Tạo cây lúa chuyển gen mang mirna nhân tạo ức chế đặc hiệu gen mục tiêu MPG1 của nấm đạo ôn magnaporthe grisea

Những kết quả trên cho thấy có thể ứng dụng công nghệ RNAi ñể tạo ra giống lúa chống bệnh ñạo ôn bằng cách ức chế trực tiếp các gen quan trọng liên quan tới khả năng gây bệnh của nấm.. G

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
  -

PHAN THỊ HƯƠNG

TẠO CÂY LÚA CHUYỂN GEN MANG MIRNA NHÂN TẠO

ỨC CHẾ ðẶC HIỆU GEN MỤC TIÊU MPG1

CỦA NẤM ðẠO ÔN MAGNAPORTHE GRISEA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
  -

PHAN THỊ HƯƠNG

TẠO CÂY LÚA CHUYỂN GEN MANG MIRNA NHÂN TẠO

ỨC CHẾ ðẶC HIỆU GEN MỤC TIÊU MPG1

CỦA NẤM ðẠO ÔN MAGNAPORTHE GRISEA

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 60.42.02.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS TS NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO

HÀ NỘI - 2013

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn ñã ñược ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

Phan Thị Hương

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thị Phương Thảo, Trưởng khoa Công nghệ sinh học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, người ñã tận tình dạy bảo, hướng dẫn, tạo ñiều kiện cho tôi ñược học tập, làm việc và thực hiện luận văn tại bộ môn Công nghệ sinh học thực vật

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và cán bộ công tác tại bộ môn Công nghệ sinh học thực vật - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã giúp

ñỡ, ñộng viên và tạo mọi ñiều kiện cho tôi thực hiện ñề tài tại phòng thí nghiệm

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy PGS TS Nguyễn Văn Viên,

TS Hà Viết Cường ñã tận tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh ñạo Trung tâm Khảo nghiệm Khuyến nông Khuyến ngư ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này

Với tất cả lòng biết ơn, tôi xin cảm ơn gia ñình bố mẹ và các anh chị, những người ñã tin tưởng, ñộng viên, khích lệ và là nguồn ñộng lực giúp tôi học tập và làm việc

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bạn bè ñã quan tâm, chia sẻ, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập và trong cuộc sống

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng 9 năm 2013

Tác giả

Phan Thị Hương

MỤC LỤC

1.2 Biến ñổi khí hậu và bệnh ñạo ôn trên lúa 6

1.3 Phân tích di truyền gen kháng bệnh ñạo ôn của cây lúa 9 1.4 Phân tích genome nấm ñạo ôn và công nghệ RNAi trong phòng

1.4.3 Công nghệ RNAi và ứng dụng trong phòng chống bệnh ñạo ôn 15 1.5 Ứng dụng cây trồng biến ñổi gen và thực trạng nghiên cứu

1.5.2 Nghiên cứu chuyển gen vào cây lúa trên thế giới 23 1.5.3 Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây lúa ở Việt Nam 26

2.1 Vật liệu nghiên cứu 29

2.3.1 Khảo sát khả năng tái sinh của một số giống lúa Indica và

2.3.2 Xác ựịnh ảnh hưởng của kháng sinh ựến sự sinh trưởng của mô sẹo 33

2.3.3 Chuyển vector mang pre-amiR-P1 nhân tạo ức chế gen MPG1 ở

nấm ựạo ôn (M.grisea) vào lúa bằng vi khuẩn A.tumefaciens. 34

2.3.5 đánh giá sinh trưởng, phát triển của 22 dòng lúa chuyển gen

3.1 Khảo sát khả năng tái sinh của một số giống lúa Indica và

Japonica trồng tại Việt Nam 39 3.1.1 Khảo sát khả năng cảm ứng tạo mô sẹo của một số giống lúa 40 3.1.2 Khảo sát khả năng tái sinh cây từ mô sẹo của một số giống lúa 44 3.2 Xác ựịnh ảnh hưởng của kháng sinh ựến sự sinh trưởng của mô sẹo 49 3.3 Chuyển vector pPS1-pre-amiR-P1 vào lúa bằng vi khuẩn

3.4.1 Kiểm tra sự có mặt của promoter 2x35S trong 22 dòng lúa J02

3.3.2 PCR kiểm tra sự có mặt của gen chuyển pre-amiR-P1 trong 22

3.5 Sinh trưởng, phát triển của 22 dòng lúa chuyển gen trong chậu vại 59

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT Kí hiệu, chữ viết tắt Từ viết tắt

