Nghiên cứu diễn thế sinh thái và đặc điểm sinh học của vi sinh vật tham gia quá trình chuyển hóa rơm rạ thành mùn hữu cơ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 PHẠM THỊ THANH NHÀN NGHIÊN CỨU DIỄN THẾ SINH THÁI VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI SINH VẬT THAM GIA QUÁ TRÌNH CHUYỂN HÓA RƠM RẠ THÀN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

PHẠM THỊ THANH NHÀN

NGHIÊN CỨU DIỄN THẾ SINH THÁI

VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI SINH VẬT THAM GIA QUÁ TRÌNH CHUYỂN HÓA

RƠM RẠ THÀNH MÙN HỮU CƠ

Chuyên ngành: Sinh thái học

Mã số: 60 42 01 20

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Thị Thúy

HÀ NỘI, 2014

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện đề tài, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, chỉ bảo

và đóng góp ý kiến quý báu từ các thầy cô giáo, gia đình, bạn bè và đồng nghiệp

Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Trần Thị Thúy, người trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và đồng hành giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài

Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà Nội

2, trường Đại học Sư phạm Hà Nội Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy, cô giáo trong Bộ môn Vi sinh, khoa Sinh học - Kĩ thuật nông nghiệp, trường Đại học

Sư phạm Hà Nội 2 và Bộ môn Công nghệ Sinh học - Vi sinh, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã quan tâm, tạo điều kiện và giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành đề tài này

Em xin cảm ơn tất cả các anh, chị và các bạn đang nghiên cứu, học tập tại phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh, khoa Sinh học - Kĩ thuật nông nghiệp, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 và Bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh, trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã giúp đỡ và có ý kiến đóng góp cho em trong thời gian qua

Em xin được bày tỏ lòng biết ơn và yêu thương tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện cho em trong quá trình thực hiện đề tài

Trong quá trình thực hiện không thể tránh khỏi những thiếu sót, em kính mong thầy cô giáo và các bạn đóng góp ý kiến để đề tài được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 11 năm 2014

Học viên

Phạm Thị Thanh Nhàn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này

là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả

Phạm Thị Thanh Nhàn

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Đối tượng nghiên cứu 2

3 Mục tiêu nghiên cứu 2

4 Nội dung nghiên cứu 3

5 Những đóng góp của đề tài 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về rơm rạ 4

1.1.1 Phụ phẩm rơm rạ trong sản xuất lúa gạo 4

1.1.2 Hiện trạng sử dụng rơm rạ trên thế giới và ở Việt Nam 10

1.2 Tổng quan về vi sinh vật có khả năng phân giải rơm rạ 13

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Vật liệu 18

2.1.1 Vi sinh vật 18

2.1.2 Môi trường nghiên cứu và hóa chất 18

2.1.3 Thuốc thử 19

2.1.4 Thiết bị 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Lấy mẫu 19

2.2.2 Phương pháp vi sinh vật 19

2.2.3 Phương pháp xác định độ ẩm tuyệt đối của rơm rạ 28

2.2.4 Phương pháp toán học thống kê và xử lý số liệu 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Diễn thế sinh thái của vi sinh vật trong quá trình mùn hóa tự nhiên của rơm rạ 29

3.1.1 Đặc điểm trạng thái của rơm rạ trong quá trình mùn hóa 29

3.1.2 Sự thay đổi nhiêt độ của các khối ủ mùa hè và mùa đông 34

3.1.3 Sự giảm khối lượng của các khối ủ mùa hè và mùa đông 36

3.2 Vi sinh vật đất phân lập được từ quá trình mùn hóa tự nhiên của rơm rạ 39

3.3 Tuyển chọn các chủng vi sinh vật đất có hoạt tính enzyme ngoại bào phân giải lignin, cellulose và hemicelluloses 42

3.4 Mô tả một số đặc điểm sinh học của 05 chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme ngoại bào điển hình 44

3.4.1 Hình thái khuẩn lạc và hiển vi của ba chủng vi khuẩn điển hình 45

3.4.2 Hình thái khuẩn lạc và hiển vi của hai chủng xạ khuẩn điển hình 49

3.4.3 Nghiên cứu tính đối kháng của các chủng VSV tuyển chọn 51

3.5 Đánh giá khả năng phân giải rơm rạ của một số chủng vi sinh vật tuyển chọn 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2 1 Môi trường phân lập và nuôi cấy VSV 18

Bảng 2 2 Thành phần môi trường thử hoạt tính enzyme ngoại bào 18

Bảng 2 3 Các khối ủ và tỉ lệ thành phần phối trộn trong khối ủ 20

Bảng 2 4 Vi sinh vật bổ sung vào cơ chất rơm rạ 27

Bảng 3 1 Sự thay đổi trạng thái rơm rạ trong các khối ủ vào mùa hè 30

Bảng 3 2 Sự thay đổi trạng thái rơm rạ trong các khối ủ vào mùa đông 32

Bảng 3 3 Sự thay đổi độ mủn của rơm rạ trong các khối ủ 34

Bảng 3 4 Vi sinh vật phân lập được trong 5 đợt phân lập các mẫu của khối ủ mùa hè (U1 và U2) 40

Bảng 3 5 Vi sinh vật phân lập được trong 5 đợt phân lập các mẫu của khối ủ mùa đông (Đ1 và Đ2) 40

Bảng 3 6 Hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng vi sinh vật phân lập được từ các khối ủ 42

Bảng 3 7 Hoạt tính của 05 chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme ngoại bào mạnh nhất 43

Bảng 3 8 Một số đặc điểm hình thái của 3 chủng vi khuẩn có hoạt tính enzyme ngoại bào mạnh 45

Bảng 3 9 Một số đặc điểm hình thái của 2 chủng xạ khuẩn có hoạt tính enzyme ngoại bào mạnh 49

Bảng 3 10 Thành phần C và N trong rơm rạ khô (%) 54

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1 Sản lượng và diện tích gieo trồng lúa thế giới 4

Hình 1 2 Cấu trúc lập thể của cellulose 6

Hình 1 3 Cấu trúc của hemicelluloses 8

Hình 1 4 Các đơn vị cơ bản của lignin 9

Hình 1 5 Cấu trúc lignin 10

Hình 3 1 Rơm rạ được ủ trong thùng xốp 29

Hình 3 2 Biến thiên nhiệt độ của khối ủ U1 và U2 35

Hình 3 3 Biến thiên nhiệt độ của khối ủ Đ1 và Đ2 36

Hình 3 4 Biến thiên khối lượng của khối ủ U1 và U2 trong 10 tuần 37

Hình 3 5 Biến thiên khối lượng của khối ủ Đ1 và Đ2 trong 10 tuần 37

Hình 3 6 Các khuẩn lạc vi sinh vật trên đĩa Petri phân lập mẫu từ khối ủ U2 (đợt phân lập IV trên môi trường MPA) 41

Hình 3 7 Hoạt tính enzyme ngoại bào của một số chủng vi sinh vật phân lập được từ các khối ủ rơm rạ 44

Hình 3 8 Hình thái khuẩn lạc (A, B) và tế bào với độ phóng đại 800x (C, D) của chủng IUv2.8.1 47

Hình 3 9 Hình thái khuẩn lạc (A, B) và tế bào với độ phóng đại 800x(C, D) của chủng IUv2.23 47

Hình 3 10 Hình thái khuẩn lạc (A, B) và tế bào với độ phóng đại 800x (C) của chủng IIUv1.22 48

Hình 3 11 Hình thái khuẩn lạc (A, B,C) và tế bào với độ phóng đại 800x (D, E) của chủng xạ khuẩn IIUx1.13.2 51

