cộng sự

(2012) cho thấy khả năng bắt gốc tự do DPPH của loài S vulgare dao động từ 0,2%

÷ 20,3%) [129] Hong Ye và cộng sự (2009) công bố hoạt tính chống oxy hóa tổng

của loài S pallidum dao động từ 0,04 ± 0,02 đến 52,08 ± 0,02µmol FeSO4/mg [85] Theo tác giả Hong Yu và cộng sự (2010) cũng chỉ ra hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ một số loài rong đƣợc thể hiện ở bảng 1.4 [86]

Bảng 1.4 Hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết từ một số loài rong Sargassum

Nhiều nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ loài S kjellmanianum có hoạt tính bắt

gốc tự do và bắt gốc (.OH) lớn nhất trong các loài rong nghiên cứu, tương ứng (58,25 ± 1,36)% và (67,65 ± 0,19)% Hoạt tính bắt gốc tự do và bắt gốc (.OH) của

dịch chiết từ loài S fusiforme là thấp nhất, ứng với (24,2 ± 0,56)% và (30,84 ± 0,71)% Xét về kết quả đo OD hoạt tính khử sắt thấy rằng S kjellmanianum vẫn có

OD lớn nhất, ứng với 0,982 ± 0,081 và OD thấp nhất ở loài S thunbergii ứng với

0,607 ± 0,011 Kết quả nghiên cứu của Hong-Yu (2010) chỉ ra có sự sai khác mang tính thống kê và tính toán về hoạt tính chống oxy hóa ở 5 loài rong được nghiên cứu [86] Đồng thời Sadati N và cộng sự (2011) chỉ ra khả năng bắt gốc tự do của dịch chiết dao động từ 1,33% ÷ 30,5 ± 0,03% Khả năng chelat hóa ion biến thiên từ 1,24

÷ 51,34 ± 0,02% và hoạt tính khử sắt dao động từ 0,105 - 0,505 µmol FeSO4/mg

Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết rong nâu S swartzii dao động từ 50,52 ±

86,22 mmol Fe2+/100 g rong khô [160]

Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH, khử sắt, bắt gốc oxygen và khả năng liên kết ion kim loại hóa trị 2+ của dịch chiết từ Fucus spiralis thủy phân bằng enzyme đã

được Michelle S Tierney và cộng sự nghiên cứu năm 2013 [119] Kết quả nghiên

cứu cũng chỉ ra phân đoạn dưới 3 kDa từ loài Fucus spiralis có hoạt tính thấp nhất

so với các phân đoạn khác Dịch chiết thủy phân bằng enzyme từ loài F spiralis có hoạt tính chống oxy hóa thấp hơn so với dịch chiết thu từ loài F spiralis và Cystoseira tamariscifolia (Bảng 1.5)

Vijayabaskar P và cộng sự (2012) công bố hoạt tính bắt gốc tự do DPPH, bắt

gốc hydroxyl và bắt gốc peroxide của loài rong nâu Tubinaria ornata tương ứng

(84,27 ± 2,17)%, (70,12 ± 2,03)% và (61,86 ± 2,03)% [201] Hoạt tính bắt gốc tự

do DPPH của dịch chiết ethanol từ loài rong S wightii đạt tương ứng (79,1 ± 1,21)% đã được Indu H và cộng sự (2013) công bố [95]

(giá trị đo OD)

(giá trị đo OD)

S fusiforme 0,706 ± 0,074a S thunbergii 0,607 ± 0,011d

S kjellmanianum 0,982 ± 0,081b S horneri 0,748 ± 0,071c

S pallidum 0,744 ± 0,064c

Bảng 1.5 Hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết từ loài Fucus spiralis và

Cystoseira tamariscifolia [119]

Dịch chiết/ phân

đoạn

Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH

Hoạt tính khử sắt

Hoạt tính bắt gốc

Khả năng liên kết ion kim loại

Ghi chú: các chữ cái x, xe, y, z: là sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê

