Nghiên cứu tạo rễ tơ của cây hoàng liên gai (berberis juliane) cho mục tiêu nuôi cấy sinh khối dược liệu

cây Hoàng liên gai chủ yếu thu được từ rễ, tôi đã thực hiện đề tài “ Nghiên cứu tạo rễ tơ của cây Hoàng liên gai Berberis juliane cho mục tiêu nuôi cấy sinh khối dược liệu”.. Nghiên cứu

Lưu VIẾT THỦY

NG HIÊN CỨU TẠO RẺ Tơ CỦA CÂY HOÀNG LIÊN GAI (Berberỉs julỉane)

CHO MỤC TIÊU NUÔI CÁY SINH KHÓI DƯỢC LIỆU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

juliane) CHO MỤC TIÊU NUÔI CẤY SINH KHỐI Dược LIỆU

•

•

Nội, 2014

• Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người Thầy của tôi: PGS TS Chu Hoàng Hà - Trưởng phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, người Thày đã định hướng nghiên cứu, đồng thời cũng chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thả nh luận văn này.

• Tôi xin được cảm ơn Cô giáo TS Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn.

• Cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Sau đại học trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện cho chúng tôi được học tập tại trường Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS Nguyễn Văn Đính - CN Khoa Sinh - KTNN, các thầy, cô giáo đang công tác tại Khoa Sinh - KTNN đã tận tình dạy dỗ chúng tôi trong thời gian qua.

• Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới sự giúp đỡ của CN Nguyễn Khắc Hưng,

Th.s Hoàng Đăng Hiếu cùng tập thể cán bộ phòng Công nghệ Tế bào thực vật và phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học đã dành cho tôi trong suốt quá trình làm luận văn.

• Cảm ơn tất cả những người bạn cùng thực tập với tôi và các bạn lớp

S inh học thực nghiệm KI 6 , đặc biệt là bạn Phạm Văn Hoàng đã giúp đỡ rất nhiều trong thời gian thực hiện đề tài.

LỜI CẢM ƠN

động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.

• Hà Nội, tháng 12 năm 2014 Học viên

• Lưu Viết Thủy

• Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu tạo rễ tơ của cây Hoàng liên gai

cứu của tôi Những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực

và không trùng lặp với các đề tài khác Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi sự giúp

đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.

•

•

LỜI CẢM ƠN

II III NHỮNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

IV. A.rhizogenes Agobacterium rhizogenes

V. A.tumefaciens Agobacterium tumefaciens

IX. Gus Escherichia coli - ß - D - glucoronidase gene

XV. ITS Internal Transcribed Spacer

XVI. kp Kilobase pair

XIX. Ri-plasmid Root inducing plasmid

XXV. YMB Yeast Malnitol Broth

1 Danh mục các

XXVII XXVIII

2 Danh mục bảng biểu

XXIX Bảng 1.1: Một số loài thực vật được nuôi cấy rễ tơ để thu hoạt chất sinh

học 21

XXX XXXI

I MỞ ĐẦU

1 Đăt vấn đề

là cây thảo dược quý hiếm phân bố tại vùng Tây Bắc Việt Nam Hoàng Liên gai mọc nhiều tại Sa Pa - Lào Cai và một số tỉnh thuộc vùng Tây Nam Trung Quốc Hoàng liên gai là vị thuốc được sử dụng tò lâu trong các bài thuốc Đông y chữa các bệnh tiêu hóa như: viêm ruột, tiêu chảy, lỵ, trĩ, viêm túi mật, sốt cao, viêm gan, hoàng đản, viêm ngứa ngoài da, mụn nhọt Thân rễ Hoàng liên gai chứa nhiều họp chất aỉkaloid (5 - 8 %), trong đó chủ yếu là berberin. Ngoài ra trong thân

rễ Hoàng liên gai còn có worenin, coptỉsin, paỉmatin Các alkaloid trong Hoàng liên gai chia thành 2 nhóm chính: các aỉkaloid có nhân phenol và các aỉkaỉoid

không có nhân phenol. Các thành phần alkaloỉd của Hoàng liên gai đều chứa ừong hầu hết các bộ phận của cây Tuy nhiên ở mỗi bộ phận lại có hàm lượng thay đổi, tùy theo mùa phát triển của cây Vào tháng 9 - 1 0 , hàm lượng berberin ở thân rễ và

rễ nhánh cao, ừong khi đó, vào khoảng tháng 10 , hàm lượng alkaỉoid ở lá già trước khi rụng cũng thường cao Trong số các họp chất alkaỉoid nói trên, berberỉn

được y học quan tâm đến nhiều nhất, sau đó là palmatin.

giảm mạnh do bị khai thác quá mức Hoàng liên gai được đưa vào danh sách các loài thực vật đang nguy cấp ừong Sách Đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá

"đang nguy cấp" (Bậc E) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 1) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ để nghiêm cấm khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại Trước tinh hình trên, bên cạnh việc nghiên cứu các giá tri y dược của cây Hoàng liên gai ở Việt Nam, cần đưa ra các phương pháp bảo tồn cũng như khai thác hiệu quả cây Hoàng liên gai Bên cạnh việc trồng bảo tồn ngoại vi (Ex sỉtu ) tại vườn quốc gia Hoàng liên, việc ứng dựng các kỹ thuật công nghệ sinh học vào quá trình bảo tồn

và phát triển bền vững cây Hoàng liên gai theo hướng thu sinh khối tế bào thực vật là một trong những yêu cầu cấp bách và cần thiết.

công nghệ s inh khối tế bào thực vật để sản xuất những sản phẩm thứ cấp đang bắt đầu được quan tâm phát triển trong nước Hiện có nhiều phương pháp nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật như: nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy huyền phù, nuôi cấy rễ bất định Các phương pháp nuôi cấy tế bào cho phép thu lượng lớn tế bào ừong thời gian nuôi cấy ngắn hơn, chất lượng đồng đều Bên cạnh đó, sản lượng ổn định do được nuôi cấy ừong điều kiện ỉn vitro, các yếu tố tác động đến quá trình nuôi cấy đều được kiểm soát, không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố tự nhiên cũng như dịch bệnh.

