Luận văn nghiên cứu tạo rễ tơ của cây hoàng liên gai (berberis juliane) cho mục tiêu nuôi cấy sinh khối dược liệu

Hà Nội, tháng 12 năm 2014 Học viênLưu Viết Thủy Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu tạo rễ tơ của cây Hoàng liên gai Berberis juliane cho mục tiêu nuôi cấy sinh khối dược liệu” là công t

Lưu VIẾT THỦY

NGHIÊN CỨU TẠO RẺ Tơ CỦA CÂY HOÀNG LIÊN GAI

(Berberỉs julỉane) CHO MỤC TIÊU NUÔI CÁY SINH KHÓI

NGHIÊN CỨU TAO RẺ Tơ CỦA CÂY HOÀNG LIÊN GAI

(Berberis juliane) CHO MỤC TIÊU NUÔI CẤY SINH KHỐI

giúp đỡ tận tình đế tôi hoàn thành luận văn này:

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người Thầy của tôi: PGS.

TS Chu Hoàng Hà - Trưởng phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện trưởng

Viện Công nghệ sinh học, người Thày đã định hướng nghiên cứu, đồng thời cũngchỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thảnh luận văn này

Tôi xin được cảm ơn Cô giáo TS Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phòng Công

nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Sau đại học trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện cho chúng tôi được học tập tại trường Tôi xin chân thành

cảm ơn thầy giáo TS Nguyễn Văn Đính - CN Khoa Sinh - KTNN, các thầy, cô

giáo đang công tác tại Khoa Sinh - KTNN đã tận tình dạy dỗ chúng tôi trong thời gian qua

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới sự giúp đỡ của CN Nguyễn Khắc Hưng, Th.s

Hoàng Đăng Hiếu cùng tập thể cán bộ phòng Công nghệ Tế bào thực vật và

phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học đã dành cho tôi trong suốt quá trình làm luận văn

Cảm ơn tất cả những người bạn cùng thực tập với tôi và các bạn lớp Sinh

trong thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân thành tới những người thân ừong gia đình và bạn bè - những người luôn động

Hà Nội, tháng 12 năm 2014 Học viên

Lưu Viết Thủy

Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu tạo rễ tơ của cây Hoàng liên gai (Berberis juliane) cho mục tiêu nuôi cấy sinh khối dược liệu” là công trình nghiên cứu của

tôi Những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

FT1 ĩ _ _ • 2.

Tác gia

Lưu Viết Thủy MỤC LỤC

I MỞ ĐẦU 1

II NỘI DUNG 6

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 Tổng quan về cây Hoàng liền gai 6

1.1.1 Phân bố địa lý 6

1.1.2 Phân loại 6

1.1.3 Hình thái và đặc điểm sinh thái 7

1.1.5 Tính cấp thiết nghiên cứu, bảo tồn và sản xuất bền vững cây Hoàng

liên gai 12

1.2 Tổng quan về nuôi cấy sinh khối rễ tơ 13

1.2.1 Giới thiệu về nuôi cấy sinh khối tế bào 13

1.2.2 Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes 15

1.2.3 Cơ chế chuyển các gen vùng T - DNA vào tế bào thực vật 16

1.2.4 Nuôi cấy sinh khối rễ tơ 19

1.3 Các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị DNA vào việc xác định loài 23

Chương II: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN cứu 26

2.1 Vật liệu 26

2.2 Dụng cụ - hóa chất 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Thu thập và nhận dạng loài bằng chỉ thị phân tử 26

2.3.2.Phương pháp khử trùng hạt và đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro 28

2.3.3.Phương pháp chuyển gen thông qua A.rhizogenes 29

3.4 Kiểm tra hiệu quả chuyển gen thông qua biểu hiện tạm thời gen gus

31 Chương III: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Thu thập và nhận dạng loài Hoàng liên gai 33

3.1.2.Nhận dạng loài bằng so sánh hình thái 353.1.3.Nhận dạng loài bằng chỉ thị DNA 37

3.2 Kết quả khử trùng hạt và đưa mẫu Hoàng liên gai vào nuôi cấy in

vitro là nguyền liệu cho nuôi cấy mô tế bào và chuyển gen tạo rễ tơ 45

3.3 Tối ưu hóa quy trình chuyển gen và tiến hành chuyển gen tạo rễ tơ

thông qua Agrobacterium rhizogenes 47

3.3.1.Anh hưởng của nguồn mẫu đến hiệu quả chuyển gen 473.3.2.Anh hưởng của mật độ vi khuẩn Agrobacterium tới hiệu quả chuyểngen 50

523.4 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen 54

III KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

NHỮNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

AS Acetosyringone

1 Danh

mục các hình ảnh

■

Hình 1.1: Cây Hoàng liên gai 6

Hình 1.2: Một số bênh ở thực vật gây ra bởi Agrobacterỉum sp 15

Hình 1.3: Cấu trúc Ri - plasmid 16

Hình 1.4: Cơ chế chuyển gen của Agrobacterỉum sp 18

Hình 1.5 Các hệ rễ tơ được nuôi cấy 19

Hình 3.1: Hai loài Hoàng liên thu thập tại Vườn Quốc gia Hoàng liên 35

Hình 3.2 Kết quả khuếch đại và tách dòng đoạn gen ITS từ mẫu Hoàng liên gai .38

Hình 3.3 Cây phân loại xây dựng theo phương pháp NJ của chỉ thị trrĩL 41

Hình 3.4 Cây phân loại xây dựng theo phương pháp NJ của chỉ thị ITS 44

Hình 3.5: Quá trình vào mẫu hạt Hoàng liên gai 47

Hình 3.6: Anh hưởng của nguồn mẫu đến hiệu quả chuyển gen 49

Hình 3.7: Anh hưởng của mật độ vi khuẩn đến khả năng biểu hiện gen gws 51

Hình 3.8: Anh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chyển gen 53

Hình 3.10: Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai 58

2 Danh mục bảng biểu

Bảng 1.1: Một số loài thực vật được nuôi cấy rễ tơ để thu hoạt chất sinh học 21Bảng 2.1: Thông tin các mồi sử dụng ừong nghiên cứu 27Bảng 3.1 Thông tin và kí hiệu mẫu Hoàng liên gai thu thập tại Sa Pa 33Bảng 3.2 Thông tin các trình tự của 2 loài Hoàng liên gai nghiên cứu đăng ký trên Genbank 34Bảng 3.3: Đặc điểm hình thái hai loài Hoàng liên tại Sa pa - Lào Cai 35Bảng 3.4: Đặc điểm phân biệt hai loài Hoàng liên 37Bảng 3.5 Bảng hệ số sai khác xây dựng trên trình tự nucleotit của gen trnL 39Bảng 3.6: Kết quả khử trùng hạt Hoàng liên gai 46Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến hiệu quả chuyển gen 48Bảng 3.8: Kết quả ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến hiệu quả chuyển gen 50Bảng 3.9: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen 53Bảng 3.10: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen 55Bảng 3.11: Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai 57

I MỞ ĐẦU

1 Đăt vấn đề

Hoàng liên gai (hay Hoàng mù - Hoàng mộc) Berberỉs juliane là cây thảo

dược quý hiếm phân bố tại vùng Tây Bắc Việt Nam Hoàng Liên gai mọc nhiều tại Sa Pa - Lào Cai và một số tỉnh thuộc vùng Tây Nam Trung Quốc Hoàng liên gai là vị thuốc được sử dụng tò lâu trong các bài thuốc Đông y chữa các bệnh tiêuhóa như: viêm ruột, tiêu chảy, lỵ, trĩ, viêm túi mật, sốt cao, viêm gan, hoàng đản, viêm ngứa ngoài da, mụn nhọt Thân rễ Hoàng liên gai chứa nhiều họp chất

gai còn có worenin, coptỉsin, paỉmatin Các alkaloid trong Hoàng liên gai chia thành 2 nhóm chính: các aỉkaloid có nhân phenol và các aỉkaỉoid không có nhân phenol Các thành phần alkaloỉd của Hoàng liên gai đều chứa ừong hầu hết các

bộ phận của cây Tuy nhiên ở mỗi bộ phận lại có hàm lượng thay đổi, tùy theo

mùa phát triển của cây Vào tháng 9 - 1 0 , hàm lượng berberin ở thân rễ và rễ

khi rụng cũng thường cao Trong số các họp chất alkaỉoid nói trên, berberỉn được

y học quan tâm đến nhiều nhất, sau đó là palmatin.