Theo công bố của Federico Ferreres và cộng sự (2012) cho thấy loài F spiralis có phlorotannin trọng lượng phân tử cao thể hiện hoạt tính ức chế sự

peroxid hóa lipid và ức chế hoạt động của enzyme hyaluronidase (HAase) rất mạnh

mẽ, tương ứng IC50 là 2,32 mg/mL trọng lượng khô và IC50 là 0,73 mg/mL trọng

lượng khô Loài Cystoseira nodicaulis có khả năng bắt gốc peroxide (IC50 là 0,93 mg/mL trọng lượng khô) mạnh mẽ hơn so với loài Fucus spiralis (IC50 là 1,30

mg/mL trọng lượng khô) [65]

Sun Hee và cộng sự (2008) đã sử dụng ethyl acetate để phân đoạn dịch chiết

ethanol từ rong nâu S siliquastrum và cho chạy phân đoạn ethylacetate qua cột

silica gel Kết quả cho thấy phân đoạn sau khi qua cột có hoạt tính chống oxy hóa rất mạnh, tương đương (84,9 ± 1,2)% khi nồng độ chất khô của phân đoạn sau cột là 0,5 mg/ml Ở phương pháp đo phản ứng với acid thiobarbituric cho thấy đỉnh số 2 thu được sau khi cho phân đoạn ethylacetate qua HPLC có hoạt tính chống oxy hóa

rất mạnh, tương đương 84,08% khi nồng độ chất khô là 0,5mg/ml [180]

Các phân tích ở trên cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của phlorotannin thu nhận từ rong nâu bị ảnh hưởng nhiều bởi phương pháp chiết, phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa, vùng sinh trưởng của rong, lo i rong,… Do vậy, khi nghiên cứu tách chiết phlorotannin từ rong nâu cũng cần quan tâm đến các thông

số này

* Tình hình nghiên cứu phlorotannin ở Việt Nam

Phlorotannin chống oxy hóa được chiết từ rong nâu mới bước đầu được nghiên cứu ở Việt Nam từ năm 2009 Tuy nhiên đến năm 2010 mới có một số công bố về hoạt tính chống oxy hóa của một số loài rong nâu ở vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa, Việt Nam và những công bố đều do nhóm nghiên cứu của tác giả công bố

1.6 ỨNG DỤNG SẤY PHUN TẠO BỘT CHỨA PHLOROTANNIN

Trong công nghệ thực phẩm, phương pháp sấy phun đã được áp dụng để sản xuất rất nhiều loại thực phẩm khác nhau Quá trình nghiên cứu sấy phun tạo bột hòa tan từ dịch chiết thực vật (dịch ép trái cây, rau, củ…) đã được nghiên cứu nhiều Mỗi loại thực phẩm lại có yêu cầu đặc thù cho từng loại sản phẩm và điều kiện sấy phải đảm bảo giữ được các đặc tính tốt nhất của thực phẩm đó Nguyên liệu đem sấy phun phải là dịch lỏng hoặc huyền phù

Đối với thực phẩm chứa các chất có hoạt chất chống oxy hóa, quá trình sấy cần đảm bảo hoạt tính chống oxy hóa càng ít biến đổi càng tốt Mỗi hợp chất chống oxy hóa có các đặc tính khác nhau Tùy thuộc vào đặc tính của chúng mà có các kỹ thuật sấy phun phù hợp Do vậy, cần phải tìm hiểu về tính chất của chúng trước khi sấy để có thế đạt kết quả tốt

Theo Rao A V và cộng sự (2000) cho thấy cà chua có chứa lycopen (chất chống oxy hóa mạnh) đó là carotenoid có cấu trúc phân tử mạch dài, gồm 13 nối đôi, nhiều hơn tất cả các carotenoid khác Với cấu trúc có nhiều nối đôi, lycopene được chứng minh là rất hữu hiệu trong việc ngăn chặn các gốc tự do, trong cơ thể của con người một cách rất có hiệu quả [150] Nguyễn Thị Hồng Minh và cộng sự (2011) đã xác định được điều kiện tối ưu cho quá trình sấy phun tạo bột từ cà chua với hiệu suất thu hồi sản phẩm cao nhất và sản phẩm có hàm lượng lycopen cao

nhất với kết quả thu được là: tỷ lệ maltodextrin/chất khô dịch quả 52%, nhiệt độ không khí sấy 1330C, tốc độ bơm nhập liệu 27ml/phút, hiệu suất đạt 74,2% và hàm lượng lycopen của sản phẩm đạt 43,334µg [18]