XXXV.Hiện nay, một số công trình nuôi cấy sinh khối tế bào được áp dụng

ừên đối tượng Hoàng liên gai nhằm thu sinh khối tách chiết berberỉn ứng dụng trong y dược Đinh Thị Thu Hiền và công sự (2003) đã đưa ra qui trình tái sinh cây Hoàng liên gai ỉn vitro tò hạt Cây Hoàng liên gai in vitro được sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình tạo và nuôi cấy sinh khối mô sẹo Hoàng liên gai tạo họp chất berberỉn với hàm lượng cao [1] Lại Đức Lưu và công sự (2013) ứng dụng kỹ thuật khí canh ừong nghiên cứu nhân giống và thu s inh khối rễ cây Hoàng liên gai Nhóm tác giả đã thực hiện thu thập, đánh giá hàm lượng berberin và tìm ra chế độ nuôi cấy cũng như môi trường dinh dưỡng phù hợp cho sinh khối rễ Hoàng liên gai phát triển[4].

nhằm làm giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng vào trong môi trường nuôi cấy vấn đề này là một trong những trở ngại lớn do tồn dư của các chất điều hòa sinh trưởng trong sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sản phẩm và sức khỏe người sử dụng Tuy

nhiên, kỹ thuật nuôi cấy sinh khối rễ tơ ra đời giúp giải quyết các vấn đề khó khăn của hướng nuôi cấy sinh kh ối tế bào thực vật hiện tại.

giữa vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes và tế bào vật chủ Rễ tơ có có khả năng

s inh trưởng nhanh, phát triển tốt trên môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng và có thể nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, điều này có ý nghĩa trong dây chuyền sản xuất các hợp chất thứ cấp hay các dược phẩm sinh học tái tổ họp Rễ

tơ có thể sản xuất một lượng lớn các họp chất thứ cấp và là cơ quan biệt hóa nên

rễ tơ có sự di tuyền ổn định hơn nuôi cấy tế bào huyền phù hay nuôi cấy sinh khối

mô sẹo.

cây Hoàng liên gai chủ yếu thu được từ rễ, tôi đã thực hiện đề tài “ Nghiên cứu tạo

rễ tơ của cây Hoàng liên gai (Berberis juliane) cho mục tiêu nuôi cấy sinh khối dược liệu” Công tr ình này được thực hiện tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2 Đổi tượng nghiên cứu

học cổ truyền Thành phần chủ yếu của Hoàng liên gai là berberin, một hoạt chất được ứng dụng trong điều ừị các bệnh về hệ tiêu hóa.

XL. Mau vật nghiên cứu bao gồm quả, lá của cây Hoàng liên gai phân

bố ừong tự nhiên được thu thập tại tại vườn quốc gia Hoàng liên, địa phận huyện

Sa Pa tỉnh Lào Cai.

3 Mục đích nghiên cứu

XLI Nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc tạo sinh khối

cây Hoàng liên gai làm nguyên liệu dược bằng công nghệ nuôi cấy rễ tơ.

4 Nội dung nghiên cứu

4.1 Thu thập và nhận dạng mẫu cây Hoàng liên gai bằng chỉ thị phân tử.

- Tiến hành thu thập mẫu Hoàng liên gai phân bố tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên tại địa phận tỉnh Sa Pa, tỉnh Lào Cai.

- Nhận dạng các loài Hoàng liên gai thu thập được thông qua đặc điểm hình thái.

- Sử dụng kỹ thuật DNA Barcoding nhằm nhận dạng các mẫu Hoàng liên gai.

- Bước đầu đưa ra các chỉ thị đặc hiệu cho việc nhận dạng cây Hoàng liên gai trong

tự nhiên bằng phương pháp chỉ thị phân tử sử dụng kỹ thuật DNA Barcodỉng.

XLII Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu hạt Hoàng liên gai và kỹ

thuật nuôi cấy Hoàng liên gai in vitro tạo nguyên liệu cho các nghiên cứu chuyển gen tạo rễ tơ.

rhizogenes, bước đầu tạo một số dòng rễ tơ Hoàng liên gai.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai qua phương pháp biểu hiện tạm thời với gen chỉ thị GusA.

- Bước đầu tạo một số dòng rễ tơ Hoàng liên gai.

5 Phương pháp nghiên cứu

kiện sinh sống của cây Hoàng liên gai tại địa phận Sa Pa - Lào Cai.

kiện in vitro tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

6 Ý nghĩa khoa học

XLIII Việc xác định được chỉ thị phân tử đặc hiệu cho loài Hoàng liên gai

sẽ đưa ra cơ sở khoa học vững chắc cho việc nhận dạng loài Hoàng liên gai trong

tự nhiên cũng như các loài khác nhau trong chi Berberis.

XLIV Hoàn thiện quy trình chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai qua

vi khuẩn Agrobacterium rhizogenese cung cấp cơ sở khoa học cho quá trình chuyển gen tạo rễ tơ trên các đối tượng loài khác thuộc chi Hoàng liên ( Berberis')

XLV Cung cấp cơ sở cho bảo vệ nguồn gen cây Hoàng liên gai trong tự

nhiên qua việc đáp ứng nguồn cung cấp ổn định sinh kh ối rễ tơ Hoàng liên gai nuôi cấy in vitro

7 Ý nghĩa thực tiễn

XLVI Xây dựng quy trình chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai tạo

tiền đề cho nuôi cấy thu sinh khối rễ tơ ừên qui mô bỉoreactor, nhằm thu lượng lớn sinh khối Hoàng liên gai phục vụ cho các lĩnh vực y dược.

II NỘI DUNG Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.1 Phân bố địa lý

vùng Tây Bắc Việt Nam và Tây Nam Trung Quốc (tây Vân Nam, nam Tây Tạng), nên Trung Quốc còn gọi Hoàng liên gai là Vân Nam Hoàng liên) Hoàng liên gai

vùng núi cao từ 1000 - 2500m Hoàng liên gai ưa đất nhiều màu trên núi cao mưa nhiều ẩm ướt, lớp đát mùn ở trên càng dày càng tốt, cây ưa mát lạnh, sợ nóng, khô, nơi trồng thích hợp là khe núi, sườn dốc, đủ ánh sáng, thoát nước.

liệu Sa Pa (Lào Cai) nhằm bảo vệ nguồn gen, nghiên cứu các hình thức nhân và phát triển giống cây trồng.

Lớp: Ngọc Lan - Magnoliopsida Bộ : Mao lương - Ranunculales Họ : Hoàng liên gai

- Berberidaceae Chi: Hoàng liên gai Berberis Loài: Hoàng Liên gai

1.1.3 Hình thái và đăc điểm sinh thái

nhiều; có gai chia thành 3 nhánh, mọc dưới các túm lá Lá mọc vòng 3-7 cái, cuống lá ngắn; phiến lá cứng, thuôn, nhọn 2 đầu, hơi bóng ở mặt trên, kích thươc

lá khoảng 3 - 9 cm X 1,2 - 2,5 cm, mép lá có răng cưa nhỏ, đều và nhọn.

L. Hoa nhiều, gồm 1 0 - 3 0 mọc ở giữa các túm lá Hoa nhỏ, có cuống dài 1- 1,3 cm, màu vàng, mẫu 3; tổng bao 3, hình mác rộng Đài hoa, hình trứng ngược xếp thành 2 vòng, những vòng ừong lớn hơn vòng ngoài Cánh hoa, nhỏ hơn đài, hình trứng thuôn, đỉnh lõm, gốc có 2 tuyến nhầy Nhị hoa, ngắn hơn cánh hoa; bao phấn hình trứng Bầu hình trụ, hơi phình ở giữa noãn[2] Quả hình trứng thuôn, dài 0,5 cm; đầu nhuỵ tồn tại rõ; khi chín màu tím đen, hơi có phấn trắng Hạt, gần hình trụ, màu nâu nhạt.

20,12 gam; tỷ lệ nảy mầm của hạt khi gieo 38,1%; thời gian nảy mầm từ 38-60 ngày Cây con nảy mầm từ hạt trong tự nhiên quan sát được vào tháng 4 và 5 Có khả năng tái sinh sau khi bị chặt phát Cây ưa ẩm, chịu bóng khi còn nhỏ, sau ưa sáng; thích nghi với vùng có khí hậu á nhiệt đới núi cao Thường mọc rải rác ở rừng cây bụi núi đá vôi, ở độ cao 1500 - 1600 m.

