Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhạn dạng một số nguồn gen hoa lan hoàng thảo (dendrobium) bản địa của việt nam (TT)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN DUY DƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ NHẬN DẠNG MỘT SỐ NGUỒN GEN HOA LAN HOÀ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

TRẦN DUY DƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN

VÀ XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ NHẬN DẠNG MỘT SỐ

NGUỒN GEN HOA LAN HOÀNG THẢO (DENDROBIUM)

BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM

Chuyên ngành : Di truyền và Chọn giống cây trồng

Mã số : 62.62.01.11

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI - 2015

Luận án được hoành thành tại:

VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS Lã Tuấn Nghĩa

2 TS Nguyễn Thị Thanh Thuỷ

Phản biện 1:……… Phản biện 2:……… Phản biện 3:………

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sỹ tại Viện

Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vào lúc:……giờ…….ngày…….tháng… năm…

Có thể tìm hiểu luận án tại:

Thư viện của Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) có số lượng lớn, đa dạng về hình

dáng, màu sắc và kích thước với hơn 1148 loài khác nhau, đứng thứ 2 trong họ

hoa lan, sau chi lan Lọng (Bulbophyllum) (Leitch và cs., 2009) Vùng Đông

Nam Á có thể coi là quê hương của chi lan Hoàng Thảo với hàng trăm loài, riêng ở Việt Nam đã có hơn 100 loài (Trần Hợp, 1998; Nguyễn Xuân Linh, 2002; Averyanov, 2004; Dương Đức Huyến, 2007), chúng được phân bố rộng rãi trên khắp các vùng miền trong cả nước

Trong công tác bảo tồn và sử dụng bền vững tài nguyên di truyền thực vật, việc đánh giá quỹ gen là công đoạn vô cùng quan trọng không chỉ phục vụ cho việc xác định các giống/loài khác nhau mà còn nhằm tìm hiểu mối quan hệ

về di truyền giữa các giống/loài để bảo tồn đa dạng nguồn gen Sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp và kỹ thuật trong lĩnh vực sinh học phân tử đã tạo ra các công cụ hữu hiệu và nhanh chóng được ứng dụng trong nghiên cứu bảo tồn đa dạng sinh học Ưu thế của các kỹ thuật phân tử là có khả năng xác định được sự đa dạng ở mức độ gen, tạo cơ sở để đánh giá về giá trị bảo tồn của loài và quần thể Chính vì vậy, việc tạo lập cơ sở dữ liệu ADN (DNA fingerprinting) của các giống/loài, đăng kí ở ngân hàng gen thế giới, khẳng định chủ quyền quốc gia về tài nguyên di truyền thực vật của nước ta cũng như việc xác định bản quyền đối với giống cây trồng và thực hiện quyền sở hữu trí tuệ về tên các giống cây trồng quý, đặc hữu của Việt Nam nói chung và lan Hoàng Thảo nói riêng đang là vấn đề rất quan trọng, cấp bách, mang tính khoa học và thực tiễn cao, không chỉ phục vụ cho lợi ích trước mắt mà còn định hướng mục tiêu lâu dài trong công tác bảo tồn khai thác hiệu qủa nguồn gen phục vụ các chương trình kinh tế trọng điểm đất nước cơ sở

, chúng tôi đề tài nghiên cứu: “ Nghiên cứu đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng một số nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo (Dendrobium)

2 Mục tiêu của luận án

- Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ hình thái kết hợp với chỉ thị phân

tử để xác định mối quan hệ di truyền của các giống/loài hoa lan Hoàng Thảo bản địa phục vụ cho công tác phân loại, chọn và lai tạo giống mới

- Sử dụng chỉ thị ITS để để nhận dạng một số nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo bản địa quý của Việt Nam phục vụ cho công tác bảo tồn, làm cơ sở dữ liệu cho xây dựng ADN mã vạch

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Cung cấp dữ liệu khoa học về đa dạng di truyền ở mức hình thái và mức phân tử của các mẫu giống hoa lan thuộc chi Hoàng Thảo bản địa, là cơ sở để tuyển chọn những nguồn gen ưu tú phục vụ cho công tác chọn và lai tạo giống mới;

- Kết quả của đề tài rất có ý nghĩa trong việc nhận dạng một số giống/loài lan Hoàng Thảo bản địa Việt Nam, làm cơ sở cho công tác bảo tồn, lưu giữ các nguồn gen quý, có giá trị kinh tế và đăng kí trên ngân hàng gen thế giới

