phân tích phân tử và khả năng kháng bệnh ghẻ thường do vi khuẩn streptomyces scabies ở một số dòng khoai tây chuyển gen mir

MỞ ĐẦU 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là cây lương thực đóng vai trò quan trọng thứ 4 trên thế giới. Là cây trồng có hàm lượng nước và dinh dưỡng cao nên khoai tây dễ bị tấn công bởi rất nhiều loại sâu bệnh hại. Trong đó đáng chú ý là bệnh ghẻ thường (Common scap) do vi khuẩn Streptomyces Scabies tấn công. Bệnh được ghi nhận gây hại trên hầu hết các quốc gia trồng khoai tây, trong đó có Việt Nam (Dung và cs., 2003) Bệnh ghẻ thường khoai tây là một trong những bệnh hại nghiêm trọng xuất hiện ở tất cả các vùng trồng khoai tây trên thế giới bao gồm: Mỹ, Ấn Độ, Châu Á và Châu Phi (Waner, 2006). Ở Mỹ, bệnh ghẻ thường là bệnh hại nghiêm trọng thứ 4 trên cây khoai tây, gây thiệt hại cho ngành công nghiệp khoai tây khoảng 3.5 tỉ USD (Meng và cs., 2012). Ở Việt Nam, hầu hết các vùng trồng khoai tây đều bị ảnh hưởng bởi bệnh này (Dung và cs., 2003). Các biện pháp phòng chống bệnh hiện nay như: không dùng phân chuồng, tăng cường tưới nước và giảm pH của đất thực tế là không cho hiệu quả rõ rệt, đồng thời cũng gây ra những tác động xấu đến môi trường và giảm tính bền vững của hệ thống nông nghiệp. Hiện tại có rất ít các giống khoai tây thương mại có tính kháng bệnh cao, trong khi đó khả năng phát triển các giống kháng bệnh lại gặp khó khăn do cho đến nay vẫn chưa tìm thấy nguồn gen kháng bệnh trong các loài khoai tây Solanum tuberosum. Trong khi các nỗ lực nhằm tạo giống kháng bệnh thông qua lai tạo truyền thống còn chưa có kết quả, việc sử dụng công nghệ gen đã cung cấp một công cụ hiệu quả để nâng cao tính kháng của khoai tây đối với bệnh này. Yếu tố gây độc ở Streptomyces Scabies (S.scabies) được xác định là Thaxtomin A (TA) – một loại phytotoxin ức chế sinh tổng hợp cellulose. Cùng với phát hiện này, Scheible và cộng sự (2003) đã tìm ra một đột biến gene kháng TA ở Arabidopsis, gọi là txr1. Gen tương ứng với đột biến này là gen TXR1. Đồng thời, sử dụng công cụ Blast (NCBI) cho thấy TXR1 có mức tương đồng cao trên các loài thực vật khác, như cà chua, đậu tương, ngô, lúa và lúa mì… (khoảng từ 73 đến

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

TRẦN VIỆT HÀ

PHÂN TÍCH PHÂN TỬ VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH GHẺ THƯỜNG

DO VI KHUẨN STREPTOMYCES SCABIES Ở MỘT SỐ DÒNG

KHOAI TÂY CHUYỂN GEN MIR

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 60.42.02.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS-TS NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO

HÀ NỘI - 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

- Luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi;

- Số liệu sử dụng trong luận văn được là trung thực;

- Thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc và có

độ chính xác cao nhất trong phạm vi hiểu biết của tôi

Hà Nội, ngày 24 tháng 02 năm 2015

Tác giả luận văn

Học viên

Trần Việt Hà

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, cho tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả quý thầy cô

giảng dạy và công tác tại Ban quản lý Đào tạo, Bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật

, Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã luôn quan tâm,

tạo điều kiện giúp đỡ và ủng hộ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt

nghiệp của mình

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn

và kính trọng sâu sắc tới PGS-TS Nguyễn Thị Phương Thảo – Trưởng khoa

CNSH, Học viện Nông nghiệp Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ và

tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài, đánh giá kết quả

và hoàn thành luận văn đồng thời bồi dưỡng cho tôi những kiến thức chuyên môn

và kinh nghiệm quý báu

Với tình cảm sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo, Cán

bộ công nhân viên trong Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật - Khoa Công nghệ

sinh học, , đặc biệt ThS Nguyễn Thị Thủy đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho

tôi trong suốt quá trình thực tập

Cuối cùng, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến toàn thể gia đình,

bạn bè, anh em, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi

mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn này!

Hà Nội, ngày 24 tháng 02 năm 2015

Học viên

Trần Việt Hà

1.1.2 Chiến lược sản xuất khoai tây bền vững và vấn đề an ninh lương

1.1.3 Khoai tây bến đổi gen trên thị trường hiện nay 5

1.2 Bệnh ghẻ thường khoai tây (Common scab potato) và vi khuẩn

1.2.1 Triệu chứng, nguyên nhân gây bệnh và đặc điểm phát sinh bệnh 8

1.4 Đột biến TXR1 và quá trình vận chuyển độc tố Thaxtomin A 13 1.5 Các biện pháp quản lý đối với bệnh ghẻ thường trên khoai tây 14

1.5.2 Cải tạo tính chất lý hóa đất 15

1.7.5 Phương pháp tiếp cận để tạo RNAi trong cây trồng 22 1.7.6 Các công cụ phát hiện miRNA và mục tiêu mRNA hiệu quả 23

CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.4.1 Phương pháp chiết tách DNA (QUIA gen plant mini kit) 27 2.4.2 Phương pháp kiểm tra cây chuyển gen bằng PCR: 28 2.4.3 Phương pháp đánh giá tính mẫn cảm với Thaxtomin A của các

2.4.4 Phương pháp đánh giá khả năng kháng bệnh ghẻ thường bằng lây

nhiễm nhân tạo với S.scabies (Wanner, 2006 cải tiến): 30

2.4.5 Phương pháp xác định chỉ số gây bệnh (Wanner và Haynes,

3.1 Kết quả kiểm tra sự có mặt của cấu trúc gen được chuyển vào các

3.2 Kết quả kiểm tra sự có mặt của cấu trúc gen được chuyển vào các

4.2.1 Kết quả chiết tách DNA tổng số và nhân gen được chuyển 38

3.3 Đánh giá các dòng chuyển gen thông qua thử tính mẫn cảm với

3.4 Kết quả đánh giá khả năng kháng bệnh ghẻ thường của các dòng

khoai tây chuyển gen thông qua lây nhiễm nhân tạo với vi khuẩn

RE sRNA siRNA dsRNA

Artificial miRNA microRNA Polymerase Chain Reaction RNA Inducing Silencing Complex Restriction Enzyme

Small RNA Small interfering RNA Double-stranded RNA Công thức

Thí nghiệm

DANH MỤC HÌNH

1.1 Triệu chứng bệnh ghẻ thường trên củ khoai tây 9

3.1 Kết quả điện di sau PCR nhân gen của các dòng khoai tây chuyển

3.2 Kết quả điện di sau PCR kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn

A.tumerfacens bằng cặp mồi VirD F , VirD R 37 3.3 Kết quả chiết tách DNA tổng số ( DNAesasy plant mini kit,

3.8 Hình ảnh các dòng khoai tây chuyển với các công thức thí

nghiệm nồng độ Thaxtomin A từ 100ppm đến 600ppm sau 4

3.9 Kết quả lây nhiễm nhân tạo với S.scabies (sau 16 tuần lây nhiễm) 47

MỞ ĐẦU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là cây lương thực đóng vai trò quan trọng

thứ 4 trên thế giới Là cây trồng có hàm lượng nước và dinh dưỡng cao nên khoai tây dễ bị tấn công bởi rất nhiều loại sâu bệnh hại Trong đó đáng chú ý là bệnh ghẻ

thường (Common scap) do vi khuẩn Streptomyces Scabies tấn công Bệnh được ghi

nhận gây hại trên hầu hết các quốc gia trồng khoai tây, trong đó có Việt Nam (Dung

và cs., 2003)

Bệnh ghẻ thường khoai tây là một trong những bệnh hại nghiêm trọng xuất hiện ở tất cả các vùng trồng khoai tây trên thế giới bao gồm: Mỹ, Ấn Độ, Châu Á và Châu Phi (Waner, 2006) Ở Mỹ, bệnh ghẻ thường là bệnh hại nghiêm trọng thứ 4 trên cây khoai tây, gây thiệt hại cho ngành công nghiệp khoai tây khoảng 3.5 tỉ USD (Meng và cs., 2012) Ở Việt Nam, hầu hết các vùng trồng khoai tây đều bị ảnh hưởng bởi bệnh này (Dung và cs., 2003)