Hàm Rồng đã bị tàn phá (còn vài cây); Điểm ở Ô Quí Hồ đang bị đe doạ (gàn nơi khai thác đá) Đã từng bị khai thác thu mua, nguy cơ bị tuyệt chủng cao[2],[7],[8]

1.1.4 Tác dụng dược lý của cây Hoàng liên gai.

LI. Theo Đông y, Hoàng liên gai vị đắng, lạnh; có tác dụng tả hóa giải độc, thanh tâm nhiệt, táo tỳ thấp, trị tiêu hoá không tốt, viêm ruột, hạ lỵ, đau bụng nôn mửa, trị đau mắt đỏ, tổn thương mí mắt; tiết tả ra máu mủ lâu ngày, trừ thuỷ, lợi xương ích mật, mồm miệng bị nhiệt lở loét

LII. Còn theo y khoa hiện đại, thành phàn hoá học có trong Hoàng liên gai gồm 7 loại aỉkaỉoid, chủ yếu là chất berberin, panmatin, coptỉsin, worenin,

columbamỉn Berberỉn là thà nh phần chủ yếu trong cây Hoàng liên gai Tác dụng chính của berberỉn là chống các loại vi khuẩn, ký sinh trùng đường ruột gây hại cho cơ thể mà không ảnh hưởng tới hoạt động của các vi sinh vật có lợi của đường tiêu hóa Berberỉn còn được bào chế thành thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do các yếu tố kích ứng từ môi trường hoặc do đau mắt hột gây nên Berberỉn có khả năng ngăn ngừa sự lây lan của nấm, bột nhiễm nấm, chống lại tác hại của vi khuẩn tả, E.Coli. Khi dùng kết họp với kháng sinh thì berberin

còn có khả năng hạn chế lại tác dụng không mong muốn của các loại kháng sinh

là diệt hệ vi sinh vật có lợi trong hệ tiêu hóa [ 2 ].

quy mô lớn bằng phương pháp công nghệ sinh học nuôi cấy mô Berberin có tác dụng kháng khuẩn với shỉgella, tụ cầu và liên cầu khuẩn Những năm gần đây, một

số nghiên cứu mới nhất ở nước ngoài đã xác định berberin có tác dụng chống lại nhiều loại vi khuẩn gram dương, gram âm và các vi khuẩn kháng axit Ngoài ra,

nó còn có tác dụng chống lại một số nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên sinh.

LIV. Đặc biệt khi dùng berberin điều trị các nhiễm trùng đường ruột sẽ không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở một Các nghiên cứu gần đây cũng chứng minh: Khi dùng một số thuốc kháng sinh nếu phối hợp với berberin sẽ hạn chế được tác dụng phụ gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột Bởi vậy, berberin đang được chú ý phát triển ở nhiều nước.

LV. Thông thường, khi nhắc đến berberin, hầu hết chúng ta đều nghĩ ngay đến tác dụng hữu hiệu của nó trên đường tiêu hóa Nhưng nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy, hoạt chất này còn đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm

cholesterol, ngăn ngừa bệnh mạch vành và cải thiện chức năng tim Các nhà khoa học phát hiện hoạt chất berberỉn có vai trò tích cực ừong việc bảo vệ thả nh mạch, ngăn ngừa hình thành mảng xơ vữa Do nó tác động lên lớp nội mạc mạch máu (lóp lót ừong lòng mạch máu) và lớp tế bào cơ trơn thành mạch nên làm tăng độ đàn hổi và dẻo dai cho thành mạch; ngăn chặn phản ứng viêm, chống lại việc hình thành mảng xơ vữa từ những giai đoạn đàu tiên.

hóa lipid thông qua quá trình ức chế tổng họp Cholesterol và Triglycerid tại gan Thực tế, từ năm 2004, nhiều nước phương Tây đã ứng dụng berberỉn ừong điều trị tăng lipid máu (mỡ ừong máu) Các nghiên cứu đã đánh giá hiệu quả của hoạt chất này tương đương với statin - một nhóm thuốc hạ mỡ máu phổ biến hiện nay Đồng thời, việc kết hợp berberin với simvastatin trong điều trị mỡ máu giúp giảm đáng kể nồng độ LDL-C máu, Cholesterol toàn phàn cũng như Trỉgicerỉd, hơn hẳn

so với việc sử dụng Simvastatin đơn độc.

LVII Bên cạnh những tác dụng trên mạch máu, nhiều nghiên cứu đã

chứng minh vai trò của berberỉn trong việc tăng cường sự dẻo dai của trái tim Nghiên cứu được thực hiện tại Trung Quốc đã mở ra hy vọng mới cho những người bệnh mắc chứng phì đại cơ tim và suy tim mạn tính bởi hoạt chất này có khả năng ức chế phì đại cơ tim, cải thiện các chỉ số về sức co bóp, khả năng giãn

nở của cơ tim và điều chỉnh hoạt động của thần kỉnh giao cảm tại tim.

LVIII Một nghiên cứu khác tại Trung Quốc trên bệnh nhân suy tim sung

huyết hoặc thiếu máu cơ tim vô căn cho thấy, việc bổ sung hoạt chất này vào phác đồ điều trị chuẩn có sự cải thiện đáng kể chức năng thất ừái, tăng khả năng hoạt động thể lực, biểu hiện khó thở, mệt mỏi cũng cải thiện rõ rệt.

của nhiều nghiên cứu để ứng dụng sản xuất thuốc điều trị bệnh tim mạch trong tương lai Việc sử dụng berberin đơn độc cho bệnh tim mạch vẫn còn trong quá trình thử nghiệm và càn có khuyến cáo từ các nhà dược học trên thế giới.

LX. Khi nghiên cứu tác dụng dược lý của họ Hoàng liên, các nhà khoa học đã chứng minh được vai trò của họ Hoàng liên trong việc điều trị một số loại bệnh như:

đối với Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis và Staphylococcus aureus

Thuốc có tác dụng ức chế mạnh đối với khuẩn gây lỵ nhất là Shigella dysenterỉae

hoặc Chloramphenicol. Thuốc không có tác dụng đối với Shigella sonneỉ,

đối với 1 số vi khuẩn phát triển mà kháng với Streptomicine, Chloramphenicol và

của Hoàng liên đối với vi trùng lao, nhưng không có tác dụng giống như thuốc

INH. Hoạt chất kháng khuẩn của Hoàng liên thường được coi là do berberỉn. Khi sao lên thì lượng berberin kháng khuẩn thấp đi.

Hoàng liên có tác dụng đối với nhiều loại virus cúm khác nhau và virus

Newcastle.

dụng ức chế nhiều loại nấm Nước sắc Hoàng liên và berberỉn tương đối có tác dụng mạnh diệt Leptospira.