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Đề tài góp phần thu thập và lưu giữ các nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo bản địa của Việt Nam;

- góp phần bảo tồn và sử dụng hợp lí nguồn gen hoa lan

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài

4.1 Đối tượng nghiên cứu

- Là các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo bản địa được phân bố ở các vùng

miền Việt Nam

4.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Thí nghiệm được triển khai tại: Bộ môn Kĩ thuật Di truyền, thuộc Viện

Di truyền Nông nghiệp- Phạm Văn Đồng -Từ Liêm, Hà Nội

- Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2010 đến năm 2014

5 Những đóng góp của luận án

Luận án là công trình đầu tiên nghiên cứu một cách bài bản có hệ thống về đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị hình thái kết hợp với chỉ thị phân tử, nhận dạng các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo bản địa quý hiếm của Việt Nam dựa vào trình tự vùng ITS Kết quả của luận án có ý nghĩa

phong l

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược về chi lan Hoàng Thảo

1.1.1 Hệ thống phân loại

Trong hệ thống phân loại thực vật, chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) thuộc họ lan hay họ phong lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales), phân lớp Hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Liliopsida), ngành thực vật hạt kín

Angiospermanophyta), phân giới thực vật bậc cao (Cosmobionia), giới thực vật

(Plantae) (Trần Hợp, 1998; Hoàng Thị Bé, 2004; Leitch và cs., 2009; Evans và

cs., 2012)

Nghiên cứu phân loại chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium sw) ở Việt Nam

thường dựa trên hệ thống của Seidenfaden (1985) Hệ thống này rõ ràng, không phức tạp, có độ tin cậy cao và phù hợp với các đại diện của chi lan Hoàng Thảo ở Việt Nam (Trần Hợp, 1998; Dương Đức Huyến, 2007)

1.1.2 Đặc điểm hình thái

1.1.2.1 Thân

Thân của các đại diện chi lan Hoàng Thảo đều phân đốt, hình trụ, hình con suốt, hình chùy, hình trứng, có chiều dài thay đổi từ 2-3cm đến 120cm hoặc đôi khi hơn, kích thước phổ biến là 20-50cm (Trần Hợp, 1998) Thân có thể mảnh, đôi khi dẹp bên hoặc là dày mập lên hay có dạng tràng hạt

1.1.2.2 Rễ

Rễ của các đại diện chi lan Hoàng Thảo là rễ khí sinh, thường mảnh, hình trụ, màu xanh và chuyển thành nâu khi già, chúng thường ôm lấy giá thể hoặc buông thõng xuống

1.1.2.3 Lá

Lá mọc thành hai dãy so le nhau, không có cuống mà chỉ có bẹ ôm thân,

ít khi không có bẹ Lá thường cứng, dạng da, bóng, ít khi nạc và mềm, bề mặt thường nhẵn Lá thường hình mác, bầu dục, đôi khi hình kiếm, hình thuôn hoặc

ít khi lá hình thoi dài (Averyanov, 2004)

1.1.2.4 Nhóm hoa

Nhóm hoa thường là nhiều hoa, đôi khi ít hoa hoặc hoa đơn độc Nhóm hoa dài thường rủ thõng xuống, nhiều loài có nhóm hoa đẹp có giá trị làm cảnh (Trần Hợp, 1998)

1.1.3 Phân bố vùng sinh thái

chủ yếu ở vùng núi suốt từ Bắc, Trung, Nam và ở trên một số đảo ven biển nước ta (Trần Hợp, 1998; Averyanov, 2004)

1.2 Giá trị sử dụng củaa hoa lan Hoàng Thảo

Ngoài ý nghĩa làm cảnh, một số loài Hoàng Thảo cũng là một vị thuốc dân tộc cổ truyền h và cs., 2004; Cai và cs., 2012; Feng

và cs., 2013)

1.3 Tổng quan phương pháp nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền và xác định maker nhận dạng ở thực vật

1.3.1 Khái niệm về đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể trong

cùng một loài và giữa các loài khác nhau, là sự đa dạng về gen có thể di truyền được trong một quần thể hoặc giữa các quần thể

1.3.2 Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền

Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự nhiên và rất quan trọng đối với con người