Trà xanh được biết đến như thực phẩm tốt cho sức khỏe và tim mạch Vì vậy, người tiêu dùng luôn ưa thích và lựa chọn các sản phẩm chế biến từ trà xanh Trong trà xanh có chứa hợp chất tannin và tannin là một loại polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa rất mạnh, mạnh gấp 25 lần acid ascorbic Hiện có rất nhiều những nghiên cứu về tách chiết, cũng như chế biến các dạng thực phẩm từ trà xanh, như nước uống đóng chai hay trà hòa tan Trong đó có áp dụng phương pháp sấy phun

để sản xuất trà hòa tan sao cho vẫn giữ được những tính chất tốt của sản phẩm cũng như hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol [23]

Phlorotannin từ rong nâu Sargassum có một số đặc tính hóa học tương tự

tannin trong trà xanh Theo các nhà khoa học đã nghiên cứu về cấu trúc và tính chất của tannin thì hợp chất này bị phân hủy dưới tác động của nhiệt độ cao (180-

2000C) Do vậy, việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sấy phun để tạo chế phẩm phlorotannin và từ đó sử dụng chế phẩm n y để tạo đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa là phù hợp

1.7 KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG PHLOROTANNIN TRONG ĐỒ UỐNG

Các gốc tự do trong thực phẩm có thể tăng thời gian bảo quản Vì vậy, sử dụng các chất chống oxy hóa hoặc phụ gia chống oxy hóa bổ sung vào thực phẩm hoặc sử dụng các chất chống oxy hóa sau khi ăn thực phẩm có thể giúp bảo vệ cơ thể cũng như thực phẩm chống lại các gốc tự do có hại đã được Chandini S K và cộng sự công bố năm 2008 [50]

Kết quả nghiên cứu của Yan X và cộng sự (1996) cho thấy hỗn hợp các chất polyphenolic từ rong là chất chống oxy hóa hiệu quả trong việc chống ôi dầu [206] Nagai và cộng sự (2003) đã công bố quy trình sản xuất đồ uống từ 04 loại rong biển [127] Kết quả nghiên cứu của các tác giả này cho thấy đồ uống từ dịch chiết rong biển có khả năng hỗ trợ điều trị bệnh về tim mạch, tiểu đường và ung thư Plaza M và cộng sự (2008) cũng cho rằng polyphenol từ rong biển là nguồn thực phẩm chức năng hữu ích [139] Soo Jin và cộng sự (2005) công bố dịch chiết trong

methanol và trong nước từ rong biển có tiềm năng như chất chống oxy hóa tự nhiên

có thể ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm [177]

Vijayabaskar và cộng sự (2012) có các nghiên cứu, đóng góp thêm vào cơ sở

dữ liệu về khả năng ứng dụng các chất có hoạt tính sinh học từ rong biển trong hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến sự oxy hóa do stress Các tác giả này cũng chỉ ra

hỗn hợp phenolic từ rong Tubinaria ornata có hoạt tính chống oxy hóa Nghiên cứu này mở ra triển vọng ứng dụng các chất chiết từ T ornata trong công nghiệp và

dược phẩm [201]

Sinéad Lordan và cộng sự (2011) cho rằng môi trường biển là nguồn tài nguyên thiên nhiên quý hiếm và chưa được khai thác một cách có hiệu quả để ứng dụng trong lĩnh vực chế biến thực phẩm và bảo quản [173]

Năm 2010, M Lynn Cornish và cộng sự cho rằng các hoạt chất chống oxy hóa trong rong cần được đánh giá về mặt sinh học và ứng dụng Các chất chống oxy hóa

từ rong biển có thể sử dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng, y dược và thực phẩm dinh dưỡng Những thử nghiệm lâm sàng về các chất chống oxy hóa từ rong biển cho thấy chúng có lợi cho sức khỏe con người và cần phải được nghiên cứu nhiều hơn nữa [106]

Dartsch và cộng sự (2009) cho rằng ảnh hưởng của hoạt tính chống oxy hóa của một số loại đồ uống chức năng khác nhau (sơ ri - thanh long; mật ong - hạt tiêu; ) đối với chức năng và trạng thái cơ thể là khác nhau [56]

