Thực trạng hội chứng tiêu chảy ở lợn con sau cai sữa tại vĩnh phúc và sử dụng kháng thể lòng đỏ trứng gà kháng f4 pili trong điều trị

HCTC chủ yếu do các E.coli có kháng nguyên bám dắnh pili F4 các chủng F5, F6 và F18cd, sản sinh các ựộc tố ựường ruột chịu nhiệt ST và không chịu nhiệt LT gây tiêu chảy ở lợn con ngay s

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

TRẦN QUANG THẮNG

THỰC TRẠNG HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY Ở LỢN CON SAU CAI SỮA TẠI VĨNH PHÚC VÀ SỬ DỤNG KHÁNG THỂ LÒNG ðỎ

TRỨNG GÀ KHÁNG F4-PILI TRONG ðIỀU TRỊ

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: THÚ Y M· sè : 60.62.50

Người hướng dẫn khoa học:TS CHU ðỨC THẮNG

PGS.TS NGUYỄN VIẾT KHÔNG

Hµ néi - 2012

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình do tôi chủ trì và thực hiện chính Những kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng ñược

sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này

ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, tháng 10 năm 2012

Tác giả luận văn

Trần Quang Thắng

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ quý báu của các thầy cô giáo khoa Thú y, Viện ñào tạo sau ñại học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã giúp

ñỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện ñề tài

Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS Chu ðức Thắng, PGS TS Nguyễn Viết Không ñã tận tình giúp ñỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo Bộ môn Nội chẩn - Dược lý và ðộc chất, Khoa Thú y, các cán bộ, nghiên cứu viên

Bộ môn Hoá sinh - Miễn dịch và Bệnh lý, Viện Thú y ñã giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài

Chân thành cảm ơn Lãnh ñạo Chi cục Thú y Vĩnh Phúc cùng toàn thể cán bộ, công nhân viên trong Chi cục ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới người thân trong gia ñình, bạn bè ñồng nghiệp

ñã luôn ñộng viên giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, tháng 10 năm 2012

Tác giả luận văn

Trần Quang Thắng

MỤC LỤC

LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

1.MỞ ðẦU 1

2 TỔNG QUAN 3

2.1 Hội chứng tiêu chảy ở lợn 3

2.1.1 Ảnh hưởng của mơi trường, khí hậu 3

2.1.2 Ảnh hưởng của chăm sĩc, nuơi dưỡng khơng đúng kỹ thuật 4

2.1.3 Nguyên nhân do ký sinh trùng 4

2.1.4 Nguyên nhân do vi rút 4

2.1.5 Nguyên nhân do vi khuẩn 5

2.2 Vi khuẩn E.coli 6

2.2.1 ðặc điểm hình thái của E.coli 7

2.2.2 ðặc tính nuơi cấy, sinh hĩa 7

2.2.3 Kháng nguyên và type huyết thanh 8

2.3 Yếu tố độc lực của ETEC 11

2.3.1 Yếu tố bám dính (Adhesion) 11

2.3.2 ðộc tố đường ruột 12

2.3.4 Yếu tố độc lực khác 14

2.4 Bệnh do E.coli gây ra ở lợn con theo mẹ 15

2.5 Bệnh tiêu chảy do E.coli ở lợn sau cai sữa 16

2.5.1 Các chủng gây bệnh 17

2.5.2 Yếu tố độc lực 17

2.5.3 Sinh bệnh học 17

2.5.4 Triệu chứng 18

2.5.5 Bệnh tích 18

2.5.6 Chẩn đốn 18

2.6 Bệnh phù đầu ở lợn con 19

2.7 Những nghiên cứu về chế phẩm phịng và trị bệnh do E.coli 20

2.7.1 Văc xin phịng bệnh lợn con tiêu chảy do E.coli 20

2.7.2 Chế phẩm lịng đỏ trứng trong phịng trị lợn con tiêu chảy 20

2.8 Nghiên cứu trong nước về phịng trị bệnh do E.coli ở lợn 21

2.8.1 Văc xin 21

2.8.2 Kháng sinh và chế phẩm sinh học thay thế 22

2.8.3 Kháng thể lòng ựỏ trứng 22

3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 đối tượng và nội dung nghiên cứu 24

3.2 địa ựiểm và thời gian nghiên cứu 24

3.3 Nguyên vật liệu 24

3.3.1 động vật thắ nghiệm và sinh phẩm 24

3.3.2 Môi trường, hóa chất 25

3.4.3 Phương pháp PCR xác ựịnh chủng F4 E.coli 28

3.4.4 Phương pháp ELISA kháng thể (Ab-ELISA)ở lợn 30

3.4.5 Phương pháp ựiều trị và theo dõi lợn ựiều trị 32

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

4.1 điều tra hội chứng tiêu chảy ở lợn con sau cai sữa tại Vĩnh Phúc 34 4.1.1 Tỷ lệ mắc HCTC trên ựàn lợn sau cai sữa năm 2009, 2010 34

4.1.2 Tỷ lệ mắc HCTC trên ựàn lợn sau cai sữa theo ựàn và cá thể 35

4.1.3 Tỷ lệ lợn sau cai sữa chết do HCTC tại ựiểm ựiều tra 37

4.1.4 Tỷ lệ mắc HCTC trên ựàn lợn sau cai sữa theo quy mô ựàn nuôi39 4.1.5 Tỷ lệ HCTC trên ựàn lợn sau cai sữa theo tình trạng vệ sinh 41

4.1.6 Tỷ lệ mắc HCTC trên ựàn lợn sau cai sữa theo giống lợn 44

4.1.7 Tỷ lệ mắc HCTC trên ựàn lợn sau cai sữa theo mùa 45

4.1.8 Tỷ lệ mắc HCTC trên ựàn lợn theo thời gian sau cai sữa 48

4.2 Nguyên nhân E.coli gây tiêu chảy ở lợn sau cai sữa 50

4.2.1 Kết quả phân lập vi khuẩn E.coli ở lợn con tiêu chảy 50

4.2.2 Kết quả PCR xác ựịnh gen mã hóa yếu tố ựộc lực của E.coli 51

4.2.3 Kết quả xác ựịnh hiệu giá kháng thể ở lợn con sau cai sữa 54

4.3 Kết quả phòng trị tiêu chảy ở lợn cai sữa bằng kháng thể dị loài 56 4.3.1 Kết quả ựiều trị thử nghiệm 57

4.3.2 Kết quả phòng bệnh bằng KT04 58

4.3.3 đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm ựến tăng trọng 59

5 KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ 61

5.1 Kết luận 61

5.2 Kiến nghị 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

A Tiếng Việt 63

B Tiếng Anh 68

DANH MỤC CÁC BẢNG

3.01 Trình tự nucleotide của các cặp mồi và sản phẩm nhân gene 29

3.02 Thành phần phản ứng PCR 29

3 03 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 30

3.04 Thành phần và các bước thực hiện Ab-ELISA 31

3.05 Sơ ñồ ELISA phát hiện kháng thể F4 ở huyết thanh lợn con 31

4.01 Tỷ lệ mắc HCTC trên ñàn lợn sau cai sữa trong 2 năm 2009, 2010………….34

4.02 Tỷ lệ lợn mắc HCTC theo ñàn và theo cá thể ở ba huyện 35

4.03 Tỷ lệ lợn sau cai sữa chết do HCTC ở ba huyện 37

4.04 Tỷ lệ mắc HCTC trên ñàn lợn sau cai sữa theo quy mô ñàn nuôi 39

4.05 Tỷ lệ mắc HCTC trên ñàn lợn sau cai sữa theo tình trạng vệ sinh thú y 42

4.06 Tỷ lệ mắc HCTC trên ñàn lợn sau cai sữa theo giống lợn 44

4.07 Tỷ lệ mắc HCTC trên ñàn lợn sau cai sữa theo mùa 46

4.08 Tỷ lệ mắc HCTC trên ñàn lợn theo thời gian sau cai sữa 48

4.09 Kết quả phân lập E.coli từ mẫu phân tiêu chảy lợn sau cai sữa 51

4.10 Kết quả PCR phát hiện gene mã hóa yếu tố bám dính 52

4.11 Kết quả PCR xác ñịnh gene mã hóa ñộc tố ñường ruột của F4(+)E.coli 53

4.12 Kết quả Ab-ELISA phát hiện kháng thể kháng F4-E.coli pili 54

4.13 Kết quả theo dõi ñiều trị lợn con tiêu chảy bằng KT04 57

4.14 Kết quả theo dõi ñiều trị dự phòng lợn con tiêu chảy 59

4.15 Kết quả theo dõi trọng lượng lợn ñiều trị bằng KT04 60

DANH MỤC CÁC HÌNH

3.01 Sơ ñồ phân lập và giám ñịnh vi khuẩn E.coli 28

4.01 Biến ñộng tỷ lệ lợn sau cai sữa mắc HCTC theo ñịa phương 36

4.02 Biến ñộng tỷ lệ lợn sau cai sữa chết do HCTC theo ñịa phương 38

4.03 Biến ñộng tỷ lệ mắc HCTC theo quy mô ñàn nuôi 40

4.04 Biến ñộng tỷ lệ lợn mắc HCTC theo tình trạng vệ sinh 42

4.05 Tỷ lệ mắc HCTC trên ñàn lợn sau cai sữa theo giống lợn 45

4.06 Biến ñộng tỷ lệ mắc HCTC trên ñàn lợn sau cai sữa theo mùa 46

4.07 Phân bố tỷ lệ lợn mắc HCTC theo thời gian sau cai sữa 49

4.08 ðiện di gel Multiplex PCR phát hiện gene Sta, STb và LT 53

4.09 Biến ñộng của kháng thể kháng F4-E.coli pili theo nhóm lợn 55

1 MỞ đẦU

Trong những năm gần ựây, ngành chăn nuôi lợn phát triển mạnh mẽ, trở thành một ngành sản xuất quan trọng Theo thống kê của Tổ chức Lương nông Thế giới (FAO), Việt Nam là quốc gia có số ựầu lợn nhiều nhất ở khu vực đông Nam châu Á với tổng ựàn lợn (2006) là 26,9 triệu Theo Cục Chăn nuôi, ựến năm

2020, tổng ựàn lợn của Việt Nam dự kiến ựạt 35 triệu con, ựóng góp 42% tỷ trọng chăn nuôi trong nông nghiệp