Hoàng liên đối với ho gà có khác nhau Một nghiên cứu cho thấy trong thí nghiệm tập trung Hoàng liên ức chế sự phát triển của Hemophilus pertussis cao hơn

nhiên, nghiên cứu khác trên heo Hà Lan, cho uống Hoàng liên thì lại không làm giảm tỉ lệ tử vong.

và thỏ đã được gây mê và chuột không gây mê thấy huyết áp giảm Liều lượng bình thường, hiệu quả không kéo dài, liều lập lại cho kết quả không cao hơn Hiệu quả này xẩy ra dù tác dụng trợ tim ảnh hưởng đến lượng máu tim gây nên bởi liều thuốc này Huyết áp giảm dường như liên hệ với việc tăng dãn mạch, cũng như có

sự gia tăng đồng bộ ở lách, thận và tay chân.

dụ: đang khi berberin làm hạ áp thì phản xạ tăng - hạ của Adrenalin giảm rất nhiều nhưng phụ hồi lại nhanh Berberỉn cũng dung hòa sự rối loạn của Adrenaline và các hợp chất liên hệ.

thể làm tăng việc tạo nên mật cũng như làm giảm độ dính của mật Dùng berberỉn

rất hiệu quả đối với những bệnh nhân viêm mật mạn tính.

nhỏ có tác dụng kích thích vỏ não, trong khi đó, liều lớn lại tăng sự ức chế hoạt động của vỏ não.

bởi dầu cotton ừên chuột nhắt cho thấy chất berberin làm gia tăng đáp ứng kháng viêm của thể Chất Ethanol chiết xuất của Hoàng liên có tác dụng kháng viêm khi cho vào tại chỗ, nó làm cho chất Granulomas co lại Hiệu quả này giống như tác dụng của thuốc Butazolidin. ( http://thuocdongduoc.vn/cay- thuoc-vi-thuoc/278-cay- thuoc-vi-thuoc/934-hoang-lien.hừnl)

Hoàng liên gai

LXX Hoàng liên gai có nhiều đặc t ính quý hiếm, các hợp chất chiết xuất

tò Hoàng liên gai có khả năng ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực y dược Mặt khác, số lượng cá thể Hoàng liên gai ừong tự nhiên đang suy giảm mạnh Bên cạnh đó, đặc tính sinh trưởng và phát triển chậm, khó nuôi trồng khiến cho việc tái sinh Hoàng liên gai trong tự nhiên trở nên kh ỏ khăn Do đó cần quản lý và sử dụng các phương pháp khoa học để khai thác bền vững nguồn tài nguyên này.

LXXI Hoàng liên gai được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam (1996) với cấp

đánh giá "đang nguy cấp" (Bậc E) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 1) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CPngày 30/3/2006 của Chính phủ để nghiêm cấm khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại Bảo vệ những cá thể còn sót lại ở núi Hàm Rồng Trồng được bằng hạt hay cành chiết Khuyến khích người dân trồng làm hàng rào vườn và nương rẫy Trồng bảo tồn ngoại vi (Ex situ ) ở vườn Trạm nghiên cứu trồng cây thuốc Sapa (Viện Dược liệu) [2],[7].Trước tình hình trên, cần sớm nghiên cứu áp dụng kỹ thuật nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật tạo nguồn nguyên liệu ổn định, đáp ứng yêu cầu làm thuốc.

1.2 Tổng quan về nuôi cấy sinh khối rễ tơ

1.2.1 Giới thiệu về nuôi cấy sinh khối tế bào

năng khai thác các hợp chất có giá trị trong y học mà chỉ có thể có ở thực vật Vài năm ừở lại đây, những hoạt chất sinh học từ thực vật được sử dụng như một nguồn dược liệu giá trị Những chất này thường được sản xuất với một lượng rất nhỏ trong tế bào thực vật [5] Để đáp ứng nhu cầu về dược phẩm, các nhà khoa học đã đưa giải pháp nuôi cấy sinh khối ( biomass ) tế bào thực vật, nhằm thu hoạt chất dược với trữ lượng lớn.

bào Phương diện về di truyền cũng như hóa sinh của tế bào thực vật khi gặp điều

kiện tương ứng sẽ biểu hiện các tính trạng như một cá thể hoàn c hỉnh Có nhiều nghiên cứu cho thấy sản phẩm trao đổi chất được sản xuất theo phương pháp sinh khối cho chất lượng cũng như số lượng cao hơn ở cá thể cây hoàn chỉnh Các nhóm chất thường được sản xuất theo phương pháp này là các alkaloid , tinh dầu

và hợp chất glycosỉd. Các loại vật liệu được nuôi cấy có thể là: tế bào đơn, mô sẹo,

kinh tế cao là sản phẩm của nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật: Các hoạt chất dùng trong dược phẩm như caffein thu được từ nuôi cấy tế bào Coffea arabica [26],

phải trồng tò 4 - 6 năm mới thu được hàm lượng berberỉne đáng kể trong rễ, trong khi hàm lượng này có thể thu được sau 4 tuần nuôi cấy bằng sinh khối tế bào thực vật) [27].

tế bào thông đỏ), nuôi cấy sinh kh ối tế bào bằng hệ thống bioreactor 10.000 lít trong sản xuất reserpine (alkaloid chiết xuất từ cây Ba gác có tác dụng chữa bệnh cao huyết áp và rối loạn tuần hoàn máu) có thể sản xuất được 3.500 kg resperin trong thời gian 30 ngày nuôi cấy.

công quy trình nhân nhanh sinh khối mô sẹo của cây Hoàng liên gai nhằm sản xuất nguồn dược liệu berberỉne, thay thế nguồn tự nhiên đang ngày càng khan hiếm Với quy trình này, sau khoảng 3-4 tuần nuôi cấy mô của cây Hoàng liên gai, có thể thu được một lượng mô lớn gấp hàng chục lần lượng ban đầu[l].

vật các chất điều hòa sinh trưởng thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy

nhằm làm giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy Việc làm này sẽ dẫn tới có sự tồn dư của các chất điều hòa sinh trưởng trong sinh khối tế bào nuôi cấy gây ảnh hưởng đến ức khỏe người sử dụng và tính an toàn của sản phẩm Tuy nhiên, vấn đề này có thể khắc phục được thông qua nuôi cấy sinh khối tò rễ tơ, bởi rễ tơ có khả năng sinh trưởng cao và đặc biệt có thể s inh trưởng, phát triển tốt trên môi trường không cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng [17].

Phương pháp tạo rễ tơ ở tế bào thực vật

a )Agrobacterium sp b) Bệnh khối u ở thực vật, c) Bệnh rễ tơ ở thực vật

biết đến từ rất lâu ừong nông nghiệp với vai ữò là vi khuẩn cố định đạm, cung cấp

Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rubi là hai nhóm gây bệnh khối u (crowwn gaỉỉ) ở thực vật; nhóm Agrobacterium rhizogenes gây bệnh mọc rễ tơ {hairy roots) tại các vết thương của cây; nhóm Agrobacterium radiobacter không gây bệnh

vai trò của hai loài vi khuẳn Agrobacterium rhừogenes và Agrobacterium tumefaciens trong mục đích chuyển gen vào thực vật Chúng được xem như là các

“kĩ sư trao đổi chất”, được áp dụng để chuyển gen vào tế bào thực vật nhằm mục

gây bệnh của Agrobacterium sp đã được chứng minh là do sự có mặt của pTi

< .