Hình 3.12 Hình thái khuẩn lạc (A), tế bào với độ phóng đại 400x (B), Làm đổi màu cơ chất Gause I (C), hệ sợi và bào tử mọc kín hộp thạch (D) của chủng VUn1.51 52

Hình 3 13 Kết quả kiểm tra tính đối kháng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 53

Hình 3 14 Thử nghiệm khả năng phân giải rơm rạ của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 54

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Việt Nam là một nước nông nghiệp, trong đó, sản xuất lúa gạo chiếm tỷ trọng lớn Cây lúa là cây lương thực chính trong mục tiêu phát triển nông nghiệp của Việt Nam nhằm đảm bảo vững chắc an ninh lương thực quốc gia

và xuất khẩu Hiện nay, ở Việt Nam, sản lượng lúa trung bình hàng năm khoảng 38 - 40 triệu tấn trên diện tích gieo trồng khoảng 7,44 triệu hecta Hai vùng trồng lúa trọng điểm của cả nước là đồng bằng sông Cửu Long và đồng bằng sông Hồng Nông dân Việt Nam có tập quán canh tác lúa nước từ hai đến ba vụ trong năm Trung bình một tấn lúa gạo cho ra 1 - 1,2 tấn rơm rạ Với sản lượng lúa hiện nay, ước tính lượng rơm rạ thải ra có thể lên đến 40 -

46 triệu tấn/năm [20]

Việc xử lý rơm rạ - một dạng phế phụ phẩm nông nghiệp sau mỗi vụ thu hoạch lúa - trên thực tế chưa đem lại hiệu quả Trước đây, chất lượng đời sống của nông dân còn thấp, rơm rạ được dùng làm vật liệu đun nấu trong sinh hoạt, làm thức ăn cho gia súc Hiện nay, khi chất lượng cuộc sống của người dân được nâng cao, khí đốt (gas) được dùng để đun nấu, thức ăn tổng hợp được sử dụng phổ biến cho chăn nuôi, do đó, việc xử lý rơm rạ sau thu hoạch đã trở thành vấn đề cấp bách của xã hội Vấn đề này còn trở nên nghiêm trọng hơn khi nhận thức của người nông dân về bảo vệ môi trường sống còn thấp Nếu thu hoạch lúa vào mùa khô, người nông dân sẽ đốt ngoài đồng để tranh thủ mùa vụ, giảm lượng rơm rạ sau thu hoạch nhanh chóng Còn nếu thu hoạch lúa vào mùa mưa người nông dân thường vun rơm ngay cạnh bờ kênh, rạch hay bên lề đường Rơm rạ để tự nhiên ngoài đồng ruộng cần mất nhiều thời gian để xảy ra quá trình phân hủy giúp tăng độ mùn trong đất Xử lý rơm rạ theo các cách thức trên sẽ gây tắc nghẽn giao thông và gây ô nhiễm môi trường khí, ảnh hưởng tới sức khỏe của con người, đồng thời còn làm thất thoát, lãng phí

nguồn cacbon trong chu trình chuyển hóa C trong hệ sinh thái nông nghiệp Theo ước tính nếu đốt 1 tấn rơm thì sẽ thải ra 36,32 kg khí CO; 4,54 kg hydrocarbon; 3,18 kg tro bụi và 56,00 kg CO2 [dẫn theo 4] Đây là những thành phần khí đóng góp một phần không nhỏ gây hiệu ứng nhà kính, gây ô nhiễm môi trường nói chung và không khí nói riêng

Trên thế giới, nhiều công trình khoa học đã đề cập đến công nghệ xử lý mùn cưa, trấu, rơm và một số nguyên liệu khác thành phân bón hữu cơ của các nhà khoa học như Kiohyko Nakasaky và công sự (Khoa Kỹ thuật, Đại học Shizuoka, Nhật Bản) Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, vấn đề về xử lý rơm rạ sau thu hoạch đã nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học Trong đó có nhiều công trình khoa học nghiên cứu và ứng dụng công nghệ xử

lý rơm rạ như: xử lý rơm rạ bằng chế phẩm Trichoderma với nhiều loại đất

canh tác khác nhau (Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long), xử lý rơm rạ tại ruộng làm phân bón sinh học (Công ty cổ phần phân bón FITOHOOCMON), Tuy nhiên chưa có nhiều công trình nghiên cứu đầy đủ về khu hệ vi sinh vật (VSV) tự nhiên tham gia chuyển hóa rơm rạ thành mùn hữu cơ ở nước ta Do vậy, nghiên cứu khu hệ VSV tham gia vào diễn thế sinh thái tự nhiên của quá trình chuyển hóa rơm rạ thành mùn hữu cơ là hướng nghiên cứu cần thiết

Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu diễn thế

sinh thái và đặc điểm sinh học của vi sinh vật tham gia quá trình chuyển hóa rơm rạ thành mùn hữu cơ”

2 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng VSV đất tham gia quá trình chuyển hóa rơm rạ thành mùn hữu cơ tại xã Liên Mạc, huyện Mê Linh, Hà Nội

3 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu diễn thế sinh thái, các đặc điểm sinh học của vi sinh vật tham gia quá trình chuyển hóa rơm rạ thành mùn hữu cơ làm phân bón cho cây trồng

4 Nội dung nghiên cứu

- Theo dõi diễn thế sinh thái của vi sinh vật đất trong quá trình mùn hóa

tự nhiên của rơm rạ

- Phân lập vi sinh vật tham gia quá trình mùn hóa tự nhiên của rơm rạ

- Đánh giá vai trò của các vi sinh vật phân lập được thông qua hoạt tính enzyme ngoại bào và khả năng mùn hóa rơm rạ của chúng

5 Những đóng góp của đề tài

Đánh giá được vai trò của các nhóm VSV đất khác nhau tham gia vào diễn thế sinh thái của quá trình mùn hóa rơm rạ trong tự nhiên Trên cơ sở các nghiên cứu cơ bản, đề tài đóng góp những hiểu biết toàn diện nhằm hướng tới xây dựng quy trình công nghệ xử lý phế phụ phẩm rơm rạ trong sản xuất nông nghiệp, tránh lãng phí các nguồn cacbon và góp phần hạn chế gây ô nhiễm môi trường

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về rơm rạ

1.1.1 Phụ phẩm rơm rạ trong sản xuất lúa gạo

Lúa gạo (Oryza sativa) là cây trồng thuộc họ Hòa thảo (Poaceae) Đây

là cây lương thực chính của nhiều nước trên thế giới và Việt Nam

Hình 1 1 Sản lượng và diện tích gieo trồng lúa thế giới [dẫn theo 21]

Sản xuất lúa gạo trên thế giới từ năm 2005 đến nay tăng trưởng cả về diện tích gieo trồng lẫn sản lượng (hình 1.1) Châu Á luôn đứng đầu về sản xuất lúa gạo chiếm 90,3% (khoảng 651 triệu tấn) sản lượng gạo thế giới năm

2012 Kết quả này có được chủ yếu nhờ sản lượng tăng mạnh tại Trung Quốc,

Ấn Độ, Pakistan và Việt Nam Trong đó, Việt Nam đạt 27,12 triệu tấn, xuất khẩu 7,72 triệu năm 2012, tấn đứng thứ hai sau Ấn Độ [dẫn theo 21] Mười quốc gia hàng đầu về xuất khẩu gạo trên thế giới năm 2012 là Ấn Độ, Việt Nam, Thái Lan, Pakistan, Brazil, Uruguay, Campuchia, Argentina, Myanmar, Trung Quốc

Cũng theo số liệu năm 2012, với lượng phụ phẩm rơm rạ khoảng 40 triệu tấn/năm, Việt Nam có tiềm năng rất dồi dào về sinh khối từ rơm rạ và trấu [dẫn theo 21] Lượng sinh khối phụ phẩm lúa gạo này được ước tính chiếm tới 64% các nguồn sinh khối ở nước ta Theo báo cáo của Tổ chức Nông lương thế giới năm 1997, tỷ lệ rơm rạ/thóc dao động từ 0,4 (với rơm có

