Nghiên cứu tạo rễ tơ của cây hoàng liên gai (berberis juliane) cho mục tiêu nuôi cấy sinh khối dược liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 LƯU VIẾT THỦY NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ CỦA CÂY HOÀNG LIÊN GAI Berberis juliane CHO MỤC TIÊU NUÔI CẤY SINH KHỐI DƯỢC LIỆU LUẬN VĂN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

LƯU VIẾT THỦY

NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ

CỦA CÂY HOÀNG LIÊN GAI (Berberis juliane)

CHO MỤC TIÊU NUÔI CẤY SINH KHỐI DƯỢC LIỆU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

LƯU VIẾT THỦY

NGHIÊN CỨU TẠO RỄ TƠ

CỦA CÂY HOÀNG LIÊN GAI (Berberis juliane)

CHO MỤC TIÊU NUÔI CẤY SINH KHỐI DƯỢC LIỆU

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Mã số : 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Chu Hoàng Hà

Hà Nội, 2014

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những người đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình để tôi hoàn thành luận văn này:

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người Thầy của tôi:

PGS TS Chu Hoàng Hà – Trưởng phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện

trưởng Viện Công nghệ sinh học, người Thầy đã định hướng nghiên cứu, đồng thời cũng chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Tôi xin được cảm ơn Cô giáo TS Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phòng

Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn

Cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Sau đại học trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện cho chúng tôi được học tập tại trường Tôi xin chân

thành cảm ơn thầy giáo TS Nguyễn Văn Đính – CN Khoa Sinh – KTNN,

các thầy, cô giáo đang công tác tại Khoa Sinh – KTNN đã tận tình dạy dỗ chúng tôi trong thời gian qua

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới sự giúp đỡ của CN Nguyễn Khắc

Hưng, Th.s Hoàng Đăng Hiếu cùng tập thể cán bộ phòng Công nghệ Tế

bào thực vật và phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học đã dành cho tôi trong suốt quá trình làm luận văn

Cảm ơn tất cả những người bạn cùng thực tập với tôi và các bạn lớp

Sinh học thực nghiệm K16, đặc biệt là bạn Phạm Văn Hoàng đã giúp đỡ rất

nhiều trong thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân thành tới những người thân trong gia đình và bạn bè – những người luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Hà Nội, tháng 12 năm 2014

Học viên

Lưu Viết Thủy

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu tạo rễ tơ của cây Hoàng liên gai

(Berberis juliane) cho mục tiêu nuôi cấy sinh khối dược liệu” là công trình

nghiên cứu của tôi Những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là

trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác Tôi cũng xin cam đoan rằng

mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông

tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả

Lưu Viết Thủy

MỤC LỤC

I MỞ ĐẦU 1

II NỘI DUNG 6

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 Tổng quan về cây Hoàng liên gai 6

1.1.1 Phân bố địa lý 6

1.1.2 Phân loại 6

1.1.3 Hình thái và đặc điểm sinh thái 7

1.1.4 Tác dụng dược lý của cây Hoàng liên gai 8

1.1.5 Tính cấp thiết nghiên cứu, bảo tồn và sản xuất bền vững cây Hoàng liên gai 12

1.2 Tổng quan về nuôi cấy sinh khối rễ tơ 13

1.2.1 Giới thiệu về nuôi cấy sinh khối tế bào 13

1.2.2 Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes 15

1.2.3 Cơ chế chuyển các gen vùng T – DNA vào tế bào thực vật 16

1.2.4 Nuôi cấy sinh khối rễ tơ 19

1.3 Các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị DNA vào việc xác định loài 23

Chương II: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Vật liệu 26

2.2 Dụng cụ - hóa chất 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Thu thập và nhận dạng loài bằng chỉ thị phân tử 26

2.3.2 Phương pháp khử trùng hạt và đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro 28

2.3.3 Phương pháp chuyển gen thông qua A.rhizogenes 29

3.4 Kiểm tra hiệu quả chuyển gen thông qua biểu hiện tạm thời gen gus 31

Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Thu thập và nhận dạng loài Hoàng liên gai 33

3.1.1 Thu thập mẫu 33

3.1.2 Nhận dạng loài bằng so sánh hình thái 35

3.1.3 Nhận dạng loài bằng chỉ thị DNA 37

3.2 Kết quả khử trùng hạt và đưa mẫu Hoàng liên gai vào nuôi cấy in vitro là nguyên liệu cho nuôi cấy mô tế bào và chuyển gen tạo rễ tơ 45

3.3 Tối ưu hóa quy trình chuyển gen và tiến hành chuyển gen tạo rễ tơ thông qua Agrobacterium rhizogenes 47

3.3.1 Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến hiệu quả chuyển gen 47

3.3.2 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn Agrobacterium tới hiệu quả chuyển gen 50

3.3.3.Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen 52

3.4 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen 54

III KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

PHỤ LỤC 69

Phụ lục 1: THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG MS VÀ WPM 69

Phụ lục 2: KẾT QUẢ SO SÁNH TRÌNH TỰ DNA THÔNG QUA CÁC MỒI CỦA SẢN PHẨM PCR 71

NHỮNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

A.rhizogenes Agobacterium rhizogenes

A.tumefaciens Agobacterium tumefaciens

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BẢNG BIỂU

1 Danh mục các hình ảnh

Hình 1.1: Cây Hoàng liên gai 6

Hình 1.2: Một số bênh ở thực vật gây ra bởi Agrobacterium sp 15

Hình 1.3: Cấu trúc Ri - plasmid 16

Hình 1.4: Cơ chế chuyển gen của Agrobacterium sp 18

Hình 1.5 Các hệ rễ tơ được nuôi cấy 19

Hình 3.1: Hai loài Hoàng liên thu thập tại Vườn Quốc gia Hoàng liên 35

Hình 3.2 Kết quả khuếch đại và tách dòng đoạn gen ITS từ mẫu Hoàng liên gai 38

Hình 3.3 Cây phân loại xây dựng theo phương pháp NJ của chỉ thị trnL 41

Hình 3.4 Cây phân loại xây dựng theo phương pháp NJ của chỉ thị ITS 44

Hình 3.5: Quá trình vào mẫu hạt Hoàng liên gai 47

Hình 3.6: Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến hiệu quả chuyển gen 49

Hình 3.7: Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến khả năng biểu hiện gen gus 51

Hình 3.8: Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chyển gen 53

Hình 3.9: Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen 56

Hình 3.10: Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai 58

2 Danh mục bảng biểu

Bảng 1.1: Một số loài thực vật được nuôi cấy rễ tơ để thu hoạt chất sinh học 21 Bảng 2.1: Thông tin các mồi sử dụng trong nghiên cứu 27 Bảng 3.1 Thông tin và kí hiệu mẫu Hoàng liên gai thu thập tại Sa Pa 33 Bảng 3.2 Thông tin các trình tự của 2 loài Hoàng liên gai nghiên cứu đăng ký trên Genbank 34 Bảng 3.3: Đặc điểm hình thái hai loài Hoàng liên tại Sa pa - Lào Cai 35 Bảng 3.4: Đặc điểm phân biệt hai loài Hoàng liên 37

Bảng 3.5 Bảng hệ số sai khác xây dựng trên trình tự nucleotit của gen trnL 39

Bảng 3.6: Kết quả khử trùng hạt Hoàng liên gai 46 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến hiệu quả chuyển gen 48 Bảng 3.8: Kết quả ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến hiệu quả chuyển gen 50 Bảng 3.9: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen 53 Bảng 3.10: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen 55 Bảng 3.11: Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai 57

I MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Hoàng liên gai (hay Hoàng mù – Hoàng mộc) Berberis juliane là cây

thảo dược quý hiếm phân bố tại vùng Tây Bắc Việt Nam Hoàng Liên gai mọc nhiều tại Sa Pa - Lào Cai và một số tỉnh thuộc vùng Tây Nam Trung Quốc Hoàng liên gai là vị thuốc được sử dụng từ lâu trong các bài thuốc Đông y chữa các bệnh tiêu hóa như: viêm ruột, tiêu chảy, lỵ, trĩ, viêm túi mật, sốt cao, viêm gan, hoàng đản, viêm ngứa ngoài da, mụn nhọt Thân rễ