Hiện nay, số lượng cá thể Hoàng liên gai ngoài tự nhiên suy giảm mạnh do

bị khai thác quá mức Hoàng liên gai được đưa vào danh sách các loài thực vật đang nguy cấp ừong Sách Đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá "đang nguy cấp"(Bậc E) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 1) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ để nghiêm cấm khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại Trước tinh hình trên, bên cạnh việc nghiên cứu các giá tri y dược của cây Hoàng liên gai ở Việt Nam, cần đưa ra các phương pháp bảo tồn cũng như khai thác hiệu quả cây Hoàng liên gai Bên

cạnh việc trồng bảo tồn ngoại vi (Ex sỉtu) tại vườn quốc gia Hoàng liên, việc ứng

dựng các kỹ thuật công nghệ sinh học vào quá trình bảo tồn và phát triển bền

vững cây Hoàng liên gai theo hướng thu sinh khối tế bào thực vật là một trong những yêu cầu cấp bách và cần thiết.

Cùng với xu hướng chung trên thế giới, hướng nghiên cứu công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản xuất những sản phẩm thứ cấp đang bắt đầu được quan tâm phát triển trong nước Hiện có nhiều phương pháp nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật như: nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy huyền phù, nuôi cấy rễ bất định Các phương pháp nuôi cấy tế bào cho phép thu lượng lớn tế bào ừong thời gian nuôi cấy ngắn hơn, chất lượng đồng đều Bên cạnh đó, sản lượng ổn định do được nuôi

cấy ừong điều kiện ỉn vitro, các yếu tố tác động đến quá trình nuôi cấy đều được

kiểm soát, không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố tự nhiên cũng như dịch bệnh

Hiện nay, một số công trình nuôi cấy sinh khối tế bào được áp dụng ừên

đối tượng Hoàng liên gai nhằm thu sinh khối tách chiết berberỉn ứng dụng trong y

dược Đinh Thị Thu Hiền và công sự (2003) đã đưa ra qui trình tái sinh cây

Hoàng liên gai ỉn vitro tò hạt Cây Hoàng liên gai in vitro được sử dụng làm

nguyên liệu cho quá trình tạo và nuôi cấy sinh khối mô sẹo Hoàng liên gai tạo họp

chất berberỉn với hàm lượng cao [1] Lại Đức Lưu và công sự (2013) ứng dụng

kỹ thuật khí canh ừong nghiên cứu nhân giống và thu sinh khối rễ cây Hoàng liên gai Nhóm tác giả đã thực hiện thu thập, đánh giá hàm lượng berberin và tìm ra chế độ nuôi cấy cũng như môi trường dinh dưỡng phù hợp cho sinh khối rễ Hoàngliên gai phát triển[4]

Tuy nhiên, quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm làm giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng vào trong môi trường nuôi cấy vấn đề này là một trong những trở ngại lớn do tồn dư của các chất điều hòa sinh trưởng trong sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sản phẩm và sức khỏe người sử dụng Tuy nhiên, kỹ thuật nuôi cấy sinh khối rễ tơ ra đời giúp giải quyết các vấn đề khó khăn của

hướng nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật hiện tại.

Rễ tơ là một bệnh ở thực vật được gây ra quá trình tương tác giữa vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenes và tế bào vật chủ Rễ tơ có có khả năng sinh trưởng

nhanh, phát triển tốt trên môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng và

có thể nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, điều này có ý nghĩa trong dây chuyền sản xuất các hợp chất thứ cấp hay các dược phẩm sinh học tái tổ họp Rễ tơ có thể sảnxuất một lượng lớn các họp chất thứ cấp và là cơ quan biệt hóa nên rễ tơ có sự di tuyền ổn định hơn nuôi cấy tế bào huyền phù hay nuôi cấy sinh khối mô sẹo

Xuất phát từ các ưu điểm ừên và do họp chất dược lý quý của cây Hoàng

liên gai chủ yếu thu được từ rễ, tôi đã thực hiện đề tài “ Nghiên cứu tạo rễ tơ của cây Hoàng liên gai (Berberis juliane) cho mục tiêu nuôi cấy sinh khối dược liệu” Công trình này được thực hiện tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện

Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2 Đổi tượng nghiên cứu

Cây Hoàng liên gai (.Berberis Juliane) thuộc chi Hoàng liên Berberis, một

loài thảo dược quý hiếm được sử dụng rộng rãi trong các bài thuốc y học cổ

truyền Thành phần chủ yếu của Hoàng liên gai là berberin, một hoạt chất được

ứng dụng trong điều ừị các bệnh về hệ tiêu hóa

Mau vật nghiên cứu bao gồm quả, lá của cây Hoàng liên gai phân bố ừong

tự nhiên được thu thập tại tại vườn quốc gia Hoàng liên, địa phận huyện Sa Pa tỉnh Lào Cai

3 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc tạo sinh khối cây Hoàng liên gai làm nguyên liệu dược bằng công nghệ nuôi cấy rễ tơ

4 Nội dung nghiên cứu

4.1 Thu thập và nhận dạng mẫu cây Hoàng liên gai bằng chỉ thị phân tử.

- Tiến hành thu thập mẫu Hoàng liên gai phân bố tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên tại địa phận tỉnh Sa Pa, tỉnh Lào Cai.

- Nhận dạng các loài Hoàng liên gai thu thập được thông qua đặc điểm hình thái

- Sử dụng kỹ thuật DNA Barcoding nhằm nhận dạng các mẫu Hoàng

liên gai

- Bước đầu đưa ra các chỉ thị đặc hiệu cho việc nhận dạng cây Hoàng liên gai trong tự nhiên bằng phương pháp chỉ thị phân tử sử dụng kỹ thuật DNA

Barcodỉng.

Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu hạt Hoàng liên gai và kỹ thuật

nuôi cấy Hoàng liên gai in vitro tạo nguyên liệu cho các nghiên cứu chuyển gen

tạo rễ tơ

rhizogenes, bước đầu tạo một số dòng rễ tơ Hoàng liên gai.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen tạo

rễ tơ ở cây Hoàng liên gai qua phương pháp biểu hiện tạm thời với gen chỉ thị

GusA.

- Bước đầu tạo một số dòng rễ tơ Hoàng liên gai

5 Phương pháp nghiên cứu

- Nghiên cứu ngoài thực địa: Đánh giá đặc điểm hình thái, phân bố, điều

kiện sinh sống của cây Hoàng liên gai tại địa phận Sa Pa - Lào Cai

- Nghiên cứu trong phòng thỉ nghiệm: Thực hiện các thí nghiệm trọng điều kiện in vitro tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

6 Ý nghĩa khoa học

Việc xác định được chỉ thị phân tử đặc hiệu cho loài Hoàng liên gai sẽ đưa

ra cơ sở khoa học vững chắc cho việc nhận dạng loài Hoàng liên gai trong tự

nhiên cũng như các loài khác nhau trong chi Berberis.

Hoàn thiện quy trình chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai qua vi

khuẩn Agrobacterium rhizogenese cung cấp cơ sở khoa học cho quá trình chuyển gen tạo rễ tơ trên các đối tượng loài khác thuộc chi Hoàng liên (Berberis')

Cung cấp cơ sở cho bảo vệ nguồn gen cây Hoàng liên gai trong tự nhiên qua việc đáp ứng nguồn cung cấp ổn định sinh khối rễ tơ Hoàng liên gai nuôi cấy

in vitro

7 Ý nghĩa thực tiễn

Xây dựng quy trình chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai tạo tiền đề

cho nuôi cấy thu sinh khối rễ tơ ừên qui mô bỉoreactor, nhằm thu lượng lớn sinh

khối Hoàng liên gai phục vụ cho các lĩnh vực y dược

II NỘI DUNG Chương 1:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tẳng quan về cây Hoàng liên gai

1.1.1 Phân bố địa lý

Hoàng liên gai (Berberis julỉane) là cây thảo dược phân bố nhiều tại vùng

Tây Bắc Việt Nam và Tây Nam Trung Quốc (tây Vân Nam, nam Tây Tạng), nên Trung Quốc còn gọi Hoàng liên gai là Vân Nam Hoàng liên) Hoàng liên gai nguyên gốc mọc ở tỉnh Lào Cai (huyện Sa Pa), trên dãy núi cao Hoàng Liên San, vùng núi

cao từ 1000 - 2500m Hoàng liên gai ưa đất nhiều màu trên núi cao mưa nhiều ẩm

ướt, lớp đát mùn ở trên càng dày càng tốt, cây ưa mát lạnh, sợ nóng, khô, nơi trồng thích hợp là khe núi, sườn dốc, đủ ánh sáng, thoát nước.