Các trang trại chăn nuôi lợn ở Việt Nam hiện ựang nuôi hầu hết các giống lợn ngoại như Landrace, Yorkshine, Duroc, PietranẦ có phẩm chất thịt cao, khả năng tăng trọng và hiệu quả kinh tế tốt Tuy nhiên, khi ựược nuôi trong ựiều kiện khắ hậu nước ta cùng với ựiều kiện chăm sóc chưa thực sự tốt các giống lợn trên hoặc thế hệ sau thường mắc một số bệnh truyền nhiễm, hiện tượng còi cọc chậm lớn và ựặc biệt là Hội chứng tiêu chảy (HCTC) đặc biệt là tiêu chảy ở lợn con sau cai sữa, ựây là hội chứng ựa nguyên nhân, phần lớn có liên quan ựến vi

khuẩn, trong ựó Escherichia Coli (E.coli) là phổ biến nhất Tại thời ựiểm cai

sữa, kháng thể thụ ựộng còn lại ở mức rất thấp và chưa có kháng thể chủ ựộng

tuy lợn con ựã tiếp xúc với mầm bệnh E.coli gây bệnh có 2 yếu tố ựộc lực quan

trọng là yếu tố bám dắnh ở ựầu pili và ựộc tố; yếu tố bám dắnh giúp căn bệnh bám vào thụ thể ở niêm mạc ựường ruột, vi khuẩn tăng sinh và sản sinh ựộc tố gây bệnh

Tiêu chảy lợn con do E.coli ựã có từ lâu và hiện vẫn rất phổ biến HCTC chủ yếu do các E.coli có kháng nguyên bám dắnh pili F4 (các chủng F5, F6 và

F18cd), sản sinh các ựộc tố ựường ruột chịu nhiệt (ST) và không chịu nhiệt (LT) gây tiêu chảy ở lợn con ngay sau cai sữa Vi khuẩn và ựộc tố làm cho lợn bị viêm ruột tiêu chảy, mất nước và ựiện giải dẫn ựến giảm sức ựề kháng, còi cọc

và chết nếu không ựiều trị kịp thời, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn

ðể ñiều trị lợn con tiêu chảy, rất nhiều trang trại sử dụng kháng sinh trộn vào thức ăn, nước uống Việc sử dụng kháng sinh tùy tiện gây nên hiện tượng kháng thuốc và tồn dư kháng sinh rất cao ðiều trị tiêu chảy ở giai ñoạn cai sữa

là vô cùng quan trọng, vì nó tiếp tục ảnh hưởng lớn tới sự phát triển của lợn ðể khắc phục tình trạng kháng thuốc và tồn dư kháng sinh, các thế hệ thuốc thay thế ñã ñược thử nghiệm nhằm nâng cao hiệu quả phòng, trị tiêu chảy ở lợn con sau cai sữa ñồng thời tạo ñiều kiện ñể cá thể lợn sinh trưởng tốt nhất có thể

“Thuốc” phòng trị lợn con tiêu chảy có hiệu quả nhất hiện nay là các chế phẩm sinh học

Xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn của sản xuất, cập nhật các công nghệ tiên tiến, ứng dụng chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng và trị tiêu chảy ở lợn

sau cai sữa, chúng tôi tiến hành ñề tài: “Thực trạng hội chứng tiêu chảy ở lợn

con sau cai sữa tại Vĩnh Phúc và sử dụng kháng thể lòng ñỏ trứng gà kháng F4-Pili trong ñiều trị"

Mục tiêu của ñề tài là:

Xác ñịnh ñược thực trạng hội chứng tiêu chảy ở lợn con sau cai sữa tại Vĩnh Phúc, thử nghiệm và ñánh giá ñược hiệu quả phòng và trị bệnh bằng chế

phẩm kháng thể lòng ñỏ trứng gà kháng F4-Pili E.coli, cung cấp cơ sở khoa học

ñể ñề xuất hướng sử dụng chế phẩm sinh học trong ñiều trị bệnh tiêu chảy ở lợn con sau cai sữa, giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh, hiện tượng kháng thuốc và tồn dư kháng sinh trong thực phẩm

2 TỔNG QUAN

2.1 Hội chứng tiêu chảy ở lợn

Tiêu chảy là biểu hiện lâm sàng của quá trình bệnh lý ñặc thù của ñường tiêu hoá Hiện tượng lâm sàng này tuỳ theo ñặc ñiểm, tính chất diễn biến, tuỳ theo lứa tuổi mắc bệnh, tuỳ theo nguyên nhân gây bệnh mà ñược gọi tên bệnh khác nhau như bệnh lợn con phân trắng, bệnh tiêu chảy sau cai sữa, chứng rối loạn tiêu hoá

Tiêu chảy luôn ñược ñánh giá là hội chứng phổ biến nhất trong các dạng bệnh của ñường tiêu hoá, xảy ra mọi lúc, ở mọi nơi và ñặc biệt là ở gia súc non với triệu chứng là tiêu chảy, mất nước và chất ñiện giải, suy kiệt, dẫn ñến có thể chết do trụy tim mạch (Radostits O.M và cộng sự, 1963, 1994)

Hội chứng tiêu chảy là một quá trình bệnh lý liên quan ñến nhiều yếu tố như dinh dưỡng, chăm sóc, ñiều kiện ngoại cảnh, ký sinh trùng, vi khuẩn, vi rút Mỗi yếu tố có thể là nguyên phát trong trường hợp này và là thứ phát trong trường hợp khác, việc phân biệt rõ nguyên nhân gây tiêu chảy là rất khó khăn Bất luận nguyên nhân nào dẫn ñến tiêu chảy thì hậu quả ñều là quá trình viêm nhiễm, tổn thương thực thể ñường tiêu hoá và cuối cùng luôn là quá trình nhiễm khuẩn (Trịnh Văn Thịnh, 1964; Hồ Văn Nam, 1997) Những nguyên nhân chính gây tiêu chảy ở lợn con bao gồm:

2.1.1 Ảnh hưởng của môi trường, khí hậu

ðiều kiện ngoại cảnh là yếu tố quan trọng ảnh hưởng ñến sức ñề kháng của

cơ thể gia súc Những thay ñổi các yếu tố như nhiệt ñộ, ẩm ñộ, mưa, nắng, ñiều kiện chuồng nuôi, ñều gây stress cho lợn, ñặc biệt ở giai ñoạn lợn con theo mẹ

và lợn con sau cai sữa với cấu tạo và chức năng sinh lý chưa hoàn thiện thường

bị tiêu chảy

Trong các yếu tố khắ hậu thì nhiệt ựộ lạnh và ựộ ẩm cao là hai yếu tố gây rối loạn hệ thống ựiều hoà trao ựổi nhiệt của cơ thể lợn dẫn ựến rối loạn quá trình trao ựổi chất, làm giảm sức ựề kháng của cơ thể, vi khuẩn và vi rút trong ựường tiêu hoá có thời cơ tăng cường ựộc lực và gây bệnh (Lê Văn Phước, 1997) Ở nước ta, trong những tháng mưa nhiều kèm theo khắ hậu lạnh, tỉ lệ lợn con tiêu chảy tăng rõ rệt, có khi tới 80-100% cá thể trong ựàn bị tiêu chảy (đào Trọng đạt và cộng sự, 1996)

2.1.2 Ảnh hưởng của chăm sóc, nuôi dưỡng không ựúng kỹ thuật

Trong chăn nuôi lợn, việc thực hiện ựúng quy trình chăm sóc, nuôi dưỡng

sẽ ựem lại sức khoẻ và tăng trưởng cho lợn Thức ăn kém phẩm chất, bị ôi thiu, nấm mốc, tạp khuẩn và các chất ựộc khác, khẩu phần ăn mất cân ựối, thay ựổi khẩu phần thức ăn ựột ngột, chế ựộ nghỉ ngơi, ăn uống không hợp lý hoặc lợn con sau khi sinh ra không ựược bú sữa mẹ kịp thời, hay sữa mẹ kém phẩm chất ựều có thể làm cho lợn con mắc tiêu chảy (đào Trọng đạt và cộng sự, 1996)

2.1.3 Nguyên nhân do ký sinh trùng

Ký sinh trùng ựường tiêu hóa là một trong những nguyên nhân gây tiêu chảy ở gia súc Tác hại của chúng không chỉ là tranh cướp chất dinh dưỡng của vật chủ

mà còn tiết ra ựộc tố làm giảm sức ựề kháng của vật chủ, tạo ựiều kiện cho các bệnh khác phát sinh Tại ựường tiêu hóa, các loài giun sán làm tổn thương niêm mạc ruột, nhờ ựó các loại mầm bệnh dễ xâm nhập, gây viêm ruột, gây rối loạn quá trình tiêu hóa hấp thu, kắch thắch nhu ựộng ruột, gây tiêu chảy và hiện tượng nhiễm trùng (Phạm Văn Khuê và Phan Lục, 1996) Một số loại ký sinh trùng như cầu trùng, giun ựũa, giun tóc, giun lươn là một trong những nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn sau cai sữa (Nguyễn Thị Kim Lan và Trần Thu Nga, 2005)

2.1.4 Nguyên nhân do vi rút

Trong số những mầm bệnh thường gặp ở lợn trước và sau cai sữa bị bệnh

tiêu chảy có rất nhiều loại vi rút: 20,9% lợn bệnh phân lập ựược Rotavirus;

11,2% có vi rút gây viêm dạ dày Ờ ruột truyền nhiễm; 2% có Enterovirus; 0,7%

có Parvovirus (Dẫn theo đào Trọng đạt và cộng sự, 1996) Các loại vi rút như Rotavirus (RV), Transmissible Gastroenteritis (TGE), Porcine Epidemic

Diarrhea Virus (PEDV) ựược ghi nhận là những nguyên nhân chủ yếu gây hội chứng tiêu chảy ở lợn Việt nam (Lê Minh Chắ, 1995; Nguyễn Tất Toàn, 2012) Các vi rút này tác ựộng gây viêm ruột và gây rối loạn quá trình tiêu hoá, hấp thu của lợn và cuối cùng dẫn ựến triệu chứng tiêu chảy

2.1.5 Nguyên nhân do vi khuẩn

Trong ựường ruột của gia súc nói chung và của lợn nói riêng có rất nhiều loài vi sinh vật cùng sinh sống ở trạng thái cân bằng và có lợi cho cơ thể vật chủ Dưới tác ựộng bất lợi nào ựó, trạng thái cân bằng của khu hệ vi sinh vật này bị phá vỡ, tăng sinh bất thường tất cả vi khuẩn hoặc chỉ một loài nào ựó gây ra hiện tượng loạn khuẩn, hấp thu ở ruột bị rối loạn, hậu quả là lợn bị tiêu chảy

Trong số các loại vi sinh vật, E.coli ựóng vai trò quan trọng, chiếm tỷ lệ

cao nhất 45,6% (đào Trọng đạt và cộng sự, 1996) trong số các vi khuẩn gây

tiêu chảy; tỷ lệ nhiễm E.coli ựộc ở lợn bình thường là 14,66% và ở lợn tiêu chảy lên tới 33,84% (Tạ Thị Vịnh và cộng sự, 1996); E.coli ựộc trong phân là 80% - 90% số mẫu xét nghiệm (Vũ Bình Minh và Cù Hữu Phú, 1999) E.coli gây bệnh

cho lợn là các chủng có kháng nguyên pili và sản sinh ựộc tố ựường ruột (Radostits O.M và cộng sự, 1994)