Hoàng liên gai chứa nhiều hợp chất alkaloid (5 - 8%), trong đó chủ yếu là

berberin Ngoài ra trong thân rễ Hoàng liên gai còn có worenin, coptisin, palmatin… Các alkaloid trong Hoàng liên gai chia thành 2 nhóm chính: các alkaloid có nhân phenol và các alkaloid không có nhân phenol Các thành

phần alkaloid của Hoàng liên gai đều chứa trong hầu hết các bộ phận của cây

Tuy nhiên ở mỗi bộ phận lại có hàm lượng thay đổi, tùy theo mùa phát triển

của cây Vào tháng 9 - 10, hàm lượng berberin ở thân rễ và rễ nhánh cao, trong khi đó, vào khoảng tháng 10, hàm lượng alkaloid ở lá già trước khi rụng cũng thường cao Trong số các hợp chất alkaloid nói trên, berberin được y học quan tâm đến nhiều nhất, sau đó là palmatin

Hiện nay, số lượng cá thể Hoàng liên gai ngoài tự nhiên suy giảm mạnh

do bị khai thác quá mức Hoàng liên gai được đưa vào danh sách các loài thực vật đang nguy cấp trong Sách Đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá "đang nguy cấp" (Bậc E) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 1) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ để nghiêm cấm khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại Trước tình hình trên, bên cạnh việc nghiên cứu các giá trị y dược của cây Hoàng liên gai

ở Việt Nam, cần đưa ra các phương pháp bảo tồn cũng như khai thác hiệu quả

cây Hoàng liên gai Bên cạnh việc trồng bảo tồn ngoại vi (Ex situ) tại vườn

quốc gia Hoàng liên, việc ứng dựng các kỹ thuật công nghệ sinh học vào quá trình bảo tồn và phát triển bền vững cây Hoàng liên gai theo hướng thu sinh khối tế bào thực vật là một trong những yêu cầu cấp bách và cần thiết

Cùng với xu hướng chung trên thế giới, hướng nghiên cứu công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản xuất những sản phẩm thứ cấp đang bắt đầu được quan tâm phát triển trong nước Hiện có nhiều phương pháp nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật như: nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy huyền phù, nuôi cấy

rễ bất định… Các phương pháp nuôi cấy tế bào cho phép thu lượng lớn tế bào trong thời gian nuôi cấy ngắn hơn, chất lượng đồng đều Bên cạnh đó, sản

lượng ổn định do được nuôi cấy trong điều kiện in vitro, các yếu tố tác động

đến quá trình nuôi cấy đều được kiểm soát, không bị ảnh hưởng bởi các yếu

tố tự nhiên cũng như dịch bệnh

Hiện nay, một số công trình nuôi cấy sinh khối tế bào được áp dụng

trên đối tượng Hoàng liên gai nhằm thu sinh khối tách chiết berberin ứng

dụng trong y dược Đinh Thị Thu Hiền và công sự (2003) đã đưa ra qui trình

tái sinh cây Hoàng liên gai in vitro từ hạt Cây Hoàng liên gai in vitro được sử

dụng làm nguyên liệu cho quá trình tạo và nuôi cấy sinh khối mô sẹo Hoàng

liên gai tạo hợp chất berberin với hàm lượng cao [1] Lại Đức Lưu và công sự

(2013) ứng dụng kỹ thuật khí canh trong nghiên cứu nhân giống và thu sinh khối rễ cây Hoàng liên gai Nhóm tác giả đã thực hiện thu thập, đánh giá hàm lượng berberin và tìm ra chế độ nuôi cấy cũng như môi trường dinh dưỡng phù hợp cho sinh khối rễ Hoàng liên gai phát triển[4]

Tuy nhiên, quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm làm giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng vào trong môi trường nuôi cấy Vấn đề này là một trong

những trở ngại lớn do tồn dư của các chất điều hòa sinh trưởng trong sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến sản phẩm và sức khỏe người sử dụng Tuy nhiên, kỹ thuật nuôi cấy sinh khối rễ tơ ra đời giúp giải quyết các vấn đề khó khăn của hướng nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật hiện tại

Rễ tơ là một bệnh ở thực vật được gây ra quá trình tương tác giữa vi

khuẩn Agrobacterium rhizogenes và tế bào vật chủ Rễ tơ có có khả năng sinh

trưởng nhanh, phát triển tốt trên môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng và có thể nuôi cấy tạo sinh khối liên tục, điều này có ý nghĩa trong dây chuyền sản xuất các hợp chất thứ cấp hay các dược phẩm sinh học tái tổ hợp

Rễ tơ có thể sản xuất một lượng lớn các hợp chất thứ cấp và là cơ quan biệt hóa nên rễ tơ có sự di tuyền ổn định hơn nuôi cấy tế bào huyền phù hay nuôi cấy sinh khối mô sẹo

Xuất phát từ các ưu điểm trên và do hợp chất dược lý quý của cây

Hoàng liên gai chủ yếu thu được từ rễ, tôi đã thực hiện đề tài “ Nghiên cứu

tạo rễ tơ của cây Hoàng liên gai (Berberis juliane) cho mục tiêu nuôi cấy sinh khối dược liệu” Công trình này được thực hiện tại Phòng Công nghệ Tế

bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2 Đối tượng nghiên cứu

Cây Hoàng liên gai (Berberis Juliane) thuộc chi Hoàng liên Berberis,

một loài thảo dược quý hiếm được sử dụng rộng rãi trong các bài thuốc y học

cổ truyền Thành phần chủ yếu của Hoàng liên gai là berberin, một hoạt chất

được ứng dụng trong điều trị các bệnh về hệ tiêu hóa

Mẫu vật nghiên cứu bao gồm quả, lá của cây Hoàng liên gai phân bố trong tự nhiên được thu thập tại tại vườn quốc gia Hoàng liên, địa phận huyện

Sa Pa tỉnh Lào Cai

3 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc tạo sinh khối cây Hoàng liên gai làm nguyên liệu dược bằng công nghệ nuôi cấy rễ tơ

4 Nội dung nghiên cứu

4.1 Thu thập và nhận dạng mẫu cây Hoàng liên gai bằng chỉ thị phân tử

Hoàng Liên tại địa phận tỉnh Sa Pa, tỉnh Lào Cai

- Nhận dạng các loài Hoàng liên gai thu thập được thông qua đặc điểm hình thái

liên gai

- Bước đầu đưa ra các chỉ thị đặc hiệu cho việc nhận dạng cây Hoàng liên gai trong tự nhiên bằng phương pháp chỉ thị phân tử sử dụng kỹ thuật

DNA Barcoding

4.2 Đưa mẫu cây Hoàng liên gai vào nuôi cấy in vitro

Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu hạt Hoàng liên gai và kỹ thuật

nuôi cấy Hoàng liên gai in vitro tạo nguyên liệu cho các nghiên cứu chuyển

gen tạo rễ tơ

4.3 Nghiên cứu tối ưu quy trình chuyển gen sử dụng Agrobacterium rhizogenes, bước đầu tạo một số dòng rễ tơ Hoàng liên gai

tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai qua phương pháp biểu hiện tạm thời với gen chỉ

thị GusA

- Bước đầu tạo một số dòng rễ tơ Hoàng liên gai

5 Phương pháp nghiên cứu

- Nghiên cứu ngoài thực địa: Đánh giá đặc điểm hình thái, phân bố,

điều kiện sinh sống của cây Hoàng liên gai tại địa phận Sa Pa – Lào Cai

- Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm: Thực hiện các thí nghiệm trọng điều kiện in vitro tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ

Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

6 Ý nghĩa khoa học

Việc xác định được chỉ thị phân tử đặc hiệu cho loài Hoàng liên gai sẽ đưa ra cơ sở khoa học vững chắc cho việc nhận dạng loài Hoàng liên gai

trong tự nhiên cũng như các loài khác nhau trong chi Berberis

Hoàn thiện quy trình chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai qua vi

khuẩn Agrobacterium rhizogenese cung cấp cơ sở khoa học cho quá trình

chuyển gen tạo rễ tơ trên các đối tượng loài khác thuộc chi Hoàng liên

Xây dựng quy trình chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai tạo tiền

đề cho nuôi cấy thu sinh khối rễ tơ trên qui mô bioreactor, nhằm thu lượng

lớn sinh khối Hoàng liên gai phục vụ cho các lĩnh vực y dược

II NỘI DUNG Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về cây Hoàng liên gai

1.1.1 Phân bố địa lý

Hoàng liên gai (Berberis juliane) là cây thảo dược phân bố nhiều tại

vùng Tây Bắc Việt Nam và Tây Nam Trung Quốc (tây Vân Nam, nam Tây Tạng), nên Trung Quốc còn gọi Hoàng liên gai là Vân Nam Hoàng liên) Hoàng liên gai nguyên gốc mọc ở tỉnh Lào Cai (huyện Sa Pa), trên dãy núi cao Hoàng Liên Sơn, vùng núi cao từ 1000 – 2500m Hoàng liên gai ưa đất nhiều màu trên núi cao mưa nhiều ẩm ướt, lớp đất mùn ở trên càng dày càng tốt, cây ưa mát lạnh, sợ nóng, khô, nơi trồng thích hợp là khe núi, sườn dốc,

đủ ánh sáng, thoát nước

Hiện nay, Hoàng liên gai được trồng giữ giống tại Trạm dược liệu Sa

Pa (Lào Cai) nhằm bảo vệ nguồn gen, nghiên cứu các hình thức nhân và phát triển giống cây trồng

1.1.2 Phân loại

Giới : Thực vật - Plantate

Ngành: Ngọc Lan - Magnoliophyta

Lớp: Ngọc Lan - Magnoliopsida

Bộ : Mao lương - Ranunculales

Họ : Hoàng liên gai - Berberidaceae

Chi: Hoàng liên gai Berberis

Loài : Hoàng Liên gai

1.1.3 Hình thái và đặc điểm sinh thái

- Đặc điểm hình thái: Cây bụi, cao 2 - 3 m; thân và rễ có màu vàng

đậm; phân cành nhiều; có gai chia thành 3 nhánh, mọc dưới các túm lá Lá mọc vòng 3 - 7 cái, cuống lá ngắn; phiến lá cứng, thuôn, nhọn 2 đầu, hơi bóng ở mặt trên, kích thươc lá khoảng 3 - 9 cm x 1,2 - 2,5 cm, mép lá có răng cưa nhỏ, đều và nhọn

Hoa nhiều, gồm 10 - 30 mọc ở giữa các túm lá Hoa nhỏ, có cuống dài 1,3 cm, màu vàng, mẫu 3; tổng bao 3, hình mác rộng Đài hoa, hình trứng ngược xếp thành 2 vòng, những vòng trong lớn hơn vòng ngoài Cánh hoa, nhỏ hơn đài, hình trứng thuôn, đỉnh lõm, gốc có 2 tuyến nhầy Nhị hoa, ngắn hơn cánh hoa; bao phấn hình trứng Bầu hình trụ, hơi phình ở giữa noãn[2] Quả hình trứng thuôn, dài 0,5 cm; đầu nhuỵ tồn tại rõ; khi chín màu tím đen, hơi có phấn trắng Hạt, gần hình trụ, màu nâu nhạt

1 Đặc điểm sinh thái:Mùa hoa tháng 3-4 quả tháng 4-10 (11) Khối

lượng 1.000 hạt: 20,12 gam; tỷ lệ nảy mầm của hạt khi gieo 38,1%; thời gian nảy mầm từ 38-60 ngày Cây con nảy mầm từ hạt trong tự nhiên quan sát được vào tháng 4 và 5 Có khả năng tái sinh sau khi bị chặt phát Cây ưa ẩm, chịu bóng khi còn nhỏ, sau ưa sáng; thích nghi với vùng có khí hậu á nhiệt đới núi cao Thường mọc rải rác ở rừng cây bụi núi đá vôi, ở độ cao 1500 –

1600 m

- Tình trạng: Phân bố hẹp, số lượng cá thể hiện có không nhiều; Điểm

phân bố ở núi Hàm Rồng đã bị tàn phá (còn vài cây); Điểm ở Ô Quí Hồ đang

bị đe doạ (gần nơi khai thác đá) Đã từng bị khai thác thu mua, nguy cơ bị tuyệt chủng cao[2],[7],[8]

1.1.4 Tác dụng dược lý của cây Hoàng liên gai

Theo Đông y, Hoàng liên gai vị đắng, lạnh; có tác dụng tả hóa giải độc, thanh tâm nhiệt, táo tỳ thấp, trị tiêu hoá không tốt, viêm ruột, hạ lỵ, đau bụng nôn mửa, trị đau mắt đỏ, tổn thương mí mắt; tiết tả ra máu mủ lâu ngày, trừ thuỷ, lợi xương ích mật, mồm miệng bị nhiệt lở loét…

Còn theo y khoa hiện đại, thành phần hoá học có trong Hoàng liên gai

gồm 7 loại alkaloid, chủ yếu là chất berberin, panmatin, coptisin, worenin,

columbamin Berberin là thành phần chủ yếu trong cây Hoàng liên gai Tác

dụng chính của berberin là chống các loại vi khuẩn, ký sinh trùng đường ruột

gây hại cho cơ thể mà không ảnh hưởng tới hoạt động của các vi sinh vật có

lợi của đường tiêu hóa Berberin còn được bào chế thành thuốc nhỏ mắt điều

trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do các yếu tố kích ứng từ môi trường hoặc do

đau mắt hột gây nên Berberin có khả năng ngăn ngừa sự lây lan của nấm, bột nhiễm nấm, chống lại tác hại của vi khuẩn tả, E.Coli Khi dùng kết hợp với kháng sinh thì berberin còn có khả năng hạn chế lại tác dụng không mong

muốn của các loại kháng sinh là diệt hệ vi sinh vật có lợi trong hệ tiêu hóa [2]

Ở một số nước công nghiệp phát triển, Berberin được sản xuất với quy

mô lớn bằng phương pháp công nghệ sinh học nuôi cấy mô Berberin có tác dụng kháng khuẩn với shigella, tụ cầu và liên cầu khuẩn Những năm gần đây, một số nghiên cứu mới nhất ở nước ngoài đã xác định berberin có tác

dụng chống lại nhiều loại vi khuẩn gram dương, gram âm và các vi khuẩn kháng axit Ngoài ra, nó còn có tác dụng chống lại một số nấm men gây bệnh

và một số động vật nguyên sinh

Đặc biệt khi dùng berberin điều trị các nhiễm trùng đường ruột sẽ

không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở ruột Các nghiên cứu gần đây cũng chứng minh: Khi dùng một số thuốc kháng sinh

nếu phối hợp với berberin sẽ hạn chế được tác dụng phụ gây ra bởi các thuốc

kháng sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột Bởi vậy, berberin đang được

chú ý phát triển ở nhiều nước

Thông thường, khi nhắc đến berberin, hầu hết chúng ta đều nghĩ ngay

đến tác dụng hữu hiệu của nó trên đường tiêu hóa Nhưng nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy, hoạt chất này còn đóng một vai trò quan trọng trong việc

giảm cholesterol, ngăn ngừa bệnh mạch vành và cải thiện chức năng tim Các nhà khoa học phát hiện hoạt chất berberin có vai trò tích cực trong việc bảo

vệ thành mạch, ngăn ngừa hình thành mảng xơ vữa Do nó tác động lên lớp nội mạc mạch máu (lóp lót trong lòng mạch máu) và lớp tế bào cơ trơn thành mạch nên làm tăng độ đàn hổi và dẻo dai cho thành mạch; ngăn chặn phản ứng viêm, chống lại việc hình thành mảng xơ vữa từ những giai đoạn đầu tiên