Hiện nay, Hoàng liên gai được ừồng giữ giống tại Trạm dược liệu Sa Pa (Lào Cai) nhằm bảo vệ nguồn gen, nghiên cứu các hình thức nhân và phát triển giống cây trồng.

1.1.2 Phân ỉoại Giới: Thực vật

Ngọc Lan Magnoliopsida Bộ : Mao lương

Ranunculales Họ : Hoàng liên gai

Hoàng Liên gai

Berberis juỉỉanae Schneid 1913

1.1.3 Hình thái và đăc điểm sinh thái

- Đặc điểm hình thái: Cây bụi, cao 2 - 3 m; thân và rễ có màu vàng đậm;

phân cành nhiều; có gai chia thành 3 nhánh, mọc dưới các túm lá Lá mọc vòng

thươc lá khoảng 3 - 9 cm X 1,2 - 2,5 cm, mép lá có răng cưa nhỏ, đều và nhọn.Hoa nhiều, gồm 1 0 - 3 0 mọc ở giữa các túm lá Hoa nhỏ, có cuống dài 1- 1,3

cm, màu vàng, mẫu 3; tổng bao 3, hình mác rộng Đài hoa, hình trứng ngược xếp thành 2 vòng, những vòng ừong lớn hơn vòng ngoài Cánh hoa, nhỏ hơn đài, hìnhtrứng thuôn, đỉnh lõm, gốc có 2 tuyến nhầy Nhị hoa, ngắn hơn cánh hoa; bao phấn hình trứng Bầu hình trụ, hơi phình ở giữa noãn[2] Quả hình trứng thuôn, dài 0,5 cm; đầu nhuỵ tồn tại rõ; khi chín màu tím đen, hơi có phấn trắng Hạt, gầnhình trụ, màu nâu nhạt

- Đặc điểm sinh thải.'Mùa hoa tháng 3-4 quả tháng 4-10 (11) Khối lượng

1.000 hạt: 20,12 gam; tỷ lệ nảy mầm của hạt khi gieo 38,1%; thời gian nảy mầm

từ 38-60 ngày Cây con nảy mầm từ hạt trong tự nhiên quan sát được vào tháng 4

và 5 Có khả năng tái sinh sau khi bị chặt phát Cây ưa ẩm, chịu bóng khi còn nhỏ, sau ưa sáng; thích nghi với vùng có khí hậu á nhiệt đới núi cao Thường mọc

- Tình trạng: Phân bố hẹp, số lượng cá thể hiện có không nhiều; Điểm phân

bố ở núi Hàm Rồng đã bị tàn phá (còn vài cây); Điểm ở Ô Quí Hồ đang bị đe doạ (gàn nơi khai thác đá) Đã từng bị khai thác thu mua, nguy cơ bị tuyệt chủng cao[2],[7],[8]

1.1.4 Tác dụng dược lý của cây Hoàng liên gai.

Theo Đông y, Hoàng liên gai vị đắng, lạnh; có tác dụng tả hóa giải độc, thanh tâm nhiệt, táo tỳ thấp, trị tiêu hoá không tốt, viêm ruột, hạ lỵ, đau bụng nôn mửa, trị đau mắt đỏ, tổn thương mí mắt; tiết tả ra máu mủ lâu ngày, trừ thuỷ, lợi xương ích mật, mồm miệng bị nhiệt lở loét

Còn theo y khoa hiện đại, thành phàn hoá học có trong Hoàng liên gai gồm

7 loại aỉkaỉoid, chủ yếu là chất berberin, panmatin, coptỉsin, worenin,

columbamỉn Berberỉn là thành phần chủ yếu trong cây Hoàng liên gai Tác dụng

chính của berberỉn là chống các loại vi khuẩn, ký sinh trùng đường ruột gây hại

cho cơ thể mà không ảnh hưởng tới hoạt động của các vi sinh vật có lợi của

đường tiêu hóa Berberỉn còn được bào chế thành thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết

mạc, đau mắt đỏ do các yếu tố kích ứng từ môi trường hoặc do đau mắt hột gây

nên Berberỉn có khả năng ngăn ngừa sự lây lan của nấm, bột nhiễm nấm, chống lại tác hại của vi khuẩn tả, E.Coli Khi dùng kết họp với kháng sinh thì berberin

còn có khả năng hạn chế lại tác dụng không mong muốn của các loại kháng sinh

Ở một số nước công nghiệp phát triển, Berberỉn được sản xuất với quy mô lớn bằng phương pháp công nghệ sinh học nuôi cấy mô Berberin có tác dụng kháng khuẩn với shỉgella, tụ cầu và liên cầu khuẩn Những năm gần đây, một số nghiên cứu mới nhất ở nước ngoài đã xác định berberin có tác dụng chống lại

nhiều loại vi khuẩn gram dương, gram âm và các vi khuẩn kháng axit Ngoài ra,

nó còn có tác dụng chống lại một số nấm men gây bệnh và một số động vật

nguyên sinh

Đặc biệt khi dùng berberin điều trị các nhiễm trùng đường ruột sẽ không

ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở một Các nghiêncứu gần đây cũng chứng minh: Khi dùng một số thuốc kháng sinh nếu phối hợp với berberin sẽ hạn chế được tác dụng phụ gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối

với hệ vi sinh vật đường ruột Bởi vậy, berberin đang được chú ý phát triển ở

nhiều nước

Thông thường, khi nhắc đến berberin, hầu hết chúng ta đều nghĩ ngay đến

tác dụng hữu hiệu của nó trên đường tiêu hóa Nhưng nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy, hoạt chất này còn đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm

cholesterol, ngăn ngừa bệnh mạch vành và cải thiện chức năng tim Các nhà khoa

học phát hiện hoạt chất berberỉn có vai trò tích cực ừong việc bảo vệ thảnh mạch,

ngăn ngừa hình thành mảng xơ vữa Do nó tác động lên lớp nội mạc mạch máu (lóp lót ừong lòng mạch máu) và lớp tế bào cơ trơn thành mạch nên làm tăng độ đàn hổi và dẻo dai cho thành mạch; ngăn chặn phản ứng viêm, chống lại việc hìnhthành mảng xơ vữa từ những giai đoạn đàu tiên

Berberin tạo được mối quan tâm với các nhà dược học trong chuyển hóa lipid thông qua quá trình ức chế tổng họp Cholesterol và Triglycerid tại gan Thực tế, từ năm 2004, nhiều nước phương Tây đã ứng dụng berberỉn ừong điều

trị tăng lipid máu (mỡ ừong máu) Các nghiên cứu đã đánh giá hiệu quả của hoạt

chất này tương đương với statin - một nhóm thuốc hạ mỡ máu phổ biến hiện nay Đồng thời, việc kết hợp berberin với simvastatin trong điều trị mỡ máu giúp giảm đáng kể nồng độ LDL-C máu, Cholesterol toàn phàn cũng như Trỉgicerỉd, hơn hẳn so với việc sử dụng Simvastatin đơn độc.