Ngoài E.coli, vi khuẩn Samonella và Clostridium perfringens cũng ựóng

vai trò quan trọng trong hội chứng tiêu chảy ở lợn con (Radostits O.M và cộng

sự, 1994; Phan Thanh Phượng, 1988; đặng Xuân Bình và Trần Thị Hạnh, 2001) Salmonella thường xuyên có trong ựường ruột lợn và khi ựiều kiện chăn nuôi, quản lý kém, sức ựề kháng của cơ thể giảm, những Salmonella này tăng sinh, trở

thành ựộc gây viêm ruột, tiêu chảy (Phan Thanh Phượng, 1988) Lợn con từ sơ

sinh ựến 2 tháng tuổi tỷ lệ nhiễm Salmonella 26,02% Lợn 3-4 tháng tuổi có tỷ lệ

nhiễm cao nhất 34,03% Sau ñó, giảm dần theo lứa tuổi: Lợn 5 – 8 tháng tuổi 16,17%; lợn 9 – 12 tháng tuổi 12,02% Khi bị tiêu chảy, lợn bị bội nhiễm

Salmonella khá rõ, vi khuẩn xuất hiện cả trong máu tim, thận (Hồ Văn Nam,

1997) ðến 1994, các nhà khoa học ñã ghi nhận có khoảng 2.200 serotype

Samonella và chia ra 67 nhóm huyết thanh dựa vào cấu trúc kháng nguyên O (Radostits O.M và cộng sự, 1994) C.perfringens cũng là những vi khuẩn thường

trú trong ñường tiêu hóa của lợn (ðặng Xuân Bình, 2004), tuy nhiên

C.perfringens ñộc, sản sinh ñộc tố LT thường xuyên tìm thấy ở phủ tạng lợn con

chết do tiêu chảy (ðặng Xuân Bình và Trần Thị Hạnh, 2001)

Trong số các nguyên nhân vi sinh vật gây tiêu chảy ở lợn con ký sinh trùng,

vi khuẩn và vi rút, tiêu chảy do vi khuẩn mang tính trường diễn, thường xuyên, dai dẳng, phần nào do ñặc tính thường trú của chúng tại ñường tiêu hóa của lợn

và gây bệnh khi có cơ hội Các loại vi khuẩn chính gây tiêu chảy ở lợn con bao

gồm E.coli, Salmonella và C.perfringens Tình hình diễn biến dai dẳng và phức

tạp hơn do những vi khuẩn này tiếp nhận thêm ñặc tính kháng kháng sinh

2.2 Vi khuẩn E.coli

Vi khuẩn Escherichia coli lần ñầu tiên ñược bác sĩ nhi khoa người ðức

Theodor Escherich (1857-1911) phân lập vào năm 1885 từ phân trẻ em Loại vi khuẩn này sống vô hại trong ruột già người và ñộng vật và ñược gọi tên là

Bacterium coli commune ðể tri ân người phát hiện, 4 năm sau vi khuẩn này

ñược ñổi tên thành Escherich Vi khuẩn này ñã có nhiều tên gọi khác nhau, nhưng từ phiên họp của Hội ñồng Danh pháp Quốc tế năm 1991 ñến nay, tên gọi ñược thống nhất là Escherichia coli (E.coli)

Ở ñộng vật khỏe mạnh, E.coli chỉ khu trú ở trực tràng, rất hiếm xuất hiện ở

dạ dày và ruột non Khi ñiều kiện ngoại cảnh bất lợi, sức ñề kháng của con vật

giảm, E.coli tăng sinh mạnh, phát triển ở ruột non và gây bệnh (ðặng Xuân Bình

và cộng sự, 2003) Vai trò E.coli gây lợn con tiêu chảy lần ñầu tiên ñược Schoield và

Davis ghi nhận năm 1955 (Dubreuil, J D STb and AIDA-I, 2010) Các công trình nghiên cứu sau ñó chứng tỏ bệnh lợn con tiêu chảy do E.coli thực sự gây thiệt

hại to lớn cho cả ngành chăn nuôi lợn

2.2.1 ðặc ñiểm hình thái của E.coli

Hình thái: E coli là trực khuẩn có hình gậy ngắn, hai ñầu tròn, kích thước

2-3 x 0,4-0,6 µm Vi khuẩn bắt màu Gram âm, thường thẫm hơn ở hai ñầu

Trong cơ thể E.coli có hình cầu trực khuẩn ñơn lẻ, ñôi khi tạo thành nhiều chuỗi ngắn E.coli có lông xung quanh thân, phần lớn có roi (di ñộng ñược)

Sức ñề kháng: Tại nhiệt ñộ cao, vi khuẩn E.coli bị diệt ở 55O

C trong 60 phút, ở 60OC trong vòng 15-30 phút, và chết ngay ở 100OC Tại nhiệt ñộ bình

thường ở môi trường bên ngoài, E.coli có thể tồn tại 4 tháng E.coli mẫn cảm với

những thuốc sát trùng Acid Phenic, Formol, Hydroperoxit bị diệt sau 5 phút tại nồng ñộ 0,1%

2.2.2 ðặc tính nuôi cấy, sinh hóa

ðặc tính nuôi cấy: E.coli dễ dàng phát triển trên môi trường nuôi cấy

thông thường, tuy nhiên chúng có thể sống yếm khí tùy tiện Vi khuẩn có thể thích nghi ở khoảng nhiệt ñộ 5-40OC và ở pH từ 5,5-8,0, ñiều kiện nuôi cấy thích hợp nhất là tại nhiệt ñộ 37OC và pH 7,2-7,4 Sau 24 giờ nuôi cấy trên các

môi trường thông thường, E.coli phát triển tốt với các ñặc ñiểm như sau:

- Môi trường nước thịt: Phát triển tốt, ñục, có cặn màu tro nhạt, mùi thối

- Môi trường thạch thường: Khuẩn lạc tròn hơi lồi, ướt bóng láng, màu tro

- Môi trường thạch máu: khuẩn lạc sáng màu, dung huyết tùy chủng

- Khuẩn lạc có màu ñỏ cánh sen ñặc trưng trên thạch MacConkey, màu ánh kim trên môi trường Endo, màu vàng chanh trên thạch Brilliant Green và màu tím ñen trên thạch Eosin Methyl Blue

E.coli trong phân thường ñược phân lập trên môi trường thạch MacConkey

hoặc Eosin Methyl Blue ở 370C trong ñiều kiện hiếu khí

ðặc tính sinh hóa: Việc phân biệt E.coli và những chủng thuộc họ

Enterobacteriaceae thường dựa vào các ñặc tính sinh hoá trên môi trường 3 ống

nghiệm sau 24 giờ nuôi cấy ở 37OC:

Trên môi trường KIA (Kligler Iron Agar) E.coli cho kết quả:

- Lên men ñường Glucose (+), phần thạch ñứng chuyển từ màu hồng sang màu vàng,

- Lên men ñường Lactose (+), phần thạch nghiêng chuyển từ màu hồng sang màu vàng,

- Sinh hơi (+) hoặc (-), chủng E.coli sinh hơi tạo bọt khí ở phần thạch ñứng

gây nứt thạch hoặc có thể ñẩy toàn bộ khối thạch lên cao,

- Không sinh H2S (-): phần thạch ñứng không có màu ñen

Trên môi trường Mannitol-Mobility các chủng E.coli cho kết quả:

- Lên men ñường Mannite (+), môi trường chuyển từ màu hồng sang màu vàng,

- Có thể di ñộng (+) làm môi trường ñục ñều hoặc không (-) tùy chủng

Trên môi trường Urea-Indol các chủng E.coli cho kết quả:

- Không sinh ureaza (-): màu môi trường không ñổi,

- Sinh Indol (+), xuất hiện một vòng màu ñỏ thẫm khi nhỏ thuốc thử Kowacs vào canh khuẩn

2.2.3 Kháng nguyên và type huyết thanh

Theo Kaufman (1994), cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E.coli rất phức

tạp Dựa vào kháng thể ñặc hiệu (hay type huyết thanh), các nhà khoa học ñã

phân loại kháng nguyên E.coli thagnh nhóm các kháng nguyên O (somatic),

kháng nguyên H (flagellar) và kháng nguyên K (capsular) Cho ñến nay có trên

250 loại kháng nguyên O, 56 loại kháng nguyên H và 89 loại kháng nguyên F

Do bản chất là protein, kháng nguyên K trước ñây còn có tên là kháng nguyên F (Fimbriae) hay kháng nguyên pili

Kháng nguyên O (Somatic, kháng nguyên thân) Theo Ewing, W.H và

Kauffmann, F (1948, 1950); Nagy, L.K và Bharucha, Z (1973) là thành phần của Lipopolysaccharide ở lớp ngoài màng tế bào, có tính ñặc trưng về serotype tùy loài vi khuẩn; Ngược lại, lớp Polysaccharide trong màng là như nhau ở các

E.coli, khi thay ñổi cấu trúc làm thay ñổi ñộc lực vi khuẩn và hình thái khuẩn lạc

(dạng S sang dạng R) Kháng nguyên O chịu nhiệt, bền với cồn và axit Các

serotype O của vi khuẩn E.coli thường ñượcxác ñịnh bằng phản ứng ngưng kết

Kháng nguyên H (flagella): Theo Orskov, F (1953), kháng nguyên H là

thành phần protein của roi vi khuẩn, nên gắn liền với khả năng di ñộng của

E.coli ðặc tính này giúp cho vi khuẩn tránh bị thực bào tiêu diệt và làm tăng

khả năng tiếp xúc với bề mặt tế bào vật chủ Kháng nguyên H kém chịu nhiệt, axit và cồn

Kháng nguyên K (Kapsul) ñược gọi do chúng tạo ra ngứng kết khi sử

dụng kháng nguyên toàn khuẩn, do vậy K ñược nghĩ là là thành phần của vỏ polysaccharide (Briggs, C, 1951) Gần ñây, kháng nguyên K ñược biết là thành phần của pili bao quanh bề mặt tế bào, các kháng nguyên K ñổi tên thành kháng nguyên F (Fimbriae hay kháng nguyên Pili) Kháng nguyên pili có thể ñược phân loại dựa theo sự khác biệt về hình thể, hoá học, chức năng và ñặc tính

kháng nguyên Các chủng Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) sinh ñộc tố

ñường ruột phân lập từ lợn mắc tiêu chảy có mang các kháng nguyên F4 (K88), F5 (K99), F41, F6 (987P) và F18 (Vazquez, F và cộng sự, 2006)