Berberin tạo được mối quan tâm với các nhà dược học trong chuyển

hóa lipid thông qua quá trình ức chế tổng hợp Cholesterol và Triglycerid tại gan Thực tế, từ năm 2004, nhiều nước phương Tây đã ứng dụng berberin trong điều trị tăng lipid máu (mỡ trong máu) Các nghiên cứu đã đánh giá hiệu quả của hoạt chất này tương đương với statin - một nhóm thuốc hạ mỡ máu phổ biến hiện nay Đồng thời, việc kết hợp berberin với simvastatin trong điều trị mỡ máu giúp giảm đáng kể nồng độ LDL-c máu, Cholesterol toàn phần cũng như Trigicerid, hơn hẳn so với việc sử dụng Simvastatin đơn

độc

Bên cạnh những tác dụng trên mạch máu, nhiều nghiên cứu đã chứng

minh vai trò của berberin trong việc tăng cường sự dẻo dai của trái tim

Nghiên cứu được thực hiện tại Trung Quốc đã mở ra hy vọng mới cho những người bệnh mắc chứng phì đại cơ tim và suy tim mạn tính bởi hoạt chất này

có khả năng ức chế phì đại cơ tim, cải thiện các chỉ số về sức co bóp, khả năng giãn nở của cơ tim và điều chỉnh hoạt động của thần kinh giao cảm tại tim

Một nghiên cứu khác tại Trung Quốc trên bệnh nhân suy tim sung huyết hoặc thiếu máu cơ tim vô căn cho thấy, việc bổ sung hoạt chất này vào phác đồ điều trị chuẩn có sự cải thiện đáng kể chức năng thất trái, tăng khả năng hoạt động thể lực, biểu hiện khó thở, mệt mỏi cũng cải thiện rõ rệt

Từ những kết quả khả quan bước đầu, hiện berberin vẫn là đích đến

của nhiều nghiên cứu để ứng dụng sản xuất thuốc điều trị bệnh tim mạch

trong tương lai Việc sử dụng berberin đơn độc cho bệnh tim mạch vẫn còn

trong quá trình thử nghiệm và cần có khuyến cáo từ các nhà dược học trên thế giới

Khi nghiên cứu tác dụng dược lý của họ Hoàng liên, các nhà khoa học

đã chứng minh được vai trò của họ Hoàng liên trong việc điều trị một số loại bệnh như:

+ Tác dụng kháng khuẩn: Hoàng liên và 1 trong các hoạt chất của nó là berberin, có phổ kháng khuẩn rộng trong thí nghiệm Có tác dụng ức chế

mạnh đối với Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis và

Staphylococcus aureus Thuốc có tác dụng ức chế mạnh đối với khuẩn gây lỵ

nhất là Shigella dysenteriae và S.flexneri Thuốc có hiệu quả hơn thuốc Sulfa nhưng kém hơn Streptomicine hoặc Chloramphenicol Thuốc không có tác dụng đối với Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa và Salmonella

paratyphi Nước sắc Hoàng liên có hiệu quả đối với 1 số vi khuẩn phát triển

mà kháng với Streptomicine, Chloramphenicol và Oxytetracycline

hydrochloride Nhiều báo cáo khác cho thấy độ hiệu quả khác biệt của Hoàng

liên đối với vi trùng lao, nhưng không có tác dụng giống như thuốc INH Hoạt chất kháng khuẩn của Hoàng liên thường được coi là do berberin Khi sao lên thì lượng berberin kháng khuẩn thấp đi

+ Tác dụng kháng virus: Thí nghiệm trên phôi gà chứng minh rằng

Hoàng liên có tác dụng đối với nhiều loại virus cúm khác nhau và virus

Newcastle

+ Tác dụng chống nấm: Trong thí nghiệm, nước sắc Hoàng liên có tác

dụng ức chế nhiều loại nấm Nước sắc Hoàng liên và berberin tương đối có tác dụng mạnh diệt Leptospira

+ Tác dụng chống ho gà: Kết quả nhiều nghiên cứu về tác dụng của

Hoàng liên đối với ho gà có khác nhau Một nghiên cứu cho thấy trong thí

nghiệm tập trung Hoàng liên ức chế sự phát triển của Hemophilus pertussis cao hơn Streptomycine hoặc Chloramphenicol, ít nhất là thuốc có tác dụng

lâm sàng Tuy nhiên, nghiên cứu khác trên heo Hà Lan, cho uống Hoàng liên thì lại không làm giảm tỉ lệ tử vong

+ Tác dụng hạ áp: Chích hoặc uống dịch chiết berberin cho mèo, chó

và thỏ đã được gây mê và chuột không gây mê thấy huyết áp giảm Liều lượng bình thường, hiệu quả không kéo dài, liều lập lại cho kết quả không cao hơn Hiệu quả này xẩy ra dù tác dụng trợ tim ảnh hưởng đến lượng máu tim gây nên bởi liều thuốc này Huyết áp giảm dường như liên hệ với việc tăng dãn mạch, cũng như có sự gia tăng đồng bộ ở lách, thận và tay chân

+ Tác dụng nội tiết: Berberin cũng có tác dụng kháng Adrenaline Thí

dụ: đang khi berberin làm hạ áp thì phản xạ tăng – hạ của Adrenalin giảm rất nhiều nhưng phụ hồi lại nhanh Berberin cũng dung hòa sự rối loạn của

Adrenaline và các hợp chất liên hệ

+ Tác dụng đối với hệ mật: Berberin có tác dụng lợi mật và có thể làm

tăng việc tạo nên mật cũng như làm giảm độ dính của mật Dùng berberin rất

hiệu quả đối với những bệnh nhân viêm mật mạn tính

+ Tác dụng đối với hệ thần kinh trung ương: Berberin dùng liều nhỏ có

tác dụng kích thích vỏ não, trong khi đó, liều lớn lại tăng sự ức chế hoạt động của vỏ não

+ Tác dụng kháng viêm: Lịch sử nghiên cứu chất Granulomas gây ra

bởi dầu cotton trên chuột nhắt cho thấy chất berberin làm gia tăng đáp ứng kháng viêm của thể Chất Ethanol chiết xuất của Hoàng liên có tác dụng kháng viêm khi cho vào tại chỗ, nó làm cho chất Granulomas co lại Hiệu quả này giống như tác dụng của thuốc Butazolidin (http://thuocdongduoc.vn/cay-

lý và sử dụng các phương pháp khoa học để khai thác bền vững nguồn tài nguyên này

Hoàng liên gai được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá "đang nguy cấp" (Bậc E) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 1) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ để nghiêm cấm khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại Bảo vệ những cá thể còn sót lại ở núi Hàm Rồng Trồng được bằng hạt hay cành chiết Khuyến khích người dân trồng làm hàng rào vườn và

nương rẫy Trồng bảo tồn ngoại vi (Ex situ) ở vườn Trạm nghiên cứu trồng

cây thuốc Sapa (Viện Dược liệu) [2],[7].Trước tình hình trên, cần sớm nghiên

cứu áp dụng kỹ thuật nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật tạo nguồn nguyên liệu