độ ẩm 27%) đến 1,4 (với rơm có độ ẩm 12 - 22%) Một nghiên cứu thực tế khác trên đồng ruộng ở Thái Lan đã đưa ra con số bình quân tỷ lệ rơm rạ/thóc

là 0,75 (với rơm rạ có độ ẩm 10%) Nhiều tài liệu khác cũng chỉ ra số liệu tương đối nhất quán với tỷ lệ này Theo tỷ lệ đó thì lượng rơm rạ sau thu hoạch chiếm trên 50% trọng lượng của cây lúa [dẫn theo 22]

Trong 40 triệu tấn sinh khối từ phụ phẩm lúa gạo có 32 triệu tấn rơm rạ

và 8 triệu tấn trấu Tương ứng với sản lượng lúa, khối lượng phụ phẩm này tập trung chủ yếu ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long (chiếm gần 54%), Đồng bằng sông Hồng (chiếm 17%) và vùng Bắc trung bộ và duyên hải miền Trung (chiếm 15,4%) [dẫn theo 22]

1.1.2 Thành phần, cấu trúc của rơm rạ

Theo Nguyễn Lân Dũng, thành phần hóa học của rơm rạ nếu tính theo nguyên tố thì cacbon (C) chiếm 44%, hyđrô (H) chiếm 5% oxy (O) chiếm 49% và nitơ (N) chiếm khoảng 0,92% ; một lượng rất nhỏ còn lại là phốt pho (P), lưu huỳnh (S) và kali (K) [dẫn theo 21]

Thành phần chính của rơm rạ tính theo khối lượng khô là: cellulose (34 - 38%), hemicelluloses (32 - 40%), lignin (12%), và hàm lượng tro (oxit silic) cao (từ 14 - 18%) Tỷ lệ lignocellulose cao (78 - 90%) gây cản trở việc

sử dụng rơm, rạ một cách kinh tế Thành phần lignocellulose trong rơm rạ, trong đó có cenllulose, rất khó bị phân hủy bởi hóa chất và VSV nhưng nếu

sử dụng tập hợp VSV phân giải thích hợp thì sẽ tạo thành nguồn phân hữu cơ sinh học tốt

1.1.2.1 Cellulose

Cellulose là loại polysaccharide cấu trúc của thực vật, chúng thường tạo nên thành tế bào, giúp cho các mô thực vật có độ bền cơ học và tính đàn hồi Cellulose là thành phần chủ yếu trong thân, lá của thực vật (trong gỗ chứa khoảng 95% cellulose, sợi bông vải 97 - 98%, sợi đay 75%, thân cây họ Cói và họ Lúa 30 - 40% [18])

Cellulose có màu trắng, không mùi, không vị Cellulose không tan trong nước (ngay cả khi đun nóng) và các dung môi hữu cơ thông thường nhưng tan trong một số dung dịch axit vô cơ mạnh (HCl, HNO3) và một số dung dịch muối (ZnCl2, PbCl2), [dẫn theo 22]

Cellulose là hợp chất cao phân tử được cấu tạo bởi hàng nghìn đến

hàng chục nghìn gốc β-D-glucose liên kết với nhau bằng các liên kết

β-1,4-glycoside nên có cấu trúc mạch thẳng, rất bền và khó bị phân hủy Cellulose

có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000 Trong đó, các nhóm hydroxyl đều nằm trên mặt phẳng nằm ngang (hình 1.1)[dẫn theo 22]

Hình 1 2 Cấu trúc lập thể của cellulose [8]

Các phân tử cellulose kết hợp với nhau tạo thành micel tức là bó sợi có chiều dài 50 - 100Å Các micel lại tạo thành bó microfibril với đường kính khoảng 250 Å nhờ nhiều liên kết hydro tạo sợi bền chắc Toàn bộ cấu trúc này được bao bọc bởi lignin và hemicelluloses [8]

1.1.2.2 Hemicellulose

Hemicellulose là một trong ba sinh khối tự nhiên chính Cùng với cellulose và lignin, hemicellulose tạo nên thành phần lignocellulose, cấu trúc

nên thành tế bào thực vật Hemicellulose là loại polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng hợp khoảng 70 đến 200 đơn phân (hình 1.3) Thành phần cơ

bản của hemicellulose là β-D xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β-(1,4)=glucoside Chúng tạo nên chất nền, khảm vào khung cấu trúc của

cellulose [8] Cấu trúc và thành phần của hemicellulose rất khác biệt trong các loại tế bào khác nhau và ở các nhóm thực vật khác nhau

Hemicellulose là polysaccharide dễ tan trong dung dịch kiềm, trong nước nóng và dễ bị phân hủy bởi axit loãng Về thành phần hóa học, hemicellulose được sắp xếp theo 4 nhóm phổ biến dựa theo sự khác nhau về

thành phần các đơn phân và cấu trúc của chúng: Xylan, mannan, β-glucan đều

là các polymer của xyloglucan Các nhóm này khác biệt nhau về cấu trúc chuỗi, vị trí hay loại liên kết glycoside trong mạng lưới phân tử Chuỗi chính của hemicellulose có thể chứa chỉ một nhóm chức (homopolymer) như xylan, hoặc hai hay nhiều đơn vị tạo nên một heteropolymer như glucomannan [9] Chuỗi chính trong hemicellulose ngắn hơn rất nhiều so với chuỗi phân tử cellulose Ngoài ra, chúng có các nhóm phụ được phân nhánh ở một vài trường hợp Xylan là thành phần của hemicellulose ở màng tế bào thứ cấp, chiếm khoảng 20 - 30% tổng sinh khối của cây hai lá mầm (cây gỗ cứng và cây thân cỏ) Trong một vài tổ chức mô của cây một lá mầm (cỏ và ngũ cốc), xylan được tìm thấy chiếm tỷ lệ tới 50% [5]

Hình 1 3 Cấu trúc của hemicelluloses [18]

Một số hemicellulose được cấu tạo từ một số phân tử monosaccaride không cùng loại như: D-galactose, D-arabinose, D-xylose, D-manose, D-axit glucononic

1.1.2.3 Lignin

Lignin là hợp chất hóa học phổ biến được tìm thấy trong hệ mạch thực vật, chủ yếu là giữa các tế bào, trong thành tế bào thực vật Chúng bao bọc xung quanh sợi cellulose và có hàm lượng lớn thứ hai sau cellulose Hàm lượng lignin trong thực vật khác nhau tùy từng loài cây, độ tuổi và điều kiện tự nhiên Trung bình, hàm lượng lignin trong thực vật chiếm khoảng 25 - 40% Cây lá nhọn chứa 20 - 30% lignin, cây lá rộng chứa 20 - 25%, cây cỏ khoảng 5

- 9% Chúng là hợp chất có khối lượng lớn, có đặc tính thơm và kị nước [3]

Lignin có cấu trúc không gian 3 chiều, phức tạp, vô định hình Lignin không phải là carbohydrate nhưng có liên kết chặt chẽ với nhóm này để tạo nên màng tế bào giúp thực vật cứng chắc và giòn, có chức năng vận chuyển nước trong cơ thể thực vật, giúp cây phát triển và chống lại sự tấn công của

côn trùng và mầm bệnh Thực vật càng già, lượng lignin tích tụ càng lớn Hơn nữa, lignin đóng vai trò quan trọng trong chu trình carbon, tích lũy carbon khí quyển trong mô của thực vật thân gỗ lâu năm; chúng là một trong các thành phần bị phân hủy lâu nhất của thực vật sau khi chết, để rồi đóng góp một phần lớn chất mùn cho đất [dẫn theo 22]