Kháng nguyên K ở bề mặt nên có khả năng ngăn cản sự ngưng kết của vi khuẩn với kháng huyết thanh O (lớp polysaccaride màng ngoài) Khi gia nhiệt, kháng nguyên K bị biến tính và mất tác dụng ngăn cản Kháng nguyên K ñược chia thành 3 loại chính tùy vào khả năng chịu nhiệt: L (biến tính ở 100oC sau 1 giờ), B (100OC trong 1 giờ nhưng vẫn giữ ñược khả năng ngưng kết), và A vẫn giữ nguyên khả năng ngưng kết sau xủa lý 121OC sau 2,5 giờ (Nisbet D 2002) Dưới kính hiển vi ñiện tử, pili (fimbriae) vi khuẩn mang yếu tố bám dính có

dạng sợi bao gồm các ñơn vị cấu trúc nhỏ do vậy F còn có tên gọi là kháng nguyên bám dính Protein kháng nguyên F dài khoảng 0,5-3 µm, ñường kính 2,1- 7,0 nm, dạng thẳng hay xoắn Kháng nguyên pili giúp vi khuẩn bám dính vào thụ thể ñặc hiệu (receptor) trên tế bào niêm mạc ruột, do vậy là yếu tố ñộc lực quan trọng của

vi khuẩn

Kháng nguyên bám dính F4 (K88): Theo Nisbet D 2002, K88 là loại kháng

nguyên kém chịu nhiệt, bị phá huỷ ở nhiệt ñộ cao Ở nhiệt ñộ ≤18oC E.coli không

sản sinh kháng nguyên K88 (Vũ Khắc Hùng, 2003) F4 là một protein dạng sợi, phần thân sợi chứa các tiểu ñơn vị protein FaeF, FaeH, FaeC, và có thể FaeI kế tiếp nhau thành dạng sợi Phần ñỉnh là protein FaeG Kháng nguyên F4 ñược cấu tạo gồm 2 phần: cố ñịnh (F4a) và thay ñổi Orskov và cộng sự 1964, ghi nhận phần thay ñổi gồm 2 loại b và c, Guinee và Jansen, 1979 phát hiện thêm loại ”d” ðến nay F4 có 3 suptype chính là F4ab, F4ac và F4ad

Kháng nguyên F5 (K99): Theo de Graaf F K 1981, F5 Protein ñược cấu tạo

từ các tiểu ñơn vị 18,5 kDa có ñiểm ñẳng ñiện 9,5; gene mã hóa cho protein F5 nằm trên Plasmid (Acres, S.D, 1985) Kháng nguyên F5 là một yếu tố gây bệnh phổ biến, hay gặp ở các chủng ETEC gây tiêu chảy cho bê, nghé, dê, cừu non, ñôi khi ở lợn (Moon H.W và cộng sự, 1977) Trong quá trình nghiên cứu kháng nguyên F5, người ta phát hiện một protein tương tự nhưng có trọng lượng phân tử lớn hơn,

ñược gọi là F41, có gene mã hóa ở Genome của E.coli

Kháng nguyên F6 (987P): Yếu tố bám dính của các F6 ETEC gắn vào thụ thể

glycoprotein ở tế bào thành ruột (Shin, S.J và cộng sự, 1994; Khan, A S và cộng

sự, 1996) F6 có cấu trúc chuỗi xoắn ñược tạo thành từ 2 tiểu protein FasF và FasG

và một tiểu ñơn vị FasA ở ñỉnh của sợi pili

Kháng nguyên bám dính F18: Trước kia gọi là F107 bao gồm 2 biến thể

F18ab và F18ac có miễn dịch bảo hộ chéo Những F18ab E.coli thường sản xuất

ñộc tố VT2e và gây bệnh phù ñầu và các F18ac thường sản xuất ñộc tố ñường ruột

và gây bệnh tiêu chảy

2.3 Yếu tố ñộc lực của ETEC

Các chủng vi khuẩn thuộc nhóm Enterotoxigenic E.coli (ETEC) tham gia vào

quá trình gây bệnh nhờ hai ñặc tính chủ yếu: (1) Khả năng bám dính vào các thụ thể ở tế bào biểu mô ruột nhờ các yếu tố bám dính như F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F41 và F18ac; và (2) Sản sinh ít nhất một loại ñộc tố ñường ruột (ñộc tố không chịu nhiệt LTI và LTII; ñộc tố chịu nhiệt STI và STII) (Ewing W H và

cộng sự, 1950) Vì vậy, ñể xác ñịnh một chủng vi khuẩn E.coli có thể gây bệnh tiêu

chảy của lợn, cần phải xác ñịnh ñược sự có mặt của cả hai yếu tố gây bệnh

2.3.1 Yếu tố bám dính (Adhesion)

Bám dính là quá trình nhận biết và tương tác của các kháng nguyên bề mặt

vi khuẩn ñối với các ñiểm nhận trên tế bào Các thụ thể bcd tương ứng cho các F4 pili là tập hợp các glycoprotein có khối lượng phân tử từ 45-70 kDa, thụ thể

bc là sự kết hợp của 2 glycoprotein với khối lượng phân tử tương ứng là 210 và

240 kDa, thụ thể b là một glycoprotein có khối lượng phân tử là 74 kDa, và thụ thể d là glycophingolipid (Van den, B W và cộng sự, 2000)

Quá trình này diễn ra do bản chất lý hoá học, và tương tác sinh học do liên kết ñặc hiệu giữa kháng nguyên tại yếu tố bám dính (pili) với receptor tương ứng trên bề mặt của các tế bào biểu mô:

Tác ñộng vật lí và hoá học: Vi khuẩn di ñộng , tiếp xúc và liên kết từng phần với bề mặt tế bào, tùy thuộc vào ñặc tính của vi khuẩn và tế bào mà vi khuẩn bám dính, tương tác bám dính là phản ứng thuận nghịch

Tương tác sinh học: Là quá trình tương tác giữa yếu tố bám dính của vi khuẩn tại các ñiểm tiếp nhận trên bề mặt tế bào vật chủ

Kháng nguyên K88 ñảm nhiệm chức năng bám dính của vi khuẩn vào phần trên của ruột non, có thể dựa vào khả năng bám dính cao của kháng nguyên bám

tế bào nhung mao ruột lợn (Lê Văn Tạo và cộng sự, 1991)

ðây là yếu tố ñặc biệt quan trọng, giúp vi khuẩn thực hiện bước ñầu của quá

trình gây bệnh (Anderson, E S và cộng sự, 1973; Shin, S J và cộng sự, 1994) là tiêu chuẩn ñể phân biệt vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn không gây bệnh thường trực

ở ñường tiêu hoá (Lê Văn Tạo, 1995) Nhờ có yếu tố bám dính, E.coli bám vào các

tế bào biểu mô của niêm mạc ruột và không bị rửa trôi theo phân

Các F4 E.coli (ETEC) là một trong những nguyên nhân quan trọng gây tiêu

chảy ở lợn con sau cai sữa và lợn con theo mẹ (Vũ Khắc Hùng, 2003) Tỷ lệ ngưng

kết K88 của các chủng E.coli phân lập từ lợn con tiêu chảy cao hơn chủng từ lợn

con không tiêu chảy (93,33% so với 33,33%) (Trương Quang, 2005)

2.3.2 ðộc tố ñường ruột

ðộc tố ñường ruột: Vi khuẩn E.coli gây bệnh tiêu chảy sản sinh các

Enterotoxin gồm hai loại ñộc tố chính, khác nhau ở khả năng chịu nhiệt: ðộc tố chịu nhiệt (Heat Stable Toxin – ST) không bị biến tính ở nhiệt ñộ 100OC trong

15 phút, ñộc tố không chịu nhiệt (Heat Labile Toxin – LT) bị vô hoạt ở 60OC trong 15 phút Gene mã hóa cho LT và ST nằm trên Plasmid ETEC có thể ñồng

thời sản sinh 2 loại ñộc tố hoặc chỉ 1 loại Các E.coli gây bệnh ở người thường

sản sinh ST (Takeda, Y và cộng sự, 1983)

Các Enterotoxin tác ñộng vào chu trình Adenylat làm thay ñổi quá trình trao ñổi muối-nước, dẫn ñến tiêu chảy Chúng không gây ra những biến ñổi bệnh tích hoặc sự thay ñổi về mặt hình thái của lớp niêm mạc ruột non Enterotoxin chỉ làm gia tăng mạnh quá trình thẩm xuất H2O, Na+ và Cl-, gây giảm sự hấp thu nước và các chất dinh dưỡng Kết quả là cơ thể bị mất nước, mất muối NaHCO3, con vật rơi vào tình trạng bị nhiễm ñộc và suy kiệt

- ðộc tố không chịu nhiệt LT: ðộc tố LT của E.coli là protein có khối

lượng phân tử lớn (Gyles, C L và Barnum, D, 1969), bị vô hoạt ở 60OC trong

15 phút (Nataro J P và Kaper J, 1998) ðộc tố LT chỉ tìm thấy ở các chủng ETEC gây bệnh cho người và lợn nhưng không thấy ở ETEC gây bệnh ở bò (Acres S D, 1985)

LT kích hoạt enzyme adenylate cyclase, tăng cường chu trình adenosine monophosphate (cAMP) ñến mức quá ngưỡng, dẫn ñến sự gia tăng thẩm xuất

Cl-, Na+, HCO- và nước vào trong lòng ruột Cơ thể mất nước trầm trọng, các quá trình trao ñổi chất bị ngừng trệ, con vật bị trúng ñộc do a xit nội sinh ðộc tố LT gồm 2 phân lớp LT-I và LT-II, không có phản ứng miễn dịch

chéo LT-I có hai phân lớp LTp (LTp-I) tìm thấy ở E.coli lợn và LTh (LTh-I,

người) có quan hệ gần gũi và có thể phản ứng chéo (Takeda, Y và cộng sự, 1998) LT-II ñược tìm thấy chủ yếu ở E.coli trên ñộng vật và hiếm khi ở người,

LT-II có một số ñặc tính sinh học tương tự ñộc tố CT và LT-I, nhưng không bị trung hoà bởi huyết thanh kháng LT-I và Vibrio cholerae toxin (Nisbet D 2002; Holmes, R K và cộng sự, 1986)

- ðộc tố chịu nhiệt: ST có trọng lượng phân tử nhỏ bền vững nhờ có nhiều

cầu nối disulfit Gen mã hoá cho các ST protein chủ yếu trnằm ở plasmid, một vài trường hợp tìm thấy ở transposon ST ñược chia thành 2 nhóm là STa và STb, khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt ñộng STa (hay ST-I) ñược sản sinh bởi ETEC, khoảng 50% giống với EAST1 do EAEC sản sinh Một số chủng ETEC sản sinh cả hai loại ñộc tố STa và EAST1 (Savarino, S J et al, 1996) STb chỉ ñược tìm thấy ở các ETEC