/

(pỉasmiđ tumor induction) ở Agrobacterium tumefaciens và pRi (pỉasmid root induction) ở Agrobacterium rhizogenes.

LXXXVIII. Agrobacterium rhizogenes, tên khoa học khác là Rhizobium rhizogenes, là một loài vi khuẩn đất gram âm, thuộc họ Rhizobiaceae nằm trong bộ

Rhizobiales cổ định đạm Chúng có khả năng nhận biết được các phân tử tín hiệu từ các tế bào thực vật bị tổn thương và tấn công vào vị trí đó [12],[36].

thương của thực vật thì chúng sẽ chuyển gen của chúng vào các tế bào thực vật tại vị trí đó Các gen được chuyển từ Agrobacterium rhizogenes vào bộ gen của tế bào thực

gắn ổn định vào bộ gen của thực vật Tuy nhiên các gen mã hóa T-DNA có nguồn gốc

hiện được trong tế bào thực vật Vùng T-DNA này ừong một plasmid lởn của

Agrobacterium rhizogenes và plasmid này được đặt tên là Rỉ-plasmid (root inducing plasmid) do Â.rhizogenes có khả năng cảm úng tạo rễ bất định [23].

rigin of («plKition

XCI.

I.

II Hình 1.3: Cấu trúc Ri - plasmid

XCII Ri-plasmid được chia thành 2 nhóm chính là agropine và mannopine,

vi khuẩn A.rhỉzogenes chứa Ri-plasmid thuộc loại agropine được sử dụng chủ yếu cho quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật để cảm ứng tạo rễ tơ Ri- plasmid được chia thành nhiều vùng như vùng gây độc (gọi tắt là vùng vir- vỉrulence)),

vùng chuyển gen (T-DNA), vùng orì (vùng mã hóa chức năng tái bản và kh ởi điểm tái bản), vùng phiên mã chỉ có đoạn T-DNA của plasmid mới được chuyển vào bộ gen của thực vật và sự chuyển gen này thông qua sự hỗ ừợ bởi các đoạn gen trong vùng vir của Ri-plasmid Vùng vir chiếm khoảng 35 kb trong Ri- plasmid và mã hóa 6 locus phiên mã cho các proteỉn (vir A, B, c, D, F, G ), có chức năng quan trọng trong quá trình chuyển gen [30] Sự phiên mã của vùng vir được cảm ứng với nhiều hợp chất thuộc nhóm phenoỉ, điển hình là acetosyringone - họp chất liên quan được xác định là có vai trò làm tăng tần số của quá trình chuyển gen thông qua Agrobacterium ở nhiều loài thực vật Nhiều loại đường cũng đóng vai trò như chất bổ trợ hoạt động cho acetosyringone để cảm ứng sự biểu hiện của gen vir ở mức độ cao [29].

t rình vận chuyển T-DNA vào tế bào vật chủ của vi khuẩn A.tume/aciens và

khối u ở vi khuẩn A.tume/aciens do gen mã hóa s inh tổng hợp auxin quy định Trong khi đó, các gen mã hóa sinh tổng họp auxỉn ở vi khuẩn A.rhỉzogenes có vai

ừò rất nhỏ ừong quá trình hình thành rễ tơ ở thực vật

XCIV.[12],[36].

XCV T-DNA ở Ri-plasmid của nhóm agropỉne bao gồm 2 vùng chính là vùng biên trái Tl-DNA và biên phải Tr-DNA Hai vùng này đều có kích thước khoảng 15 - 20 kb và được xen kẽ bởi 1 đoạn DNA, đoạn DNA này sẽđược chuyển vào hệ gen của tế bào vật chủ Vùng Tr-DNA mang các gen mã hóa sinh tổng họp auxỉn (tms 1 và tms2), vùng Tl-DNA bao gồm 18 khung dọc (ORFs), trong đó có 4 locus 10, 11, 12 và 15 mã hóa cho rol A, B, c và D (root locus), Các Ri-plasmid của các chủng A.rhizogenes thuộc nhóm mannopỉne, cucumopine và

mỉlimopỉne chứa vùng T-DNA đơn, có cấu trúc giống vùng Tl-DNA của các chủng thuộc nh ỏm agropine nhưng khuyết gen roỉD [16] Các gen rol A, roỉB và rol c đóng vai trò quan trọng trong quá trình tạo rễ tơ ở mô tế bào thực vật Sự biểu hiện đồng thời của 3 gen này gây lên kiểu hình rễ tơ ở mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm Các rễ tơ này có khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh hơn rất nhiều

so với rễ bình thường Trong 3 gen rol ừên, gen roi B đóng vai trò quan trọng hơn

cả, khi gen roỉ B được biểu hiện, mô tế bào thực vật đã cảm ứng tạo kiểu hình rễ

tơ, trong khi đó bất hoạt gen rolB không tạo được kiểu hình rễ tơ [ 11 ].

XCVI.

r 7 >

Hình 1.4: Cơ chê chuyên gen của Agrobacterium sp (nguôn : www.zbook.vn )

III.

1.2.4 Nuôi cấy sinh khối rễ tơ.

khi chuyển vào tế bào thực vật thì chúng sẽ được gắn vào bộ gen của thực vật, từ đó

IAA) làm tăng khả năng tạo các lông rễ một cách mạnh mẽ ngay tại vị trí bị tổn thương ở mô thực vật đó số lượng các lông rễ được tạo ra khá nhiều, phát triển thành một hệ thống lông rễ, hay còn gọi là hệ thống rễ tơ [36].

XCVIII.

khối rễ sau 30 ngày nuôi cay (b,c)

IV.

V Hình 1.5 Các hệ rễ tơ được nuôi cấy

XCIX Điểm đặc trưng nổi bật của hệ thống tễ tơ là chúng có khả năng phát

triển nhanh và ổn định trên môi trường nuôi cấy không cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật, với sự chuyển gen của A rhizogenes vào tế bào rễ tơ có khả năng tổng hợp ra nhiều loại hợp chất tự nhiên với hiệu suất cao mà các tế bào không phân hóa và các rễ bất định không chuyển gen không tổng hợp được hay tổng hợp với hàm lượng không đáng kể [36].

CI. Công nghệ nuôi cấy rễ tơ đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhờ vào những ưu điểm của mình Rễ chuyển gen có đặc tính là tốc độ sinh trưởng nhanh và tính di truyền ổn định Rễ tơ có thể sản xuất một lượng lớn hợp chất thứ cấp hay hàng loạt họp chất có liên quan tới thực vật.

CII. Sản xuất hợp chất thứ cấp

CIII Thông thường, nuôi cấy rễ cần có sự xuất hiện của các chất điều hòa

sinh trưởng ngoại sinh, hay là sự có mặt của các chất này ừong môi ừường nuôi cấy Phương pháp nuôi cấy rễ này tạo các dòng rễ sinh trưởng rất chậm và có thể dẫn đến tình trạng thiếu hụt hay tổng hợp kém các hoạt chất thứ cấp Tuy nhiên,

rễ tơ đã cải tiến công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật trong thu nhận các hợp chất

có giá trị sinh học cao Rễ tơ cũng đã cung cấp một nguồn hóa chất thiên nhiên dồi dào cho các ngành công nghiệp dược phẩm, hóa mỹ phẩm và phụ gia thực phẩm [9].