Các biện pháp phòng chống bệnh hiện nay như: không dùng phân chuồng, tăng cường tưới nước và giảm pH của đất thực tế là không cho hiệu quả rõ rệt, đồng thời cũng gây ra những tác động xấu đến môi trường và giảm tính bền vững của hệ thống nông nghiệp Hiện tại có rất ít các giống khoai tây thương mại có tính kháng bệnh cao, trong khi đó khả năng phát triển các giống kháng bệnh lại gặp khó khăn

do cho đến nay vẫn chưa tìm thấy nguồn gen kháng bệnh trong các loài khoai tây

Solanum tuberosum Trong khi các nỗ lực nhằm tạo giống kháng bệnh thông qua lai

tạo truyền thống còn chưa có kết quả, việc sử dụng công nghệ gen đã cung cấp một công cụ hiệu quả để nâng cao tính kháng của khoai tây đối với bệnh này

Yếu tố gây độc ở Streptomyces Scabies (S.scabies) được xác định là

Thaxtomin A (TA) – một loại phytotoxin ức chế sinh tổng hợp cellulose Cùng với phát hiện này, Scheible và cộng sự (2003) đã tìm ra một đột biến gene kháng TA ở

Arabidopsis, gọi là txr1 Gen tương ứng với đột biến này là gen TXR1 Đồng thời,

sử dụng công cụ Blast (NCBI) cho thấy TXR1 có mức tương đồng cao trên các loài

thực vật khác, như cà chua, đậu tương, ngô, lúa và lúa mì… (khoảng từ 73 đến

80%) Trên cây khoai tây, Nguyễn thị Thùy Linh (2010) và Phạm Thị Lan Hương

(2011) đã tìm thấy 4 gen ứng viên trên giống khoai tây Atlantic

Công nghệ RNAi được phát triển gần đây đã và đang tỏ ra là công cụ hiệu quả để điều hoà ức chế các gen đơn hoặc các nhóm gen khác nhau trên cơ sở các trình tự đặc hiệu Các amiRNA đặc hiệu được thiết kế để để điều hoà ức chế các gen

cũng đã được công bố trên các cây hai lá mầm như Arabidopsis, cà chua và thuốc lá

và cây một lá mầm như lúa (Parizotto và cs., 2004; Alvarez và cs., 2006; Schwab và cs., 2006; Xinshun và cs., 2008; Warthmann và cs., 2008)

Ứng dụng công nghệ này với mục đích tạo giống khoai tây kháng bệnh ghẻ thường Nguyễn Thị Thùy Linh (2010) đã thiết kế thành công 11 vector miRNA đặc hiệu tại các vị trí khác nhau trên gen này đã được thiết kế (Nguyễn Thị Thùy Linh, 2010; Phạm Thị Lan Hương, 2011; Ngô Thị Thanh Hiền, 2012) và đã chuyển gen thành công 1 vector miRNA cho 3 dòng khoai tây (Ngô Thị Thanh Hiền, 2012), bước đầu đánh giá biotest 3 dòng chuyển gen ở mức độ chống chịu với TA và tiến hành lây nhiễm nhân tạo ở 3 dòng chuyển gen đều cho kết quả khả quan (Phan Thị Ngân, 2013)

Để khẳng định sự có mặt của cấu trúc miRNA được chuyển vào 3 dòng khoai tây và sự hoạt động của cấu trúc này thì chúng tôi tiếp tục tiến hàng nghiên

cứu để đánh giá đồng bộ ở cả ba mức là đánh giá phân tử, đánh giá in-vitro và đánh giá in-vivo một số dòng khoai tây chuyển gen để bước đầu khẳng định các dòng

khoai tây đã được chuyển gen thành công và đánh giá được tính kháng bệnh ghẻ thường của các dòng này

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

1.2.1 Mục tiêu chung

Đánh giá đồng bộ ở cả 3 phương diện là phân tử, in vitro, in vivo các dòng

chuyển gen để kết luận được hiệu quả tác động của các amir lên việc hình thành tính kháng bệnh ở dòng khoai tây chuyển gen, tạo tiền đề cho việc sản xuất giống

khoai tây kháng bệnh ghẻ thường do vi khuẩn S.scablies gây ra

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Đây là nghiên cứu đầu tiên của Việt Nam ứng dụng công nghệ RNAi nhằm phòng chống bệnh ghẻ thường ở cây khoai tây

Nghiên cứu đã chứng tỏ được 3 dòng khoai tây D1-At-Po9, D2-At-Po9 và D89-At-Po9 chuyển gen có biểu hiện kháng bệnh ghẻ thường do vi khuẩn

Streptomyces scablies rất tốt

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây khoai tây

1.1.1 Giới thiệu chung

Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) thuộc họ cà (Solanaceae), là cây nông

nghiệp ngắn ngày, được trồng rộng rãi trên thế giới và có sản lượng tươi đứng thứ

tư thế giới sau lúa, lúa mì và ngô Khoai tây có nguồn gốc ở vùng cao thuộc dãy núi Andes, Nam Mỹ, du nhập vào Tây Ban Nha khoảng năm 1570, vào Anh Quốc năm

1590 và sau đó được lan truyền khắp châu Âu và châu Á Khoai tây có thời gian sinh trưởng ngắn, từ 80 - 100 ngày, nhưng cho năng suất từ 15 - 30 tấn củ/ha với giá trị dinh dưỡng cao

1.1.2 Chiến lược sản xuất khoai tây bền vững và vấn đề an ninh lương thực toàn cầu

Khoai tây (Solanum spp.) hiện nay đang là đối tượng cây lương thực hàng

đầu trong nhóm lương thực không phải từ hạt (FAO, 2009a).Theo thống kê năm

2009 thì sản xuất toàn cầu đạt vượt quá 329 triệu tấn (FAOSTAT, 2011) Với phạm

vi thích nghi rộng với các vùng trồng (Haverkort, 1990) cũng như mang lại giá trị dinh dưỡng cao là một trong những nguyên nhân giúp xu hướng tăng trồng khoai tây trên toàn cầu trở nên ổn định Trong thực tế, sản lượng khoai tây của thế giới tại các nước phát triển đã tăng gấp đôi so với năm 2005 (FAO, 2010) Hàng triệu nông dân trên thế giới đang phụ thuộc vào khoai tây để sinh sống và xem đây là cây lương thực chủ yếu của địa phương Một ưu thế của khoai tây so với các cây lương thực khác đó là tiềm năng năng suất của chúng rất cao, có đến 80% sinh khối tạo thành năng suất kinh tế (Osaki và cs., 1996) Năm 2008, liên hợp quốc đã tuyên bố năm này là “năm quốc tế khoai tây” (IYP), tại hội nghị này vai trò của khoai tây được nhấn mạnh với các nội dung gồm (1) góp phần cải thiện chế độ ăn uống và an ninh lương thực; (2) giảm thu nhập và có những thách thức nhỏ trong sinh hoạt cho các gia đình nông dân ở quy mô nhỏ; (3) bảo tồn nguồn tài nguyên di truyền cần thiết để sử dụng trong nghiên cứu đa dạng sinh học của khoai tây, làm nguồn cải thiện giống trong tương lai (FAO, 2009a)

Nhiệm vụ của các nhà khoa học và nhà chiến lược đối với khoai tây được xác định rõ với các nội dung (1) sản xuất khoai tây bền vững với việc kiểm soát các tác nhân gây gệnh từ đất và mầm bệnh của chúng tồn tại trong đất; (2) cải thiện thành phần và lượng chất dinh dưỡng của khoai tây; (3) quản lý canh tác với các biện pháp sử dụng nước hiệu quả giúp tăng năng suất khoai tây

Mối quan tâm của toàn cầu với sản xuất khoai tây tăng lên đáng kể do bởi giá lương thực tăng vọt, tạo nên sự bất ổn trong vấn đề an ninh lương thực ở các nước

có thu nhập thấp (FAO 2009a, b; Lutaladio và Castaldi, 2009) Giá lương thực tăng cao cũng có xu hướng làm nghèo đói và suy dinh dưỡng trở nên tồi tệ hơn (FAO 2011) Trong khi đó, khoai tây được đánh giá là loại lương thực có hàm lượng dinh dưỡng cao, thành phần khá đầy đủ (bao gồm carbohydrate, các vi chất, vitamin B, C; hàm lượng protein cao hơn các loại ngũ cốc khác, ngoài ra khoai tây còn có các chất chống oxi hóa) (Burlingame và cs., 2009); và lượng thực phẩm thu được chiếm đến 85%, cao hơn hẳn các loại ngũ cốc hạt khác (chỉ 50%) (FAO 2009a)

1.1.3 Khoai tây bến đổi gen trên thị trường hiện nay

Để chống lại các tác nhân gây bệnh trên khoai tây, hàng loạt các chiến lược phòng chống đã được đề cập, trong đó có cả can thiệp bằng kỹ thuật di truyền Các giống khoai tây biến đổi gen kháng CPB, PVY, và PLRV đã được nghiên cứu và phát triển bởi công ty Mosanto, chúng là các giống khoai tây biến đổi di truyền được chấp nhận trên thị trường thương mại, làm thức ăn, làm thực phẩm chăn nuôi cũng như nguyên liệu cho ngành công nghiệp chế biến từ năm 1996 tại các quốc gia như Úc, Canada, Mỹ, Philippines, Romania và Nhật Bản (BATS, 2003) Đến năm