Bên cạnh những tác dụng trên mạch máu, nhiều nghiên cứu đã chứng minh

vai trò của berberỉn trong việc tăng cường sự dẻo dai của trái tim Nghiên cứu

được thực hiện tại Trung Quốc đã mở ra hy vọng mới cho những người bệnh mắc chứng phì đại cơ tim và suy tim mạn tính bởi hoạt chất này có khả năng ức chế phì đại cơ tim, cải thiện các chỉ số về sức co bóp, khả năng giãn nở của cơ tim và điều chỉnh hoạt động của thần kỉnh giao cảm tại tim

Một nghiên cứu khác tại Trung Quốc trên bệnh nhân suy tim sung huyết hoặc thiếu máu cơ tim vô căn cho thấy, việc bổ sung hoạt chất này vào phác đồ điều trị chuẩn có sự cải thiện đáng kể chức năng thất ừái, tăng khả năng hoạt động thể lực, biểu hiện khó thở, mệt mỏi cũng cải thiện rõ rệt

Từ những kết quả khả quan bước đầu, hiện berberỉn vẫn là đích đến của

nhiều nghiên cứu để ứng dụng sản xuất thuốc điều trị bệnh tim mạch trong tương

lai Việc sử dụng berberin đơn độc cho bệnh tim mạch vẫn còn trong quá trình

thử nghiệm và càn có khuyến cáo từ các nhà dược học trên thế giới

Khi nghiên cứu tác dụng dược lý của họ Hoàng liên, các nhà khoa học đã chứng minh được vai trò của họ Hoàng liên trong việc điều trị một số loại bệnh như:

+ Tác dụng kháng khuẩn: Hoàng liên và 1 trong các hoạt chất của nó là berberin, có phổ kháng khuẩn rộng trong thí nghiệm Có tác dụng ức chế mạnh

đối với Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis và Staphylococcus

aureus Thuốc có tác dụng ức chế mạnh đối với khuẩn gây lỵ nhất là Shigella dysenterỉae và s.flexneri Thuốc có hiệu quả hơn thuốc Sulfa nhưng kém hơn Streptomỉcỉne hoặc Chloramphenicol Thuốc không có tác dụng đối với Shigella sonneỉ, Pseudomonas aeruginosa và Salmonella paratyphi Nước sắc Hoàng liên

có hiệu quả đối với 1 số vi khuẩn phát triển mà kháng với Streptomicine,

Chloramphenicol và Oxytetracyclỉne hydrochloride Nhiều báo cáo khác cho thấy

độ hiệu quả khác biệt của Hoàng liên đối với vi trùng lao, nhưng không có tác

dụng giống như thuốc INH Hoạt chất kháng khuẩn của Hoàng liên thường được

coi là do berberỉn Khi sao lên thì lượng berberin kháng khuẩn thấp đi.

+ Tác dụng kháng virus: Thí nghiệm trên phôi gà chứng minh rằng Hoàng liên có tác dụng đối với nhiều loại virus cúm khác nhau và virus Newcastle.

+ Tác dụng chổng nấm: Trong thí nghiệm, nước sắc Hoàng liên có tác dụng ức chế nhiều loại nấm Nước sắc Hoàng liên và berberỉn tương đối có tác dụng mạnh diệt Leptospira.

+ Tác dụng chổng ho gà: Kết quả nhiều nghiên cứu về tác dụng của Hoàng

liên đối với ho gà có khác nhau Một nghiên cứu cho thấy trong thí nghiệm tập

trung Hoàng liên ức chế sự phát triển của Hemophilus pertussis cao hơn

Streptomycỉne hoặc Chloramphenicol, ít nhất là thuốc có tác dụng lâm sàng Tuy

nhiên, nghiên cứu khác trên heo Hà Lan, cho uống Hoàng liên thì lại không làm giảm tỉ lệ tử vong

+ Tác dụng hạ áp: Chích hoặc uống dịch chiết berberin cho mèo, chó và

thỏ đã được gây mê và chuột không gây mê thấy huyết áp giảm Liều lượng bình thường, hiệu quả không kéo dài, liều lập lại cho kết quả không cao hơn Hiệu quả này xẩy ra dù tác dụng trợ tim ảnh hưởng đến lượng máu tim gây nên bởi liều thuốc này Huyết áp giảm dường như liên hệ với việc tăng dãn mạch, cũng như có

sự gia tăng đồng bộ ở lách, thận và tay chân

+ Tác dụng nội tiết: Berberỉn cũng có tác dụng kháng Adrenaline Thí dụ:

đang khi berberin làm hạ áp thì phản xạ tăng - hạ của Adrenalin giảm rất nhiều nhưng phụ hồi lại nhanh Berberỉn cũng dung hòa sự rối loạn của Adrenaline và

các hợp chất liên hệ.

+ Tác dụng đối với hệ mật: Berberỉn có tác dụng lợi mật và có thể làm tăng việc tạo nên mật cũng như làm giảm độ dính của mật Dùng berberỉn rất hiệu quả

đối với những bệnh nhân viêm mật mạn tính

+ Tác dụng đối với hệ thần kinh trung ương: Berberỉn dùng liều nhỏ có tác

dụng kích thích vỏ não, trong khi đó, liều lớn lại tăng sự ức chế hoạt động của vỏ não

+ Tác dụng kháng viêm: Lịch sử nghiên cứu chất Granulomas gây ra bởi dầu cotton ừên chuột nhắt cho thấy chất berberin làm gia tăng đáp ứng kháng

viêm của thể Chất Ethanol chiết xuất của Hoàng liên có tác dụng kháng viêm khi

cho vào tại chỗ, nó làm cho chất Granulomas co lại Hiệu quả này giống như tác

số lượng cá thể Hoàng liên gai ừong tự nhiên đang suy giảm mạnh Bên cạnh đó, đặc tính sinh trưởng và phát triển chậm, khó nuôi trồng khiến cho việc tái sinh Hoàng liên gai trong tự nhiên trở nên khỏ khăn Do đó cần quản lý và sử dụng cácphương pháp khoa học để khai thác bền vững nguồn tài nguyên này.

Hoàng liên gai được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá

"đang nguy cấp" (Bậc E) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 1) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CPngày 30/3/2006 của Chính phủ để nghiêm cấm khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại Bảo vệ những cá thể còn sót lại ở núi Hàm Rồng Trồng được bằng hạt hay cành chiết Khuyến khích người dân trồng làm hàng rào vườn và nương rẫy Trồng bảo tồn ngoại vi

(Ex situ) ở vườn Trạm nghiên cứu trồng cây thuốc Sapa (Viện Dược liệu) [2],

[7].Trước tình hình trên, cần sớm nghiên cứu áp dụng kỹ thuật nuôi cấy sinh khối

tế bào thực vật tạo nguồn nguyên liệu ổn định, đáp ứng yêu cầu làm thuốc

1.2 Tổng quan về nuôi cấy sinh khối rễ tơ

1.2.1 Giới thiệu về nuôi cấy sinh khối tế bào

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật đóng góp nhiều cho tiềm năng khai thác các hợp chất có giá trị trong y học mà chỉ có thể có ở thực vật Vài năm ừở lại đây, những hoạt chất sinh học từ thực vật được sử dụng như một nguồn dược liệu giá trị Những chất này thường được sản xuất với một lượng rất nhỏ trong tế bào thực vật [5] Để đáp ứng nhu cầu về dược phẩm, các nhà khoa học đã đưa giải

pháp nuôi cấy sinh khối (biomass) tế bào thực vật, nhằm thu hoạt chất dược với

trữ lượng lớn

Phương pháp này hoạt động trên cơ sở về tính toàn thể của tế bào Phương diện về di truyền cũng như hóa sinh của tế bào thực vật khi gặp điều kiện tương ứng sẽ biểu hiện các tính trạng như một cá thể hoàn chỉnh Có nhiều nghiên cứu cho thấy sản phẩm trao đổi chất được sản xuất theo phương pháp sinh khối cho

chất lượng cũng như số lượng cao hơn ở cá thể cây hoàn chỉnh Các nhóm chất

thường được sản xuất theo phương pháp này là các alkaloid, tinh dầu và hợp chất glycosỉd Các loại vật liệu được nuôi cấy có thể là: tế bào đơn, mô sẹo, protoplast

hoặc nuôi cấy rễ

Cho đến nay, rất nhiều hoạt chất nguồn gốc thực vật có giá trị kinh tế cao làsản phẩm của nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật: Các hoạt chất dùng trong dược

phẩm như caffein thu được từ nuôi cấy tế bào Coffea arabica [26], betalain từ mô sẹo của cải đường, berberine từ cây Coptis Japonica (loài cây này phải trồng tò 4

này có thể thu được sau 4 tuần nuôi cấy bằng sinh khối tế bào thực vật) [27]

Các hoạt chất dùng trong thực phẩm: các chất tạo màu (anthocyanỉn, crocỉn), các chất tạo mùi (vani, mùi hành và mùi tỏi) Một số chất khác như: shikonin (chất có khả năng diệt khuẩn), paclỉtaxel (sản phẩm của nuôi cấy sinh

khối tế bào thông đỏ), nuôi cấy sinh khối tế bào bằng hệ thống bioreactor 10.000

lít trong sản xuất reserpine (alkaloid chiết xuất từ cây Ba gác có tác dụng chữa

bệnh cao huyết áp và rối loạn tuần hoàn máu) có thể sản xuất được 3.500 kg resperin trong thời gian 30 ngày nuôi cấy