ATCC 15834 cảm ứng với loài Taxus cuspidata và thu nhận được 107 dòng rễ tơ Trải qua quá t rình sàng lọc cho 3 dòng rễ tơ có thể sinh trưởng tốt ừên môi trường

MS không chất điều hòa sinh trưởng, và có khả năng sinh tổng hợp taxol - một hợp chất có công dụng mạnh trong điều tri ung thư [ 22 ].

CV. Bảng 1.1: Một số loài thực vật được nuôi cấy rễ tơ để thu hoạt chất sinh

CVI học[19].

CVIII Rễ tơ được xem như là muột nguồn nguyên liệu có giá trị ừong sản

xuất các họp chất tự nhiên có lợi như dược phẩm, các chất phụ gia trong ngành

mỹ phẩm và thực phẩm Vào năm 2002, Sevon đã tổng kết lại những hợp chất ankaloid quan trọng nhất trong ngành được sản xuất bởi hệ thống rễ tơ, bao gồm

vào những đặc điểm như phát triển nhanh, dễ duy trì ổn định và khả năng tổng họp một số lượng lớn họp chất tự nhiên, hệ thống rễ tơ thể hiện tiềm năng lớn trong việc sản xuất các họp chất tự nhiên thông qua các hệ thống nuôi cấy liên tục Điều này có ý nghĩa lớn trong việc sản xuất các sản phẩm họp chất tự nhiên ừên quy mô công nghiệp với hiệu xuất cao, giảm chi phí trong quá trình sản xuất

từ đó giảm giá thành sản phẩm.

thể chuyển các gen ngoại lai vào trong tế bào thông qua việc tái tổ hợp đoạn gen

đó vào trong đoạn T-DNA của A.rhizogenes. Các gen này có thể là gen biểu hiện ra các họp chất mục tiêu hay có thể là các gen mã hóa các enzyme chìa khóa trong con đường sinh tổng họp ra các chất tự nhiên mong muốn Phương pháp này có thể giúp ta điều khiển hay định hướng cho quá trình sinh tổng hợp các chất tự nhiên ở rễ tơ để tổng họp ra một loại họp chất tự nhiên với hàm lượng cao Nghiên cứu của Lodhi (1996) đã chứng minh hàm lượng anthraquỉnone và alizarin

ừong hệ thống nuôi cấy rễ tơ của Rubỉa peregrỉna L tăng cao khi gắn đoạn gen mã hóa ra enzyme izochorismate synthase vào đoạn T-DNA; và theo Baneîjee (2002) thì

rễ tơ của A.belladonna được chuyển gen P450 2E1 thể hiện khả năng tổng hợp chất

tự nhiên với mức độ rất cao [31].

CX. Tại Hàn Quốc, một số công ty đang sản xuất rễ tơ nhân sâm với bioreactor có dung tích 10.000 đến 20.000 lít Sản phẩm này được làm nguyên liệu cho các dạng thực phẩm chức năng và thực phẩm khác nhau ừên thị trường

Đã có rất nhiều nghiên cứu thả nh công trong tạo các hoạt chất từ nuôi cấy sinh khối rễ tơ [5],[ 6 ].

CXI Với tiềm năng to lớn của hệ thống rễ tơ, các hệ thống rễ tơ của

nhiều loài thực vật đã được nghiên cứu rộng rãi cho mục đích sản xuất hợp chất tự nhiên in vỉtro. Đặc biệt là những cây thuốc có ứng dụng lớn cho việc chữa bệnh.

CXII ửng dụng của rễ tơ trong phân tích chức năng của gen

CXIII Rễ tơ không chỉ được ứng dụng để sản xuất họp chất thứ cấp mà

còn được sử dụng trong các thí nghiệm nghiên cứu chức năng gen Các đoạn gen chức năng được tái tổ hợp với gen chỉ thị gus, hoặc chỉ thị bằng huỳnh quang và được đưa vào A.rhỉzzogenes để chuyển vào thực vật Thông qua quá trình biểu hiện của gen chỉ thị gus mà các gen chuyển vào rễ tơ được nghiên cứu chức năng Một

ví dụ là gen gus kết họp với promotor alcohol dehydrogenase (Adh) và được chuyển vào rễ tơ đậu nành Chức năng của promotor được nghiên cứu dưới các điều kiện môi trường như: nhiệt độ thấp, thiếu khí, bị tổn thương và xử lý acid abscisic. Tất

cả các chức năng đều được nghiên cứu thông qua sự biểu hiện của gen gus [47].

CXIV Biểu hiện proteỉn ngoại lai

CXV Rễ tơ còn được dùng để biểu hiện các protein công nghiệp và các

loại protein chức năng Nhờ vào khả năng chuyển một đoạn gen ngoại lai vào thực vật, A.rhỉzogenes đã được thiết kế mang các vector tái tổ hợp để có thể biểu hiện các loại protein trong rễ tơ Các gen ngoại lai này được gắn kết vào genome

thực vật và ổn định về mặt di truyền nên khả năng biểu hiện không bị suy giảm Ryan (2008) đã tạo thành công dòng rễ tơ mang gen mã hóa cho

cho cơ thể Các dòng rễ này tuy tăng trưởng chậm nhưng có hàm lượng

nghiên cứu cho thấy có thể tạo rễ tơ mang cấu trúc kháng thể ở người hay cấu trúc

vỏ protein của các virus gây bệnh nhằm bước đầu tạo nguồn vaccine thực vật Sharp (2001) đã thành công ừong việc tạo dòng rễ tơ thuốc lá mang kháng thể đơn dòng IgGI ở ngưcri[38].

CXVI Với tiềm năng và khả năng ứng dụng to lớn của mình, hệ thống rễ

tơ của nhiều loài thực vật đã được nghiên cứu rộng rãi cho mục đích sản xuất các họp chất tự nhiên in vitro, đặc biệt là những cây thuốc có ứng dụng lớn cho việc chữa bệnh Bên cạnh đó, rễ tơ còn là một công cụ hữu hiệu trong các nghiên cứu

về gen hay công nghệ protein.

Hoàng liên gai ngoài tự nhiên làm nguyên liệu cho nuôi cấy là một việc cần thiết Tuy nhiên nguồn nguyên liệu ngoài tự nhiên nếu chỉ dựa vào hình thái và kinh nghiệm dân gian đôi khi dễ nhầm lẫn với những đối tượng cây có hình thái tương

tự sống tại cùng một khu vực Điều này có ảnh hưởng không nhỏ đến nghiên cứu

Do đó việc nhận dạng các mẫu cây ngoài tự nhiên bằng phương pháp sinh học phân tử sẽ mang ý nghĩa rất quan trọng.