2003, trên thị trường có thêm 3 giống khoai tấy biến đổi gen mới là Newleaf, NewleafPlus và Newleaf Y (BATS, 2003)

Giống khoai tây Newleaf đã được biến đổi gen để kháng lại đọc tố nhóm Cry

3A có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus thuriensis tenebrionis, chúng mang tính

kháng chọn lọc cao trong việc kiểm soát CPB Theo công bố của BATS, 2003 thì

danh sách các cấu trúc DNA được sử dụng để tạo nên giống Newleaf từ giống Atlantic: ATB04-6; ATB04-30; ATB04-27; ATB04-36 Dòng Newleaf Y:

RBMT15-101; SEMT15-02; SEMT15-15 và HLMT15-46 đã được thiết kế cho khả năng chống lại cả CPB và PVY-O (BATS, 2003)

Khoai tây biến đổi gen cũng nhận được sự quan tâm nghiên cứu của các trường Đại học, ví dụ như đại học Michigan, Mỹ cùng với dự án Hỗ trợ công nghệ sinh học nông nghiệp (ABSP) đã phát hành 2 giống khoai tây thương mại là Stunta-G2 và Stunta-G3 với việc sử dụng vector chuyển gen là pSPUD5 với gen chuyển được thiết kế theo mô phỏng promoter CaMV35S-gen Cy5-Bt- Vùng NOS terminator (Mohammed et al, 2000) Gen Cry5-Bt là gen kháng đối với sâu bớm

khoai tây (Phthorimaea operculella Zeller), củ của giống khoai tây này đã được

trồng ở Ai Cập

Alexander và cs (2003) đã tiến hành lai giữa các giống khoai tây trồng lưỡng bội (2x) và tứ bội (4x), sau đó sử dụng con lai để làm vật liệu chuyển gen, gen

chuyển được thiết kế chống lại nội độc tố Cry3A của Bacillus thurigiensis và gen

đối bản với gen tạo protein vỏ của virus PVY, gen thiết kế được chuyển vào bằng

phương pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Kết quả

cho thấy, việc biểu hiện của gen chuyển vào đã giúp làm giảm chi phí sản xuất và không gây ảnh hưởng đáng kể lên kiểu hình của cây

Mức độ kháng cao đối với virus PVY đã thu được kết quả khả quan (Hefferon

và cs., 1997; Maki-Valkama và cs., 2000; Pehu và cs., 1995) Các chiến lược phòng chống bệnh do virus ở khoai tây bằng phương pháp chuyển gen sản xuất protein vỏ của virus đã thu được các dòng khoai tây kháng bệnh hiệu quả (Barler và cs., 1999; Spillane và cs., 1998) và ứng dụng công nghệ RNAi cũng được áp dụng trong việc kháng bệnh do virus gây ra với công trình của Alexander và cộng sự năm 2003 Khoai tây biến đổi di truyền không chỉ tập trung vào phòng bệnh mà còn có mục tiêu tăng chất lượng sản phẩm từ khoai tây Dòng EH92-527-1 đã được biến đổi gen để làm tăng cao hàm lượng amylopectin của tinh bột Ủy ban châu Âu đã cho phép dòng khoai tây này lưu thông trên thị trường (EC, 2002)

1.1.4 Dịch hại trên cây khoai tây

Với đặc điểm có hàm lượng dinh dưỡng và hàm lượng nước cao trong tất cả các bộ phận của cây nên khoai tây là đối tượng tấn công của nhiều loài sâu bệnh

hại Bao gồm mốc sương do nấm Phytophthora infestance gây ra được đánh giá là

gây hại hàng đầu trên khoai tây Theo tính toàn cũ thì người ta ước tính rằng năng suất khoai tây trên thế giới bị ảnh hưởng do sâu bệnh hại lên đến 22% (Ross, 1986) Các nhà nghiên cứu và nhà quản lý tập trung chú ý vào các bệnh gây hại cho khoai tây với nguồn lây nhiễm từ đất, do sản phẩm cho giá trị kinh tế ở khoai tây là

củ Các loại vi khuẩn đất thuộc nhóm hoại sinh rất được chú ý bao gồm Erwinia carotovora app gây bệnh chân đen, thối mềm gốc và các bộ phận trên mặt đất ( Bank, 2004); vi khuẩn gây bệnh thối vòng là Clavibacter michiganensis sepedonicus, chúng thường được lây truyền qua hạt giống và không bị chết ngay cả trong điều kiện bị đóng băng (Bank, 2004); bệnh ghẻ thường do Streptomyces scabies với việc gây hại trực tiếp lên củ và có thể tồn tại lâu trong đất và truyền

bệnh cho vụ sau

1.2 Bệnh ghẻ thường khoai tây (Common scab potato) và vi khuẩn

Streptomyces

Có hơn 400 loài được xác định thuộc chi Streptomyces nhưng chỉ một số ít

trong đó được xác định là tác nhân gây bệnh (Loria và cs., 1997) Tuy số lượng loài

gây bệnh ít hơn các chi vi khuẩn khác nhưng phổ ký chủ của Streptomyces khá

rộng, chúng có thể lây nhiễm và lan truyền từ cây ký chủ này sang cây ký chủ khác của vụ sau Phổ ký chủ của chúng bao gồm các bộ phận dưới mặt đất, các cây có củ

như củ cải (Raphanus sativus), củ cải đường (Pastinaca sativa), củ cải (Beta vulgaris), cà rốt (Daucus carota), khoai tây (Solanium tuberorum) (Goyer và

Beaulieu, 1997), các tác nhân gây bệnh còn kích thích gây dạng mụn có trên vỏ lạc,

với vết tổn thương sâu, lớn và có màu đen (Loria và cs., 1997) Chi Streptomyces

đầu tiên được biết đến với vai trò sản xuất các hợp chất thứ cấp dùng như kháng sinh sử dụng trong y học, hơn hai phần ba thuốc kháng sinh tự nhiên hiện nay có

nguồn gốc từ các chất chuyển hóa thứ cấp của các loài thuộc chi Streptomyces

Bệnh ghẻ thường trên củ khoai tây là do Streptomyces scablies đóng vai trò

là tác nhân gây bệnh chính Mức độ tổn thương gây ra trên bề mặt củ được phân loại và đánh giá, tuy nó không ảnh hưởng nhiều đến chất lượng củ giống nhưng về mặt thương mại lại làm giản đáng kể giá trị thương phẩm của sản phẩm, đặc biệt là với những tổn thương sâu vào bên trong củ

1.2.1 Triệu chứng, nguyên nhân gây bệnh và đặc điểm phát sinh bệnh

• Triệu chứng

Bệnh ghẻ thường gây nên rất nhiều triệu chứng khác nhau trên củ khoai tây

Bệnh gây ra những đám mô nổi, thô ráp Vết bệnh cũng có thể sẽ hõm sâu vài centimet Tổn thương cũng khác nhau về kích thước và hình dạng: rải rác hoặc bao trùm hầu hết bề mặt củ Khi củ tăng kích thước, tổn thương do bệnh ghẻ mở rộng và tăng mức độ nghiêm trọng của bệnh (Reiette Gouws, 2006) Nhìn chung, tổn thương

do ghẻ trên củ khoai tây có thể được phân thành 3 loại: ghẻ nâu đỏ; ghẻ lồi với những vết lồi khoảng 1-2 mm; ghẻ sao với những vết bệnh sâu đến 7mm (Hooker, 1981).

Hình 1.1 Triệu chứng bệnh ghẻ thường trên củ khoai tây

(nguồn Steven B Johnson và David Lambert 2010)

• Nguyên nhân gây bệnh và đặc tính phát sinh

Bệnh ghẻ thường được gây ra bởi một loại vi khuẩn Gram (+) thuộc chi

Streptomyces, đây được đánh giá là một bệnh gây hại nghiêm trọng trên khoai tây

Bệnh chủ yếu gây ảnh hưởng đến chất lượng củ và tạo nên các vết tổn thương tùy mức độ trên bề mặt củ Bệnh ghẻ thường được đánh giá là một trong 5 loại dịch hại hàng đầu trên khoai tây trồng ở Mỹ (Slack, 1991)

Streptomyces scablies là vi khuẩn đất, tuy nhiên chúng có thể tồn tại và

truyền bệnh qua hạt giống và củ (Wilson và cs., 1999; Wang và Lazarovits, 2005)

Chi Streptomyces spp được biết đến là một chi hoại sinh và có sản xuất tạo kháng sinh (Chater, 2006; Chater và cs., 2010) Trong chi này thì chủng Streptomyces scabies là được phát hiện đầu tiên trên khoai tây (Lambert và Loria 1989a;

Waksman và Henrici 1948) và chúng được tìm thấy ở trên nhiều giống khoai tây trên toàn thế giới (Bouchek-Mechiche và cs., 2000a; Flores-Gonzailez và cs.,