Đinh Thị Thu Hiền và cộng sự (2003) đã nghiên cứu thành công quy trình nhân nhanh sinh khối mô sẹo của cây Hoàng liên gai nhằm sản xuất nguồn dược

liệu berberỉne, thay thế nguồn tự nhiên đang ngày càng khan hiếm Với quy trình

này, sau khoảng 3-4 tuần nuôi cấy mô của cây Hoàng liên gai, có thể thu được một lượng mô lớn gấp hàng chục lần lượng ban đầu[l]

Tuy nhiên trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật các chất điều hòa sinh trưởng thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm làm giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy Việc làm này sẽ dẫn tới có

sự tồn dư của các chất điều hòa sinh trưởng trong sinh khối tế bào nuôi cấy gây ảnh hưởng đến ức khỏe người sử dụng và tính an toàn của sản phẩm Tuy nhiên,

vấn đề này có thể khắc phục được thông qua nuôi cấy sinh khối tò rễ tơ, bởi rễ tơ

có khả năng sinh trưởng cao và đặc biệt có thể sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường không cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng [17]

2.2.2 Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes - Phương pháp tạo rễ

tơ ở tế bào thực vật

Hình 1.2: Một số bênh ở thực vật gây ra bởi Agrobacterium sp a)Agrobacterium

sp b) Bệnh khối u ở thực vật, c) Bệnh rễ tơ ở thực vật

Agrobacterium sp thuộc nhóm vi khuẩn đất, gram âm, được biết đến từ rất

lâu ừong nông nghiệp với vai ữò là vi khuẩn cố định đạm, cung cấp nguồn nitơ cho

cây ừồng Agrobacterium được phân loại dựa trên những căn bệnh mà chúng gây

ra trên thực vật hai lá mầm Agrobacterium gồm 4 nhóm chính: Agrobacterium

tumefaciens, Agrobacterium rubi là hai nhóm gây bệnh khối u (crowwn gaỉỉ) ở

thực vật; nhóm Agrobacterium rhizogenes gây bệnh mọc rễ tơ {hairy roots) tại các vết thương của cây; nhóm Agrobacterium radiobacter không gây bệnh trên

thực vật[10] Trong những thập kỉ gần đây thì các nhà khoa học đã chú ý đến vai

trò của hai loài vi khuẳn Agrobacterium rhừogenes và Agrobacterium tumefaciens trong mục đích chuyển gen vào thực vật Chúng được xem như là các

“kĩ sư trao đổi chất”, được áp dụng để chuyển gen vào tế bào thực vật nhằm mục đích đẩy mạnh quá trình sinh tổng hợp ra các hợp chất thứ cấp cần thiết Khả năng

gây bệnh của Agrobacterium sp đã được chứng minh là do sự có mặt của pTi (pỉasmiđ tumor induction) ở Agrobacterium tumefaciens và pRi (pỉasmid root induction) ở Agrobacterium rhizogenes.

< .

/

Agrobacterium rhizogenes, tên khoa học khác là Rhizobium rhizogenes, là

một loài vi khuẩn đất gram âm, thuộc họ Rhizobiaceae nằm trong bộ Rhizobiales

cổ định đạm Chúng có khả năng nhận biết được các phân tử tín hiệu từ các tế bào thực vật bị tổn thương và tấn công vào vị trí đó [12],[36].

1.2.3 Cơ chế chuyển các gen vừng T - ĐNA vào tế bào thực vật

Khi các vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes nhiễm vào viết thương của thực

vật thì chúng sẽ chuyển gen của chúng vào các tế bào thực vật tại vị trí đó Các gen

được chuyển từ Agrobacterium rhizogenes vào bộ gen của tế bào thực vật được

gọi tên là T- DNA {transfer DNA) T-DNA sau khi chuyển vào thì sẽ được gắn ổn

định vào bộ gen của thực vật Tuy nhiên các gen mã hóa T-DNA có nguồn gốc từ vi

khuẩn nhưng nó có mang các trình tự điều tiết ở Eukaryote nên có thể biểu hiện

được trong tế bào thực vật Vùng T-DNA này ừong một plasmid lởn của

Agrobacterium rhizogenes và plasmid này được đặt tên là Rỉ-plasmid (root inducing plasmid) do Â.rhizogenes có khả năng cảm úng tạo rễ bất định [23].

Origin of («plKition

Hình 1.3: Cấu trúc Ri - plasmid

Ri-plasmid được chia thành 2 nhóm chính là agropine và mannopine, vi khuẩn A.rhỉzogenes chứa Ri-plasmid thuộc loại agropine được sử dụng chủ yếu

cho quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật để cảm ứng tạo rễ tơ Ri- plasmid

được chia thành nhiều vùng như vùng gây độc (gọi tắt là vùng vir- vỉrulence)), vùng chuyển gen (T-DNA), vùng orì (vùng mã hóa chức năng tái bản và khởi

điểm tái bản), vùng phiên mã chỉ có đoạn T-DNA của plasmid mới được chuyển vào bộ gen của thực vật và sự chuyển gen này thông qua sự hỗ ừợ bởi các

đoạn gen trong vùng vir của plasmid Vùng vir chiếm khoảng 35 kb trong

chức năng quan trọng trong quá trình chuyển gen [30] Sự phiên mã của vùng vir được cảm ứng với nhiều hợp chất thuộc nhóm phenoỉ, điển hình là

acetosyringone - họp chất liên quan được xác định là có vai trò làm tăng tần số

của quá trình chuyển gen thông qua Agrobacterium ở nhiều loài thực vật Nhiều loại đường cũng đóng vai trò như chất bổ trợ hoạt động cho acetosyringone để cảm ứng sự biểu hiện của gen vir ở mức độ cao [29].

Nhìn chung cơ chế quá trình xâm nhiễm và cơ chế phân tử của quá trình

vận chuyển T-DNA vào tế bào vật chủ của vi khuẩn A.tume/aciens và

Ả.rhizogenes được chứng minh là tương tự nhau [36] Tuy nhiên sự hình thành khối u ở vi khuẩn A.tume/aciens do gen mã hóa sinh tổng hợp auxin quy định Trong khi đó, các gen mã hóa sinh tổng họp auxỉn ở vi khuẩn A.rhỉzogenes có vai

ừò rất nhỏ ừong quá trình hình thành rễ tơ ở thực vật

[12],[36]

T-DNA ở Ri-plasmid của nhóm agropỉne bao gồm 2 vùng chính là vùng

biên trái Tl-DNA và biên phải Tr-DNA Hai vùng này đều có kích thước khoảng

15 - 20 kb và được xen kẽ bởi 1 đoạn DNA, đoạn DNA này sẽ

được chuyển vào hệ gen của tế bào vật chủ Vùng Tr-DNAmang các gen mã hóa sinh tổng họp auxỉn (tms 1 và tms2), vùng Tl-DNA bao gồm 18 khung dọc (ORFs), trong đó có 4 locus 10,

11, 12 và 15 mã hóa cho rolA, B, c và D (root locus), Các plasmid của các chủng A.rhizogenes thuộc nhóm mannopỉne,

giống vùng Tl-DNA của các chủng thuộc nhỏm agropine nhưng khuyết gen roỉD [16] Các gen rolA, roỉB và rolc đóng vai trò quan trọng trong quá trình tạo rễ tơ ở mô tế bào thực vật

Sự biểu hiện đồng thời của 3 gen này gây lên kiểu hình rễ

tơ ở mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm Các rễ tơ này có khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh hơn rất nhiều so với

rễ bình thường Trong 3 gen rol ừên, gen roiB đóng vai trò quan trọng hơn cả, khi gen roỉB được biểu hiện, mô tế bào thực vật đã cảm ứng tạo kiểu hình rễ tơ, trong khi đó bất hoạt gen rolB không tạo được kiểu hình rễ tơ [11]

1.2.4 Nuôi cấy sinh khối rễ tơ.

Rễ tơ là tên gọi dùng để chỉ các rễ bất định được sản sinh ra mạnh mẽ tại vị

trí bị nhiễm bởi vi khuẩn A.rhizogenes T-DNA từ A.rhizogenes sau khi chuyển vào

tế bào thực vật thì chúng sẽ được gắn vào bộ gen của thực vật, từ đó tế bào thực vật

sẽ làm nhiệm vụ biểu hiện các gen roỉ và gen awe ( tổng hợp ra các IAA) làm tăng

khả năng tạo các lông rễ một cách mạnh mẽ ngay tại vị trí bị tổn thương ở mô thực vật đó số lượng các lông rễ được tạo ra khá nhiều, phát triển thành một hệ thống lông rễ, hay còn gọi là hệ thống rễ tơ [36].