ổn định, đáp ứng yêu cầu làm thuốc

1.2 Tổng quan về nuôi cấy sinh khối rễ tơ

1.2.1 Giới thiệu về nuôi cấy sinh khối tế bào

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật đóng góp nhiều cho tiềm năng khai thác các hợp chất có giá trị trong y học mà chỉ có thể có ở thực vật Vài năm trở lại đây, những hoạt chất sinh học từ thực vật được sử dụng như một nguồn dược liệu giá trị Những chất này thường được sản xuất với một lượng rất nhỏ trong tế bào thực vật [5] Để đáp ứng nhu cầu về dược phẩm, các nhà khoa

học đã đưa giải pháp nuôi cấy sinh khối (biomass) tế bào thực vật, nhằm thu

hoạt chất dược với trữ lượng lớn

Phương pháp này hoạt động trên cơ sở về tính toàn thể của tế bào Phương diện về di truyền cũng như hóa sinh của tế bào thực vật khi gặp điều kiện tương ứng sẽ biểu hiện các tính trạng như một cá thể hoàn chỉnh Có nhiều nghiên cứu cho thấy sản phẩm trao đổi chất được sản xuất theo phương pháp sinh khối cho chất lượng cũng như số lượng cao hơn ở cá thể cây hoàn chỉnh Các nhóm chất thường được sản xuất theo phương pháp này là các

alkaloid, tinh dầu và hợp chất glycosid Các loại vật liệu được nuôi cấy có thể

là: tế bào đơn, mô sẹo, protoplast hoặc nuôi cấy rễ

Cho đến nay, rất nhiều hoạt chất nguồn gốc thực vật có giá trị kinh tế cao là sản phẩm của nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật: Các hoạt chất dùng

trong dược phẩm như caffein thu được từ nuôi cấy tế bào Coffea arabica [26],

betalain từ mô sẹo của cải đường, berberine từ cây Coptis Japonica (loài cây

này phải trồng từ 4 - 6 năm mới thu được hàm lượng berberine đáng kể trong

rễ, trong khi hàm lượng này có thể thu được sau 4 tuần nuôi cấy bằng sinh khối tế bào thực vật)[27]

Các hoạt chất dùng trong thực phẩm: các chất tạo màu (anthocyanin,

crocin), các chất tạo mùi (vani, mùi hành và mùi tỏi) Một số chất khác như: shikonin (chất có khả năng diệt khuẩn), paclitaxel (sản phẩm của nuôi cấy

sinh khối tế bào thông đỏ), nuôi cấy sinh khối tế bào bằng hệ thống bioreactor

10.000 lít trong sản xuất reserpine (alkaloid chiết xuất từ cây Ba gác có tác

dụng chữa bệnh cao huyết áp và rối loạn tuần hoàn máu) có thể sản xuất được 3.500 kg resperin trong thời gian 30 ngày nuôi cấy

Đinh Thị Thu Hiền và cộng sự (2003) đã nghiên cứu thành công quy trình nhân nhanh sinh khối mô sẹo của cây Hoàng liên gai nhằm sản xuất

nguồn dược liệu berberine, thay thế nguồn tự nhiên đang ngày càng khan

hiếm Với quy trình này, sau khoảng 3 - 4 tuần nuôi cấy mô của cây Hoàng liên gai, có thể thu được một lượng mô lớn gấp hàng chục lần lượng ban đầu[1]

Tuy nhiên trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật các chất điều hòa sinh trưởng thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm làm giảm hoặc mất tính biệt hóa ở các mô tế bào nuôi cấy Việc làm này sẽ dẫn tới có sự tồn dư của các chất điều hòa sinh trưởng trong sinh khối

tế bào nuôi cấy gây ảnh hưởng đến ức khỏe người sử dụng và tính an toàn của sản phẩm Tuy nhiên, vấn đề này có thể khắc phục được thông qua nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ, bởi rễ tơ có khả năng sinh trưởng cao và đặc biệt có thể sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường không cần bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng [17]

1.2.2 Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes – Phương pháp tạo rễ

tơ ở tế bào thực vật

Hình 1.2: Một số bênh ở thực vật gây ra bởi Agrobacterium sp

a)Agrobacterium sp b) Bệnh khối u ở thực vật, c) Bệnh rễ tơ ở thực vật

Agrobacterium sp thuộc nhóm vi khuẩn đất, gram âm, được biết đến từ

rất lâu trong nông nghiệp với vai trò là vi khuẩn cố định đạm, cung cấp nguồn

nitơ cho cây trồng Agrobacterium được phân loại dựa trên những căn bệnh

mà chúng gây ra trên thực vật hai lá mầm Agrobacterium gồm 4 nhóm chính:

Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rubi là hai nhóm gây bệnh khối u

(crowwn gall) ở thực vật; nhóm Agrobacterium rhizogenes gây bệnh mọc rễ

tơ (hairy roots) tại các vết thương của cây; nhóm Agrobacterium radiobacter

không gây bệnh trên thực vật[10] Trong những thập kỉ gần đây thì các nhà

khoa học đã chú ý đến vai trò của hai loài vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

và Agrobacterium tumefaciens trong mục đích chuyển gen vào thực vật

Chúng được xem như là các “kĩ sư trao đổi chất”, được áp dụng để chuyển gen vào tế bào thực vật nhằm mục đích đẩy mạnh quá trình sinh tổng hợp ra

các hợp chất thứ cấp cần thiết Khả năng gây bệnh của Agrobacterium sp đã được chứng minh là do sự có mặt của pTi (plasmid tumor induction) ở

Agrobacterium tumefaciens và pRi (plasmid root induction) ở Agrobacterium rhizogenes

Agrobacterium rhizogenes, tên khoa học khác là Rhizobium rhizogenes,

là một loài vi khuẩn đất gram âm, thuộc họ Rhizobiaceae nằm trong bộ

Rhizobiales cố định đạm Chúng có khả năng nhận biết được các phân tử tín

hiệu từ các tế bào thực vật bị tổn thương và tấn công vào vị trí đó [12],[36]

1.2.3 Cơ chế chuyển các gen vùng T – DNA vào tế bào thực vật

Khi các vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes nhiễm vào viết thương của

thực vật thì chúng sẽ chuyển gen của chúng vào các tế bào thực vật tại vị trí

đó Các gen được chuyển từ Agrobacterium rhizogenes vào bộ gen của tế bào thực vật được gọi tên là T- DNA (transfer DNA) T-DNA sau khi chuyển vào

thì sẽ được gắn ổn định vào bộ gen của thực vật Tuy nhiên các gen mã hóa T-DNA có nguồn gốc từ vi khuẩn nhưng nó có mang các trình tự điều tiết ở

Eukaryote nên có thể biểu hiện được trong tế bào thực vật Vùng T-DNA này

trong một plasmid lớn của Agrobacterium rhizogenes và plasmid này được đặt tên là Ri-plasmid (root inducing plasmid) do A.rhizogenes có khả năng

cảm ứng tạo rễ bất định [23]

Hình 1.3: Cấu trúc Ri - plasmid

Ri-plasmid được chia thành 2 nhóm chính là agropine và mannopine,

vi khuẩn A.rhizogenes chứa Ri-plasmid thuộc loại agropine được sử dụng chủ

yếu cho quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật để cảm ứng tạo rễ tơ

Ri-plasmid được chia thành nhiều vùng như vùng gây độc (gọi tắt là vùng

vir-virulence)), vùng chuyển gen (T-DNA), vùng ori (vùng mã hóa chức năng tái

bản và khởi điểm tái bản), vùng phiên mã … chỉ có đoạn T-DNA của plasmid mới được chuyển vào bộ gen của thực vật và sự chuyển gen này thông qua sự

hỗ trợ bởi các đoạn gen trong vùng vir của Ri-plasmid Vùng vir chiếm khoảng 35 kb trong Ri-plasmid và mã hóa 6 locus phiên mã cho các protein (vir A, B, C, D, F, G ), có chức năng quan trọng trong quá trình chuyển gen [30] Sự phiên mã của vùng vir được cảm ứng với nhiều hợp chất thuộc nhóm

phenol, điển hình là acetosyringone – hợp chất liên quan được xác định là có

vai trò làm tăng tần số của quá trình chuyển gen thông qua Agrobacterium ở

nhiều loài thực vật Nhiều loại đường cũng đóng vai trò như chất bổ trợ hoạt

động cho acetosyringone để cảm ứng sự biểu hiện của gen vir ở mức độ

cao[29]

Nhìn chung cơ chế quá trình xâm nhiễm và cơ chế phân tử của quá

trình vận chuyển T-DNA vào tế bào vật chủ của vi khuẩn A.tumefaciens và

A.rhizogenes được chứng minh là tương tự nhau [36] Tuy nhiên sự hình

thành khối u ở vi khuẩn A.tumefaciens do gen mã hóa sinh tổng hợp auxin quy định Trong khi đó, các gen mã hóa sinh tổng hợp auxin ở vi khuẩn