CXIX Trong vài thập kỷ gần đây, sự phát triển mạnh mẽ của các phương

pháp và kỹ thuật sinh học phân tử đã tạo ra các công cụ hữu hiệu cho các nghiên cứu sự sống ở mức độ phân tử Các kỹ thuật sinh học phân tử cũng nhanh chóng được ứng dụng trong nghiên cứu và bảo tồn đa dạng sinh học, nhận dạng loài, tạo

ra các lĩnh vực khoa học mới như tiến hóa phân tử, di truyền và bảo tồn loài Đặc biệt, đối với lĩnh vực phân loại học, việc sử dụng các DNA chỉ thị để nhận dạng loài đang được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và có những

đóng góp đáng kể trong việc phân loại loài Nhận dạng loài bằng chỉ thị DNA hay

nhận dạng loài một cách chính xác, nhanh chóng, tự động hóa bằng cách sử dụng một vùng DNA chuẩn hay còn gọi là chỉ thị DNA hay mã vạch DNA (DNA

biệt hữu dụng với các loài gần gũi và những quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ sở để nhận dạng hoặc phân biệt loài [24],[25].

CXX Hiện nay trên thế giới, phương pháp này đang được sử dụng chủ

yếu bởi các nhà phân loại học và nhiều nhà khoa học ở các lĩnh vực khác như khảo cổ học, công nghiệp sinh học và chế biến thực phẩm

CXXI Đối với thực vật, quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các

loài thực vật gặp nhiều khó khăn Hệ gen ty thể ở thực vật thường quá bảo thủ nên không được dung cho thỉ thị DNA, trong khi đó hệ gen lục lạp lại mang nhiều đặc điểm mong muốn đối với chỉ thị DNA như ở hệ gen ty thể ở động vật [44] Ở hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi ITS (Internal Transcrỉbed

cứu và đề xuất làm chỉ thị DNA cho thực vật tuy nhiên chưa có chỉ thị DNA nào được đa phàn các nhà phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận[25],[44] Mặc

dù vậy, các nhà nghiên cứu cũng đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ cần không chỉ một mà nhiều vùng DNA chỉ thị để định danh loài đối với thực vật và

hệ gen lục lạp là nơi chứa các vùng DNA chỉ thị tiềm năng, trong đó một số vùng DNA lục lạp đã được nhiều nhà nghiên cứu đề xuất là chỉ thị DNA [13],[14],[43].

biến có độ c hính xác cao đã được nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước sử dụng Nhiều vùng gen đã được nghiên cứu và đề xuất làm chỉ thị DNA cho thực vật

[13] ,[25],[43] tuy nhiên chưa có chỉ thị DNA nào được đa phần các nhà phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận [13],[16] Mặc dù vậy, các nhà nghiên cứu cũng đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ càn không chỉ một mà nhiều vùng DNA chỉ thị để xác danh loài đối với thực vật và hệ gen lục lạp là nơi chứa các vùng DNA chỉ thị tiềm năng, trong đó một số vùng DNA lục lạp đã được nhiều nhà nghiên cứu đề xuất là chỉ thị DNA [13],[14],[43].

ngày càng sụt giảm về số lượng nên việc xây dựng một công cụ phân loại nhanh chóng và chính xác cho loài cây này là một yêu càu cấp thiết nhằm bảo tồn và phát triển cây Hoàng liên gai tại Việt Nam, chỉ thị DNA barcod là phương pháp phân loại cho kết quả nhanh chóng đã được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước sử dụng ừên nhiều đối tượng khác nhau Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu xây dựng mã vạch DNA với 5 chỉ thị rpoB, rpoCl, psbA- tmH, trnL:(nằm trên

plasmid phân bố trong lục lạp), ITS ( nằm trong genome thực vật) để phục vụ cho việc phân loại và nhân dạng cây Hoàng liên gai tại Sa Pa.

- Chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 do Viện Dược học và Sinh học phân

tử, trường Đại học Heidelberg cung cấp.

- Box cấy vô trùng, các loại thiết bị trong phòng nuôi cấy vô trùng, tủ tối, tủ 37°c.

- Dụng cụ nghiên cứu và máy móc thiết bị của Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học.

- Các muôi trường cơ bản nuôi cấy tế bào thực vật như MS (Murashige and Skoog); YMB (Woody plant medium); LB (Lauria Broth) kháng sinh ( cefotaxime,

thông dụng khác (agar, gellam gum ) của các hãng Sigma, Fermentas, Duchefa 2.3 Phương pháp nghiên cứu

gai và vùng phân bố của chúng, tôi tiến hành thu thập mẫu tại Vườn Quốc gia Hoàng liên - Sa Pa - Lào Cai.

ừánh việc sử dụng nhầm đối tượng nghiên cứu Qui trình xác định loài bằng chỉ thị phân tử gồm các bước:

được tiến hành tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB theo Saghai-Maroof

et al., 1984 [34].

khi tách chiết thành công được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với như sau: bước 1: 94°c, 5 phút; bước 2: 94°c, 30s; bước 3: 54°c, 50s; bước 4: 72°c, 1 phút; từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 30 chu kì; bước 5: 72°c, 10 phút; bước 6 : 4°c bảo quản mẫu.

trong đệm IX TAE, nhuộm gel trong dung dịch Ethidium brommỉde và tinh sạch bằng kit thôi gel của QIAamp Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với các mồi sau:

tinh sạch được gắn vào vector tách dòng pBT và biến nạp vào tế bào khả biến

khuẩn lạc

Carbenicilin, 0,004% X-gal và 0,lmM IPTG Tách plasmid theo hướng dẫn của bộ Kit tách plasmid (Bioneer, Hàn Quốc) và của Sambrook và Russell (2001) Kiểm tra sự có mặt của DNA tái tổ họp bằng phương pháp clony-PCR với cặp mồi pUC18-F và PƯC18-R Tr ình tự DNA các đoạn gen rpob, rpoCl, psbA-trnH, trnL, ITS của hai mẫu Hoàng liên gai được xác định bằng máy đọc trình tự tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Các trình tự được phân tích và so sánh bằng phần mềm BioEdit, DNAstar và dựng cây phát sinh chửng loại ừên cơ sở dữ liệu thu được.

2.3.2 Phương pháp khử trùng hạt và đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro

phòng pha loãng, sau đó xả dưới vòi nước khoảng 10 phút.

CXXXV. Bước 2: Khử trùng hạt với dung dịch C 2 H 5 OH 70° trong thời gian tò 1

- 3 phút sau đó rửa lại với nước cất khử trùng 4 - 5 làn ( m ỗ i lần từ 3 - 4 phút)

ừong khoảng thời gian từ 9 - 10 phút rửa lại với nước cất khử trùng 4 - 5 lần ( m ỗ i lần 3 - 4 phút).

dụng panh, dao tách hết lớp vỏ ngoài lấy phôi nhũ Đưa phôi nhũ vào cấy trong môi trường MS đã chuẩn bị sẵn.

để ừên giá phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kỳ 16 giờ sáng và 8 giờ tối, nhiệt độ phòng 22 -24°c cường độ chiếu sáng

2000 lux Theo dõi khả năng sinh trưởng phát triển của phôi ừên môi trường MS.

yếu tiến hành là lây nhiễm trực tiếp mẫu với dịch huyền phù vi khuẩn trong môi trường lỏng trong một khoảng thời gian nhất định.