1 Rễ tơ Beta vulgaris phát triển trên môi trường agar

2 Rễ tơ của cây đậu phộng (Arachis hỵpogaea)

3 Rễ tơ ơ glabra nuôi trong môi trường lỏng

4 Nuôi cấy rễ tơ G.ệỉabra bằng hệ thống bioreactor (a); thu hoạch sinh

khối rễ sau 30 ngày nuôi cay (b,c)

Điểm đặc trưng nổi bật của hệ thống tễ tơ là chúng có khả năng phát triển nhanh và ổn định trên môi trường nuôi cấy không cần bổ sung chất điều hòa sinh

Hình 1.5 Các hệ rễ tơ được nuôi cấy

trưởng thực vật, với sự chuyển gen của A rhizogenes vào tế bào rễ tơ có khả năng

tổng hợp ra nhiều loại hợp chất tự nhiên với hiệu suất cao mà các tế bào không phân hóa và các rễ bất định không chuyển gen không tổng hợp được hay tổng hợpvới hàm lượng không đáng kể [36]

ửng dụng của nuôi cấy sinh khối rễ tơ

Công nghệ nuôi cấy rễ tơ đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhờ vào những ưu điểm của mình Rễ chuyển gen có đặc tính là tốc độ sinh trưởng nhanh và tính di truyền ổn định Rễ tơ có thể sản xuất một lượng lớn hợp chất thứ cấp hay hàng loạt họp chất có liên quan tới thực vật

Sản xuất hợp chất thứ cấp

Thông thường, nuôi cấy rễ cần có sự xuất hiện của các chất điều hòa sinh trưởng ngoại sinh, hay là sự có mặt của các chất này ừong môi ừường nuôi cấy Phương pháp nuôi cấy rễ này tạo các dòng rễ sinh trưởng rất chậm và có thể dẫn đến tình trạng thiếu hụt hay tổng hợp kém các hoạt chất thứ cấp Tuy nhiên, rễ tơ

đã cải tiến công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật trong thu nhận các hợp chất có giá trị sinh học cao Rễ tơ cũng đã cung cấp một nguồn hóa chất thiên nhiên dồi dào cho các ngành công nghiệp dược phẩm, hóa mỹ phẩm và phụ gia thực phẩm [9]

Kim và cs (2009) đã sử dụng 3 chủng A.rhizogenes là RI000, A4 và ATCC

15834 cảm ứng với loài Taxus cuspidata và thu nhận được 107 dòng rễ tơ Trải qua quá trình sàng lọc cho 3 dòng rễ tơ có thể sinh trưởng tốt ừên môi trường MS không chất điều hòa sinh trưởng, và có khả năng sinh tổng hợp taxol - một hợp

Bảng 1.1: Một số loài thực vật được nuôi cấy rễ tơ để thu hoạt chất sinh

học[19]

Panax hybỉrd Ginsenosides

Rễ tơ được xem như là muột nguồn nguyên liệu có giá trị ừong sản xuất các họp chất tự nhiên có lợi như dược phẩm, các chất phụ gia trong ngành mỹ phẩm và thực phẩm Vào năm 2002, Sevon đã tổng kết lại những hợp chất

ankaloid quan trọng nhất trong ngành được sản xuất bởi hệ thống rễ tơ, bao gồm

A.tropabelladonna L., Catharanthus trỉcophyllus L., và Datura củadỉda L [36]

Nhờ vào những đặc điểm như phát triển nhanh, dễ duy trì ổn định và khả năng tổng họp một số lượng lớn họp chất tự nhiên, hệ thống rễ tơ thể hiện tiềm năng lớn trong việc sản xuất các họp chất tự nhiên thông qua các hệ thống nuôi cấy liêntục Điều này có ý nghĩa lớn trong việc sản xuất các sản phẩm họp chất tự nhiên ừên quy mô công nghiệp với hiệu xuất cao, giảm chi phí trong quá trình sản xuất

từ đó giảm giá thành sản phẩm

Bên cạnh việc chuyển T-DNA của A.rhizogenes vào tế bào thì ta có thể

chuyển các gen ngoại lai vào trong tế bào thông qua việc tái tổ hợp đoạn gen đó

vào trong đoạn T-DNA của A.rhizogenes Các gen này có thể là gen biểu hiện ra các họp chất mục tiêu hay có thể là các gen mã hóa các enzyme chìa khóa trong

con đường sinh tổng họp ra các chất tự nhiên mong muốn Phương pháp này có thể giúp ta điều khiển hay định hướng cho quá trình sinh tổng hợp các chất tự nhiên ở rễ tơ để tổng họp ra một loại họp chất tự nhiên với hàm lượng cao

Nghiên cứu của Lodhi (1996) đã chứng minh hàm lượng anthraquỉnone và alizarin ừong hệ thống nuôi cấy rễ tơ của Rubỉa peregrỉna L tăng cao khi gắn

đoạn gen mã hóa ra enzyme izochorismate synthase vào đoạn T-DNA; và theo

Baneîjee (2002) thì rễ tơ của A.belladonna được chuyển gen P450 2E1 thể hiện

khả năng tổng hợp chất tự nhiên với mức độ rất cao [31]

Tại Hàn Quốc, một số công ty đang sản xuất rễ tơ nhân sâm với bioreactor

có dung tích 10.000 đến 20.000 lít Sản phẩm này được làm nguyên liệu cho các dạng thực phẩm chức năng và thực phẩm khác nhau ừên thị trường Đã có rất nhiều nghiên cứu thảnh công trong tạo các hoạt chất từ nuôi cấy sinh khối rễ tơ

Với tiềm năng to lớn của hệ thống rễ tơ, các hệ thống rễ tơ của nhiều loài

thực vật đã được nghiên cứu rộng rãi cho mục đích sản xuất hợp chất tự nhiên in vỉtro Đặc biệt là những cây thuốc có ứng dụng lớn cho việc chữa bệnh.

ửng dụng của rễ tơ trong phân tích chức năng của gen

Rễ tơ không chỉ được ứng dụng để sản xuất họp chất thứ cấp mà còn được

sử dụng trong các thí nghiệm nghiên cứu chức năng gen Các đoạn gen chức năng

được tái tổ hợp với gen chỉ thị gus, hoặc chỉ thị bằng huỳnh quang và được đưa vào A.rhỉzzogenes để chuyển vào thực vật Thông qua quá trình biểu hiện của gen

chỉ thị gus mà các gen chuyển vào rễ tơ được nghiên cứu chức năng Một ví dụ là gen gus kết họp với promotor alcohol dehydrogenase (Adh) và được chuyển vào

rễ tơ đậu nành Chức năng của promotor được nghiên cứu dưới các điều kiện môi

trường như: nhiệt độ thấp, thiếu khí, bị tổn thương và xử lý acid abscisic Tất cả các chức năng đều được nghiên cứu thông qua sự biểu hiện của gen gus [47].