1.3.3 Các phương pháp đánh giá đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng ở thực vật

1.3.3.1 Phương pháp dựa vào chỉ thị hình thái

Phương pháp đánh giá đa dạng ở mức hình thái là phương pháp truyền thống, bao gồm việc miêu tả những đặc điểm, cấu tạo hình thái bên ngoài, cụ thể là thân, lá, hoa

1.3.3.2 Phương pháp dựa vào các chỉ thị hóa sinh

Các isozyme được định nghĩa như các dạng khác nhau của một enzyme (protein) có chức năng giống hay gần gũi nhau có ở cùng một cá thể (Salazar, 2003)

1 3 3 3 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền dựa vào các chỉ thị phân tử ADN

Các chỉ thị ADN phổ biến trong nghiên cứu sinh học phân tử ở thực vật là: Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP); Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP); Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD); Microsatellite hay Simple Sequence Repeates (SSR); Inter-simple sequence repeats (ISSRs) (Singh và cs., 2012; Shangguo và cs., 2013; Swati

Das và cs., 2014)

1.3.3.4 Các phương pháp nghiên cứu về phân loại thực vật dựa trên trình

tự gen

* Vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) là một đoạn RNA không có

chức năng, nằm giữa các RNA cấu trúc của ribosome thường được dịch mã Cấu trúc vùng ITS gồm ITS1 – 5.8S – ITS2 Một lợi thế của vùng ITS là nó bao gồm 2 locus riêng biệt (ITS1 và ITS2) được nối với nhau qua locus 5.8S Vùng 5.8S khá bảo ôn, trên thực tế có đủ tín hiệu phát sinh loài phân biệt ở mức bộ và ngành (Richardson và cs., 2001; Sharma và cs, 2012)

* Vùng Gen rbcL (ribulose-bisphosphate carboxylase) được sử dụng

nhiều để dựng cây phát sinh loài Tuy nhiên, đối với mối quan hệ di truyền ở mức dưới loài thì sự phân tích trên gen này gặp nhiều hạn chế (Kress và Erickson, 2007)

* Vùng gen matK (gen mã hóa cho maturaseK): Các nghiên cứu sử dụng

trình tự gen matK để xây dựng cây phát sinh loài như cho thấy gen matK có tính đa dạng hơn những gen khác có trong lục lạp và do vậy gen matK trở thành

gen chỉ thị quan trọng để giúp phân loại thực vật (Asahina và cs., 2010; Sharma

và cs., 2012)

1 4 Tình hình nghiên cứu hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam

1.4.1 Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và xác định chỉ thị nhận dạng hoa lan trên thế giới

1.4.1.1 Nghiên cứu ở mức độ hình thái

Đối với loài Lan Hoàng Thảo (Dendrobium), có rất nhiều các nghiên

cứu về cây lan Hoàng Thảo như các nghiên cứu của Pellegrino và cs., 2005; Krishnan và cs., 2011)

1.4.1.2 Nghiên cứu ở mức độ phân tử

* Các nghiên cứu dựa vào chỉ thị RFLP trên ADN lạp thể

Đối với cây hoa lan Hoàng Thảo, mới đây nhất Surin và cs., 2014 đã sử dụng kĩ thuật RFLP để xác định định dạng 25 giống hoa lan Hoàng Thảo bản địa của Thái Lan 23 trong số 25 giống này đã được nhận dạng, chỉ duy nhất có

hai loài là D crumenatum và D formosum không xác định được

* Các nghiên cứu dựa vào chỉ thị RAPD

Đã có các nghiên cứu sử dụng chỉ thị RAPD để phân tích đa hình ở lan,

các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào một số loại như lan Kiếm (Cymbidiums), lan Hài (Paphiopedilum), lan Hồ Điệp (Phalaenopsis), lan Đai Châu

(Rhynchostylis gigantea) và lan Hoàng Thảo (Dendrobium) (Bateman, 2001;

Choi và cs., 2006; Goh và cs., 2005; Li và cs., 2007; Parab và cs., 2008; Zha và

cs., 2009; Chattopadhyay và cs., 2012; Paromik và Suman, 2014) Trên cây

hoa lan Hoàng Thảo, mới đây nhất, Pritam Chattopadhyay và cs., 2012 đã sử dụng 5 mồi RAPD để phân tích mối quan hệ di truyền giữa 5 loài lan Hoàng Thảo tại phía Bắc của Ấn Độ Kết quả cho thấy, với tổng số 124 băng ADN được phân tích thì phát hiện có 25 băng cá biệt giữa các giống lan Hoàng Thảo