A.rhizogenes có vai trò rất nhỏ trong quá trình hình thành rễ tơ ở thực vật

[12],[36]

T-DNA ở Ri-plasmid của nhóm agropine bao gồm 2 vùng chính là

vùng biên trái TL-DNA và biên phải TR-DNA Hai vùng này đều có kích thước khoảng 15 – 20 kb và được xen kẽ bởi 1 đoạn DNA, đoạn DNA này sẽ

được chuyển vào hệ gen của tế bào vật chủ Vùng TR-DNA mang các gen mã

hóa sinh tổng hợp auxin (tms1 và tms2), vùng TL-DNA bao gồm 18 khung

dọc (ORFs), trong đó có 4 locus 10, 11, 12 và 15 mã hóa cho rolA, B, C và D (root locus), Các Ri-plasmid của các chủng A.rhizogenes thuộc nhóm

mannopine, cucumopine và milimopine chứa vùng T-DNA đơn, có cấu trúc

rolD [16] Các gen rolA, rolB và rolC đóng vai trò quan trọng trong quá trình

tạo rễ tơ ở mô tế bào thực vật Sự biểu hiện đồng thời của 3 gen này gây lên kiểu hình rễ tơ ở mô tế bào thực vật bị xâm nhiễm Các rễ tơ này có khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh hơn rất nhiều so với rễ bình thường Trong 3

gen rol trên, gen rolB đóng vai trò quan trọng hơn cả, khi gen rolB được biểu

hiện, mô tế bào thực vật đã cảm ứng tạo kiểu hình rễ tơ, trong khi đó bất hoạt

gen rolB không tạo được kiểu hình rễ tơ [11]

Hình 1.4: Cơ chế chuyển gen của Agrobacterium sp (nguồn : www.zbook.vn)

1.2.4 Nuôi cấy sinh khối rễ tơ

Rễ tơ là tên gọi dùng để chỉ các rễ bất định được sản sinh ra mạnh mẽ

tại vị trí bị nhiễm bởi vi khuẩn A.rhizogenes T-DNA từ A.rhizogenes sau khi

chuyển vào tế bào thực vật thì chúng sẽ được gắn vào bộ gen của thực vật, từ

đó tế bào thực vật sẽ làm nhiệm vụ biểu hiện các gen rol và gen aux ( tổng

hợp ra các IAA) làm tăng khả năng tạo các lông rễ một cách mạnh mẽ ngay tại vị trí bị tổn thương ở mô thực vật đó Số lượng các lông rễ được tạo ra khá nhiều, phát triển thành một hệ thống lông rễ, hay còn gọi là hệ thống rễ tơ [36]

Hình 1.5 Các hệ rễ tơ được nuôi cấy

1 Rễ tơ Beta vulgaris phát triển trên môi trường agar

2 Rễ tơ của cây đậu phộng (Arachis hypogaea)

3 Rễ tơ G glabra nuôi trong môi trường lỏng

4 Nuôi cấy rễ tơ G.glabra bằng hệ thống bioreactor (a); thu hoạch

sinh khối rễ sau 30 ngày nuôi cấy (b,c)

Điểm đặc trưng nổi bật của hệ thống tễ tơ là chúng có khả năng phát triển nhanh và ổn định trên môi trường nuôi cấy không cần bổ sung chất điều

hòa sinh trưởng thực vật, với sự chuyển gen của A rhizogenes vào tế bào rễ tơ

có khả năng tổng hợp ra nhiều loại hợp chất tự nhiên với hiệu suất cao mà các

tế bào không phân hóa và các rễ bất định không chuyển gen không tổng hợp được hay tổng hợp với hàm lượng không đáng kể [36]

Ứng dụng của nuôi cấy sinh khối rễ tơ

Công nghệ nuôi cấy rễ tơ đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhờ vào những ưu điểm của mình Rễ chuyển gen có đặc tính

là tốc độ sinh trưởng nhanh và tính di truyền ổn định Rễ tơ có thể sản xuất một lượng lớn hợp chất thứ cấp hay hàng loạt hợp chất có liên quan tới thực vật

Sản xuất hợp chất thứ cấp

Thông thường, nuôi cấy rễ cần có sự xuất hiện của các chất điều hòa sinh trưởng ngoại sinh, hay là sự có mặt của các chất này trong môi trường nuôi cấy Phương pháp nuôi cấy rễ này tạo các dòng rễ sinh trưởng rất chậm

và có thể dẫn đến tình trạng thiếu hụt hay tổng hợp kém các hoạt chất thứ cấp Tuy nhiên, rễ tơ đã cải tiến công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật trong thu nhận các hợp chất có giá trị sinh học cao Rễ tơ cũng đã cung cấp một nguồn hóa chất thiên nhiên dồi dào cho các ngành công nghiệp dược phẩm, hóa mỹ phẩm và phụ gia thực phẩm [9]

Kim và cs (2009) đã sử dụng 3 chủng A.rhizogenes là R1000, A4 và

ATCC 15834 cảm ứng với loài Taxus cuspidata và thu nhận được 107 dòng rễ

tơ Trải qua quá trình sàng lọc cho 3 dòng rễ tơ có thể sinh trưởng tốt trên môi trường MS không chất điều hòa sinh trưởng, và có khả năng sinh tổng hợp taxol - một hợp chất có công dụng mạnh trong điều trị ung thư [22]

Bảng 1.1: Một số loài thực vật được nuôi cấy rễ tơ để thu hoạt chất sinh

học[19]

Artemisia annua Artemisinin

Panax hybird Ginsenosides

Rễ tơ được xem như là muột nguồn nguyên liệu có giá trị trong sản xuất các hợp chất tự nhiên có lợi như dược phẩm, các chất phụ gia trong ngành mỹ phẩm và thực phẩm Vào năm 2002, Sevon đã tổng kết lại những hợp chất ankaloid quan trọng nhất trong ngành được sản xuất bởi hệ thống rễ

tơ, bao gồm A.tropabelladonna L., Catharanthus tricophyllus L., và Datura

củadida L [36] Nhờ vào những đặc điểm như phát triển nhanh, dễ duy trì ổn

định và khả năng tổng hợp một số lượng lớn hợp chất tự nhiên, hệ thống rễ tơ thể hiện tiềm năng lớn trong việc sản xuất các hợp chất tự nhiên thông qua các hệ thống nuôi cấy liên tục Điều này có ý nghĩa lớn trong việc sản xuất các sản phẩm hợp chất tự nhiên trên quy mô công nghiệp với hiệu xuất cao, giảm chi phí trong quá trình sản xuất từ đó giảm giá thành sản phẩm

Bên cạnh việc chuyển T-DNA của A.rhizogenes vào tế bào thì ta có thể

chuyển các gen ngoại lai vào trong tế bào thông qua việc tái tổ hợp đoạn gen

đó vào trong đoạn T-DNA của A.rhizogenes Các gen này có thể là gen biểu hiện ra các hợp chất mục tiêu hay có thể là các gen mã hóa các enzyme chìa

khóa trong con đường sinh tổng hợp ra các chất tự nhiên mong muốn Phương pháp này có thể giúp ta điều khiển hay định hướng cho quá trình sinh tổng hợp các chất tự nhiên ở rễ tơ để tổng hợp ra một loại hợp chất tự nhiên với hàm lượng cao Nghiên cứu của Lodhi (1996) đã chứng minh hàm lượng

anthraquinone và alizarin trong hệ thống nuôi cấy rễ tơ của Rubia peregrina

L tăng cao khi gắn đoạn gen mã hóa ra enzyme izochorismate synthase vào đoạn T-DNA; và theo Banerjee (2002) thì rễ tơ của A.belladonna được

chuyển gen P450 2E1 thể hiện khả năng tổng hợp chất tự nhiên với mức độ

rất cao [31]