2008; Wanner, 2009) Gần đây, có thêm chủng S.turgidiscabies được tìm thấy là

tác nhân gây bệnh ghẻ thường trên khoai tây tại Nhật Bản (Miyama và cs., 1988)

và Phần Lan (Kreuze và cs., 1999) và sau đó là lan rộng trên toàn thế giới bao gồm Trung Quốc, Hàn Quốc, Bắc Mỹ, Na Uy, Thụy Điển, Anh (Dees và cs., 2012; Kim và cs., 1999; Lehtonen và cs., 2004; Thwaites và cs., 2010; Warnner,

2009; Zhao và cs., 2008) S.europaeiscabies được phát hiện và lần đầu tiên được

mô tả tại Pháp vào năm 2000, sau đó chúng cũng được tìm thấy ở Châu Âu, Hàn Quốc, Bắc Mỹ (Bouchek-Mechiche và cs., 2000a; Dees và cs., 2012; Wanner,

2009) Sau đó, một chủng thuộc chi Streptomyces tiếp tục được tìm thấy tại khu vực có pH thấp của Mỹ, gọi là S.acidiscabies (Lambert và Loria., 1989a), chúng

sau đó lại được tìm thấy ở rất nhiều khu vực trồng khoai tây như Canada, Trung Quốc, Hàn Quốc, Anh (Song và cs., 2004; St-Onge và cs., 2008; Thwaites và cs., 2010; Zhao và cs., 2010) Thêm một chủng gây triệu chứng ghẻ thường nữa được

nhắc đến là S.stelliscabiei được báo cáo tìm thấy tại Mỹ và Pháp

(Bouchek-Mechiche và cs., 2000a; Wanner, 2006)

Một khi đã hiện diện trong đất thì S.scabies có thể tồn tại vô thời hạn

(Agrios, 2005), chúng có khả năng tồn tại được trong ngưỡng pH đất khá rộng, từ

5.2-7.0 Cấu tạo dạng sợi của S.scabies có dạng phân nhánh, có hoặc có ít vách

ngăn ngang

Cấu trúc sporogenous của S.scabies phát triển thành dạng chuỗi xoắn ốc, khi

bào tử trong đó trưởng thành thì sắc tố melanin phát triển Sau khi các bào tử phát tán và nảy mầm ở một nơi có điều kiện thích hợp, ống mầm từ bào tử sẽ thâm nhập vào củ thông qua cấu trúc lenticels, hoặc dễ dàng hơn là chúng lợi dụng các lỗ hở tự nhiên như khí khổng hay các vết thương cơ giới Theo mô tả của Loria và cs (2006) thì trong quá trình vi khuẩn xâm nhiễm vào mô tê bào bằng các lỗ hở tự nhiên thì việc hình thành cấu trúc ống mầm không phải lúc nào cũng cần thiết Trong trường hợp này chỉ có các những cấu trúc dạng sợi thứ cấp, vuông góc với các cấu trúc sơ cấp là có vai trò quan trọng Như vậy, cấu trúc cần thiết của tất cả quá trình xâm

nhiễm của S.scabies chính là cấu trúc dạng sợi thứ cấp này Sau khi xâm nhập được

vào trong một lớp tế bào biểu bì nhất định, chúng làm chết các tế bào này và sử

dụng nguồn dinh dưỡng từ đây, vì cơ chế sinh dưỡng này mà S.scabies được xếp

vào nhóm hoại sinh

Tất cả các quá trình xâm nhiễm này đều có sự tham gia hỗ trợ của một nhóm phytotoxins là Thaxtomin, với tên được King và cs (1989) đặt theo tên của Roland Thaxter – người đầu tiên phát hiện ra chủng vi khuẩn này Thaxtomins gồm một lớp

có công thức hóa học là 4-nitroindol-3-yl chứa 2,5-dioxopiperazines đã được chấp nhận là có mối quan hệ tương quan với mức độ gây bệnh ghẻ Nhóm nghiên cứu

của Bukhalid và Loria (1997) đã nhân dòng được gen necl từ một chủng gây bệnh S.scabies; gen này còn được thu nhận tại chủng S.lividans – một chủng vi khuẩn thuộc chi Streptomyces spp nhưng không gây bệnh ghẻ khoai tây

Gen necl tạo sản phẩm là một hợp chất hòa tan trong dịch ngoại bào, gây nên các tổn thương Các nhà nghiên cứu còn đề xuất rằng gen necl có khả năng liên

quan đến vị trí ORF-stop, trong vị trí ORF này sản xuất một chuỗi amino acid tương

tự như gen nhảy (transposonases) của Staphylococcus aureus

Trong công bố của Loria và cộng sự (1998) đã cung cấp thêm các bằng

chứng cho thấy vai trò của gen necl trong khả năng gây bệnh của Streptomyces Sử

dụng phân tích Sourthen blot, họ đã phân tích từ 43 chủng từ 3 loài thuộc chi

Streptomyces gây bệnh là S.scabies; S.acidiscabies; S.turgidiscabies để thăm dò sự tồn tại của gen Necl Kết quả phát hiện thấy rằng cả 43 chủng đều tồn tại một bản duy nhất gen necl, như vậy cho tính tính bảo thủ cao của gen này trên các chủng gây

bệnh Từ đây, nhóm tác giả đã đề nghị vai trò của gen necl như là một yếu tố tham gia trực tiếp trong việc tổng hợp thaxtomin

1.3 Giới thiệu về yếu tố Thaxtomin A

Thaxtomins là tên gọi chung của một nhóm các phytotoxins với công thức hóa học đầy đủ là 4-nitroindol-3-yl chứa 2,5 dioxopiperazines, được sản xuất bởi

một loại vi khuẩn gây bệnh thực vật thuộc chi Streptomyces spp (King và cs., 1989)

Trong nhóm này thì Thaxtomin A (TA) là phytotoxin chiếm ưu thế và có động lực

lớn hơn cả, được sản xuất bởi các chủng vi khuẩn S turgidiscabies; S.miyajima; …(

King và cs., 1989; Bukhail và cs., 1998; Healy và cs., 2002; King và cs., 1996; Lindholm và cs., 1997 và Loria và cs.,1995) Những vi khuẩn này là nguyên nhân

chủ yếu gây nên bệnh ghẻ thường trên củ khoai tây (Splanum tuberosum L.), một

trong những bệnh gây thiệt hại lớn cho ngành nông nghiệp trồng khoai tây trên thế giới (Hiltumen và cs., 2005; Lambert và Loria., 1989; Loria và cs.,1997; Miyajima

và cs., 1998)

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của 4 loại Thaxtomins (King và cs., 2003)

Mặc dù Thaxtomin không được sản xuất bởi tất cả các vi khuẩn thuộc chi

Streptomyces, nhưng có một điều đặc biệt đó là nó chỉ được sản xuất ở những loài

vi khuẩn gây bệnh ghẻ thường, và qua các thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo thì đã cho thấy Thaxtomin là cần thiết cho việc lây nhiễm nhân tạo thành công của

S.acidiscabies (Ylhamen, 2001) và trong các loài gây bệnh thuộc chi này sẽ có

những trình tự tương đồng nằm tại “pathogenis island”, các gen này được bảo tồn

và di truyền ngang giữa các loài khác nhau trong chi Streptomyces, điều này giúp giải thích cho sự xuất hiện những chủng gây bệnh mới trong chi Streptomyces spp

(Healy và cs., 1999; Bukhalid và cs., 1998) Vai trò của Thaxtomin ở các tế bào thực vật vẫn chưa được biết đầy đủ nhưng một vai trò đã được biết đến là ức chế sự phát triển của các tế bào

Thaxtomin A là nguyên nhân làm gia tăng mạnh mẽ về số lượng tế bào trong

các cây thuốc lá invitro trong quá trình tái sinh Thaxtomin A cũng được biết đến

với vai trò ức chế sự tổng hợp cellulose, ức chế sự kéo dài bình thường của các tế nào protoplasts ở cây thuốc lá theo hướng làm ảnh hưởng đến sự phát triển của các thành tế bào sơ cấp Bằng cách can thiệp vào tính toàn vẹn của tế bào thực vật,

Thaxtomin trở thành yếu tố hỗ trợ cho quá trình xâm nhiễm của Streptomyces vào

những tế bào lành lặn Đồng thời những bằng chứng rõ ràng về khả năng thaxtomin

ức chế sinh tổng hợp cellulose là việc nghiên cứu trên cây mô hình Arabidopsis thaliana Lượng 14C-glucose vào trong các đoạn cellulose của thành tế bào giảm đi

rõ rệt khi ủ chồi với 100 hoặc 500 nM thaxtomin trong 24h Các chồi bị ủ trong độc

tố cũng bị giảm sinh trưởng (Scheible và cs., 2003)

Rõ ràng, thaxtomin A có vai trò quan trọng trong tính gây bệnh của tác nhân gây bệnh Tuy nhiên, mô hình hoạt động của thaxtomin đến nay vẫn chưa được làm sáng tỏ Các nghiên cứu về hoạt động của thaxtomin A và các sản phẩm tương tác với chúng ở cây trồng cần được tiến hành ở mức độ phân tử để đề ra các biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả

1.4 Đột biến TXR1 và quá trình vận chuyển độc tố Thaxtomin A

Năm 2003, Scheible và cs đã phát hiện ra một protein mới ở Arabidopsis thaliana có tính tương đồng cao trên các loài thực vật khác nhau, thậm chí trên cả động vật và người Đột biến xác định ở Arabidopsis thaliana được gọi là txr1, tăng

cường tính kháng với sự sinh trưởng trên môi trường có chứa TA do sự khác biệt

trong tỷ lệ hấp thụ độc tố Gen TXR1 có vị trí locus nằm trên nhiễm sắc thể số 3, được phát hiện bởi hai marker phân tử TSA1 và SSLP Gen TXR1 được xác định

bằng phương pháp nhân dòng dựa trên bản đồ gen và nó mã hóa cho một protein hòa tan 12.7kD, không có các motifs đặc hiệu hoặc các cơ quan phát tín hiệu mục tiêu Gen này mã hóa cho một protein mới, có kích thước nhỏ, chưa được hiểu rõ về

cơ chế và chức năng di truyền Đây là một protein có trình tự bảo thủ tương đồng trên genome nhiều sinh vật nhân chuẩn đã được giải trình tự, biểu hiện trên tất cả các mô và trong suốt các giai đoạn phát triển Phân tích microarray của hiệu ứng đột biến sự biểu hiện của 14,300 gen phát hiện được 2 gen tăng cường sự biểu hiện thay

đổi Như vậy, TXR1 là một thành phần hoặc nhân tố điều hòa cơ chế vận chuyển

độc tố (Scheible và cs., 2003; Laurent, 2005)

Gen sinh tổng hợp thaxtomin được chi phối bởi các nhân tố điều hòa phiên

mã - họ AraC/XylS, là TxtR có trình tự bảo tồn giữa các loài Streptomyces gây bệnh

và mã hóa cho nhóm gen sinh tổng hợp thaxtomin Protein TxtR liên kết đặc hiệu với cellobiose, cần thiết cho việc báo hiệu sự mở của các mô thực vật, và cellobiose cũng là yếu tố cảm ứng tổng hợp thaxtomin (Joshi và cs., 2007; Loria và cs., 2008) Tuy nhiên, một số phân tử khác như các acid amin thơm và một số chất chuyển hóa thứ cấp lại cho thấy tác dụng ức chế việc sản xuất độc tố (Lerat và cs., 2009)

Đột biến của gen TXR1, được ký hiệu là txr1, ức chế sự tổng hợp protein TXR1 và do đó làm tăng tính kháng của cây Arabidopsis thaliana đối với TA Dựa

vào các thông tin đã công bố, năm 2010, Nguyễn Thị Thùy Linh cùng cộng sự đã

xác định được ở cây khoai tây có một phần gen TXR1, Phạm Thị Lan Hương

(2011), Ngô Thị Thanh Hiền (2012) cùng cộng sự đã tiếp tục thiết kế các vector miRNA và thực hiện chuyển gen nhằm làm giảm hay ức chế sự tổng hợp protein TXR1, một vài thí nghiệm biotest xác định sự có mặt của gen chuyển, hiệu quả hoạt động của gen nhưng các thí nghiệm vẫn chưa thống nhất, vì vậy chúng tôi thực hiện nghiên cứu đánh giá và kiểm tra chức năng của gen này một cách đồng bộ trong việc làm tăng tính kháng đối với bệnh ghẻ thường trên khoai tây

1.5 Các biện pháp quản lý đối với bệnh ghẻ thường trên khoai tây

1.5.1 Biện pháp thủy lợi

Từ lâu thì quản lý thủy lợi, chế độ tưới tiêu đã được biết đến để hạn chế sự lây nhiễm của bệnh ghẻ thường trên khoai tây Sanford (1923) đã phát hiện thấy rằng độ ẩm đất có liên quan một cách trực tiếp hoặc gián tiếp đến sư kiểm soát bệnh ghẻ Ông cũng lưu ý rằng, có một sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm bệnh ở điều kiện đất trồng khô so với đất trồng ướt Trên đất khô, tỷ lệ củ bị nhiễm bệnh rất cao và biểu hiện bệnh nặng hơn so với điều kiện đất ẩm thì chỉ hơi bị nhiễm bệnh Và ông cũng

có một lưu ý quan trọng về thời gian nghỉ canh tác của đất khi phát hiện đất bị nhiễm bệnh Lewis (1970) với các khảo sát của mình đã chỉ ra thời gian này là năm

tuần cần cho đất còn ẩm khi bắt đầu có củ Nếu đất được giữ ẩm, có thế năng nước lớn hơn

Các công bố lần lượt của Lapwood và cộng sự (1966; 1970a; 1970b) không chỉ chứng minh rằng quản lý thủy lợi có vai trò quan trọng trong ức chế bệnh mà nó còn là yếu tố giúp xác định mức độ nhạy cảm sinh lý của củ thông qua việc quan sát

sự kéo dài cấu trúc intermode Biện pháp thủy lợi được đề cập là một biến pháp quản lý bệnh chỉ ở quy mô nhỏ, đặc biệt chúng không có tác dụng đối với những cấu trúc đất giữ nước kém

1.5.2 Cải tạo tính chất lý hóa đất

Các biện pháp cải tạo đất bao gồm cả bón phân, vôi và cây che phủ đều cho thấy sự không hiệu quả trong tác dụng kiểm soát bệnh ghẻ thường, Conn và Lazarovits (1998) đã sử dụng phân gia súc và phân gà lỏng cho khu vực trồng khoai tây và nhận thấy tỷ lệ bệnh ở năm đầu tiên thấp, tuy nhiên nó lại tăng mạnh ở những năm sau đó Với những kết quả thu được, họ đã kết luận rằng ngoài loại phân thì loại đất trồng cũng ảnh hưởng lớn đến sự gia tăng của tác nhân gây bệnh Việc sử dụng phân Amoni lignosulfonate (ALS) đã từng được kết luận là giúp giảm tỷ lệ mắc bệnh ghẻ thường của khoai tây Soltani và cộng sự (2001) đã ghi lại một sự giảm đáng kể bệnh ghẻ lên đến 50-80% trên tất cả các địa điểm trồng khoai tây thương mại của Canada, họ phát hiện ra rằng có mối tương quan giữa sự suy giảm

độ pH đất và sự gia tăng mật độ vi khuẩn Phương pháp quản lý dịch hại bằng phân bón đã được sử dụng trong kiểm soát bệnh ghẻ thường, theo báo cáo cáo của Sturz

và cộng sự (2004) thì việc sử dụng phân bón đã làm tăng nhóm vi khuẩn đối kháng

là Rhizobacterial Ammonium sulfate (NH4)2SO4 đã được áp dụng ở mức 379kg/ha trong 2 năm, kết quả là đã giảm 10% tỷ lệ mắc bệnh ghẻ, kết quả này được giải thích là do phân bón đã làm giảm độ pH của đất, điều này tạo lợi thế cạnh tranh cho

các loài đối kháng với S.scabies

1.5.3 Sử dụng biện pháp hóa học

Chất hóa học và thuốc kháng sinh đã được sử dụng trong kiểm soát dịch hại

do Streptomyces gây ra, tuy nhiên mức độ thành công lại phụ thuộc vào rất nhiều

yếu tố Phương pháp điều trị hóa học với 3,5-D acid beoic hoặc picolinic có xu hướng gây hại cho thực vật (McIntosh và cs., 1988) Các penta-chloronitrobenzene (PCNB) đã được cấm sử dụng mặc dù chúng có hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh

ở mức nồng độ cao Curwen và Groskopp (1978) đã áp dụng PCNB ở mức cao (20lbs/A) trong vòng 2 năm với giống Russet Burbank, với kết quả thu được là sự giảm mức độ nhiễm bệnh cũng làm cho giảm kích thước củ

Đã có bốn loại chất kháng khuẩn cho hiệu quả khi thử nghiệm invitro với S.scablies là vancomycin, gentamicin, PCBN, đồng sunfat, trong đó có gentamicin

(10ppm) và vancomycin (1,0ppm) có hiệu quả ở mức nồng độ thấp trong việc kiểm

soát S.scabies; trong khi PCNB và đồng sunfat thì cần nồng độ cao hơn rất nhiều

với mức lần lượt là 1.000ppm và 100ppm (Hollister, 2005)

1.5.4 Sử dụng loài đối kháng

Sanford (1926) là người đầu tiên gợi ý rằng các vi khuẩn có khả năng sinh

kháng sinh tự nhiên có khả năng ức chế sự phát triển của S.scabies Các loài đối kháng của Streptomyces đã được sử dụng như là tác nhân kiểm soát sinh học (Lui

và cs., 1995), ở trong nghiên cứu này có 2 chủng vi khuẩn được phát hiện là có tác

dụng đối kháng với S.scabies bao gồm S.diastatochromogenes PonSII và S.scabies stress PonR, chúng có tác dụng làm giảm đáng kể bệnh ghẻ trên khoai tây Sau đó,

Lui và cộng sự (1996) đã nghiên cứu kỹ hơn về 2 loài vi khuẩn này và cho thấy chúng có khả năng ức chế đến 22 loại tác nhân gây bệnh ở đất