Lignin là polymer, được cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, điển hình là: guaiacyl (G), trans-coniferyl alcohol; syringyl (S), trans-sinapyl

alcohol; ρ-hydroxylphenyl (H), trans-ρ-courmary alcohol (hình 1.4) Chúng là

một polyphenol có cấu trúc mở, chủ yếu đóng vai trò chất liên kết trong thành

tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose Do vậy, khó có thể tách lignin ra hoàn toàn

Hình 1 4 Các đơn vị cơ bản của lignin [8]

Cấu trúc của lignin đa dạng, tùy thuộc vào loại gỗ và tuổi cây Ngoài việc phân loại lignin theo các loại gỗ : gỗ cứng, gỗ mềm và cỏ, lignin có thể được phân thành hai loại chính: guaicyl lignin và guaicyl-syringyl lignin

Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng lignin hoàn toàn không đồng nhất trong cấu trúc Lignin dường như bao gồm vùng vô định hình và các vùng có cấu trúc hình thuôn hoặc hình cầu Thêm vào đó, cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của lignin đều bị ảnh hưởng bởi mạng lưới polysaccharide

Hình 1 5 Cấu trúc lignin [8]

Ở nhiệt độ phản ứng cao (trên 200⁰C) lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và tách ra khỏi cellulose

1.1.3 Hiện trạng sử dụng rơm rạ trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.3.1 Hiện trạng sử dụng rơm rạ trên thế giới

Khu vực châu Âu, Bắc Á và Bắc Mĩ là khu vực có điều kiện tự nhiên thích hợp với sự sinh trưởng của lúa mì, không phù hợp trồng lúa gạo Diện tích trồng lúa mì ở khu vực này rất lớn còn lúa gạo (lúa nước) được trồng chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á và châu Phi Lúa gạo là thức ăn chính cung cấp năng lượng cho hơn 3 tỉ người (phân nửa dân số trên thế giới) [21] Hơn nữa, lúa gạo còn cung cấp việc làm cho hàng trăm triệu người ở cả các nước phát triển và đang phát triển, từ thôn quê đến thành thị

Đông Nam Á là vựa lúa gạo lớn nhất trên thế giới, Thái Lan và Việt Nam là hai nước sản xuất và xuất khẩu gạo hàng đầu Cùng với việc đẩy

mạnh sự phát triển của cây lúa, phụ phẩm đi kèm với số lượng khổng lồ là rơm rạ cũng theo đó mà nhiều lên Mặc dù rơm rạ đã được xử lí theo những cách khác nhau như: làm thức ăn cho vật nuôi, làm nguyên liệu trồng nấm, nhưng lượng rơm rạ tồn dư vẫn còn rất lớn Vấn đề chuyển hóa rơm rạ thành phân bón hữu cơ đã được nghiên cứu và đã có một số công trình nghiên cứu đưa vào thực tiễn Tuy nhiên, phần lớn những công trình nghiên cứu đó đều nghiên cứu về xử lí rơm rạ của lúa mì, yến mạch của khu vực châu Âu và Bắc

Á, Bắc Mĩ như: chế biến rơm rạ thành thức ăn vật nuôi, phân hữu cơ từ rơm

rạ lúa mì (Hoa Kỳ), và gần đây là nghiên cứu chế biến rơm rạ các loại lúa

mì, lúa mạch, yến mạch, cải dầu, thành nhiên liệu sinh học (Anh), [20]

Ở khu vực châu Phi, châu Á đặc biệt là khu vực Đông Nam Á, người ta

xử lí rơm rạ của cây lúa gạo theo nhiều cách khác nhau, tương tự như cách xử

lí rơm rạ của lúa mì ở trên Tuy nhiên, hiệu quả kinh tế của các quy trình xử lí rơm rạ ở khu vực này lại chưa cao Do vậy, phần lớn rơm rạ được xử lí theo cách truyền thống như: đun nấu gia đình, làm thức ăn khô dự trữ cho đại gia súc và đốt rơm ngoài đồng ruộng

Một số nước Đông Nam Á như Thái Lan và Indonesia đã xử lí rơm rạ sau thu hoạch để sản xuất thành nguồn điện năng phục vụ đời sống Ngoài việc sản xuất điện từ nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp (rơm rạ), các dự án này cũng đưa lại những lợi ích khác cho người nông dân như: giảm thiểu ô nhiễm môi trường, tăng thu nhập cho người nông dân [20]

1.1.3.2 Hiện trạng sử dụng rơm rạ ở Việt Nam

Việt Nam nằm trong khu vực Đông Nam Á, có kiểu khí hậu cận nhiệt đới gió mùa, lượng mưa hàng năm lớn Do đó, Việt Nam có điều kiện tự nhiên rất thuận lợi để phát triển sản xuất lúa gạo, trở thành quốc gia đứng đầu thế giới về xuất khẩu gạo Việt Nam sản xuất gần 6,6 triệu tấn gạo năm 2013, đứng thứ 3 sau Ấn Độ và Thái Lan [20]

Cùng với sản lượng gạo sản xuất hàng năm cao, sự tồn dư phụ phẩm rơm rạ là rất lớn Với bề dày lịch sử của nghề trồng lúa nước, cùng với sự tồn tại của hai nền văn minh lúa nước: đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long, vấn đề xử lí rơm rạ sau thu hoạch ở nước ta cũng rất phong phú

Các giải pháp sử dụng rơm rạ truyền thống như: làm vật liệu lợp mái nhà, phơi khô làm thức ăn dự trữ cho vật nuôi, đun nấu trong gia đình rất phổ biến ở nông thôn Việt Nam trong giai đoạn trước đây, từ những năm

1990 trở về trước Hiện nay, cùng với sự phát triển của kinh tế xã hội, nhiên liệu đun nấu (gas, biogas) dần thay thế rơm rạ trong gia đình các nông hộ Quy trình chăn nuôi gia súc, gia cầm tập trung, sử dụng thức ăn công nghiệp, cũng dần thay thế việc chăn nuôi nhỏ lẻ sử dụng thức ăn tận dụng và rơm rạ tại các nông hộ Do vậy, rơm rạ tồn dư ngày càng nhiều, dẫn tới hiện tượng phổ biến sau thu hoạch là đốt rơm rạ tại ruộng Việc làm đó gây khói bụi, làm mất an toàn giao thông, gây ô nhiễm môi trường không khí, Đốt rơm rạ tại ruộng làm cho đồng ruộng bị khô, chai cứng, một lượng lớn nước bị bốc hơi

do nhiệt độ hun đốt trong quá trình cháy rơm rạ Ngoài ra, lượng dioxit cacbon (CO2), phát thải vào khí quyển cùng với cacbon monoxit (CO); khí metan (CH4); các oxit nitơ (NOx); và một ít dioxit sunfua (SO2) cũng góp phần gây hiệu ứng nhà kính [10] Phần rơm, rạ sót thường được cày lấp vào trong đất làm phân bón cho mùa vụ sau Việc phân hủy gốc rạ và rơm phụ thuộc vào độ ẩm của đất và các VSV trong đất Tuy biện pháp này cung cấp cho đồng ruộng một chút dinh dưỡng cho vụ tiếp theo, nhưng rất có thể chứa mầm sâu bệnh cho cây trồng, ảnh hưởng đến sản lượng vụ sau Nếu tình trạng đốt rơm rạ ngay trên đồng ruộng vẫn tiếp diễn thì cùng với sự lạm dụng phân hóa học, đất sẽ càng ngày càng cằn cỗi và chai cứng Hậu quả lâu dài không thể lường trước được Do đó, việc nghiên cứu xử lí rơm rạ sau thu hoạch ở nước ta là vấn đề nhận được sự quan tâm lớn của các nhà khoa học cũng như

chính phủ Nhiều công trình nghiên cứu xử lí rơm rạ đã đi vào thực tiễn và đạt được những kết quả nhất định như: trồng nấm rơm, chế biến rơm thành thức