Biểu hiện proteỉn ngoại lai

Rễ tơ còn được dùng để biểu hiện các protein công nghiệp và các loại protein chức năng Nhờ vào khả năng chuyển một đoạn gen ngoại lai vào thực

vật, A.rhỉzogenes đã được thiết kế mang các vector tái tổ hợp để có thể biểu hiện các loại protein trong rễ tơ Các gen ngoại lai này được gắn kết vào genome thực

vật và ổn định về mặt di truyền nên khả năng biểu hiện không bị suy giảm Ryan

(2008) đã tạo thành công dòng rễ tơ mang gen mã hóa cho acetylcholinesterase-

một protein có khả năng xử lý các hợp chất phosphat gây độc cho cơ thể Các

dòng rễ này tuy tăng trưởng chậm nhưng có hàm lượng acetylcholinesterase lên tới 3,3% hàm lượng protein tổng số [33] Mặt khác, các nghiên cứu cho thấy có

thể tạo rễ tơ mang cấu trúc kháng thể ở người hay cấu trúc vỏ protein của các virus gây bệnh nhằm bước đầu tạo nguồn vaccine thực vật Sharp (2001) đã thành

công ừong việc tạo dòng rễ tơ thuốc lá mang kháng thể đơn dòng IgGI ở

ngưcri[38]

Với tiềm năng và khả năng ứng dụng to lớn của mình, hệ thống rễ tơ của nhiều loài thực vật đã được nghiên cứu rộng rãi cho mục đích sản xuất các họp chất tự nhiên in vitro, đặc biệt là những cây thuốc có ứng dụng lớn cho việc chữa bệnh Bên cạnh đó, rễ tơ còn là một công cụ hữu hiệu trong các nghiên cứu về gen hay công nghệ protein

1.3 Các nghiền cứu ứng dung chỉ thỉ DNA vào vỉêc xác đỉnh loài

Trong nghiên cứu này, việc thu thập các nguồn mẫu cây Hoàng liên gai ngoài tự nhiên làm nguyên liệu cho nuôi cấy là một việc cần thiết Tuy nhiên nguồn nguyên liệu ngoài tự nhiên nếu chỉ dựa vào hình thái và kinh nghiệm dân gian đôi khi dễ nhầm lẫn với những đối tượng cây có hình thái tương tự sống tại cùng một khu vực Điều này có ảnh hưởng không nhỏ đến nghiên cứu Do đó việcnhận dạng các mẫu cây ngoài tự nhiên bằng phương pháp sinh học phân tử sẽ mang ý nghĩa rất quan trọng

Trong vài thập kỷ gần đây, sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp và

kỹ thuật sinh học phân tử đã tạo ra các công cụ hữu hiệu cho các nghiên cứu sự sống ở mức độ phân tử Các kỹ thuật sinh học phân tử cũng nhanh chóng được ứng dụng trong nghiên cứu và bảo tồn đa dạng sinh học, nhận dạng loài, tạo ra các lĩnh vực khoa học mới như tiến hóa phân tử, di truyền và bảo tồn loài Đặc biệt, đối với lĩnh vực phân loại học, việc sử dụng các DNA chỉ thị để nhận dạng loài đang được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và có những đóng góp đáng kể trong việc phân loại loài Nhận dạng loài bằng chỉ thị DNA hay

“DNA barcodỉng” là một khái niệm tương đối mới mẻ Đó là công cụ phục vụ

nhận dạng loài một cách chính xác, nhanh chóng, tự động hóa bằng cách sử dụng một vùng DNA chuẩn hay còn gọi là chỉ thị DNA hay mã vạch DNA (DNA

barcoding) Xác định loài bằng DNA chỉ thị sẽ cho mức độ chính xác cao và đặc

biệt hữu dụng với các loài gần gũi và những quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ sở để nhận dạng hoặc phân biệt loài [24],[25]

Hiện nay trên thế giới, phương pháp này đang được sử dụng chủ yếu bởi các nhà phân loại học và nhiều nhà khoa học ở các lĩnh vực khác như khảo cổ học, công nghiệp sinh học và chế biến thực phẩm

Đối với thực vật, quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các loài thực vật gặp nhiều khó khăn Hệ gen ty thể ở thực vật thường quá bảo thủ nên không được dung cho thỉ thị DNA, trong khi đó hệ gen lục lạp lại mang nhiều đặcđiểm mong muốn đối với chỉ thị DNA như ở hệ gen ty thể ở động vật [44] Ở hệ

gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi ITS (Internal Transcrỉbed

Spacer) cũng được sử dụng làm DNA chỉ thị trong một số nghiên cứu

Trong vài năm trở lại đây nhiều vùng gen đã được nghiên cứu và đề xuất làm chỉ thị DNA cho thực vật tuy nhiên chưa có chỉ thị DNA nào được đa phàn các nhà phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận[25],[44] Mặc dù vậy, các nhànghiên cứu cũng đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ cần không chỉ một mà nhiều vùng DNA chỉ thị để định danh loài đối với thực vật và hệ gen lục lạp là nơichứa các vùng DNA chỉ thị tiềm năng, trong đó một số vùng DNA lục lạp đã được nhiều nhà nghiên cứu đề xuất là chỉ thị DNA [13],[14],[43]

Chỉ thị DNA barcode là một ừong những phương pháp phổ biến có độ

chính xác cao đã được nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước sử dụng Nhiều vùng gen đã được nghiên cứu và đề xuất làm chỉ thị DNA cho thực vật

phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận [13],[16] Mặc dù vậy, các nhà nghiêncứu cũng đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ càn không chỉ một mà nhiều vùng DNA chỉ thị để xác danh loài đối với thực vật và hệ gen lục lạp là nơi chứa

các vùng DNA chỉ thị tiềm năng, trong đó một số vùng DNA lục lạp đã được nhiều nhà nghiên cứu đề xuất là chỉ thị DNA [13],[14],[43].

Do số lượng loài Hoàng liên gai trong tự nhiên khan hiếm và ngày càng sụtgiảm về số lượng nên việc xây dựng một công cụ phân loại nhanh chóng và chínhxác cho loài cây này là một yêu càu cấp thiết nhằm bảo tồn và phát triển cây

Hoàng liên gai tại Việt Nam, chỉ thị DNA barcod là phương pháp phân loại cho

kết quả nhanh chóng đã được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước sử dụng ừên nhiều đối tượng khác nhau Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu xây dựng

mã vạch DNA với 5 chỉ thị rpoB, rpoCl, psbA- tmH, trnL:(nằm trên plasmid

phân bố trong lục lạp), ITS ( nằm trong genome thực vật) để phục vụ cho việc

phân loại và nhân dạng cây Hoàng liên gai tại Sa Pa

Chương II

VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1.Vật liệu

Hoàng liên - Sa Pa - Lào Cai

Sinh học phân tử, trường Đại học Heidelberg cung cấp

2.2.Dụng cụ - hóa chất

tối, tủ 37°c.

thực vật - Viện Công nghệ Sinh học

- Các muôi trường cơ bản nuôi cấy tế bào thực vật như MS (Murashige

and Skoog); YMB (Woody plant medium); LB (Lauria Broth) kháng sinh

(cefotaxime, spectỉnomycỉne ) Nước cất, javen, ethanol 70° Ngoài ra còn có các hóa chất thông dụng khác (agar, gellam gum ) của các hãng Sigma,

Fermentas, Duchefa

2.3.Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thu thập và nhận dạng loài bằng chỉ thị phân tử.

Hoàng liên gai và vùng phân bố của chúng, tôi tiến hành thu thập mẫu tại Vườn Quốc gia Hoàng liên - Sa Pa - Lào Cai

ừánh việc sử dụng nhầm đối tượng nghiên cứu Qui trình xác định loài bằng chỉ thị phân tử gồm các bước:

Tách chiết và tinh sạch DNA: Các mẫu lá Hoàng liên gai được tiến hành tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB theo Saghai-Maroof et al., 1984 [34]

Tinh sạch và giải trình tự sản phẩm PCR: DNA tổng số sau khi tách chiết thành công được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với như sau: bước 1:

94°c, 5 phút; bước 2: 94°c, 30s; bước 3: 54°c, 50s; bước 4: 72°c, 1 phút; từ

quản mẫu

Sản phẩm PCR sau đó được điện di trên gel agarose 1% trong đệm IX

TAE, nhuộm gel trong dung dịch Ethidium brommỉde và tinh sạch bằng kit thôi

gel của QIAamp Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với các mồi sau:

Bảng 2.1: Thông tin các mồi sử dụng trong nghiên cứuST

Tách dòng và xác định trình tự gen: Sản phẩm PCR sau tinh sạch được

gắn vào vector tách dòng pBT và biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5-Ơ

theo phương pháp sốc nhiệt của Cohen et al.(1972) Chọn lọc khuẩn lạc

xanh/trắng trên môi trường thạch LB có bổ xung 50mg/l Carbenicilin, 0,004% gal và 0,lmM IPTG Tách plasmid theo hướng dẫn của bộ Kit tách plasmid

X-(Bioneer, Hàn Quốc) và của Sambrook và Russell (2001) Kiểm tra sự có mặt của DNA tái tổ họp bằng phương pháp clony-PCR với cặp mồi pUC18-F và PƯC18-

R Trình tự DNA các đoạn gen rpob, rpoCl, psbA-trnH, trnL, ITS của hai mẫu

Hoàng liên gai được xác định bằng máy đọc trình tự tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Côngnghệ Việt Nam Các trình tự được phân tích và so sánh bằng phần mềm BioEdit, DNAstar và dựng cây phát sinh chửng loại ừên cơ sở dữ liệu thu được

2.3.2 Phương pháp khử trùng hạt và đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro

Bước 1: Hạt cây Hoàng liên gai được rửa sạch bằng nước xà phòng pha

- 3 phút sau đó rửa lại với nước cất khử trùng 4 - 5 làn ( m ỗ i lần từ 3 - 4 phút)

Bước 3: Khử trùng hạt với dung dịch HgCỈ2 0,1% lắc đều ừong khoảng thời gian từ 9 - 10 phút rửa lại với nước cất khử trùng 4 - 5 lần ( m ỗ i lần 3 - 4 phút)

Bước 4: Đưa hạt ra giấy thấm khử trùng để khô ráo nước, sử dụng panh,

dao tách hết lớp vỏ ngoài lấy phôi nhũ Đưa phôi nhũ vào cấy trong môi trường

MS đã chuẩn bị sẵn.