Tại Hàn Quốc, một số công ty đang sản xuất rễ tơ nhân sâm với bioreactor có dung tích 10.000 đến 20.000 lít Sản phẩm này được làm nguyên liệu cho các dạng thực phẩm chức năng và thực phẩm khác nhau trên thị trường Đã có rất nhiều nghiên cứu thành công trong tạo các hoạt chất từ nuôi cấy sinh khối rễ tơ [5],[6]

Với tiềm năng to lớn của hệ thống rễ tơ, các hệ thống rễ tơ của nhiều loài thực vật đã được nghiên cứu rộng rãi cho mục đích sản xuất hợp chất tự

nhiên in vitro Đặc biệt là những cây thuốc có ứng dụng lớn cho việc chữa

bệnh

Ứng dụng của rễ tơ trong phân tích chức năng của gen

Rễ tơ không chỉ được ứng dụng để sản xuất hợp chất thứ cấp mà còn được sử dụng trong các thí nghiệm nghiên cứu chức năng gen Các đoạn gen

chức năng được tái tổ hợp với gen chỉ thị gus, hoặc chỉ thị bằng huỳnh quang

và được đưa vào A.rhizzogenes để chuyển vào thực vật Thông qua quá trình biểu hiện của gen chỉ thị gus mà các gen chuyển vào rễ tơ được nghiên cứu chức năng Một ví dụ là gen gus kết hợp với promotor alcohol dehydrogenase

(Adh) và được chuyển vào rễ tơ đậu nành Chức năng của promotor được nghiên cứu dưới các điều kiện môi trường như: nhiệt độ thấp, thiếu khí, bị tổn

thương và xử lý acid abscisic Tất cả các chức năng đều được nghiên cứu thông qua sự biểu hiện của gen gus [47]

Biểu hiện protein ngoại lai

Rễ tơ còn được dùng để biểu hiện các protein công nghiệp và các loại protein chức năng Nhờ vào khả năng chuyển một đoạn gen ngoại lai vào thực

vật, A.rhizogenes đã được thiết kế mang các vector tái tổ hợp để có thể biểu

hiện các loại protein trong rễ tơ Các gen ngoại lai này được gắn kết vào

genome thực vật và ổn định về mặt di truyền nên khả năng biểu hiện không bị

suy giảm Ryan (2008) đã tạo thành công dòng rễ tơ mang gen mã hóa cho

acetylcholinesterase- một protein có khả năng xử lý các hợp chất phosphat

gây độc cho cơ thể Các dòng rễ này tuy tăng trưởng chậm nhưng có hàm

lượng acetylcholinesterase lên tới 3,3% hàm lượng protein tổng số [33] Mặt

khác, các nghiên cứu cho thấy có thể tạo rễ tơ mang cấu trúc kháng thể ở người hay cấu trúc vỏ protein của các virus gây bệnh nhằm bước đầu tạo nguồn vaccine thực vật Sharp (2001) đã thành công trong việc tạo dòng rễ tơ thuốc lá mang kháng thể đơn dòng IgGI ở người[38]

Với tiềm năng và khả năng ứng dụng to lớn của mình, hệ thống rễ tơ của nhiều loài thực vật đã được nghiên cứu rộng rãi cho mục đích sản xuất các hợp chất tự nhiên in vitro, đặc biệt là những cây thuốc có ứng dụng lớn cho việc chữa bệnh Bên cạnh đó, rễ tơ còn là một công cụ hữu hiệu trong các nghiên cứu về gen hay công nghệ protein

1.3 Các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị DNA vào việc xác định loài

Trong nghiên cứu này, việc thu thập các nguồn mẫu cây Hoàng liên gai ngoài tự nhiên làm nguyên liệu cho nuôi cấy là một việc cần thiết Tuy nhiên nguồn nguyên liệu ngoài tự nhiên nếu chỉ dựa vào hình thái và kinh nghiệm dân gian đôi khi dễ nhầm lẫn với những đối tượng cây có hình thái tương tự sống tại cùng một khu vực Điều này có ảnh hưởng không nhỏ đến nghiên cứu Do đó việc nhận dạng các mẫu cây ngoài tự nhiên bằng phương pháp sinh học phân tử sẽ mang ý nghĩa rất quan trọng

Trong vài thập kỷ gần đây, sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp

và kỹ thuật sinh học phân tử đã tạo ra các công cụ hữu hiệu cho các nghiên cứu sự sống ở mức độ phân tử Các kỹ thuật sinh học phân tử cũng nhanh

chóng được ứng dụng trong nghiên cứu và bảo tồn đa dạng sinh học, nhận dạng loài, tạo ra các lĩnh vực khoa học mới như tiến hóa phân tử, di truyền và bảo tồn loài Đặc biệt, đối với lĩnh vực phân loại học, việc sử dụng các DNA chỉ thị để nhận dạng loài đang được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và có những đóng góp đáng kể trong việc phân loại loài Nhận

dạng loài bằng chỉ thị DNA hay “DNA barcoding” là một khái niệm tương

đối mới mẻ Đó là công cụ phục vụ nhận dạng loài một cách chính xác, nhanh chóng, tự động hóa bằng cách sử dụng một vùng DNA chuẩn hay còn gọi là

chỉ thị DNA hay mã vạch DNA (DNA barcoding) Xác định loài bằng DNA

chỉ thị sẽ cho mức độ chính xác cao và đặc biệt hữu dụng với các loài gần gũi

và những quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ sở để nhận dạng hoặc phân biệt loài [24],[25]

Hiện nay trên thế giới, phương pháp này đang được sử dụng chủ yếu bởi các nhà phân loại học và nhiều nhà khoa học ở các lĩnh vực khác như khảo cổ học, công nghiệp sinh học và chế biến thực phẩm…

Đối với thực vật, quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho các loài thực vật gặp nhiều khó khăn Hệ gen ty thể ở thực vật thường quá bảo thủ nên không được dung cho thỉ thị DNA, trong khi đó hệ gen lục lạp lại mang nhiều đặc điểm mong muốn đối với chỉ thị DNA như ở hệ gen ty thể ở động

vật [44] Ở hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi ITS

(Internal Transcribed Spacer) cũng được sử dụng làm DNA chỉ thị trong một

không chỉ một mà nhiều vùng DNA chỉ thị để định danh loài đối với thực vật

và hệ gen lục lạp là nơi chứa các vùng DNA chỉ thị tiềm năng, trong đó một

số vùng DNA lục lạp đã được nhiều nhà nghiên cứu đề xuất là chỉ thị DNA [13],[14],[43]

Chỉ thị DNA barcode là một trong những phương pháp phổ biến có độ

chính xác cao đã được nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước sử dụng Nhiều vùng gen đã được nghiên cứu và đề xuất làm chỉ thị DNA cho thực vật [13],[25],[43] tuy nhiên chưa có chỉ thị DNA nào được đa phần các nhà phân loại học thực vật hoàn toàn chấp nhận [13],[16] Mặc dù vậy, các nhà nghiên cứu cũng đã đi tới một quan điểm thống nhất là sẽ cần không chỉ một mà nhiều vùng DNA chỉ thị để xác danh loài đối với thực vật và hệ gen lục lạp là nơi chứa các vùng DNA chỉ thị tiềm năng, trong đó một số vùng DNA lục lạp

đã được nhiều nhà nghiên cứu đề xuất là chỉ thị DNA [13],[14],[43]