1.5.5 Biện pháp di truyền với việc sử dụng giống kháng bệnh:

Giống khoai tây kháng bệnh ghẻ thường được xem là biện pháp hiệu quả nhất để chống lại tác hại của các tác nhân gây bệnh (Mckee, 1958) Biện pháp cải thiện di truyền của một loạt các đặc tính nông học quan trọng như năng suất, chất lượng sản phẩm, tính trạng kháng với cả bệnh hại và côn trùng đã cho những thành công nhất định trong các loài lưỡng bội (Spooner và Bamberg, 1994) Reddick (1953) cho rằng những cây kháng được bệnh ghẻ thường là do tính kháng bẩm sinh trong cây và những cây lưỡng bội sẽ dễ sử dụng các biện pháp chọn giống hay can thiệp di truyền hơn so với các dòng tam bội (Dionne và Lawrence., 1961) Điều này

được lý giải rằng trong quá trình giảm phân, bộ nhiễm sắc thể giảm chỉ còn một nửa nên các phân tích di truyền tính kháng dễ dàng được phân tích, và những thông số

về mức độ biểu hiện, liều lượng tác động sẽ được xác định, đặc biệt, số lượng các nhiễm sắc thể khi chỉ còn một nửa thì trên lý thuyết sẽ dễ dàng áp dụng các biện pháp tái tổ hợp, cuối cùng, nguồn gen khoai tây hiện nay đã được giải trình tự rõ ràng cũng là một cơ sở cho việc nghiên cứu tính kháng bệnh

Một số nghiên cứu đã được thực hiện khi nghiên cứu về đặc tính kháng bệnh

ghẻ thường trên khoai tây đã chỉ ra rằng S.commersonii, S.chacoense, S.caldassii var glabrescens và S.jamesii đều có sức đề kháng với bệnh ghẻ thường (Reddick,

1939) Nghiên cứu đã xem xét việc di truyền đặc tính kháng bệnh bằng cách sử dụng các loài lai lưỡng bội (Tai và cs., 1996; Murphy và cs., 1995), vật liệu di truyền được lựa chọn dựa trên đặc tính kháng của loài lượng bội và có thể đảm bảo giữ nguyên đặc tính khi chuyển thành dòng tứ bội Trong báo cáo của Jansky và Rouse (2003) cho kết quả tương tự với khả năng di truyền tính kháng bệnh ghẻ khi

tiến hành nghiên cứu mở rộng về bệnh chết yểu (Verticillium dahliae) và bệnh bạc

lá sớm (Alternaria solania) Với việc kết hợp các tính trạng di truyền dạng dại ở các dòng S.berthaultii, S.tarijense và S.chacoense đã cho thấy tính trạng kháng bệnh

được di truyền ở cả con cháu ngay cả khi chuyển sang trạng thái tứ bội

Tính trạng kháng bệnh ghẻ thường ở các dòng khoai tây được cho là một tính trạng chất lượng (Cipar và Lawrence., 1972), và có hai hướng giả thuyết đưa ra rằng

có hai locus chịu trách nhiệm về tính kháng bệnh ghẻ ở khoai tây (Alam, 1992), giả thuyết thứ nhất cho rằng có một alen trội thể hiện tính kháng, giả thuyết thứ hai là

có nhiều alen thể hiện tính kháng tại những locus khác nhau

Tuy nhiên những nghiên cứu chuyên sâu để đưa ra phương pháp sàng lọc gen kháng hiệu của đối với bệnh ghẻ thường ở khoai tây thì chưa có, điều này từ trước đến nay đều được lý giải là do những tác động của môi trường tác động rất lớn đến khả năng kháng bệnh của giống tạo nên cũng như thời gian tạo giống bằng phương pháp lai lại rất mất thời gian thế nhưng tính trạng này lại dễ dàng bị thay đổi sau một đến năm năm

1.6 Những biện pháp sàng lọc tình kháng bệnh ghẻ ở các dòng khoai tây

Kỹ thuật sàng lọc bệnh ghẻ thường cũng như sàng lọc tính kháng ở cây khoai tây là mục tiêu cần thiết trong thời gian gần đây Theo các biện pháp truyền thống, những biện pháp thử nghiệm đã được sử dụng đển phân biệt giữa dòng mẫn cảm và dòng không mẫn cảm với bệnh, tuy nhiên những kết quả này cũng được khuyến cáo

là có thể không hoàn toàn chính xác do chịu ảnh hưởng của các điều kiện môi trường Đã có nhiều nỗ lực trong việc hạn chế/giảm tác động của điều kiện môi trường, một giải pháp trong cải thiện môi trường trồng khoai tây đã được Keinath

và Loria (1991) thực hiện, kết quả cho thấy mức độ tương quan giữa mật độ trồng

và mức độ nghiêm trọng của bệnh ghẻ thường ở khoai tây Jellis (1974) đã áp dụng kiểm soát độ ẩm đất trồng bằng cách che phủ, kết quả cho thấy sự khác biệt rõ về mức độ mẫn cảm với bệnh ở những điều kiện độ ẩm đất khác nhau

Những nghiên cứu ban đầu đã cố gắng kích thích và lây nhiễm bệnh ghẻ trong điều kiện nhân tạo Wiersema (1970) đã báo cáo về mức độ đáng tin cậy của thí nghiệm trong điều kiện nhà kính, với các cây thí nghiệm được trồng trong chậu nhựa, nước tưới được thực hiện theo kiểu subirrigation thay vì phương pháp tưới mặt như thông thường đã cho kết quả là mức độ mẫn cảm với bệnh tăng cao Theo Bjor (1974) thì sự khác nhau của đất canh tác sẽ cho kết quả về mức độ nhiễm bệnh khác nhau, chỉ khi đồng nhất được điều kiện trồng cho thí nghiệm là trên hỗn hợp cát đã có tác nhân gây bệnh thì kết quả mới có tính đồng nhất cao Tiếp theo, Bjor

và Roer (1980) đã tạo một phương pháp thử nghiệm tính mẫn cảm của khoai tây đối

với S.scabies bằng cách sử dụng cây giống là cây từ hạt gieo trong điều kiện nhà

kính Cây thí nghiệm của hai giống mẫn cảm là Kerrs Pink và Bintje, hai giống thể hiện tính kháng là FxAq-1 và T-64-12-28 được trồng trên cát đã được bổ sung tác nhân gây bệnh Nhóm tác giả nhận thấy rằng, với phương pháp lây nhiễm thông qua môi trường trồng là cát thì mức độ nhiễm/kháng bệnh của các giống thí nghiệm phù hợp với kết quả đồng ruộng, đồng thời nhóm nghiên cứu cũng tìm thấy kết quả từ 2-

3 chậu thí nghiệm/dòng

Những thí nghiệm đánh giá mức độ ảnh hưởng của Thaxtomin lên sự tăng trưởng của khoai tây được tiến hành và thu được các kết quả đáng chú ý Tất cả các

loại thaxtomin đểu gây tác động sinh lý lên cây khoai tây, tuy nhiên nông độ tác động lại khác nhau tùy thuộc vào từng chủng giống khoai tây Thống kê các triệu chứng bao gồm

- Tăng sự phát triển của rễ

- Giảm tăng trưởng rễ <50% so với đối chứng

- Giảm tăng trưởng rễ >505 so với đối chứng, giảm sự hình thành ngọn, xuất hiện hoại tử và quan sát thấy vết sưng ở thân và rễ

- Ngọn và rễ bị ức chế tăng trưởng hoàn toàn sau khi vết hoại tử lan rộng và cuối cùng cây chết

Theo kết quả nghiên cứu của Hiltunen và cs (2006) cho thấy việc thử nghiệm Thaxtomin gây ra nhưng can thiệp vào sự cân bằng nội bào của khoai tây, dẫn đến triệu chứng phì đại, rối loạn phát triển và sự thay đổi trong tổng hợp thành tế bào, đặc biệt ở ngưỡng nồng độ thaxtomin cao gây chết tế bào, kết quả này tương tự và phù hợp như đã được quan sát thấy ở một số loài thực vật khác

Những kết quả thí nghiệm in-vitro đã được tiến hành và gợi ý đây là một

sàng lọc hữu ích ban đầu đối với khoai tây để xem chúng có khả năng chịu bệnh hay không Với cách tiếp cận này có thể cho phép khảo sát một số lượng lớn các dòng giống khoai tây khi nhập nội và quyết định trồng thương mại Phương pháp này đã được áp dụng để lựa chọn cây còn trong một chương trình nhân giống khoai tây