Số mẫu phôi đưa vào cấy 1 0 - 1 2 phôi/đĩa Sau khi cấy xong để ừên giá phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kỳ 16

Theo dõi khả năng sinh trưởng phát triển của phôi ừên môi trường MS

2.3.3 Phương pháp chuyển gen thông qua A.rhizogenes

Để thực hiện chuyển gen bằng A.rhỉzogenes phương pháp chủ yếu tiến

hành là lây nhiễm trực tiếp mẫu với dịch huyền phù vi khuẩn trong môi trường lỏng trong một khoảng thời gian nhất định

Chuẩn bị mẫu mô thực vật: Các mẫu mô thực vật được cắt nhỏ, tạo vết thương trên biểu bì Các mẫu lá được tạo tổn thương bằng lưỡi dao, cắt bốn cạnh xung quanh Thân cây Hoàng liên gai cắt nhỏ có chiều dài khoảng 0,3 - 0,4 cm đặt vào trong đĩa petri có sẵn môi trường MS lỏng

Phương pháp chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai thông qua vi khuẩn

A.rhizogenes ATCC 15834 bao gồm các bước chính sau:

-Chủng khuần A.rhỉzogenes ATCC 15834 gốc được cấy ria trên môi trường

YMB đặc nuôi trong tủ ấm 28°c trong 48 giờ

- Lấy một khuẩn lạc nuôi phục hồi trong trong 20 ml YMB lỏng nuôi lắc

200 v/p qua đê m

-Nuôi nhân thu sinh khối: lấy 5 ml dịch khuẩn phục hồi cho vào 45 ml YMB lỏng, nuôi lắc 200 v/p, 28° c trong 4-6 giờ Các môi trường nuôi khuẩn đều không bổ sung kháng sinh do vector pRi 15834 không có gen kháng kháng sinh

-Dịch khuẩn được đem ly tâm 6500 v/p ở 4° c thu sinh khối, loại bỏ môi trường nuôi cấy Cặn khuẩn được hòa tan trong môi trường MS lỏng tạo dịch huyền phù vi khuẩn Các mẫu thực vật được cắt tạo tổn thương sau đó được lây nhiễm bằng cách ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn

- Sau khi lây nhiễm, mẫu biến nạp được thấm khô bằng giấy thấm khử trùng rồi được đặt vào môi trường đồng nuôi cấy: MS + saccharose 30 g/1 + agar

8g/l

- Sau thời gian đồng nuôi cấy, chuyển mẫu lên môi trường diệt khuẩn: MS

thực vật bắt đàu cảm ứng tạo rễ và được cắt ra chuyển lên môi trườngMS +

Quy trình tóm tắt tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai

Hạt câỵ Hoàng liên gai

(bổ sung 500ml/l ceíòtaxim) ị 1 tháng

Các dòng rễ được cấy chuyển sang từng đĩa petri riêng biệt

ị

Tiếp tục lưu giữ trên môi trường MS đặc cấy chuyển sang môi trường

MS đặc tạo sinh khốiViệc loại bỏ vi khuẩn sau thời gian đồng nuôi cấy là bước quan trọng Nếu không loại bỏ vi khuẩn thì trong quá trình nuôi cấy rễ tơ, chúng sẽ phát triển trongmôi trường nuôi cấy, sẽ tạo cạnh trang nguồn dinh dưỡng gây ảnh hưởng xấu đến khả năng phát triển của rễ tơ tại vị trí nhiễm, thậm trí có thể lấn át không cho rễ phát triển, rễ tơ thường xuất hiện sau khi đã chuyển gen khoảng 3-4 tuần

2.3.4 Kiểm tra hiệu quả chuyển gen thông qua biểu hiện tạm thời

gen gus.

Gen gus được khám phá bởi Jefferson [21] Nó được xem như một công cụ

hữu hiệu trong việc đánh giá hoạt động của gen trong cây chuyển gen và được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực biến nạp gen ở thực vật

Gen gus (uỉdA) là một gen chỉ thị lý tưởng với những đặc điểm sau: Sản

phẩm của nó là độc nhất và không độc đối với tế bào vật chủ, các enzyme chỉ thị của nó có tính ổn định cao, các phương pháp phân tích sản phẩm của gen này đơngiản, thuận tiện, nhạy và đặc thù

Cơ chế biểu hiện của gen gus: Gen gus mã hóa cho enzyme p -

glucoronidase Enzyme này là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải cơ chất Gluc (5-bromo-4-chỉoro-3-indolyỉ glucuronỉdè), sản phẩm phân giải có màu xanh đặc trưng dễ nhận biết và rất bền vững Trong tự nhiên j6 - glucoronidase không tồn tại trong thực vật, vì vậy gen gus là gen chỉ thị rất hữu hiệu trong kỹ thuật

Để thuận lợi cho việc sử dụng gen chỉ thị gus ở thực vật, người ta tiến hành thiết kế vùng có cấu trúc intron (vùng không phiên mã) có chứa uidA Do vậy,

trong các bước biểu hiện gen gus tạm thời ở mô thực vật tránh được hiện tượng dương tính giả Khi còn ở trong vi khuẩn Agrobacterium, gen gụs nằm trong vùng intron của vector chuyển gen nên không được phiên mã, dịch mã để tạo sản phẩm

enzyme và không có phản ứng màu đặc trưng khi nhuộm ừong cơ chất X-Gluc Khi được chuyển vào tế bào thực vật, thông qua bộ máy di truyền của tế bào thực

vật, gen gus mới được phiên mã, dịch mã để tạo ra sản phẩm tham gia vào phân

giải cơ chất và tạo phản ứng màu đặc trưng

Để đánh giá hiệu quả của một quy trình chuyển gen, người ta thường sử

dụng gen chỉ thị gus Các bộ phận khác nhau của cây chuyển gen được ngâm

ừong dung dịch đệm cơ chất X-Gluc Sau 24 - 48 giờ nhuộm mẫu được tẩy hết diệp lục bằng Ethanol và quan sát ừên kính núp soi nổi Biểu hiện hoạt động của

gen gus sau khi chuyển vào tế bào thực vật là phản ứng tạo màu đặc trưng trên các

tế bào, mô, bộ phận của cây chuyển gen

Sau khi đồng nuôi cấy, các mẫu thực vật được chuyển lên môi trường diệt

khuẩn MS bổ sung cefotaxime 500 mg/1 trong 5-7 ngày trước khi được nhuộm gus với quy trình được cải tiến theo Jeffeson et al (1987) [21] Theo đó, các bộ

phận khác nhau của cây chuyển gen được ngâm trong dung dịch đệm cơ chất Gluc (Tris/NaCl: 890 |il; X Gluc: 100 ụ,l; Triton X - 100 : 10 |il), ủ ở nhiệt độ

đến khi diệp lục mất hoàn toàn

Cuối cùng, đánh giá sự biểu hiện màu của mẫu nhiễm và chụp ảnh dưới

kính hiển vi soi nổi Biểu hiện hoạt động của gen gus sau khi chuyển vào tế bào

thực vật là phản ứng tạo màu đặc trưng trên các tế bào, mô, bộ phận của cây chuyển gen

Chương III KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Thu thập và nhận dạng loài Hoàng liên gai