* Các nghiên cứu dựa vào chỉ thị SSR

Đối với

Đối với chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium), chỉ có một vài

nghiên cứu về sử dụng chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng di truyền trong những năm gần đây như các nghiên cứu của Fan và cs., 2009, Cai và cs., 2012; Liu và

cs., 2014)

* Các nghiên cứu dựa vào chỉ thị ISSR

Với hoa lan Hoàng Thảo, năm 2009 tác giả Wang và cộng sự đã sử dụng 17 chỉ thị ISSR để đánh giá đa dạng di truyền của 31 loài hoa lan Hoàng Thảo được thu thập ở Trung Quốc Kết quả cho thấy, trong số tổng 2368 băng được khuếch đại thi

có 278 ISSR locus có độ đa hình là 100%

* Các nghiên cứu dựa vào trình tự ADN

Công trình đầu tiên trên thế giới sử dụng mã vạch ADN để phân biệt

Dendrobium là công trình của nhóm tác giả Trung Quốc công bố năm 2009 (Yao và

cs., 2009) Trong nghiên cứu này, các tác giả giải mã vùng chen giữa psbA-trnH nằm

trên genome lục lạp của 17 loài Dendrobium Cũng trên đối tượng Dendrobium, nhóm tác giả Nhật Bản (Asahina và cs., 2010) lại sử dụng trình tự gen matK và rbcL

để phân định loài đồng thời nghiên cứu sự phát sinh chủng loài của nhóm

Dendrobium dùng trong y học

1.4.2 Tình hình nghiên cứu hoa lan ở Việt Nam

Từ năm 1985 đến nay đã có một số viện nghiên cứu và các trường đại học như Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, Viện Sinh học Nhiệt đới, Đại học Nông Nghiệp

I, Đại học Lâm Nghiệp, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Rau hoa quả đã tập trung vào nghiên cứu, điều tra, phân loại lưu giữ một số tập đoàn phong lan ở nước ta Đối với cây hoa lan Hoàng Thảo, Nguyễn Thị Mỹ Duyên và cộng sự., 2012 đã nghiên

cứu dựa trên đặc điểm hình thái và tìm ra được ba loài D.pulchellum, D.Gatton

Sunray và D.moschatum có mối quan hệ rất gần nhau, mức tương đồng lần lượt là

và nhận diện lan Hoàng thảo trầm rừng (D.parishii) và Phi điệp (D.anosmum) tại

Việt nam

CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu phục vụ cho nghiên cứu bao gồm:

- Kế thừa nguồn vật liệu của đã có của Viện Di truyền Nông nghiệp và

GS TS Trần Duy Quý, 32 mẫu giống hoa lan thuộc chi Hoàng Thảo (độ tuổi từ 2-3 năm) được thu thập ở các tỉnh miền của cả nước và được lưu giữ tại vườn lan thuộc Trung tâm công nghệ cao, Viện Di truyền Nông nghiệp và nhà vườn

số 422, đường Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nội dung 1: Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo bản địa của Việt Nam

2.2.1.1 Đánh giá đa dạng di truyền các nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo ở mức hình thái

2.2.1.2 Đánh giá đa dạng di truyền của các nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo ở mức độ phân tử bằng chỉ thị RAPD

2.2.2 Nội dung 2: Giải trình tự vùng ITS của gen ribosom nhân để nhận dạng một số nguồn gen hoa lan Hoàng Thảo bản địa trong tập đoàn nghiên cứu 2.3 Phương pháp nghiên cứu

2 3.1 Phương đánh giá đa dạng di truyền ở mức hình thái

- Mô tả hình thái hoa lan theo phương pháp của Pellegrino, 2005 là phương pháp truyền thống, bao gồm việc miêu tả những đặc điểm, cấu tạo hình thái bên ngoài

2.3.2 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền mở mức phân tử bằng chỉ thị RAPD