STa là một peptide gồm 18-19 amino acid với trọng lượng phân tử khoảng

2 kDa STa ñược chia thành 2 lớp gọi là STp (ñộc tố ST ở lợn hay STIa) và STh (ñộc tố ST ở người hay STIb) Thụ thể chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cyclase C thuộc họ những enzyme receptor cyclase (Vaandrager A B, 1994) Sự kết hợp của STa vào thụ thể kích thích hoạt tính guanylate cyclase C, gia tăng lượng cGMP nội bào (Sears, C L and Kaper, J B, 1996) kích thích tiết

Cl- và/hoặc ngăn cản sự hấp thu NaCl, gây ra sự tiết chất lỏng trong ruột

STb chủ yếu thấy ở các chủng ETEC từ lợn, hiếm thấy ở ETEC gây bệnh

trên người Tiền protein STb có 71 axit amin ñược cắt thành STa có 48 axit amin

với trọng lượng phân tử 5,1 kDa (Arriaga Y L và cộng sự, 1995) Trình tự axit amin của STb khác với trình tự STa, tuy cũng có 4 cầu nối disulfit ðộc tố này bị bất hoạt ở 100OC, 15 phút, ở 37OC trong 60 phút, dễ bị vô hoạt bởi Trypsin và các proteaze Những enzyme này có thể ñược sử dụng ñể phá hủy STb ñể bảo vệ ñường tiêu hoá (Whipp S C., 1987)

Khác với STa, phương thức tác ñộng của STb là kết hợp không ñặc hiệu với màng tế bào chất và ñi vào trong tế bào, gây ra những tổn thương lớp biểu mô ruột STb không kích thích tiết Cl- như STa, nhưng kích thích tế bào ruột tiết bicarbonate (HCO3-) (Sears C L và cộng sự, 1996) STb không làm tăng cAMP hay cGMP nội bào, chúng gây tăng lượng Calci nội bào (Dreyfus L A và cộng sự, 1993), kích thích giải phóng PGE2 và serotonin (Hitotsubashi S và cộng sự, 1992)

- ðộc tố bán chịu nhiệt EST1 (Enteroaggregative partially-heat stable

enterotoxin 1) do các Enteroaggregative E.coli (EAGGEC) thường gặp trong các

trường hợp lợn con tiêu chảy

2.3.4 Yếu tố ñộc lực khác

Yếu tố kháng khuẩn của E.coli (Colicin V): Nếu loại bỏ plasmid colicin

V, vi khuẩn giảm ñộc lực và ngược lại Một số ColV plasmid làm tăng sức ñề kháng của vi khuẩn ñối với vật chủ

Các chủng E.coli ở người hoặc ñộng vật thường mang ColV plasmid có gen

mã hoá Colicin V (Smith H W và Huggins M., 1976) Khoảng 78% chủng E.coli gây bệnh bò, gà và cừu sản sinh Colicin V Colicin V là một protein trọng lượng

phân tử thấp Colicin V ức chế sự hình thành thể film (màng) của các vi khuẩn khác Ngoài ra, những plasmid này cũng mang các gen mã hóa cho các yếu tố có khả năng kích thích sự tăng sinh tế bào trong vật chủ (Williams P H, 1979) ColV plasmid mã hóa hai yếu tố ñộc lực (Smith H W và Huggins M, 1976): Một loại tăng cường khả năng kháng lại cơ chế giải ñộc của vật chủ; loại thứ hai mã hoá cho hệ thống vận chuyển sắt (Williams P H, 1979),

Hydroxamate ái lực cao có khả năng chuyển Fe2+ ở dạng phức transferrin hoặc

lactoferrin ở trong vật chủ ñể thành dạng sắt mà E.coli dễ dàng hấp thụ

(Williams P H., 1979)

ðối với các vi khuẩn khác, các Colicin V gây ñộc bằng cách phong tỏa sự tiếp xúc hoặc thu nhận chất dinh dưỡng, ñãn ñến mất cân bằng trao ñổi chất, thoái hoá và phân rã; Colicin V thẩm thấu vào tế bào vi khuẩn khác, phân hủy acid nucleic nội bào, phá huỷ hoàn toàn hệ gen của vi khuẩn; những Colicin V khác tạo kênh vận chuyển ion qua màng, gây quá tải về nồng ñộ ion, làm mất cân bằng ñiện thế màng, rối loạn trao ñổi chất và ñịch thủ bị tiêu diệt

Yếu tố kháng kháng sinh: người chăn nuôi ñã sử dụng nhiều loại kháng

sinh trong chăn nuôi với mực ñích ñiều trị, phòng bệnh và kích thích twang trọng ðồng hành với quá trình này là hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn

ñường ruột nói chung và E.coli nói riêng ñang ngày một tăng, thậm chí nhiều

loại kháng sinh còn bị kháng hoàn toàn làm giảm hiệu quả ñiều trị bệnh Các

chủng vi khuẩn kháng kháng sinh có khả năng di truyền ñồng thời có thể chuyển qua vi khuẩn khác; một vi khuẩn có thể mang nhiều R plasmid và kháng nhiều

loại kháng sinh (Scott W J, 2008)

2.4 Bệnh do E.coli gây ra ở lợn con theo mẹ

Lợn con sơ sinh mắc tiêu chảy thường xảy ra ở lợn con từ nái sinh lứa ñầu Tiêu chảy thường xảy ra khi thời tiết thay ñổi, khí hậu rét, mưa nhiều, ñộ ẩm

cao và các loại vi khuẩn trong ñó có E.coli Phần lớn các chủng E.coli gây tiêu

chảy ở lợn con sơ sinh thuộc thuộc nhóm ETEC thuộc các serogroup O8, O9, O20, O101, O141, O147, O149 và O157, trong ñó serogroup O149 là phổ biến nhất (Nagy B và Fekete P, 1999) Các ETEC mang một hoặc nhiều kháng nguyên bám dính như F4, F5, F6, F18, F41 và có khả năng sản sinh ñộc tố ñường ruột ST và LT

Triệu chứng: Bệnh xảy ra rất nhanh thường 12 giờ, thậm chí chỉ sau 2 giờ

sau khi sinh Lợn sơ sinh chết ngay sau khi xuất hiện triệu chứng tiêu chảy, tỷ lệ chết trong đàn cĩ thể lên tới 70%, chủ yếu dưới 4 ngày tuổi

Lợn con tụm vào một gĩc chuồng, xù lơng, gầy cịm, suy nhược, yếu ớt, các đầu xương nhơ ra, mắt trũng sâu, bỏ bú, một số trường hợp nơn mửa Phân từ màu sáng sang màu trắng hoặc xám, lúc đầu thành bãi, về sau phân tự do chảy, lợn bê bết phân Lợn gầy sút nhanh (giảm trọng lượng 30- 40%), cơ vùng bụng run rẩy, nhão, khơng cịn trương lực

Bệnh tích: Xác chết gầy, phần thân sau bê bết phân; xuất huyết điểm ở ruột

non và thành dạ dày, xuất huyết tồn bộ đường tiêu hố Dạ dày giãn rộng, chứa đầy sữa đơng vĩn khơng tiêu Ruột non căng hơi, chất chứa lẫn máu, niêm mạc ruột non bong trĩc, thành ruột mỏng Hạch lâm ba ruột tụ huyết Tim, gan, thận, phổi ít biến đổi

Chẩn đốn: Chẩn đốn phân biệt tiêu chảy do E.coli với viêm dạ dày ruột

truyền nhiễm do virus gặp nhiều khĩ khăn do biểu hiện lâm sàng giống nhau Tuy nhiên cĩ thể phân biệt dựa vào đặc điểm phát bệnh: Bệnh colibacillosis thường xảy

ra sớm hơn (2-12 giờ), bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE) thường xuất hiện muộn hơn (72 giờ) Bệnh do TGE cĩ tỷ lệ chết cao, gần 100%; tỷ lệ chết do colibacillosis khoảng 5-70%, tùy đàn

Chẩn đốn phịng thí nghiệm: Phân lập căn bệnh, xác định các đặc tính sinh

vật hĩa học trên các mơi trường đặc hiệu, xác định các yếu tố độc lực bằng PCR và type kháng nguyên O và F bằng ngưng kết và ELISA

2.5 Bệnh tiêu chảy do E.coli ở lợn sau cai sữa

Bệnh thường xảy ra ở tất cả các lứa tuổi của lợn; tỷ lệ bệnh, mức trầm trọng và

tỷ lệ chết cao thường xảy ra ở lợn từ 4 tuần tuổi đến sau cai sữa 1 tháng

ðặc điểm: Tiêu chảy thường xảy ra ở lợn sau cai sữa 3-10 ngày, lây lan

nhanh, 80-90% lợn trong đàn mắc tiêu chảy trong vịng 1-3 ngày, sau đĩ lây sang những đàn khác đặc biệt ở trại chăn nuơi tập trung Bệnh cĩ thể tồn tại trong đàn bị nhiễm hàng tuần hoặc tháng

2.5.1 Các chủng gây bệnh

Các chủng E.coli thuộc nhóm ETEC là nguyên nhân chính của bệnh tiêu chảy ở lợn sau cai sữa Ngoài nhóm ETEC, các chủng E.coli thuộc nhóm VTEC, EPEC và gần ñây nhóm EAGGEC (Enteroaggrigative E.coli) cũng thường

xuyên phân lập ñược từ lợn con bị bệnh tiêu chảy (Zhu C, và cộng sự, 1994)

2.5.2 Yếu tố ñộc lực

Những chủng này thường mang một hoặc nhiều kháng nguyên bám dính F4, F5, F6 và F41 và có thể sản sinh ñộc tố ñường ruột như STb (77.6%), EAST1 (65.8%), LT (61,6%), STa (26,5%) (Frydendahl, K, 2002) và EAST1

Ở lợn con sau cai sữa các chủng E.coli thuộc nhóm ETEC là nguyên nhân chính gây tiêu chảy (Nagy B và Fekete P, 1999), trong ñó F4 E.coli là nguyên nhân chính (44,7%), thường gặp còn có F18 E.coli (39,3%), Intimin (1,4%), và

F6 (0,9%) và F5, F41 (Ojeniyi B và cộng sự, 1994; Frydendahl K., 2002;

Schierack P và cộng sự, 2009) Phần lớn các ETEC gây tiêu chảy lợn con sau

cai sữa có serotype O149, O138, O139, O141, O147 và O8, trong ñó các chủng

có tổ hợp O149:K91:K88 (F4) là phổ biến (Hampson D J và cộng sự, 1993)

2.5.3 Sinh bệnh học

Các thụ thể ñặc hiệu cho kháng nguyên bám dính của E.coli thuộc nhóm

ETEC như receptor của F4 xuất hiện nhiều ở niêm mạc ruột lợn con sơ sinh và giảm dần ở lợn con sau cai sữa

Ngoại cảnh: Yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình gây bệnh của E.coli ở lợn sau

cai sữa bao gồm: lợn con bị stress khi tách mẹ, nhập chung với ñàn khác, thay ñổi thức ăn, mất nguồn kháng thể bị ñộng truyền qua sữa mẹ, chuồng ẩm