ăn vật nuôi, chế biến rơm rạ thành phân bón hưu cơ, chế biến rơm thành đồ thủ công, mỹ nghệ

Quy trình xử lý rơm rạ tại ruộng làm phân bón sinh học nhằm bảo vệ môi trường và phát triển nền nông nghiệp bền vững đã được phát triển từ các

đề tài: “Xây dựng mô hình xử lý rơm rạ làm phân hữu cơ vi sinh phục vụ cho sản xuất lúa an toàn và góp phần giảm ô nhiễm môi trường trên địa bàn huyện Bình Giang - Tỉnh Hải Dương”, do UBND tỉnh Hải Dương quản lí năm 2009 - 2010; “Ứng dụng chế phẩm vi sinh Biomix-RR chế biến rơm rạ thành phân hữu cơ tại đồng ruộng bón cho cây trồng nhằm phát triển nền nông nghiệp bền vững tại tỉnh Hòa Bình”, do UBND tỉnh Hòa Bình quản lí năm 2010 - 2011, đã được Thủ tướng Chính Phủ tặng Bằng khen về sáng tạo trong khoa hoc công nghệ năm 2008, cúp vàng - Giải nhất giải thưởng sáng tạo KHCN-VIFOTECH năm 2006, huy chương bạc - triển lãm sáng tạo Quốc tế lần thứ 4 tại Seoul - Hàn Quốc, cúp vàng hội chợ công nghệ Techmart năm 2003, 2005 [dẫn theo 22]

1.2 Tổng quan về vi sinh vật có khả năng phân giải rơm rạ

Nhóm VSV phân hủy chất hữu cơ, rơm rạ trong tự nhiên rất phong phú

và được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới và trong nước, rơm rạ được phân hủy bởi nhiều nhóm VSV Các VSV điển

hình có khả năng phân giải rơm rạ là Bacillus sp, Streptomyces sp, Actinomyces

sp, Pseudomonas sp, Azospirillum sp, Azotobacter sp, Trichoderma sp, Aspergillus sp [6] Một số chế phẩm sinh học phân hủy chất hữu cơ, đặc biệt là

những chế phẩm phân hủy rơm rạ được lưu hành trên thị trường (chế phẩm Compost maker, nấm Trichoderma, chế phẩm Viura, chế phẩm EM, ) thường bao gồm tập hợp một vài hoặc hàng chục loại VSV khác nhau

Chế phẩm Compost maker được ứng dụng để xử lý nhiều loại cơ chất hữu cơ như: than bùn, phân gia súc, gia cầm, phế phụ phẩm nông nghiệp (rơm, thân lá cây, vỏ cà phê ) làm phân bón hữu cơ sinh học hoặc làm nguyên liệu sản xuất phân hữu cơ vi sinh vật Chế phẩm bao gồm 3 chủng vi

sinh vật: Chủng xạ khuẩn (Streptomyces sp.), chủng vi khuẩn phân giải lân (Bacillus subtilis) và chủng nấm men (Saccharomyces cerevisiae)

Chế phẩm Vixura: là chế phẩm dạng bột chứa 12 - 15 loại vi sinh vật được phân lập, tuyển chọn tại Viện Công nghệ Sinh học, trong đó có các

chủng Bacillus và xạ khuẩn có khả năng sinh ra các enzyme khác nhau để

phân huỷ chất hữu cơ trong rác và rơm rạ Ngoài ra, còn có một số VSV chức

năng như các VSV đối kháng với một số bệnh của cây trồng (Bacillus sp.), VSV cố định đạm (Azotobacter sp.) và VSV phân huỷ phốt phát khó tan (Bacillus sp.) giúp cho cây trồng dễ dàng hấp thụ dinh dưỡng

Chế phẩm E.M (Effective Microorganisms - vi sinh vật hữu hiệu) được sản xuất từ Nhật Bản do Giáo sư Tiến sĩ Teuro Higa - Trường Đại học tổng hợp Ryukyus, Okinawa sáng chế và được áp dụng vào thực tiễn năm 1980 Chế phẩm E.M được tạo ra từ việc phân lập và lựa chọn các chủng VSV khác nhau có sự tương hợp về sinh lý Chúng sống cộng sinh và phát triển có ích nhằm phân giải triệt để các hợp chất hữu cơ Các nhóm VSV chính trong chế phẩm EM là: vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn lactic, nấm men, xạ khuẩn, nấm mốc Dùng E.M để ủ phân compost với nguyên liệu là lá cây, vỏ trái ca cao, rơm rạ… rất hữu hiệu

Các chế phẩm phân hủy rơm rạ kể trên có thể bao gồm hỗn hợp VSV với nhiều nhóm VSV khác nhau (như Compost maker, Vixura, E.M) nhưng cũng

có những chế phẩm chỉ có một chủng VSV (chế phẩm nấm Trichoderma)

Phần lớn các công trình nghiên cứu phân hủy rơm rạ đều nghiên cứu chuyên sâu về quy trình xử lí rơm rạ và công nghệ tạo chế phẩm Diễn thế sinh thái tự nhiên trong quá trình phân hủy rơm rạ vẫn còn ít được đề cập đến

Để phân hủy rơm rạ, VSV phải có enzyme phân hủy cả 03 thành phần chính của rơm rạ: cellulose, hemicellulose và lignin.

Liên kết chủ yếu trong cấu trúc của cellulose là β-(1,4) glucoside Để

thủy phân hoàn toàn cấu trúc của polysaccharide này cần có một hệ enzyme cellulase với những tác động đặc trưng riêng biệt Dựa theo nghiên cứu về hệ

enzyme cellulase của nấm Trichoderma reesei, hệ enzyme thủy phân

cellulose gồm 3 loại enzyme:

(1) Endoglucanase hoặc 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase là enzyme thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucoside trong phân tử cellulose ở các điểm

ngẫu nhiên bên trong chuỗi polymer hình thành các đầu chuỗi khử tự do và các chuỗi oligosaccharide ngắn Các endoglucanase không thể thủy phân cellulose tinh thể hiệu quả nhưng nó sẽ phá vỡ các liên kết tại khu vực vô định hình tương đối dễ tiếp cận

(2) Exoglucanase bao gồm các 1,4- β -D-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.74), giải phóng D-glucose từ β-glucan và cellodextrin; và các 1,4- β -D-

glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91), thủy phân D-cellobiose Tỷ lệ thủy phân của enzyme cellobiohydrolase bị hạn chế bởi sự sẵn có các đầu khử của mạch cellulose

(3) β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) giải phóng phân tử D-glucose từ cellodextrin hòa tan và một loạt các glucoside

khác

Rất ít sinh vật có khả năng phân giải cellulose để làm nguồn cung cấp thức ăn Vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng cao; chúng chỉ có tác dụng điều hòa hệ thống tiêu hóa, làm giảm lượng mỡ, cholesterol trong máu

và tăng cường đào thải chất cặn bã Vi khuẩn trong dạ cỏ của các động vật nhai lại và các động vật nguyên sinh trong ruột mối là những VSV có khả

năng sinh enzyme phân giải cellulose Ngoài ra, một số VSV đất cũng có khả

năng này [19]

 Enzyme phân giải hemicellulose

Xylan là cơ chất điển hình trong nhóm hemicellulose của thực vật Enzyme xylanase, thủy phân xylan, được sản xuất chủ yếu từ VSV Các VSV

có khả năng sinh enzyme xylanase ngoại bào bao gồm chủ yếu là vi khuẩn và nấm mốc [8; 11; 17]