1.7 Công nghệ miRNA và ứng dụng

1.7.1 RNA interference

RNA interference (RNAi) là các ARN nhỏ (20-30 nucleotit), không mã hóa protein, can thiệp và gây bất hoạt gen đặc hiệu ở bất kỳ sinh vật nhân chuẩn nào Được phát hiện từ năm 1990 đến nay, đã có rất nhiều nghiên cứu về quá trình can thiệp hay “làm câm” gen bởi ARN cũng như các thành viên tham gia vào quá trình sản sinh chúng hoặc quá trình điều hoà các sự kiện dẫn đến sự ức chế quá trình phiên

mã hoặc dịch mã của các gen mục tiêu Ở thực vật, các ARN nhỏ này có thể phân thành 2 nhóm: miRNA (microRNA) và siRNA (Small interfering hoặc Short interfering) Các gen chuyển mang RNAi là gen trội nên nó có thể được ứng dụng cho rất nhiều loài với bất kỳ một gen đã biết nào đó trong bộ gen, đặc biệt là đối

tượng thực vật Điều này mở ra tiềm năng sử dụng RNAi bằng việc thiết kế các siRNA và miRNA nhân tạo với các trình tự bổ sung đặc hiệu cho một gen quan tâm nào đó, gen này có thể bị “làm câm” một cách chính xác

Các tính năng nổi bật của RNAi:

- Cấu trúc can thiệp ở đây là RNA sợi kép chứ không phải là sợi đơn RNA antisense

- Mức độ làm câm gen cụ thể là khá cao

- Tính đặc hiệu và hiệu quả cao (chỉ cần một vài phân tử dsRNA là đủ cần thết cho hiệu quả can thiệp)

- Sự im lặng biểu hiện gen có thể diễn ra trong các giai đoạn phát triển khác nhau của toàn hệ thống

- Có thể tránh những cản trở bất thường gây ra bởi việc loại một gen ban đầu nào đó trong hệ thống

- Hiệu ứng câm gen có thể được di truyền qua nhiều thế hệ

1.7.2 MicroRNA

MicroRNA (miRNA) là 1 họ các phân tử ARN nhỏ được biết đến ở động thực vật, có tính bảo thủ cao, bền vững giữa các loài và có vai trò trong sự bảo tồn chức năng sinh học ở các loài sinh vật (Erika và cs., 2007) Có khoảng trên 4000 trình tự miRNA từ động vật, thực vật và virus đã được Sanger Centre miRBase Database công nhận (Version 9, 2006) Các hệ thống hpRNA và miRNA phát triển gần đây đã chứng minh chúng là những công cụ hiệu quả trong phân tích di truyền ngược về chức năng của gen cũng như để thiết kế di truyền các tính trạng mong muốn khác nhau ở cây trồng (Kusaba và cs., 2004; Small, 2007; Tang và cs., 2007)

Cùng đem lại tác động câm gen hiệu quả đến mRNA, nhưng sự sinh tổng hợp của hai nhóm RNAi là hoàn toàn khác nhau (Bartel, 2004; Jones và cs., 2006; Sunkar

và cs., 2007; Ossowski và cs., 2008); So với siRNA thì miRNA mang nhiều ưu điểm hơn: (i) Do có nguồn gốc nội sinh nên miRNA tránh được các hiện tượng off-target; (ii), Có thể làm câm gen đặc hiệu ở mức độ mô hay tế bào; (iii), miRNA có trình tự

bổ sung không hoàn toàn với mRNA mục tiêu nên đặc biệt hữu ích cho việc nhắm tới một nhóm các gen bệnh có trình tự tương đồng, bảo thủ cao (Cheng và cs., 2012)

1.7.3 RNAi trong thực vật

Công nghệ điều kiển gen qua RNAi trung gian đã cung cấp nền tảng với sựu phát triển các công cụ phân tử thân thiện với mục tiêu cải tiến cây trồng (Umesh và cs., 2012) Việc ngăn chặn biểu hiện gen thông qua RNAi có thể được áp dụng cho nhiều hướng nghiên cứu như thay đổi, tăng hay giảm biểu hiện tính trạng chất lượng của cây trồng, các đặc tính mới ngay cả như khả năng kháng bệnh (Nakayashiki 2005; Brodersen và Voinnet.2006; Abdolhamid và cs 2010) Trong thực vật, có hai nhóm RNAi được phân biệt dựa trên đặc tính di truyền và chức năng của chúng là miRNA và siRNA, gần đây, cả hai nhóm miRNA và siRNAs đều đã được chứng minh là có tính bảo tồn cao, có khả năng quản lý biểu hiện của những gen quan trọng trong thực vật (Jones-Rhoades và Bartel, 2006; Axtell và Bowman, 2008)

Phương thức hoạt động của các cấu trúc RNAi nhỏ giúp kiểm soát biểu hiện gen ở mức độ phiên mã hoặc hậu phiên mã đang được phát triển thành công cụ hữu hiệu của sinh học phân tử Tuy nhiên, công việc tiếp theo cần phải chỉ ra được rằng các cấu trúc này hoạt động hữu hiệu ở cả 3 cấp độ bao gồm (i) biểu hiện ở mức độ

tế bào chất khi cấu trúc dsRNA phân cắt các mRNA, hay còn được biết đến với vai trò trong quá trình hậu phiên mã – PTGS; (ii)hoạt động của miRNA ảnh hưởng tiêu cực đến sự biểu hiện mRNA dẫn tới việc tăng hoạc giảm biểu hiện của protein; (iii) RNAi liên quan đến sự methyl hóa DNA và ức chế hậu phiên mã (TGS) (Mansoor

và cs., 2006) Những bằng chứng gần đây cho thấy miRNA có liên quan đến các phản ứng stress sinh học của cây Vai trò này lần đầu tiên được mô tả bởi nghiên cứu của Jones-Rhoades và Bartel (2004), một số miRNA có liên quan đến stress sinh học trong các con đường phản ứng của cây cây khi bị nhiễm vi khuẩn gây bệnh, tuyến trùng, nấm đã được báo cáo (Ruiz-Ferrer và Voinnet., 2009; Katiyar và Jin., 2010) MiRNA cũng được biết đến trong việc điều chỉnh tương tác giữa vi

khuẩn và thực vật trong chu trình cố định Nito của Rhizobium và quá trình hình thành khối u của nhóm vi khuẩn Agrobacterium (Katiyar và Jin., 2010) Năm 2009,

nhóm nghiên cứu của Mishra và cộng sự đã quan sát thấy một sự gia tăng đáng kể hàm lượng GC trong trình tụ miRNA khi có các stress sinh học, kết quả này ủng hộ cho quan điểm rằng miRNA đóng vai trò trong việc giúp cây trồng ổn định trước

các stress Hàm lượng GC giàu có thể được xem là một tham số quan trọng để dự đoán miRNA ở thực vật

Các siRNA nội sinh đầu tiên ở thực vật đều được phát hiện có liên quan đến

các stress sinh học như nat-siRNAATGB2 điều hòa khả năng miễn dịch thông qua

cơ chế trung gian có sự tham gia của yếu tố effector (Katiyar và cs., 2006)

Những nghiên cứu tập trung về RNAi có thể chỉ ra một điều rằng miRNA tham gia vào cơ chế giúp thực vật điều chỉnh hoạt động cần thiết của các gen, giúp cây có thể thích nghi với các điều kiện môi trường Giải thích cho mức độ phức tạp của các miRNA trong cây là do cây phát triển và sinh tồn trong môi trường sống vô cùng đa dạng và cực đoạn với hàng loạt các yếu tố stress

1.7.4 Cơ chế hoạt động của miRNA

Hầu hết các miRNA đều liên kết với vùng UTR-3' của mRNA mục tiêu và thường hình thành cấu trúc sợi đôi bắt cặp không hoàn chỉnh với trình tự mục tiêu nên một miRNA có thể nhắm tới hàng trăm gen và một mRNA cũng có thể chứa vị trí gắn với một hay nhiều miRNA Hai cơ chế câm gen chính ở trong tế bào chất đã được xác định cho miRNA: (i) ức chế dịch mã bằng ức chế điểm khởi đầu dịch mã hoặc sự kéo dài chuỗi polypeptide; (ii) phân hủy mRNA (bằng loại bỏ đuôi polyA hoặc bằng phức hợp cắt mRNA theo kiểu endonuclease)

MiRNA thường hoạt động trong tế bào chất, nhưng một số miRNA gần đây đã được tìm thấy trong nhân, có thể đóng một vai trò quan trọng trong cơ chế điều hòa biểu hiện gen Cụ thể, theo Clark và cộng sự (2011), phần lớn miRNA có mặt trong nhân của các tế bào gốc thần kinh người, thường biểu hiện liên tục cao hơn so với tiêu chuẩn biểu hiện của miRNA ở trong nhân so với tế bào chất

1.7.5 Phương pháp tiếp cận để tạo RNAi trong cây trồng

Một thách thức lớn cho các nhà khoa học trong nghiên cứu ứng dụng RNAi

đó chính là tạo ra được cấu trúc gen mang RNAi mục tiêu Hầu hết các phương pháp phổ biến và thành công nhất là sử dụng hệ gen của virus (VIGS) (Fenselau và cs., 2012) Các loại virus với bộ máy di truyền khác nhau bao gồm cả RNA và DNA đều được sửa đổi để làm vector biểu hiện gen Thông qua quá trình sao chép của virus đã sản sinh ra các cấu trúc dsRNA trung gian hoạt động hiệu quả trong RNAi