2.3.2.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số

2.3.2.2 Điện di kiểm tra kết quả tách chiết ADN tổng số

2.3.2.3 Kiểm tra ADN bằng trên gel agarose

2.3.2.4 Kiểm tra ADN bằng máy đo quang phổ

2.3.2.5 Phản ứng RAPD

Các loại mồi RAPD thuộc nhóm OPA và OPN do hãng Operon cung cấp; mồi ITS do Sigma cung cấp

2.3.3 Giải trình tự vùng ITS của gen ribosom nhân

2 3.3.1 Khuếch đại vùng ITS bằng kỹ thuật PCR

Vùng ITS được khuếch đại bằng cặp mồi ITS1 và ITS4

2.3.3.2 Giải trình tự sản phẩm PCR

2 3.3.3 So sánh với cơ sở dữ liệu GenBank

2 3.3.5 Xây dựng cây phát sinh loài

2.4 Phần mềm xử lý số liệu

- Số liệu nghiên cứu được phân tích, xử lý dựa trên các phần mềm Excel version 5.0, phần mềm PCORD, phần mềm NTSYS, MEGA: phiên bản 5.2.1, để xây dựng cây phát sinh loài

2 5 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm và thời gian nghiên cứu: Bộ môn Kĩ thuật Di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp, thời gian nghiên cứu: 2010-2014

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

hoa lan nhà vườn số 422 Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội 3

D20, D21, D22, D23, D24 và D25 có dải phân bố rộng từ Bắc đến Nam Các mẫu giống hoa còn lại chỉ tìm thấy ở một số địa phương của một vài tỉnh miền Trung hoặc phía Nam, trong đó có mẫu giống hoa Hoàng thảo Vani (D27), Hoàng Thảo Đại Bạch

3.1.1 Kết quả đánh giá đa dạng si truyền bằng chỉ thị hình thái

Thân của các đại diện chi Hoàng thảo đều phân đốt, có nhiều hình dạng như: hình con suốt, hình chùy, hình vuông, hình tràng hạt, thuôn tròn, và phổ biến nhất là hình trụ Thân cũng có nhiều dạng khác nhau như, thân mảnh thân bám, thân phình to mập, thân dài, thân ngắn phình to, nhưng đa số là thân dài, buông thõng xuống Cá biệt có loài chỉ có các mấu dày lên, còn lóng thì hầu như không có, làm thân có dạng tràng hạt (D2) hoặc sự dày lên là dần dần độc lập ở mỗi lóng làm thành dạng đùi gà nối tiếp (D28) Đây là dấu hiệu đặc trưng để nhận

dạng hoa lan Hoàng Thảo Điện Biên (D2) là loài đặc hữu của Điện Biên

D1 Hoàng Thảo Long nhãn Lai

D2 Hoàng Thảo Chuỗi ngọc

Điện Biên D findlayanum Điện Biên D18 Hoàng Thảo Chuỗi Ngọc D findlayanum Kontum D3 Hoàng Thảo Thái Bình D moschatum Thái Bình D19 Hoàng Thảo Kiều trắng Đồng

D4 Hoàng Thảo Phi Điệp tím D anosmum Hòa Bình D20 Hoàng Thảo Tiểu hoàng lạp D chrysotoxum Kontum D5 Hoàng Thảo Trầm tím D.parishii Sơn La D21 Hoàng Thảo Đại hoàng lạp D chrysotoxum Lâm Đồng D6 Hoàng Thảo trầm trắng D.parishii.var alba Điện Biên D22 Hoàng Thảo bạch hạc langbiang D wattii Lâm Đồng D7 Hoàng Thảo Ngọc Vạn Vàng D chrysanthum Yên Bái D23 Hoàng Thảo Hạc vĩ D aphylum Đà Lạt

Hoàng Thảo Phi điệp vàng D chrysanthum Điện Biên D24 Hoàng Thảo vảy rồng lá nhỏ D.lindleyi QuảngTrị D9 Hoàng Thảo Long tu Bắc D primulinum Sơn La D25 Hoàng Thảo Vảy rồng lá trung D lindleyi Lâm Đồng D10 Hoàng Thảo Trúc D hancockii Ninh Bình D26 Hoàng Thảo Thủy tiên mỡ gà D haveyanum Lâm Đồng