Cơ thể lợn: pH trong ñường ruột của lợn tăng lên ở lợn sau cai sữa, các

E.coli dung huyết thuộc serotype O149, K88 từ phần cuối của hệ thống tiêu hoá chuyển ñến cư trú ở ruột non Số lượng E.coli dung huyết ở ruột non lợn mắc

Colibacillosis cao hơn 103 ñến 105 lần so với lợn khoẻ mạnh ở cùng lứa tuổi

Miễn dịch ở lợn cai sữa: Lợn con sau cai sữa mất đi nguồn miễn dịch thụ

động qua sữa mẹ và lợn con chưa kịp sản sinh kháng thể chủ động

2.5.4 Triệu chứng

Ngay sau khi cai sữa 3-4 ngày, lợn cĩ hiện tượng giảm cân với tỷ lệ 100% Trong một số trường hợp khơng cĩ biểu hiện tiêu chảy Trong đàn cĩ 1 hoặc 2 con lợn chết đột ngột nhưng khơng cĩ biểu hiện triệu chứng lâm sàng Sau đĩ một nhĩm trong đàn cĩ triệu chứng tiêu chảy, lây lan và tỷ lệ ốm chết lên đến 100% Triệu chứng điển hình là sốt, bỏ ăn, phân lỏng, màu vàng, mùi hơi tanh, đi lại siêu vẹo, co giật, đầu, mặt phù Xuất hiện những vùng da tím tái ở mũi, chĩp tai và bụng Một vài lợn cĩ triệu chứng thần kinh, đi vịng trịn theo một chiều nhất định hoặc liệt hai chân sau, vào giai đoạn cuối lợn nằm nghiêng chân bơi chèo, xác gày và bẩn Trong một đàn, bệnh thường kéo dài 6-7 ngày Nếu khơng điều trị kịp thời lợn bệnh bị chết sau 5 ngày nhiễm, số cịn lại chậm lớn, cịi cọc

50-2.5.5 Bệnh tích

Mức độ bệnh tích phụ thuộc nhiều vào tuổi mắc bệnh, thời gian kéo dài của bệnh, thường bệnh tích tập trung ở cơ quan tiêu hố và hơ hấp Nhìn chung xác lợn chết gầy, bẩn; thân bê bết phân; mắt trũng sâu; tím tái ở mũi, tai Niêm mạc mắt miệng nhợt nhạt; Phổi nhợt nhạt và khơ; cơ tim nhão, mất trương lực; bàng quang xẹp, niêm mạc xuất huyết; gan mất màu, cĩ những nốt hoại tử trên bề mặt

Dạ dày chứa đầy thức ăn Chất chứa trong các đoạn ruột cĩ trạng thái khác nhau

từ nhiều nước đến sền sệt, cĩ mùi đặc trưng Niêm mạc ruột, dạ dày xuất huyết, nếu tiêu chảy nặng niêm mạc bị bong trĩc

Quan sát bệnh tích vi thể thấy lẫn trong lớp tế bào lơng nhung là vi khuẩn E.coli

Lớp tế bào lơng nhung bị phá huỷ nặng (Nguyễn Khả Ngự và cộng sự, 1996)

2.5.6 Chẩn đốn

Chẩn đốn phân biệt: bệnh viêm ruột và phĩ thương hàn cũng cĩ triệu

chứng tiêu chảy và chết nhưng 2 bệnh này thường gặp ở lợn nhỡ Phân lợn con phĩ thương hàn cĩ mùi thối khắm, lẫn dịch nhầy, đơi khi lẫn máu Bệnh viêm ruột tiêu chảy thường điên biến dai dẳng trong đàn, lợn bệnh thường sốt cao

Chẩn đốn trong phịng thí nghiệm: định type kháng nguyên O phổ biến

và xác định yếu tố độc lực: PCR xác định gene cho yếu tố bám dính F4 và độc tố

đường ruột Phân lập E.coli từ phân và phủ tạng, 100% chủng E.coli phân lập từ

lợn chết cĩ ngưng kết với kháng huyết thanh K88, 40% gây dung huyết mạnh (Nguyễn Khả Ngự và cộng sự, 1996) Cĩ thể dùng ELISA, kháng thể huỳnh quang để xác định các kháng nguyên bám dính F4

2.6 Bệnh phù đầu ở lợn con

Bệnh phù đầu ở lợn do các VTEC cĩ kháng nguyên bám dính F18 và độc tố VT2 gây ra, thường xảy ra ở lợn 45 đến 90 ngày tuổi (sau cai sữa và trước cai sữa muộn), thường gặp ở những con phát triển tốt nhất Bệnh xảy ra lẻ tẻ hoặc ổ dịch nhỏ, khơng lan từ đàn này sang đàn khác; bệnh xuất hiện đột ngột, kéo dài trung bình 8 ngày và kết thúc cũng đột ngột Bệnh xảy ra quanh năm, cao nhất vào mùa hè Tỷ lệ bệnh thấp (16%) nhưng tỷ lệ chết cao (64%) (Kernkamp H C

và cộng sự, 1965; Bùi Xuân ðồng, 2001)

Triệu chứng: Lợn bỏ ăn, sốt sau gây bệnh thực nghiệm sau 36 giờ, chui rúc

một gĩc chuồng, uống nhiều nước, táo bĩn; sau 48 giờ lợn cĩ biểu hiện khĩ thở,

bỏ ăn hồn tồn, uống nhiều nước, mắt hơi phù, vừa tiêu chảy vừa táo bĩn; sau

52 giờ lợn bắt đầu cĩ biểu hiện thần kinh, quay cuồng, co giật và chết

Bệnh tích: Phù dưới da tồn thân; phù mí mắt, trán, đường cong lớn ở dạ

dày Cĩ dịch nhầy ở thanh quản, phù màng treo ruột, kết tràng, vỏ thận, tràn nước màng tim, màng phổi Bệnh mạn tính, khơng thấy hiện tượng phù, nhưng

cĩ thể thấy cuống não phồng rộp (Bùi Xuân ðồng, 2001)

Chẩn đốn: ổ dịch phù đầu thường đặc trưng, những trường hợp quá lẻ tẻ

hoặc mạn tính thường khĩ chẩn đốn Quan sát những tổn thương đặc trưng như

phù ở mắ mắt, mặt trước, sau gốc tai Xét nghiệm vi khuẩn học: phân lập E.coli,

xét nghiệm yếu tố bám dắnh F18ab; xét nghiệm huyết thanh học bằng ngưng kết nhanh, ELISA phát hiện kháng thể F18ab; thử ựộc tố VT2e trên tế bào Vero PCR xác ựịnh sự có mặt của gene mã hóa F18ab và ựộc tố Stx2e

2.7 Những nghiên cứu về chế phẩm phòng và trị bệnh do E.coli

Tiêu chảy ở lợn con do E.coli không phải chỉ phổ biến ở Việt Nam mà là

vấn ựề nan giải trên thế giới Những nghiên cứu về văc xin và sinh phẩm phòng

trị bệnh do E.coli là mối quan tâm của nhiều quốc gia

2.7.1 Văc xin phòng bệnh lợn con tiêu chảy do E.coli

Văc xin phòng bệnh lợn con tiêu chảy nói chung ắt có hiệu quả Hiện có một số văc xin dùng cho nái, phòng bệnh cho lợn con Các văc xin này bao gồm các yếu tố bám dắnh phổ biến là F4, F5, F6, F18ab,Ầ và giải ựộc tố ựường ruột

ST và LT (Wilson M R và Hohmann A W, 1974; Moon H W, 1981; Greer J

M và Wannemuehler M J, 1989)

2.7.2 Chế phẩm lòng ựỏ trứng trong phòng trị lợn con tiêu chảy

Hiện ựã có nhiều công trình nghiên cứu về sản xuất IgY: Yokoyama và cộng sự (1992) tách riêng lòng ựỏ trứng gà miễn dịch sấy khô thành chế phẩm dạng bột Trong 10 gam lòng ựỏ trứng có 15 mg IgY ở ựộ tinh khiết 93,8% (Banwell J G và Sherr H, 1973) Kháng thể IgY là protein nhưng bền với nhiệt

và pH: Hoạt tắnh trung hòa kháng thể kháng E.coli không bị ảnh hưởng khi hấp

ở 650C, 15 phút Tại pH 4,0 IgY không bị biến tắnh

Gây miễn dịch cho gà, kháng thể ựặc hiệu xuất hiện trong huyết thanh sau 8 ngày và trong trứng sau 10 ngày, ựạt hiệu giá cao nhất ở ngày thứ 20 sau khi tiêm kháng nguyên lần ựầu (O'Farrelly C và cộng sự, 1992) đáp ứng miễn dịch của gà ựược nâng cao khi có chất bổ trợ C-phosphate-quanosine-oligodeoxynucleotide (CpG-ODN), nâng cao hiệu quả ựiều trị của chế phẩm bột lòng ựỏ trứng (Levesque S và cộng sự, 2007)

Nhật Bản là một trong những cường quốc về ứng dụng kháng thể lòng ñỏ trứng, chế phẩm kháng thể lòng ñỏ trứng dùng ñiều trị lợn con tiêu chảy bắt ñầu

từ năm 1972, với tỷ lệ ñiều trị khỏi bệnh cao (Banwell J G và Sherr H., 1973;

Yokoyama H và cộng sự 1992) Akita và cộng sự (1993) ñã sử dụng E.coli toàn

khuẩn sản xuất kháng thể ñặc hiệu lòng ñỏ trứng gà dùng trong phòng và trị bệnh tiêu chảy cho lợn con

Marquardt và cộng sự (1999) ñã sử dụng kháng thể lòng ñỏ trứng gà miễn dịch kháng pili F4 ETEC ñể ñiều trị tiêu chảy cho lợn sơ sinh và cai sữa Kết quả cho thấy lợn uống kháng thể lòng ñỏ trứng có khả năng kháng lại sự lây nhiễm ETEC Chế phẩm lòng ñỏ trứng ñược ñánh giá hiệu quả cao trong ñiều

trị Tuy nhiên phương pháp này tốn kém và chỉ có 81% lợn bị nhiễm K88 E.coli

giảm 70% tỷ lệ chết (Li X L., Shuai J B., và Fang W H., 2006)

2.8 Nghiên cứu trong nước về phòng trị bệnh do E.coli ở lợn

Lê Văn Tạo và cộng sự (1993, 1995) ñã chế tạo vắc xin E.coli vô hoạt từ

các chủng gây bệnh tiêu chảy lợn con có mang các yếu tố gây bệnh (Enterotoxin, Hly, ColV, F4, R) Lợn con uống văc xin giảm tỷ lệ bệnh từ 46% xuống còn 11%, giảm tỷ lệ chết từ 9% còn 2,2% (Lê Văn Tạo, 1993), giảm 31,0- 34,6% lợn

con mắc bệnh phân trắng, giảm 3,6-6,8% tỷ lệ chết (Lê Văn Tạo, 1995) Văc xin

vô hoạt phòng bệnh phù ñầu làm giảm tỷ lệ bệnh 20% ở một số tỉnh ðồng bằng sông Cửu Long (Nguyễn Khả và cộng sự, 2000), ở Bình ðịnh và Hà Tây (Cù Hữu Phú, 2004), ở Bắc Giang ( Nguyễn Thị Kim Lan, 2004), bảo hộ 90% lợn không mắc bệnh phù ñầu