CXL Chuẩn bị mẫu mô thực vật: Các mẫu mô thực vật được cắt nhỏ, tạo

vết thương trên biểu bì Các mẫu lá được tạo tổn thương bằng lưỡi dao, cắt bốn cạnh xung quanh Thân cây Hoàng liên gai cắt nhỏ có chiều dài khoảng 0,3 - 0,4

cm đặt vào trong đĩa petri có sẵn môi trường MS lỏng.

CXLI Phương pháp chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai thông qua

vi khuẩn A.rhizogenes ATCC 15834 bao gồm các bước chính sau:

trên môi trường YMB đặc nuôi trong tủ ấm 28°c trong 48 giờ.

- Lấy một khuẩn lạc nuôi phục hồi trong trong 20 ml YMB lỏng nuôi lắc 200 v/p qua đ ê m

vào 45 ml YMB lỏng, nuôi lắc 200 v/p, 28° c trong 4-6 giờ Các môi trường nuôi khuẩn đều không bổ sung kháng sinh do vector pRi 15834 không có gen kháng kháng sinh.

loại bỏ môi trường nuôi cấy Cặn khuẩn được hòa tan trong môi trường MS lỏng tạo dịch huyền phù vi khuẩn Các mẫu thực vật được cắt tạo tổn thương sau đó được lây nhiễm bằng cách ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn

- Sau khi lây nhiễm, mẫu biến nạp được thấm khô bằng giấy thấm khử trùng rồi được đặt vào môi trường đồng nuôi cấy: MS + saccharose 30 g/1 + agar 8 g/l.

- Sau thời gian đồng nuôi cấy, chuyển mẫu lên môi trường diệt khuẩn: MS + saccharose 30 g/1 + agar 8 g/l + cefotaxime 500 mg/1 Sau 2-4 tuần, các mẫu thực vật bắt đàu cảm ứng tạo rễ và được cắt ra chuyển lên môi trườngMS + saccharose 30 g/1 + agar 8 g/l + cefotaxime 500 mg/1.

CXLV.Quy trình tóm tắt tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai CXLVI.

gai

C2H5OH (70%) HgCl 2 0,1%

CLV.Ly tâm thu sinh khối, tạo huyền

phù trong môi trường nhiễm khuẩn

quan trọng Nếu không loại bỏ vi khuẩn thì trong quá trình nuôi cấy rễ tơ, chúng

sẽ phát triển trong môi trường nuôi cấy, sẽ tạo cạnh trang nguồn dinh dưỡng gây ảnh hưởng xấu đến khả năng phát triển của rễ tơ tại vị trí nhiễm, thậm trí có thể lấn át không cho rễ phát triển, rễ tơ thường xuất hiện sau khi đã chuyển gen khoảng 3-4 tuần.

gen gus.

CLXVIII. Gen gus được khám phá bởi Jefferson [21] Nó được xem như một công cụ hữu hiệu trong việc đánh giá hoạt động của gen trong cây chuyển gen và được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực biến nạp gen ở thực vật.

điểm sau: Sản phẩm của nó là độc nhất và không độc đối với tế bào vật chủ, các enzyme chỉ thị của nó có tính ổn định cao, các phương pháp phân tích sản phẩm của gen này đơn giản, thuận tiện, nhạy và đặc thù.

X-Gluc ( 5-bromo-4-chỉoro-3-indolyỉ glucuronỉdè), sản phẩm phân giải có màu xanh đặc trưng dễ nhận biết và rất bền vững Trong tự nhiên j6 - glucoronidase không tồn tại trong thực vật, vì vậy gen gus là gen chỉ thị rất hữu hiệu trong kỹ thuật chuyển gen và nhận biết gen chuyển ở thực vật [ 21 ].

người ta tiến hành thiết kế vùng có cấu trúc intron (vùng không phiên mã) có chứa

hiện tượng dương tính giả Khi còn ở trong vi khuẩn Agrobacterium, gen gụs nằm trong vùng intron của vector chuyển gen nên không được phiên mã, dịch mã để tạo sản phẩm enzyme và không có phản ứng màu đặc trưng khi nhuộm ừong cơ chất X-Gluc Khi được chuyển vào tế bào thực vật, thông qua bộ máy di truyền của tế bào thực vật, gen gus mới được phiên mã, dịch mã để tạo ra sản phẩm tham gia vào phân giải cơ chất và tạo phản ứng màu đặc trưng.

thường sử dụng gen chỉ thị gus. Các bộ phận khác nhau của cây chuyển gen được ngâm ừong dung dịch đệm cơ chất X-Gluc Sau 24 - 48 giờ nhuộm mẫu được tẩy hết diệp lục bằng Ethanol và quan sát ừên kính núp soi nổi Biểu hiện hoạt động

của gen gus sau khi chuyển vào tế bào thực vật là phản ứng tạo màu đặc trưng trên các tế bào, mô, bộ phận của cây chuyển gen.

môi trường diệt khuẩn MS bổ sung cefotaxime 500 mg/1 trong 5-7 ngày trước khi được nhuộm gus với quy trình được cải tiến theo Jeffeson et al (1987) [21] Theo

đó, các bộ phận khác nhau của cây chuyển gen được ngâm trong dung dịch đệm

cơ chất X-Gluc (Tris/NaCl: 890 |il; X Gluc: 100 ụ,l; Triton X - 100 : 10 |il), ủ ở nhiệt độ 37°c trong 24 giờ Sau đó, loại bỏ thuốc nhuộm, ngâm mẫu với ethanol 70% cho đến khi diệp lục mất hoàn toàn.

chụp ảnh dưới kính hiển vi soi nổi Biểu hiện hoạt động của gen gus sau khi chuyển vào tế bào thực vật là phản ứng tạo màu đặc trưng trên các tế bào, mô, bộ phận của cây chuyển gen.

3.1 Thu thập và nhận dạng loài Hoàng liên gai

3.1.1 Thu thập mẫu

vùng núi thuộc Vườn Quốc Gia Hoàng liên - Sa Pa - Lào Cai dựa trên các đặc điểm hình thái (Cây bụi, cao 2-3m có những cành vươn dài, vỏ thân màu vàng xám nhạt, mỗi đốt dưới chùm lá có gai ba nhánh, dài l-l,5cm Lá mọc thành chùm

3 - 4 lá, có khi tới 8 lá ở một đốt Cuống lá ngắn 0,5 - 1 cm, phiến lá nguyên, hình mác, mép có răng cưa to, cứng, dài 16-17cm, rộng 4-6cm, mặt trên màu xa nh lục nhạt, mặt dưới màu trắng ).

mẫu Hoàng liên gai có đặc điểm hình thái khác nhau tại Vườn Quốc Gia Hoàng

liên Chúng tôi tiến hành nhận bước đàu qua đặc điểm hình thái của hai loài Hoàng liên gai thu nhận được.

CLXXVIII Các mẫu Hoàng liên gai thu tại Sa Pa, thông tin các mẫu

được liệt kê ở bảng 3.1

XCVII.

C. Các trình tự nucleotide các đoạn gen Hoàng liên gai khai thác trên Genbank (phụ lục 2).

TT LXV. Kí hỉêu mẫu ■ LXVI. Nguön göc

LXVII.