Do tính không đồng nhất của xylan, sự thủy phân đòi hỏi một hệ thống enzyme phức tạp Enzyme này thường bao gồm hai loại: enzyme cắt mạch

chính không phân nhánh (β-1,4-endoxylanse và β-xylosidase) và enzyme cắt mạch nhánh (α-arabinofuranosidase, α-glucuronidase, esterase xylan acetyl và

esterase axit phenolic) Tất cả các enzyme này tác động tương hỗ để chuyển đổi xylan thành các cấu tử đường của nó Hệ thống các enzyme thủy phân xylan đa chức năng như vậy khá phổ biến ở vi khuẩn và nấm

Lignin cấu trúc từ nhiều đơn phân có vòng thơm, có đặc tính không ưa nước Do đó rất khó phân huỷ

Về cấu tạo, lignin gồm các mạch phenylpropanoid phức tạp, cấu trúc không đồng nhất Chính vì tính chất đó nên việc phân huỷ sinh học lignin đòi hỏi hệ enzyme oxy hóa khử mạnh Trong các enzyme oxy hóa khử phân hủy lignin, enzyme có hoạt tính mạnh là ligninase (lignin peroxidase, với phản ứng đặc hiệu phân huỷ H2O2) và manganese peroxidase (EC 1.11.1.13) Manganese peroxidase (MnP) xúc tác phản ứng đặc hiệu phân huỷ H2O2 MnP xúc tác phản ứng oxy hoá khử một vài loại phenol đơn vòng và sắc

tố vòng, nhưng những phản ứng này phụ thuộc vào sự có mặt của Mg2+

và dung dịch đệm Trên thực tế, MnP xúc tác phản ứng oxy hoá khử Mn(II) thành Mn(III) khi có mặt chất nhận làm bền vững Mn(III) Kết quả là

tạo thành phức hợp Mn(III) sau khi xảy ra phản ứng oxi hoá khử các chất hữu cơ Ligninase (EC 1.11.1.14, LiP) là một phần của hệ thống enzyme

ngoại bào của nấm mục trắng Phanerochaete chrysosporium LiP có đặc

tính gây khoáng hoá nhiều loại hợp chất thơm khó xử lý và oxy hoá một số lượng lớn các hợp chất phenol và hợp chất thơm đa vòng LiP thường được cố định trên chất mang xốp ceramic hoặc trên màng silicon,

sử dụng để xử lý các rác thải khó phân hủy [12]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Vi sinh vật

Các chủng VSV có khả năng phân giải rơm rạ, phân lập từ khối ủ rơm

rạ với bùn ruộng đồng

2.1.2 Môi trường nghiên cứu và hóa chất [2]

Bảng 2 1 Môi trường phân lập và nuôi cấy VSV

CMC: Cacboxyl Methyl Cellulose

RBBR: Remazol Brilliant Blue R

- Máy vortex (Kinka, Đức)

- Máy đo pH (MP200R, Thụy Sĩ)

- Máy li tâm (Bekman, Đức)

- Kính hiển vi (Olympus, Nhật Bản)

- Box cấy vô trùng (Holften, Đan Mạch)

- Tủ lạnh thường, tủ lạnh sâu (Sanyo, Nhật Bản)

- Pipet (Gilson, Pháp) với các thể tích khác nhau

- Hộp đĩa Petri, ống nghiệm có nút bông, que trang, đèn cồn và các dụng

cụ thí nghiệm cần thiết khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Lấy mẫu

Lấy mẫu đất đồng ruộng tại xã Liên Mạc, huyện Mê Linh, thành phố

Hà Nội Lấy mẫu vào thời điểm ngay sau thu hoạch lúa (tháng 6 đối với vụ lúa mùa, tháng 10 đối với vụ lúa chiêm) Lúc này, đất ruộng đã được cày bừa

để chuẩn bị cấy, chưa bón phân Lấy mẫu ở vị trí giữa ruộng, từ mặt đất đến

Khu hệ VSV có khả năng phân giải rơm rạ từ đất bùn đồng ruộng được

ủ cùng với cơ chất rơm rạ trong khối ủ hiếu khí có bổ sung và không bổ sung

nguồn nitơ (bảng 2.3) Các khối ủ vào mùa hè (từ ngày 30 tháng 06 đến ngày

09 tháng 09 năm 2013) được ký hiệu là; U1, U2 Các khối ủ vào mùa đông (từ ngày 20 tháng 10 đến ngày 31 tháng 12 năm 2013), kí hiệu: Đ1 và Đ2, được tiến hành tương tự như đối với các khối ủ mùa hè Cơ chất rơm rạ trong khối

ủ được để trong thùng xốp sạch với thể tích khoảng 1m3, được che phủ bằng tấm nilon sạch để tránh mưa nắng ảnh hưởng tới quá trình phân hủy rơm rạ của khu hệ VSV

Bảng 2 3 Các khối ủ và tỉ lệ thành phần phối trộn trong khối ủ

1 U1 10kg rơm khô + 1,5kg đất đồng ruộng + 1,2 lít nước mưa

2 U2 10kg rơm khô + 1,5kg đất đồng ruộng + 1,2 lít nước mưa +

255g NH4NO3

3 Đ1 10kg rơm khô + 1,2 lít nước mưa + 255g NH4NO3

4 Đ2 10kg rơm khô + 1,5kg đất đồng ruộng + 1,2 lít nước mưa +

255g NH4NO3

Theo tính toán lý thuyết thì tỷ lệ C:N trong rơm rạ khô là khoảng 40:1 [12] Để đạt tới tỉ lệ C:N thích hợp cho VSV sinh trưởng và phát triển (~ 30:1), khối ủ được bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ (ammonium nitrate) theo tính toán sau:

mC rơm = 40mN rơm

Để đạt lượng mùn tối ưu thì:

mC mùn = 30mN mùn = 30(mN rơm + mN bổ sung)

Do đó:

Sau khi phân hủy rơm rạ có khoảng 35%C tạo mùn và 65%C tạo khí

CO2 thoát ra [12] Như vậy, trong 10kg rơm khô: mC mùn = 0,35x10 = 3,5kg

Trong mùn tiêu chuẩn có C:N = 10:1 tức là mC mùn = 10mN mùn Do đó:

mN mùn = mN rơm + mN bổ sung = 0,1x3,5 = 0,35 (kg) (II)

Từ (I), (II): mN bổ sung = 0,089 (kg) và mN rơm = 0,263 (kg)

Nguồn bổ sung là amonium nitơrat (NH4NO3) Do đó, khối lượng amonium nitơrat cần bổ sung cho 10kg rơm khô là:

(0.0875x80)/28 = 0,255 (kg) = 255 (g)

Theo dõi các khối ủ trong vòng 70 ngày với các thông số sau:

- Nhiệt độ của môi trường và khối ủ, đặc điểm hình thái của rơm rạ (mùi, độ nhớt, mầu sắc) trong các khối ủ được kiểm tra hàng ngày Đối với mỗi đặc điểm hình thái mới xuất hiện của cơ chất rơm rạ, xác định nhóm VSV sơ bộ thông qua quan sát dưới kính hiển vi quang học Kiểm tra nhiệt độ

3 lần/ngày vào khoảng thời gian 5h, 13h, 21h

- Đảo trộn khối ủ và kiểm tra độ mủn, độ nhớt, mùi và sự thay đổi khối lượng các khối ủ định kì 7 ngày/lần

- Lấy mẫu để phân lập và kiểm tra độ ẩm khối ủ định kì 14 ngày/đợt hoặc không định kì (ở thời điểm nhiệt độ lên cao nhất)