Do số lượng loài Hoàng liên gai trong tự nhiên khan hiếm và ngày càng sụt giảm về số lượng nên việc xây dựng một công cụ phân loại nhanh chóng

và chính xác cho loài cây này là một yêu cầu cấp thiết nhằm bảo tồn và phát

triển cây Hoàng liên gai tại Việt Nam, chỉ thị DNA barcod là phương pháp

phân loại cho kết quả nhanh chóng đã được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước sử dụng trên nhiều đối tượng khác nhau Vì vậy chúng tôi tiến

hành nghiên cứu xây dựng mã vạch DNA với 5 chỉ thị rpoB, rpoC1,

psbA-trnH, trnL:(nằm trên plasmid phân bố trong lục lạp), ITS ( nằm trong genome

thực vật) để phục vụ cho việc phân loại và nhân dạng cây Hoàng liên gai tại

Sa Pa

Chương II VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

- Thực vật : Mẫu hạt, lá cây Hoàng liên gai thu thập tại Vườn Quốc Gia Hoàng liên - Sa Pa – Lào Cai

và Sinh học phân tử, trường Đại học Heidelberg cung cấp

2.2 Dụng cụ - hóa chất

- Box cấy vô trùng, các loại thiết bị trong phòng nuôi cấy vô trùng, tủ tối, tủ 370C

bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học

- Các muôi trường cơ bản nuôi cấy tế bào thực vật như MS (Murashige and Skoog); YMB (Woody plant medium); LB (Lauria Broth)

kháng sinh (cefotaxime, spectinomycine …) Nước cất, javen, ethanol 70o

Ngoài ra còn có các hóa chất thông dụng khác (agar, gellam gum …) của các

hãng Sigma, Fermentas, Duchefa

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thu thập và nhận dạng loài bằng chỉ thị phân tử

- Thu thập ngoài thực địa: Dựa vào đặc điểm hình thái, sinh thái của

cây Hoàng liên gai và vùng phân bố của chúng, tôi tiến hành thu thập mẫu tại Vườn Quốc gia Hoàng liên - Sa Pa – Lào Cai

- Phương pháp xác định loài bằng chỉ thị DNA: Việc định loài giúp

ta tránh việc sử dụng nhầm đối tượng nghiên cứu Qui trình xác định loài bằng chỉ thị phân tử gồm các bước:

Tách chiết và tinh sạch DNA: Các mẫu lá Hoàng liên gai được tiến hành tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB theo Saghai-Maroof et al., 1984 [34]

Tinh sạch và giải trình tự sản phẩm PCR: DNA tổng số sau khi tách chiết thành công được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với như sau: bước 1: 94oC, 5 phút; bước 2: 94oC, 30s; bước 3: 54oC, 50s; bước 4: 72oC, 1 phút; từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 30 chu kì; bước 5: 72oC, 10 phút; bước 6:

4oC bảo quản mẫu

Sản phẩm PCR sau đó được điện di trên gel agarose 1% trong đệm 1X

TAE, nhuộm gel trong dung dịch Ethidium brommide và tinh sạch bằng kit

thôi gel của QIAamp Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với các mồi sau:

Bảng 2.1: Thông tin các mồi sử dụng trong nghiên cứu

1 psbA- trnH P10F P10R GTTATGCATGAACGTAATGCTC CGCGCATGGTGGATTCACAATCC

Tách dòng và xác định trình tự gen: Sản phẩm PCR sau tinh sạch được

gắn vào vector tách dòng pBT và biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5-α

theo phương pháp sốc nhiệt của Cohen et al.(1972) Chọn lọc khuẩn lạc

xanh/trắng trên môi trường thạch LB có bổ xung 50mg/l Carbenicilin, 0,004% X-gal và 0,1mM IPTG Tách plasmid theo hướng dẫn của bộ Kit tách plasmid (Bioneer, Hàn Quốc) và của Sambrook và Russell (2001) Kiểm tra sự có mặt của DNA tái tổ hợp bằng phương pháp clony-PCR với cặp mồi pUC18-F và

pUC18-R Trình tự DNA các đoạn gen rpob, rpoC1, psbA-trnH, trnL, ITS của

hai mẫu Hoàng liên gai được xác định bằng máy đọc trình tự tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Các trình tự được phân tích và so sánh bằng phần mềm BioEdit, DNAstar và dựng cây phát sinh chủng loại trên cơ

sở dữ liệu thu được

2.3.2 Phương pháp khử trùng hạt và đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro

Bước 1: Hạt cây Hoàng liên gai được rửa sạch bằng nước xà phòng pha

loãng, sau đó xả dưới vòi nước khoảng 10 phút

Bước 2: Khử trùng hạt với dung dịch C2H5OH 70o trong thời gian từ 1

- 3 phút sau đó rửa lại với nước cất khử trùng 4 - 5 lần ( mỗi lần từ 3 - 4 phút )

Bước 3: Khử trùng hạt với dung dịch HgCl2 0,1% lắc đều trong khoảng thời gian từ 9 - 10 phút rửa lại với nước cất khử trùng 4 - 5 lần ( mỗi lần 3 - 4 phút )

Bước 4: Đưa hạt ra giấy thấm khử trùng để khô ráo nước, sử dụng

panh, dao tách hết lớp vỏ ngoài lấy phôi nhũ Đưa phôi nhũ vào cấy trong môi trường MS đã chuẩn bị sẵn

Số mẫu phôi đưa vào cấy 10 - 12 phôi/đĩa Sau khi cấy xong để trên giá phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật với điều kiện chiếu sáng theo quang chu

kỳ 16 giờ sáng và 8 giờ tối, nhiệt độ phòng 22 -240C cường độ chiếu sáng

2000 lux Theo dõi khả năng sinh trưởng phát triển của phôi trên môi trường

MS

2.3.3 Phương pháp chuyển gen thông qua A.rhizogenes

Để thực hiện chuyển gen bằng A.rhizogenes phương pháp chủ yếu tiến

hành là lây nhiễm trực tiếp mẫu với dịch huyền phù vi khuẩn trong môi trường lỏng trong một khoảng thời gian nhất định

Chuẩn bị mẫu mô thực vật: Các mẫu mô thực vật được cắt nhỏ, tạo vết thương trên biểu bì Các mẫu lá được tạo tổn thương bằng lưỡi dao, cắt bốn cạnh xung quanh Thân cây Hoàng liên gai cắt nhỏ có chiều dài khoảng 0,3 – 0,4 cm đặt vào trong đĩa petri có sẵn môi trường MS lỏng

Phương pháp chuyển gen tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai thông qua vi

khuẩn A.rhizogenes ATCC 15834 bao gồm các bước chính sau:

- Chủng khuần A.rhizogenes ATCC 15834 gốc được cấy ria trên môi

trường YMB đặc nuôi trong tủ ấm 28oC trong 48 giờ

- Lấy một khuẩn lạc nuôi phục hồi trong trong 20 ml YMB lỏng nuôi lắc 200 v/p qua đêm

- Nuôi nhân thu sinh khối: lấy 5 ml dịch khuẩn phục hồi cho vào 45 ml YMB lỏng, nuôi lắc 200 v/p, 28o C trong 4-6 giờ Các môi trường nuôi khuẩn đều không bổ sung kháng sinh do vector pRi 15834 không có gen kháng kháng sinh

- Dịch khuẩn được đem ly tâm 6500 v/p ở 4o C thu sinh khối, loại bỏ môi trường nuôi cấy Cặn khuẩn được hòa tan trong môi trường MS lỏng tạo dịch huyền phù vi khuẩn Các mẫu thực vật được cắt tạo tổn thương sau đó

được lây nhiễm bằng cách ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn

- Sau khi lây nhiễm, mẫu biến nạp được thấm khô bằng giấy thấm khử trùng rồi được đặt vào môi trường đồng nuôi cấy: MS + saccharose 30 g/l +

agar 8g/l

- Sau thời gian đồng nuôi cấy, chuyển mẫu lên môi trường diệt khuẩn:

MS + saccharose 30 g/l + agar 8g/l + cefotaxime 500 mg/l Sau 2-4 tuần, các mẫu thực vật bắt đầu cảm ứng tạo rễ và được cắt ra chuyển lên môi trườngMS + saccharose 30 g/l + agar 8g/l + cefotaxime 500 mg/l

Quy trình tóm tắt tạo rễ tơ ở cây Hoàng liên gai

Hạt cây Hoàng liên gai Chủng vi khuẩn A.Rhizogenes

Khử trùng bằng: C2H5OH ( 70%) Nuôi lỏng tạo huyền phù

Các dòng rễ được cấy chuyển sang từng đĩa petri riêng biệt

Tiếp tục lưu giữ trên môi trường MS đặc Cấy chuyển sang môi trường

MS đặc tạo sinh khối