2.8.2 Kháng sinh và chế phẩm sinh học thay thế

Kháng sinh thường ñược trộn vào thức ăn ñể phòng bệnh Trong tình trạng kháng kháng sinh ngày càng phổ biến (ðinh Bích Thuý và Nguyễn Thị Thạo,

1995 ; Cù Hữu Phú, 2004)việc giảm thiểu sự lạm dụng kháng sinh bắt ñầu ñược cân nhắc (Nguyễn Ngọc Tuấn và cộng sự, 1999), các yếu tố liên quan ñến sự lan truyền kháng thuốc cũng ñược quan tâm (Lê Văn Tạo và cộng sự, 1991) Các thử nghiệm tìm dẫn xuất tự nhiên thay cho kháng sinh và sulfamid là một hướng nghiên cứu ưu tiên Huỳnh Thị Kim Diệu (2001) thử nghiệm sử dụng

dịch chiết lá cây xuân hoa (P palatiferum) trong ñiều trị lợn con tiêu chảy;

ðoàn Thị Kim Dung và Lê Thị Tài (1997) sử dụng Becberin (chất chiết cây Hoàng Liên) ñiều trị tiêu chảy ở lợn con tập ăn Trần Thị Hạnh và ðặng Xuân Bình (2002) sử dụng Bacterin EBC tiêm dưới da ñể ñiều trị tiêu chảy ở lợn 3 ngày tuổi Tạ Thị Vịnh và ðặng Thị Hoè (2002) chế tạo cao mật lợn, Vitom cho hiệu quả ñiều trị lành bệnh 75% ðỗ Trung Cứ và cộng sự (2000) chế tạo biosubtyl (men tiêu hoá sống chứa 105-106 CFU/g Bacillus subtilis) làm giảm

42% tiêu chảy tái phát ở lợn con 1- 60 ngày Trần Thị Hạnh và ðặng Xuân Bình

(2002) sử dụng chế phẩm ngoại nhập (Huang Y W và cộng sự, 2011) dùng cho

lợn mẹ làm giảm tỷ lệ tiêu chảy từ 55,5% xuống còn 28,12%

2.8.3 Kháng thể lòng ñỏ trứng

Có thể sử dụng 1 lượng thích hợp kháng thể dị loài kháng ñặc hiệu các

chủng E.coli ñộc, bổ sung vào thức ăn cho lợn con ñể khống chế tiêu chảy Sản

xuất kháng thể dị loài từ gà miễn dịch là một phương pháp thay thế mới ñể ñiều

trị các bệnh lây nhiễm Các nghiên cứu chỉ rõ có 3 ñiểm thuận lợi chính của phương pháp này là (1) trứng gà là nguồn phong phú, dễ kiếm (Lê Văn Tạo và cộng sự, 2001) kháng thể IgY lòng ñỏ trứng gà có chất lượng cao, số lượng lớn, giá thành rẻ, khai thác lâu dài; (2) Ngoài tác dụng ñặc hiệu, lòng ñỏ trứng còn có tác dụng bảo vệ niêm mạc ñường tiêu hoá của gia súc non; và (3) kháng thể phi ñặc hiệu có thể trung hoà ñộc tố và láng một lớp vỏ vật lý bảo vệ màng nhầy của ruột non (Lê Văn Tạo và cộng sự, 2001), ngăn cản quá trình ñộc tố ñường ruột

bám màng nhầy ruột non (O'Farrelly C và cộng sự, 1992)

Các công ty thuốc thú y trong nước cũng bắt ñầu sản xuất chế phẩm lòng

ñỏ trứng ñể ñiều trị bệnh lợn con tiêu chảy do E.coli Công ty Hanvet chế tạo thành công kháng thể KTE kháng 11 chủng E.coli ñộc Chế phẩm bột kháng thể YP-99 kháng các chủng E.coli E.Rnl, E.Rn2 và E.Ma (mang yếu tố bám dính F5

và F6, vô hoạt bằng formol) có tác dụng ñiều trị lành bệnh 80,7% ở lợn con theo

mẹ (Morand P và cộng sự 2011) Một số nghiên cứu khác nhằm nâng cao chất

lượng kháng thể dựa vào chất lượng kháng nguyên (rửa mặt thạch, vô hoạt), ña dạng hóa chế phẩm (bột uống, thuốc tiêm) (Lê Văn Tạo và cộng sự, 2001)

3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðối tượng và nội dung nghiên cứu

3.1.1 ðối tượng:

- Kháng thể lòng ñỏ trứng và chế phẩm kháng thể lòng ñỏ trứng,

- Tiêu chảy do E.coli trên lợn tại thời ñiểm sau cai sữa

3.1.2 Nội dung nghiên cứu:

(1) ðiều tra tình hình hội chứng tiêu chảy ở lợn con sau cai sữa tại Vĩnh Phúc:

- Thống kê hội chứng tiêu chảy ở lợn sau cai sữa trong 2 năm (2009, 2010);

- ðiều tra tỷ lệ hội chứng tiêu chảy ở lợn sau cai sữa theo: quy mô ñàn nuôi; tình trạng vệ sinh chuồng trại, môi trường và phun thuốc sát trùng ñịnh kỳ; giống lợn; theo mùa vụ và theo lứa tuổi sau cai sữa;

(2) Xác ñịnh nguyên nhân tiêu chảy lợn con do F4-E.coli

(3) Áp dụng kháng thể lòng ñỏ trứng kháng F4-Pili trong ñiều trị lợn con tiêu chảy

3.2 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

ðịa ñiểm nghiên cứu:

- Bộ môn Nội chẩn – Dược và ðộc chất, Khoa Thú y;

- Bộ môn Hóa sinh Miễn dịch Bệnh lý, Viện Thú Y

- Các cơ sở chăn nuôi, hộ chăn nuôi lợn tại Vĩnh Phúc, các Trạm Thú y huyện; Chi cục Thú y tỉnh Vĩnh Phúc

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 6 năm 2011 ñến tháng 10 năm 2012 3.3 Nguyên vật liệu

3.3.1 ðộng vật thí nghiệm và sinh phẩm

- Lợn con sau cai sữa ở hộ và các trang trại chăn nuôi lợn giống sinh sản và lợn thịt trên ñịa bàn tỉnh Vĩnh Phúc

- Taq DNA Polymerase Cat # M5122 do hãng Promega cung cấp,

- Thang 100 bp DNA chuẩn Cat #15628-019 do Invitrogen cung cấp,

- Kháng nguyên F4 E.coli Pili do Bộ môn Hóa sinh Miễn dịch, Viện Thú y

cung cấp,

- Antipig-HRP-Conjugate Cat # A7042 do Sigma-Aldrich cung cấp,

- Anti-Chicken IgY Polyclonal (Rabbit), Horseradish Peroxidase Conjugated, Cat LS-C60281-1500 do LifeSpan BioSciences cung cấp

3.3.2 Môi trường, hóa chất

- Hoá chất dùng trong phản ứng Ab-ELISA:

Dung dịch phủ ñĩa (Coating buffer: Carbonate-Bicarbonate buffer PH=9,6), Cat #C-304 do hãng Sigma-Aldrich cung cấp,

Sữa tách bơ (Skim Milk), Cat #92720 do Marvel cung cấp

PBS (Photphate Buffer Saline) Cat #P4417 do Sigma-Aldrich cung cấp, Tween 20, Cat #40350-2 do Cica-Reagent cung cấp

Cơ chất màu OPD (Ortho-phenylenediamine), Cat S2045 do công ty DAKO sản xuất

H2SO4 Cat #S:1/2-26-30-45 và H2O2 30%, Cat #S:3-28-36/39-45 do Lachema cung cấp

- Hoá chất ñể làm phản ứng PCR:

DNase free-water Cat #P119C, dung dịch TE 5 mM (TrisBase-EDTA pH 7,0), EDTA Disodium Cat # H5031, và Tris Base Cat # H5131 do Promega) cung cấp

- Các loại hoá chất chạy ñiện di:

Agarose Cat #A9539 và Ethidium Bromide Cat #E-1385 do hãng Aldrich cung cấp,

Sigma-TAE Buffer (dung dịch mẹ 50x) Cat #24710-030 do Gibco cung cấp

- Hoá chất chế môi trường nuôi cấy vi khuẩn:

Pepton Cat #M885 và thạch máu nền (Blood Agar base) Cat #M089 do hãng Himedia cung cấp,

Yeast extract Cat #L21 do OXOID sản xuất

BHI (Brain Heart Infusion) Cat #1.10493.0500 và Agar Cat #3644679 do Merck cung cấp

- Môi trường 3 ống nghiệm

KIA Cat #1.03913.0500 và Mannitol-Mobility Cat #1.05404.0500 do hãng Merck cung cấp; Urea-Indole Cat #880239 do Bio-Rad cung cấp

- Hóa chất bảo quản huyết thanh: Natriazit (NaN3) Cat #5224343 do Merck cung cấp

- Bổ trợ dầu Freund Complete Adjuvant Cat #F5881 do Sigma-Aldrich

cung cấp

- Hóa chất thông thường phòng thí nghiệm

3.3.3 Máy móc, trang thiết bị

- Máy móc

Máy PCR (Thermocycler), máy ñiện di (Biorad), hộp ñèn tử ngoại (Việt nam), máy lắc ñĩa chuyên dụng (Stat fax 2200, Awareness), máy ñọc ELISA (Elx800, Biotek), máy sấy trứng Centrifuge spray dryer- LPG-5, Vortex (Genie)

- Trang thiết bị dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm

Buồng cấy vô trùng (Biosafety Cabinet), cân phân tích, nồi hấp, tủ sấy, tủ

ấm, bể ấm, tủ lạnh thường (40C), các tủ lạnh -300C, -800C

Micro-pipette các loại 2 µl, 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl và ñầu tip tương ứng

Dụng cụ thông thường phòng thí nghiệm: Ống nghiệm, ñĩa Petri, ñèn

cồn, que cấy, pince, kéo, ñĩa ELISA, bơm tiêm, bông cồn, ống ly tâm 14 ml; 50 ml; Eppendorf loại 0,2 ml và 1,5 ml, máng nhựa, giá và khay ñựng