Hiện nay có một số loại đồ uống chức năng từ phlorotannin rong biển như sau:

Hình 1.6 Một số sản phẩm giàu phlorotannin trên thị trường thế giới

Từ các phân tích ở trên cho thấy trên thị thường hiện nay bắt đầu có một số sản phẩm thực phẩm chức năng có hoạt chất chống oxy hóa nguồn gốc từ rong nâu Tuy vậy, tại Việt Nam hiện chưa có nơi n o nghiên cứu sản xuất đồ uống có hoạt chất chống oxy hóa từ rong nâu

1.8 GIỚI THIỆU MỘT SỐ QUY TRÌNH SẢN XUẤT ĐỒ UỐNG

Trên thị trường có rất nhiều chủng loại sản phẩm nước giải khát Tùy từng loại sản phẩm và nguyên liệu, mà quy trình sản xuất cũng khác nhau Nhìn chung, đồ uống hiện nay được sản xuất theo các quy trình sau:

* Quy trình sản xuất nước giải khát có gaz [205]

Quy trình sản xuất nước giải khát có gaz được trình bày ở hình 1.7

Hình 1.7 Quy trình chung sản xuất nước giải khát có gaz

Bài khí

Syrup hỗn hợp đường Nước đã xử lý

Nước quả, hương liệu, phụ gia…

Rót chai, ghép nắp Rót syrup thành phẩm

Thuyết minh quy trình:

- Syrup cơ bản là dung dịch có nồng độ chất khô từ 60 ÷ 65%, có thể là syrup đường saccharose cũng có thể là syrup đường nghịch chuyển Đường saccharose được hòa tan ở 50 - 600C, sau đó đun sôi để tan hết và tiêu diệt vi sinh vật Tiến hành lọc và tránh các phản ứng tạo màu làm giảm chất lượng sản phẩm Pha syrup thành phẩm có hai phương pháp là pha nóng và pha lạnh Pha lạnh là pha hỗn hợp syrup đường với tất cả các cấu tử khác ở điều kiện bình thường sau đó lọc, làm lạnh Pha nóng là nấu hỗn hợp syrup đường với nước quả sau đó lọc, làm lạnh rồi bổ sung các chất màu, chất thơm vào sản phẩm

- Bão hòa CO2 làm tăng giá trị cảm quan và độ bền sinh học cho sản phẩm, vì

CO2 có khả năng ức chế sự hoạt động và phát triển của vi sinh vật Hàm lượng CO2

bổ sung vào khoảng 0,4 – 0,5% khối lượng sản phẩm

- Ghép mí, lắc trộn sản phẩm: Sản phẩm sau khi bão hòa CO2 được ghép mí nhanh chóng để tránh CO2 thoát ra ngoài và có điều kiện bài khí tốt nhất (do CO2đuổi không khí ra ngoài) Sau khi ghép nắp, lắc đều sản phẩm để CO2 phân bố đều trong sản phẩm đối với trường hợp bổ sung nước bão hòa CO2 vào chai sau khi rót syrup thành phẩm Tiếp theo sản phẩm được bảo ôn hai tuần và kiểm tra chất lượng trước khi được đem đi tiêu thụ

* Quy trình sản xuất nước ép quả không gaz [205]

Nguyên liệu là các loại quả có hàm lượng vitamin rất cao, ngoài ra còn có

khoáng chất có lợi Dưới đây là quy trình sản xuất nước ép quả không gaz

Thuyết minh quy trình:

Trái cây tươi ở độ chín kỹ thuật, không bị hư hỏng hay dập nát được lựa chọn, sau đó rửa sạch, loại vỏ cứng của nguyên liệu và tiến hành ép lấy dịch Một số loại quả có cấu trúc cứng có thể làm mềm cấu trúc qua chần

Tiếp theo phối trộn dịch quả với phụ gia và hương liệu Các chất bổ sung có thể là acid thực phẩm, hương liệu, chất tạo ngọt, chất ổn định… Quá trình đồng hóa được tiến hành sau khi phối trộn Cuối cùng tiến hành rót chai, bài khí, ghép mí,