D11 Hoàng Thảo Xoắn D tortile Ninh Bình D27 Hoàng Thảo Vani D aduncum Kon Tum

D13 Hoàng Thảo Kiều vàng D thyrsiflorum Tuyên Quang D29 Hoàng Thảo Long tu đá D primulinum Tây Nguyên D14 Hoàng Thảo Kiều trắng D farmeri Tuyên Quang D30 Hoàng Thảo Môi tơ D delacourii Guill Tây Nguyên D15 Hoàng Thảo Tam Đảo D daoense Tam Đảo D31 Hoàng Thảo Nhất Điểm Hồng D draconis Rchb.f Lâm Đồng D16 Hoàng Thảo Hoàng lạp Tây Bắc D chrysotoxum D32 Hoàng Thảo Đại bạch hạc D christyanum Kontum

Ghi chú: D Dendrobium

Lá mọc thành hai dãy so le nhau, không có cuống mà chỉ có bẹ ôm thân Lá phân bố suốt dọc thân nhưng ở nhiều đại diện lá tập trung 2-6 chiếc ở đỉnh thân cũng

có khi phần đỉnh thân chỉ có hoa mà không có lá Lá thường tồn tại khi cây ra hoa

Số lượng lá thay đổi từ rất nhiều (D15 trung bình 35,9 lá/cây; D23 trung bình 31,7 lá/cây) đến rất ít (D22 trung bình 6,46 lá/cây) Lá có thể cứng hoặc mềm, bề mặt thường nhẵn Đa số lá của lan Hoàng Thảo trong 32 mẫu giống nghiên cứu có lá dạng hình lưỡi mác, mộit vàu lá hình bầu dục, đỉnh lá nhọn, nhọn lệch hoặc tù

Nhóm hoa có thể có nhiều hoa, hoặc có ít hoa Nhóm hoa dài thường rủ thõng xuống, hoặc mọc so le (Hình 3.4) Các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo có sự khác biệt rõ rệt với nhau về kích thước, số lượng, cách sắp xếp và màu sắc, hình dạng lá đài, cánh hoa, cánh môi Hoa thường không quá lớn, đường kính dao động trong khoảng 1,35-5,8cm Cánh môi của các mẫu giống nghiên cứu có nhiều màu sắc khác nhau như màu vàng sẫm hay vàng nhạt, màu trắng có đốm vàng hoặc cam ở giữa, hay màu trắng họng đen (D3) hoặc màu tím (D4), màu vàng họng đen (D1), màu tím nhạt họng vàng vv Hình dạng cánh môi thường gặp là hình tròn, hình gần tròn hình rô, hình phễu, hình tim, hình bầu dục, hình trứng hay hình cằm (D32) Từ các kết quả về số liệu hình thái như thân, lá, hoa của 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo, chúng tôi sử dụng phần mềm Pcord 4.0 để xây dựng sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo (Hình 3.6)

Hình 3.4 Một số kiểu hoa của các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo

Xét ở mức độ tương đồng 37%, 32 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo chia làm 5 nhóm chính:

Nhóm I: Bao gồm 8 mẫu giống là các mẫu D1, D3, D4, D5, D6, D10, D11,

D15 ở mức độ tương đồng từ 55-100% và chia làm hai nhóm phụ:

+ Nhóm phụ thứ 1 bao gồm 6 mẫu giống là các mẫu D1, D3, D4, D5, D6 và D11 trong đó 3 giống D4, D5 và D6 được xếp vào một nhóm là các mẫu HT Phi điệp tím (D4), Hoàng thảo trầm tím (D5) và Trầm trắng (D6) có hệ số tương đồng di truyền từ 95 đến 100% trong đó mẫu D5 và D6 có hệ số tương đồng di truyền 100%

+ Nhóm phụ thứ 2 gồm 2 mẫu giống D10 (Hoàng Thảo Trúc) và D15 (Hoàng Thảo Tam Đảo)

Hình 3.6 Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền của 32 mẫu giống

hoa lan Hoàng Thảo dựa trên chỉ thị hình thái Nhóm II: gồm 15 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo khác nhau có hệ số tương

đồng di truyền từ 37-100% bao gồm các mẫu giống D2, D7, D9, D12, D13, D14, D17, D18, D19, D22, D23, D26, D27, D29, D30 ở mức độ tương đồng di truyền từ 37-100% Ở mức độ tương đồng di truyền 43% các mẫu này lại chia thành hai nhóm phụ khác nhau bao gồm:

Nhóm phụ II.1: Bao gồm 8 mẫu giống là các mẫu D2, D9, D17, D18, D23, D27, D29 và D30 trong đó hai mẫu D2 và D18 có hệ số tương đồng di truyền là 100%