được gọi là VIGS (Senthilkumar và cs., 2011) Khi các loại virus hoặc gen được chuyển vào trong cây, nó kích hoạt quá trình PTGS, lúc này cấu trúc dsRNA được tạo ra bởi quá trình trung gian khi RNA virus nhân đôi (Tyagi và cs., 2008) Cấu trúc dsRNA sau đó được xử lý tiếp tạo cấu trúc siRNA hoặc miRNA, chúng sau đó tham gia vào phức hợp RISC, phức hợp này có tác dụng

Hiện nay, các nghiên cứu về RNAi mới được bắt đầu và vẫn còn nhiều vấn đề chưa sáng tỏ Về mặt kỹ thuật, hiệu quả làm câm gen của các RNAi vẫn cần phải được cải thiện do một số gen được chuyển hoạt động rất hiệu quả trong khi một số gen khác lại không Việc làm câm gen không thành công có thể xảy ra do: i) sản sinh không đủ lượng RNAi với các trình tự đặc hiệu, ii) không tiếp cận được vị trí bổ sung trên mRNA hoặc iii) khó khăn trong việc duy trì trạng thái giảm của mRNA mục tiêu

do tác động âm tính của việc điều hoà Bên cạnh đó còn xảy ra các hiện tượng tác động đến gen không phải là gen mục tiêu (off-target) Đây là do một lượng lớn các RNAi sản sinh từ cấu trúc thiết kế có thể liên kết với bất kỳ gen nào có trình tự bổ sung (hoàn toàn hoặc gần hoàn toàn) với chúng

Tuy nhiên, các phân tích biểu gen ở mức hệ gen đã cho thấy, các miRNA nhân tạo có tính đặc hiệu tương tự với các miRNA nội sinh, vì vậy trình tự của chúng có thể được thiết kế dễ dàng để làm câm một hay một vài bản sao mục tiêu mà không ảnh hưởng tới sự biểu hiện của các bản phiên mã khác

1.7.6 Các công cụ phát hiện miRNA và mục tiêu mRNA hiệu quả

Có nhiều ứng dụng thích hợp để xác định mức độ biểu hiện của miRNA Sự biểu hiện của các miRNA khác nhau có thể được định lượng cùng nhau bằng phân tích Microarray hay vi giải trình tự (deep sequencing), trong khi Northern blotting,

real-time RT-PCR, and In-situ hybridization (ISH) có thể dùng để xác định mức độ

biểu hiện của từng miRNA Tuy nhiên, xác định các gen mục tiêu thông qua chức năng miRNA là khía cạnh phức tạp nhất trong nghiên cứu miRNA Để có các thông tin ban đầu về mục tiêu của miRNA ta có thể xem xét các dữ liệu tin sinh thông qua các chương trình dự đoán mRNA mục tiêu tiềm năng cho từng miRNA Nhưng do các chương trình này chỉ là dự đoán mục tiêu giả định, nên điều quan trọng là phải sử dụng các kỹ thuật xác nhận mục tiêu miRNA Các phương pháp cơ bản có thể dự

đoán miRNA và xác nhận mục tiêu đó là: Bioinformatic Prediction of MicroRNA

Targets, In-vitro UTR Analysis, Transcriptome and Proteome Analysis, Biochemical

Assays for Target Detection (Eva, 2011)

Tuy nhiên, cách tốt nhất để nghiên cứu chức năng của miRNA là bằng kiểm tra các thay đổi kiểu hình trong nuôi cấy hoặc trong một sinh vật có biểu hiện phản ứng lại sự điều hòa của miRNA Gần đây, một số chiến lược nghiên cứu chức năng

của các miRNA đặc hiệu trong in-vitro và in-vivo đã phát triển, như: In-vitro

MicroRNA Regulation, Genetic Manipulation of MicroRNA Levels, Therapeutic

MicroRNA Inhibition In-vivo, MicroRNA Mimicry In-vivo (Eva, 2011) Để phát hiện

1 miRNA thích hợp với mRNA mục tiêu, có thể đơn giản chỉ dựa trên kích thước của miRNA và cấu trúc miRNA liên quan tới mức độ tương đồng cao với các chuỗi trình

tự mRNA Nhưng nên áp dụng nhiều phương pháp song song, để giúp đánh giá đúng đắn sự hiện diện và hiệu quả điều hòa của miRNA Và điều quan trọng là các miRNA không chỉ có chức năng với một gen duy nhất nên sự điều hòa kết hợp của nhiều gen khác nhau mới xác định được chức năng của một miRNA

1.8 Ứng dụng của miRNA trên cây khoai tây

Khoai tây được coi là một hệ thống mô hình chuyển gen vì khả năng tiếp nhận

Agrobacterium và tái sinh từ bất kỳ một bộ phận nào của cây Hơn nữa, khoai tây được

nhân giống vô tính do đó không có bất kỳ vấn đề nào về lo ngại sự phân ly, làm mất hay chuyển gen ngang các thông tin di truyền (Montanelli và Nascari., 1990) Việc chuyển gen vào khoai tây được thực hiện đã từ rất lâu nhưng vẫn chưa có công bố nghiên cứu nào về chuyển gen miRNA vào khoai tây kháng bệnh do vi khuẩn gây ra

Tuy nhiên, trên khoai tây, người ta đã ứng dụng công nghệ RNAi thành công trong việc tạo các giống kháng virus như: kháng virus PVX (Angell và Baulcombe, 1997) và PVY (Missiou và cs., 2004) Bên cạnh đó, việc chuyển gen RNAi nhằm tới các mục tiêu tính trạng nông sinh học cũng được công bố: dòng khoai tây có gen tổng hợp patatin bị làm “câm” nhằm ứng dụng trong việc sản xuất các glycoprotein trị liệu

ở người (Yoon và cs., 2008); làm câm gen StSXD1 trong khoai tây để ức chế sự tổng hợp vitamin E và đã nâng cao được khả năng quang hợp và điều khiển quá trình đồng hoá (Hofius và cs., 2006); ức chế hoạt động của gen mã hoá axit invertase trong quá

trình bảo quản củ nhằm nâng cao chất lượng khoai tây (Zhang và Su, 2008)

Trong nghiên cứu của Yang (2010) dự đoán miRNA tiềm năng ở khoai tây, nhận thấy có 71 miRNA thuộc 48 họ Hầu hết các họ miRNA đều có 1-3 thành viên,

và phân tích trình tự chỉ ra các cấu trúc pre-miRNA đều có độ dài khoảng 48 - 224bp

Đa số miRNA đều có mức biểu hiện cao nhất ở lá, và mức thấp nhất trong thân cây Một số nghiên cứu đã chứng minh, microRNA 172 (miR172, có trên cơ sở dữ liệu EST của khoai tây) có vai trò quan trọng trong thời gian từ sinh trưởng đến ra hoa của thực vật Dựa trên các thông tin đó, Antoine (2009) đã thực hiện mô hình cho đường hướng tạo củ ở khoai tây dựa trên nghiên cứu miR172 Ngoài ra, bằng cách sử dụng cấu trúc pre-miR159a, pre-miR167b và pre-miR171, Ai và cộng sự (2011) đã thiết kế

2 amiRNA nhằm ức chế sự biểu hiện của gen HC-Pro trên Potato virus Y (PVY) và TGBp1/p25 (p25) của Potato virus X (PVX) Kết quả nhận thấy hiệu quả ức chế nhờ

tác động của amiRNA là rất mạnh mẽ, duy trì tính kháng cả 2 virus trên cây khoai tây chuyển gen trong điều kiện tăng áp lực virus Chuyển cấu trúc ihRNA sử dụng

promoter 409S ức chế biểu hiện protein vỏ (CP) của Potato virus Y cũng cho thấy

hiệu quả cao (Missiou và cs., 2004)

Có thể nói, RNAi là một công nghệ mới, đang được sử dụng một cách rộng rãi trong lĩnh vực sinh học và phát triển nhanh chóng Với hàng loạt các nghiên cứu đã, đang và sẽ được triển khai nhằm hiểu rõ về cơ chế, hoạt động của RNAi đồng thời hoàn thiện công nghệ này, các ứng dụng của RNAi sẽ tạo ra những lợi ích kinh tế và

xã hội to lớn

CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu thực vật: Giống khoai tây Atlantic (Viện Sinh học Nông Nghiệp,

Học viện Nông Nghiệp Việt Nam) và 3 dòng khoai tây chuyển gen D1-At-Po9, D2-At- Po9, D89-At-Po9 ( Ngô Thị Thanh Hiền, 2012)

Dòng Giống Đã được chuyển vector Ký hiệu

D89 Atlantic pPS1-PomiR9 D89-At-Po9

Vật liệu vi sinh vật:

- Vi khuẩn Agrobacterium tumerfacience pPS1 poMiR9 (Bộ môn CNSH

TV- Khoa CNSH- Học viện Nông Nghiệp Việt Nam)

- Vi khuẩn Streptomyces scabies (ACTT 49173)

Hình 2.1: Cấu trúc Vector pPS1-poMir9