2.2.2.2 Phân lập vi sinh vật từ các khối ủ [2]

Lấy mẫu rơm rạ từ các khối ủ (đã nêu trên) để phân lập VSV Nghiền nhỏ mẫu và pha loãng mẫu bằng nước muối sinh lý vô trùng, sau đó trang đều mẫu đã pha loãng trên môi trường thạch MPA, Czapek Dox và Gause I Giữ các đĩa Petri môi trường đã phân lập này trong tủ ấm 30 - 37ºC trong vòng 7 ngày để đếm số lượng VSV sống và tách các khuẩn lạc VSV Cụ thể như sau:

- Sau khi đảo trộn khối ủ, lấy 5g mẫu rơm ủ, cắt nhỏ, trộn đều và cho 1g vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch NaCl 0,9% vô trùng, lắc đều trên máy vortex trong vài phút thu được dịch pha loãng 10-1

- Dùng pipet lấy 1ml ở ống nghiệm ở độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch NaCl 0,9% vô trùng, đảo trộn đều bằng máy

vortex để thu được dung dịch có độ pha loãng 10-2

Tiếp tục pha loãng như vậy, thu được nhiều nồng độ pha loãng nhỏ hơn

- Hút 0.1ml dịch pha loãng ở nồng độ nghiên cứu (10-7, 10-8) vào môi trường thạch trên đĩa Petri (môi trường MPA, Czapek Dox, Gause I) và trang đều trên bề mặt thạch cho đến khi khô dịch Gói kín các hộp đĩa Petri môi trường đã phân lập này bằng giấy báo và đặt vào tủ ấm 30⁰C Theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc trên các hộp đĩa Petri phân lập trong 7 - 10 ngày Khi các khuẩn lạc khác nhau của từng nhóm VSV xuất hiện, cấy ria nhiều lần (nếu cần) để thu được khuẩn lạc thuần trước khi cấy khuẩn lạc vào môi trường giữ giống thích hợp

Môi trường MPA dùng để cấy vi khuẩn, Czapek Dox để cấy nấm mốc, Gause I để cấy xạ khuẩn

2.2.2.3 Đếm số lượng tế bào vi sinh vật sống trên đĩa thạch [2]

Khuẩn lạc vi khuẩn được đếm trên đĩa môi trường phân lập sau 1 - 3 ngày ủ trong tủ ấm 30 - 37ºC Khuẩn lạc nấm mốc và xạ khuẩn được đếm trên đĩa môi trường phân lập sau 3 - 7 ngày ủ trong tủ ấm 30 - 37ºC

Tổng số VSV trong đống ủ (N) được xác định theo công thức:

300 thì phải lặp lại thí nghiệm pha loãng mẫu

2.2.2.4 Kiểm tra hoạt tính enzyme ngoại bào phân giải lignin, cellulose và hemicellulose

Sử dụng phương pháp khuếch tán enzyme ngoại bào trên môi trường thạch chứa cơ chất (đặt thạch hoặc nhỏ dịch) Sau đó dùng thuốc thử để kiểm

tra sự phân giải của cơ chất trong môi trường thạch

- Chuẩn bị môi trường thử hoạt tính (môi trường chứa cơ chất) trong các đĩa Petri với độ dày đồng đều 3mm như độ dày của môi trường nuôi cấy Dùng khoan nút chai (đường kính d = 10mm) vô trùng, khoan các khối thạch

có VSV trên môi trường nuôi cấy và đặt lên môi trường thử hoạt tính Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần cho mỗi chủng VSV nghiên cứu Đặt các đĩa Petri thử hoạt tính này ở 4⁰C trong 24h, sau đó, chuyển chúng sang tủ ấm 30⁰C để 24h (lưu ý: không để trôi khối thạch)

- Kiểm tra hoạt tính của các VSV nghiên cứu thông qua sự phân giải cơ chất trên môi trường thử hoạt tính:

+ Môi trường chứa RBBR: Quan sát trực tiếp vòng phân giải Trường hợp có hoạt tính phân giải RBBR, quanh khối thạch có vòng trong suốt, màu sáng hơn vùng xung quanh, đó là vòng phân giải cơ chất

+ Môi trường chứa CMC hoặc bột giấy: Nhuộm dung dịch congo đỏ 1% trong 5 phút, đổ bỏ dung dịch thuốc thử và rửa bằng dung dịch NaCl 1M trong 15 phút/lần (rửa khoảng 2 - 3 lần đến khi rõ vòng phân giải cơ chất) Quan sát vòng phân giải cơ chất có màu vàng nhạt hoặc trong suốt ở quanh khối thạch

+ Môi trường chứa xylan: Nhuộm lugol trong 5 - 10 phút, đổ bỏ dung dịch thuốc nhuộm và quan sát vòng phân giải cơ chất màu sáng trong suốt

quanh khối thạch

Hoạt tính phân giải cellulose, hemicellulose, lignin được xác định bằng kích thước vòng phân giải (D - d), tính bằng mm, D là đường kính vòng phân giải, d là đường kính khối thạch

 Phương pháp nhỏ dịch [2]

- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy trong bình nón 100ml chứa 15ml môi trường dịch thể thích hợp Dùng que cấy lấy sinh khối VSV nghiên cứu, đưa vào các bình nón trên và nuôi lắc ở điều kiện 35 - 37⁰C trong khoảng thời gian thích hợp (2 ngày đối với VK, 3 ngày đối với NM, 4 ngày đối với XK)

- Chuẩn bị môi trường chứa cơ chất tương tự như đối với phương pháp đặt khối thạch Dùng khoan nút chai vô trùng khoan lên môi trường cơ chất, nhấc bỏ khối thạch có đường kính 10mm để tạo các lỗ

- Nhỏ 0,1ml dịch nuôi cấy VSV nghiên cứu vào lỗ thạch trên môi trường cơ chất, lặp lại thí nghiệm 3 lần đối với mỗi chủng VSV nghiên cứu Đặt các đĩa Petri thử hoạt tính này ở 4⁰C trong 24 giờ, sau đó, chuyển chúng sang tủ ấm 30⁰C thêm 24 giờ nữa

- Kiểm tra sự phân giải cơ chất quanh các lỗ thạch trên môi trường thử hoạt, và xác định hoạt tính tương tự như với phương pháp đặt khối thạch

2.2.2.5 Kiểm tra tính đối kháng giữa các chủng vi sinh vật nghiên cứu

Dùng phương pháp cấy chữ thập trên môi trường thạch để kiểm tra tính đối kháng của các chủng vi khuẩn nghiên cứu; phương pháp đặt khối thạch để

kiểm tra tính đối kháng của các chủng nấm mốc và xạ khuẩn nghiên cứu

 Phương pháp cấy chữ thập [2]

Các chủng vi khuẩn được cấy vạch, mỗi chủng cấy thành 01 vạch giao với vạch cấy của chủng vi khuẩn khác, tạo thành hình chữ thập trên môi

trường thạch đĩa MPA Ủ ở 37⁰C trong 48 giờ cho đến khi các vạch cấy vi khuẩn mọc rõ

Quan sát sự đối kháng giữa các chủng vi khuẩn nghiên cứu tại những điểm giao nhau giữa các vạch cấy Các chủng không đối kháng nhau khi tại điểm giao nhau đó không có vùng vô khuẩn Ngược lại, nếu tại điểm giao nhau xuất hiện vùng vô khuẩn chứng tỏ các chủng vi khuẩn nghiên cứu đó đối kháng nhau

 Phương pháp đặt khối thạch [1]