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ

- Sử dụng phương pháp nghiên cứu dịch tễ mơ tả, dịch tễ học thống kê, dịch tễ học phân tích Cụ thể: Lập biểu mẫu điều tra; ðiều tra theo phương pháp điều tra thống kê ngẫu nhiên 3 huyện, mỗi huyện 3 xã, mỗi xã 3 thơn cĩ các hộ chăn nuơi lợn nái sinh sản và lợn từ sau cai sữa; Trực tiếp điều tra qua chẩn đốn lâm sàng kết hợp với mổ khám những lợn mắc tiêu chảy sắp chết hoặc chết do tiêu chảy

- Phương pháp điều tra lợn từ sau cai sữa mắc tiêu chảy theo đàn và cá thể

Số đàn cĩ lợn mắc tiêu chảy chết và số con chết trong từng đàn

- Phương pháp điều tra lợn từ sau cai sữa mắc tiêu chảy theo quy mơ đàn nuơi từ 10 con trở xuống, từ 11 đến 20 con, trên 21 con

- ðiều tra lợn từ sau cai sữa bị tiêu chảy theo tình trạng vệ sinh chuồng trại, mơi trường tốt, trung bình, kém; theo loại lợn địa phương, lai, ngoại; theo các mùa xuân, hè, thu, đơng và theo tháng tuổi sau cai sữa

3.4.2 Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn E.coli

Phương pháp thu thập mẫu phân

Dùng tăm bơng ngốy vào hậu mơn của lợn tiêu chảy, mẫu phân được lấy trực tiếp từ trực tràng của lợn con; cho tăm bơng vào ống Eppendorf cĩ sẵn dung dịch bảo quản Mẫu được ký hiệu, ghi rõ tính biệt, ngày tuổi và ngày lấy mẫu, được bảo quản trong hộp lạnh và chuyển về phịng thí nghiệm trong ngày Phương pháp chuẩn bị các mơi trường nuơi cấy vi khuẩn

Các mơi trường nuơi cấy thơng thường và mơi trường giám định đặc tính

sinh vật hĩa học của E.coli bao gồm nước thịt, thạch thường, thạch máu, thạch

KIA, Mannitol-Mobility, Urea-Indole…được chuẩn bị như thường quy Phương pháp nuơi cấy, phân lập và giám định vi khuẩn E.coli

Mẫu phân mới được nuơi cấy, phân lập giám định đặc tính sinh vật hĩa học

và giám định PCR như thường quy và được tĩm tắt ở sơ đồ hình 03.01

Hình 03.01 Sơ ñồ phân lập và giám ñịnh vi khuẩn E.coli

3.4.3 Phương pháp PCR xác ñịnh chủng F4 E.coli

Phương pháp chuẩn bị DNA sợi mẹ

- Ly tâm canh khuẩn ñã nuôi cấy ở 200 µl BHI sau 16-18h/370C, lắc 220 vòng/ phút, bỏ dịch lấy cặn,

- Hòa tan cặn bằng 250 µl nước cất, và ñun cách thủy 5 phút/1000C, lập tức chuyển vào ñá lạnh, giữ 3 phút,

- Ly tâm 4000v/phút trong 4 phút ở 40C, giữ trên ñá lạnh, dịch trong chứa DNA dùng làm sợi mẹ trong PCR

Chuẩn bị mồi (Primer)

Dung dịch mẹ (10 x) primer 100 µM ñược chuẩn bị trong dung dịch TE pH 8,0, bảo quản ở -30OC Pha loãng 1/10 primer 10x trong TE ñể có dung dịch làm việc (10 µM), dùng 1 µl primer mỗi loại cho 25 µl phản ứng PCR

ðể xác ñịnh sự có mặt của gene mã hóa pili F4, các ñộc tố ñường ruột LT, Sta và STb bằng phương pháp PCR, trình tự nucleotide của các cặp mồi ñặc hiệu ñược trình bày ở bảng 03.01

Bảng 03.01 Trình tự oligo primer và sản phẩm dự kiến

F4 GCA CAT GCC TGG ATG ACT GGTG

CGT CCG CAG AAG TAA CCC ACCT

499

LT ATT TAC GGC GTT ACT ACT CTC

TTT TGG TCT CGG TAC GAT AGT

272

STa TCC GTG AAA CAA CAT GAC GG

ATA ACA TCC AGC ACA GGC AG

158

STb GCC TAT GCA TCT ACA CAA TC

TGA GAA ATG GAC AAT GTC CG

133

Chuẩn bị phản ứng PCR

Trên ñá lạnh, chuẩn bị mỗi phản ứng PCR 25 µl bằng cách tuần tự thêm các chất với nồng ñộ và thể tích xác ñịnh như ở bảng 03.02 vào ống PCR 0,2 ml thành mỏng

Bảng 03.02 Thành phần phản ứng PCR

1 Dnase-, Rnase- Free water Cat #P119C, Promega 8,5

5 Gotaq Green MasterMix 2x (Cat # M5122, Promega) 12,5

Nhân gen: chạy máy PCR theo chương trình và chu trình nhiệt như bảng

03.03

Bảng 03.03 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Giai ñoạn Bước Tên Nhiệt ñộ (0C) Thời gian (phút) Số chu kỳ

ðiện di sản phẩm PCR trên gel Agarose

- Chuẩn bị gel Agarose 2%: Thêm 0,8 gam Agarose (Cat #A9539 Aldrich) vào 40 ml dung dịch 1 x TAE (Cat #24710-030, Gibco), ñun sôi trong Microwave, 2 phút, ñể nguội tới 600C; ñổ gel vào khuôn nằm ngang ñã có gel-lược; ñể yên 20 phút cho tới khi gel ñông cứng; tháo bỏ lược

Sigma ðặt gel Agarose vào máy ñiện di, bổ sung dung dịch ñiện di TAE 1x ñến khi ngập gel

- Nhỏ mẫu vào các giếng tương ứng của gel; nhỏ thang DNA 1 giếng (Cat

#15628-019, Invitrogen) Chạy ñiện di ở 100 Vol trong 30 phút

- Nhuộm gel trong Ethidium Bromide (Cat #E-1385, Sigma-Aldrich) 5µg/ml trong 10 phút Kiểm tra sản phẩm PCR trên ñèn UV, chụp ảnh

3.4.4 Phương pháp ELISA kháng thể (Ab-ELISA)ở lợn

Các bước thực hiện Ab-ELISA phát hiện kháng thể ñặc hiệu (kháng kháng

nguyên pili F4 E.coli) ở huyết thanh lợn có trình tự như sau:

Thu thập mẫu huyết thanh: ðối tượng mẫu bao gồm: (i) Lợn ở thời ñiểm

từ sau cai sữa mắc và không mắc tiêu chảy cùng ñàn; (ii) lợn trước cai sữa (21 ngày tuổi); (iii) lợn choai 3 -5 tháng tuổi cùng ñàn lấy mẫu; và (iv) lợn nái

Lập sơ ñồ mẫu theo thiết kế thí nghiệm: Trên ñĩa ELISA 96 giếng, hai

cột 1 và 2 ñược bố trí các mẫu ñối chứng như sau: A1, A2: ðối chứng cơ chất (SC); B1, 2: ðối chứng Conjugate (CC); C1, C2 và D1, D2: ñối chứng huyết

thanh dương chuẩn (2 mẫu lặp ðC +1 và ðC +2); E1, E2 đến H1, H2: đối chứng huyết thanh âm chuẩn (8 mẫu) Dãy các giếng từ cột 3 đến 12 dùng cho 40 mẫu (2 giếng/mẫu) huyết thanh cần xét nghiệm (bảng 03.04)

Bảng 03.04 Sơ đồ ELISA phát hiện kháng thể F4 ở huyết thanh lợn

Các đối chứng Mẫu huyết thanh xét nghiệm

SC: ðối chứng cơ chất; CC: ðối chứng conjugate

- Pha huyết thanh 1/200: Chuẩn bị đủ số mẫu huyết thanh pha lỗng tại

nồng độ 1/200 (5 µl huyết thanh trong 995 µl PBS-2% skim milk và sắp xếp theo đúng sơ đồ mẫu trên khay mẫu 1 Chuẩn bị 2 mẫu huyết thanh đối chứng dương, và 8 đối chứng âm ở độ pha lỗng 1/200 theo cách tương tự

- Tiến hành phản ứng Ab-ELISA: Tuần tự tiến hành phản ứng theo trình

2 Bão hồ Sữa tách bơ 6% 200 37oC 60 5

3 Huyết thanh HT chẩn đốn 1/200 100 37oC 30 5

- ðọc kết quả: ðọc kết quả trên máy ELx800 ở bước sóng 490/630 nm

Tính giá trị ngưỡng (Cut off value) dựa trên trị giá OD của 8 mẫu huyết thanh chuẩn ñối chứng âm theo chương trình phần mềm (ñộ tin cậy 99,9%)

Công thức giá trị ngưỡng: Cut off = 

n

SD t Mean 3 α

Trong ñó: Mean: Giá trị OD trung bình của 8 ñối chứng âm,

SD: ðộ lệnh chuẩn tính theo quy luật phân phối chuẩn,

n: Bậc tự do (số mẫu ñối chứng âm),

tα: Giá trị trong bảng phân phối Student ở mức ý nghĩa α, n-1 bậc tự do Ngưỡng chuẩn là giá trị OD tính toán, tại ñó nếu giá trị OD của mẫu bằng hoặc cao hơn ngưỡng ñược coi là dương tính huyết thanh học Ngược lại, mẫu ñược coi là âm tính huyết thanh học

3.4.5 Phương pháp ñiều trị và theo dõi lợn ñiều trị

Kết quả ñiều trị lợn con tiêu chảy sau cai sữa ñược ghi chép theo bảng theo dõi và theo ca bệnh Khi phát hiện ca bệnh, lợn ñược ñánh dấu, ghi số tai, cân trọng lượng, dùng ngay liều 1g/kgP theo phác ñồ chỉ dẫn

Phác ñồ ñiều trị: Tại mỗi phiếu theo dõi, phác ñồ ñiều trị ñược chỉ ñịnh,

thí dụ phác ñồ ñiều trị 01:

- Liều 1g/kg P [Bột lòng ñỏ trứng KT04 (Số lô KT04 091011)] Cho uống

- Sau 4 liều nếu triệu chứng giảm, tiếp tục ñiều trị bằng KT04 ñến liều thứ 6

- Nếu triệu chứng không giảm ở liều thứ 4, thay ñổi phác ñồ ñiều trị

- Ghi chú: (1) Thí nghiệm này dùng ñể ñánh giá hiệu quả khi chỉ sử dụng chế phẩm KT04, yêu cầu không thay ñổi phác ñồ, không dùng kết hợp với kháng sinh và các chất ñiện giải (2) Trường hợp tái phát sử dụng phác ñồ ñiều trị tái phát, chuyển sang ghi chép ở mẫu theo dõi ñiều trị tái phát

Truy cập và ghi các thông số về lợn mẹ, ngày sinh Theo dõi và ghi chép