Nhóm phụ II.2: Bao gồm các mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo gồm D7, D12, D13, D14, D17, D19 và D26 ở mức độ tương đồng di truyền 68% Nhóm phụ thứ II.2 chia thành hai nhóm nhỏ hơn trong đó D7 và D17 vào một nhóm còn lại là 5 mẫu giống D12, D13, D14, D19, và D26 tạo thành một nhóm Đây là các giống hoa lan Hoàng Thảo Kiều của miền Bắc hay gọi là Thủy Tiên theo cách gọi của người miền Nam Các mẫu giống hoa trong nhóm này về đặc điểm hình thái như thân, lá, hình dạng hoa khá giống nhau, chỉ khác nhau về màu hoa Nhóm này bao gồm các loài mang đặc điểm là có hoa to, cánh môi thường phủ lông rậm, có u lồi Tuy vậy

sự khác biệt lớn ở đây là thân có hình con suốt, lá tập trung ở đỉnh, cụm hoa thường nhiều hoa (Clements, 2003; Dương Đức Huyến, 2007)

Nhóm III: Bao gồm 4 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo là D8, D28, D31và

D32 Trong số 4 mẫu giống này thì hai mẫu giống D31 và D32 rất dễ nhầm khi chúng có đặc điểm hình thái như thân, lá, rễ, hoa tương đối giống nhau Hai mẫu giống này chỉ khác nhau về đặc điểm hình dạng cánh môi, mẫu giống D31 có hình dạng hình mác, còn mẫu giống D32 có dạng hình cằm

Nhóm IV: Bao gồm 3 mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo là các mẫu giống D16,

D20 và D21 Trong số 3 mẫu giống này thì hai mẫu giống D20 và D21 được phân bố ở hai tỉnh Đồng Nai và Lâm Đồng Về mặt hình thái chúng có màu hoa giống nhau hơn nữa hình thái như thân, lá, rễ cũng như nhau, chỉ khác nhau về kích thước lá

Nhóm V: gồm hai mẫu giống hoa lan Hoàng Thảo là Hoàng Thảo vảy rồng lá

nhỏ (D24) và Hoàng Thảo Vảy rồng lá trung (D25) Đây là hai mẫu giống phân bố ở khắp ba miền Bắc, Trung và Nam có đặc điểm hình thái như nhau và chỉ khác nhau

về kích cỡ lá Có thể nhận thấy rằng hai giống này là một loài và chỉ khác nhau ở vùng phân bố nên khả năng sinh trưởng và phát triển của chúng có ít sai khác đặc biệt là lá

Sự phân loại chi Dendrobium từ trước đến nay một trong những vấn đề phức

tạp trong họ Orchidaceae do sự đa dạng về hình thái, phạm vi phân bố rộng, số lượng các loài lớn, và do sự biến đổi hình thái chồng chéo giữa các loài Cho tới nay, đại đa số các nhà phân loại đều chia chi lan Hoàng Thảo thành các nhóm

(section) Một vài tác giả đã chọn cách phân chia chi Dendrobium thành các phân

chi (subgenra)(Dressler, 1993; Kumar và cs., 2011; Schuiteman, 2011) Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, việc sử dụng chỉ thị hình thái để đánh giá đa dạng di

Tuy nhiên,

trong việc phân loại các loài thuộc chi lan Hoàng Thảo của Việt

3.1.2 Kết quả đánh giá đa dạng di truyền ở mức phân tử

3.1.2.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số

Kết quả thực hiện

nhiên, mồi OPN9 có tổng số băng nhân lên được nhiều nhất (254 băng), mồi OPN7

có tổng số băng nhân lên thấp nhất (84 băng) Dưới đây là một số mồi RAPD điển hình (Hình 3.11)

Trong tổng số 20 mồi RAPD được sử dụng trong nghiên cứu có 26 loại băng cá biệt hoặc băng khuyết xuất hiện Mồi OPN7 cho năm loại băng khác nhau Còn lại là các mồi OPN1, OPN2, OPN3, OPN6, OPN8, OPN11, OPN12, OPN13, OPN16, OPN19, OPN20, OPA3 và OPA6 xuất hiện 1-2 băng cá biệt/hoặc băng khuyết V

mẫu