Các chủng vi nấm hoặc xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường thạch thích hợp trong đĩa Petri Dùng khoan nút chai vô trùng (d = 10mm) khoan vào môi trường đã mọc kín VSV nghiên cứu để nhấc các khối thạch chứa sinh khối VSV nghiên cứu ra, đặt lên môi trường nuôi cấy Các khối thạch có chứa các chủng VSV khác nhau được đặt cách nhau 1cm Ủ đĩa Petri môi trường nuôi cấy này trong tủ ấm 37⁰C trong 72 giờ và quan sát sự sinh trưởng của VSV nghiên cứu từ các khối thạch lan ra môi trường thạch đĩa Nếu xuất hiện vùng vô khuẩn giữa hai khối thạch chứng tỏ các chủng VSV nghiên cứu trên khối thạch đối kháng nhau Ngược lại, nếu không có vùng vô khuẩn giữa hai khối thạch thì các chủng VSV nghiên cứu không đối kháng nhau

2.2.2.6 Quan sát hình thái vi sinh vật [2]

 Quan sát hình thái khuẩn lạc

Sau khi xác định hoạt tính theo phương pháp đã trình bày ở trên (mục 2.2.2.4), tuyển chọn các chủng VSV có hoạt tính để quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc bằng phương pháp cấy ria trên môi trường thạch hoặc phương pháp pha loãng VSV nghiên cứu để trang thành các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch đĩa như phương pháp phân lập VSV

- Đối với phương pháp ria cấy: Dùng que cấy vô trùng, lấy sinh khối VSV nghiên cứu, cấy thành đường zíc zắc từ một góc trên bề mặt thạch đĩa

(hoặc 4 góc) để tạo thành khuẩn lạc riêng rẽ sau thời gian nuôi cấy từ 24 – 72 giờ ở 30⁰C Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc khi khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trường thạch, mô tả và chụp ảnh khuẩn lạc

- Phương pháp pha loãng VSV nghiên cứu trong môi trường dịch thể được thực hiện tương tự như phương pháp phân lập VSV, chỉ khác là mẫu phân lập được thay bằng mẫu sinh khối VSV nghiên cứu

+ Đối với mẫu vi khuẩn, chủng vi khuẩn nghiên cứu được nuôi trong môi trường MPA dịch thể

Giống cấp 1 được nuôi trong 3 - 5ml môi trường dịch thể, nuôi lắc 180

- 200 vòng/phút ở 35 - 37⁰C trong 24 giờ Bổ sung 3% dịch nuôi cấy cấp 1 vào 15ml môi trường dịch thể trong bình nón 100ml, nuôi lắc 180 - 200 vòng/phút ở 35 - 37⁰C trong 24 giờ để được giống cấp 2 Pha loãng giống cấp

2 tới nồng độ thích hợp (từ 10-6 đến 10-8) bằng dung dịch NaCl 0,9% vô trùng

Ủ các đĩa Petri phân lập VSV ở điều kiện 35 - 37⁰C, trong 72h và quan sát định kì trong 3 ngày liên tiếp (mỗi ngày một lần) Mô tả hình thái khuẩn lạc, chụp ảnh đồng thời xác định số lượng tế bào trung bình của VSV nghiên cứu trong 1ml dịch nuôi cấp 2 để sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo

+ Đối với xạ khuẩn, chủng VSV nghiên cứu được nuôi trên môi trường thạch Gause I; vi nấm được nuôi trên môi trường thạch Czapek Dox Sau khi VSV nghiên cứu đã mọc kín đĩa Petri môi trường thạch, khoan lấy một khối thạch chứa VSV nghiên cứu tương tự trong phương pháp thử hoạt tính và đối kháng Lấy 03 khối thạch cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch NaCl 0,9% vô trùng và dầm nát khối thạch Sau đó, dùng dung dịch NaCl 0,9% vô trùng để pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp (từ 10-5

- 10-7 đối với xạ khuẩn,

từ 10-1 - 10-3 đối với vi nấm) Hút 0,1ml của mỗi nồng độ trên vào môi trường thạch thích hợp trên đĩa Petri và trang đều cho đến khi khô dịch, lặp 3 lần đối với mỗi nồng độ pha loãng Ủ các đĩa Petri này ở điều kiện 35 - 37⁰C Quan

sát định kì trong 3 ngày sau khi khuẩn lạc bắt đầu mọc (mỗi ngày một lần),

mô tả khuẩn lạc, chụp ảnh, đồng thời xác định số lượng bào tử trung bình của VSV nghiên cứu trong 1 cm2 bề mặt môi trường thạch để sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo

 Quan sát hình thái hiển vi các VSV nghiên cứu

Sử dụng các phương pháp làm tiêu bản VSV sống, kĩ thuật tiêu bản ép lam và tiêu bản cố định nhuộm mầu để quan sát hình thái tế bào VSV dưới kính hiển vi quang học [3]

2.2.2.7 Phương pháp cấy truyền và bảo quản giống [2]

Cấy truyền định kì hàng tháng trên môi trường giữ giống thạch nghiêng

và bảo quản ở 4 - 10ºC Giữ giống vi khuẩn lạnh sâu (-30ºC) trong dung dịch 10-30% glycerol Giống nấm mốc và xạ khuẩn được giữ dạng bào tử trong cát khô, vô trùng

2.2.2.8 Xác định khả năng phân giải rơm rạ của các chủng VSV nghiên cứu

Các chủng VSV nghiên cứu được bổ sung riêng rẽ hoặc bổ sung thành tập hợp vào cơ chất rơm rạ trong các túi ủ (30g rơm + 1gNH4NO3 + 60ml H2O + VSV tuyển chọn) Các thí nghiệm (bảng 2.4) được lặp lại 3 lần

Dựa vào nghiên cứu và tính toán lượng tế bào hoặc bảo tử của mỗi chủng VSV trên 1ml dịch thể nuôi cấy hoặc 1 cm2 môi trường thạch, chúng tôi xác định lượng VSV bổ sung vào cơ chất rơm rạ trong bảng 2.4

Bảng 2 4 Vi sinh vật bổ sung vào cơ chất rơm rạ

Kí hiệu

chủng

CFU/1ml dịch CFU/1cm 2 nuôi cấy

Các thông số được theo dõi:

- Khối lượng túi ủ, theo dõi hàng tuần

- Độ mủn cơ chất rơm rạ, theo dõi 2 tuần/lần

- Đặc điểm hình thái cơ chất rơm rạ (mùi, màu sắc, độ nhớt), theo dõi hàng ngày

2.2.3 Phương pháp xác định độ ẩm tuyệt đối của rơm rạ

Độ ẩm của rơm tươi và rơm khô (rơm được phơi khô tự nhiên) được xác định bằng phương pháp sấy đến trọng lượng không đổi: Cân 20g rơm (tươi hoặc khô) cho vào đĩa Petri, sấy ở 105o

C trong 16 giờ Sau đó cân lại mẫu và tiếp tục sấy trong 1 giờ Tiếp tục làm như vậy cho đến khi trọng lượng mẫu sấy không đổi

Xác định độ ẩm tuyệt đối theo công thức:

%H2O = [(mo - m) : mo] x 100%

Trong đó: mo: Khối lượng mẫu trước khi sấy

m: Khối lượng mẫu không đổi sau khi sấy

2.2.4 Phương pháp toán học thống kê và xử lý số liệu

Các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần, các số liệu thô được xử lý toán học thống kê bằng phần mềm Microsoft Office Excel trước khi mô hình hóa thành biểu đồ, đồ thị Công thức toán học được sử dụng bao gồm:

Công thức tính giá trị trung bình: EX = 1/n(X1 + X2 + X3 + + Xn)

Công thức tính phương sai: DX = E(X - EX)2 = EX2 - (EX)2

Trong đó: X1, X2, X3, , Xn: giá trị các biến ngẫu nhiên X

EX: giá trị trung bình của các biến ngẫu nhiên X DX: phương sai của biến ngẫu nhiên X