1 amiRNA Artificial microRNA - microRNA nhân tạo

6 CIRAD French Agricultural Research Centre for

International Development – Trung tâm nghiên cứu phát triển nông nghiệp Pháp

11 MS Môi trường Murashige và Skoog (1962)

12 N6 Môi trường Chu và cộng sự (1975)

14 α-NAA α-Napthalene acetic acid

15 PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi

trùng hợp

16 QTL Quantitative trait loci - Di truyền tính trạng số

lượng

17 RISC RNA Inducing Silencing Complex - Phức hợp

làm câm cảm ứng bởi RNA

18 RNAi RNA interfering - RNA tương tác

19 sRNA Small RNA – RNA kích thước nhỏ

20 siRNA Small interfering RNA - RNA can thiệp kích

thước nhỏ

21 shRNA Short hairpin RNA - RNA kẹp tóc

23 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

2.1 Danh sách giống lúa sử dụng trong nghiên cứu 29 2.2 Một số ñặc ñiểm của trình tự miRNA ñã thiết kế 30 2.3 Công thức môi trường khảo sát khả năng tạo mô sẹo 32 2.4 Các công thức môi trường khảo sát khả năng tái sinh cây 33 2.5 Các công thức thời gian lây nhiễm dịch khuẩn với mô sẹo 35 2.6 Một số ñặc ñiểm cặp mồi nhân gen pre-amiR-P1 37 3.1 Tỷ lệ hình thành mô sẹo của một số giống lúa (%) 40 3.2 Ảnh hưởng của môi trường ñến khả năng tái sinh của mô sẹo sau

3.3 Ảnh hưởng của kháng sinh chọn lọc kanamycin ñến sinh trưởng

3.4 Kết quả chuyển gen vào mô sẹo 3 tuần tuổi (3W) và 6 tuần tuổi

3.5 Kết quả chuyển gen vào mô sẹo 3 tuần tuổi của giống HC 52

DANH MỤC CÁC HÌNH

3.1 Tỷ lệ hình thành mô sẹo của một số giống lúa 41 3.2 Hình thái mô sẹo sơ cấp 3 tuần tuổi của 7 giống 43 3.3 Hình thái mô sẹo thứ cấp 6 tuần tuổi của giống J02 và HC 43 3.4 Ảnh hưởng của môi trường ñến khả năng tái sinh của mô sẹo 47 3.5 Cây tái sinh giống BC15 trên môi trường RM1 47 3.6 Hình ảnh tái sinh của giống lúa J02 và HC các giai ñoạn 48 3.7 Hình ảnh lây nhiễm dịch khuẩn với mô sẹo giống J02 (bên trái)

3.8 Hình ảnh mô sẹo trong giai ñoạn ñồng nuôi cấy 55 3.9 Một số hình ảnh mô sẹo trong giai ñoạn chọn lọc 56 3.10 Cây chuyển gen tái sinh của giống J02 56 3.11 Cây tái sinh bị bạch tạng của giống HC 56 3.12 Quy trình chuyển gen vào mô sẹo 3 tuần tuổi của giống J02 bằng

3.13 Kết quả kiểm tra sự có mặt của promoter 2x35S trong 22 dòng

3.14 Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen chuyển pre-amiR-P1 trong 22

3.15 Hình ảnh một số dòng lúa chuyển gen trồng trong chậu vại 60

MỞ ðẦU

1 ðặt vấn ñề

Lúa gạo là nguồn lương thực quan trọng nuôi sống hơn một nửa dân số thế giới Năm 2011, tổ chức FAO ước tính sản lượng lúa thế giới ñạt 700 triệu tấn, năng suất trung bình ñạt 4.30 tấn/ha; tổng sản lượng lúa gạo của Việt Nam năm 2011 là 41,5 triệu tấn (http://news.agropages.com/News/ NewsDetail -4060.htm) Tuy nhiên, nhiều bệnh hại thường xuyên xuất hiện,

gây tổn thất lớn về sản lượng lúa như: bệnh ñạo ôn (do nấm M grisea), khô vằn (do nấm Rhizoctonia solani), bạc lá (do vi khuẩn Xanthomonas oryzae) Trong ñó, bệnh ñạo ôn lúa do nấm M grisea gây ra gây thiệt hại lớn về sản

lượng lúa gạo toàn cầu và là bệnh có ý nghĩa quan trọng nhất ñối với nghề trồng lúa trên toàn thế giới (Valent and Chumley, 1991) Mỗi năm bệnh ñạo

ôn làm thế giới mất một lượng lúa ñủ ñể nuôi sống hơn 60 triệu người (Scardaci S.C., 2003)

Trong chiến lược phòng chống bệnh ñạo ôn, việc tìm ra các gene kháng nhằm tạo ra các giống lúa kháng bệnh ñạo ôn vẫn ñược coi là phương pháp có hiệu quả và bền vững Khoảng 85 gen và 350 QTL ñiều khiển tính kháng bệnh ñạo ôn ñã ñược phát hiện, nhưng nhiều gen ñược tìm thấy trên cùng loci (Ramkumar và cs, 2010), tạo cơ sở cho việc chọn tạo giống mang gene kháng bệnh Ở Việt Nam, việc ñánh giá ña dạng nguồn gen kháng và tạo ra các giống lúa mang gen kháng bệnh ñạo ôn nhận ñược sự quan tâm của nhiều nhà khoa học (Nguyễn Mạnh Cường và cs, 2004; Lê Cẩm Loan và cs, 2006; Nguyễn Hoàng Lộc và cs, 2008; Lã Tuấn Nghĩa và cs, 2009; Phan Hữu Tôn, 2004) Tuy nhiên, chủng nấm ñạo ôn rất ña dạng và dễ phát sinh chủng mới, trong khi ñó, mỗi gen kháng chỉ có khả năng chống ñược một số chủng nhất

ñịnh, bởi vậy các nhà khoa học luôn phải nỗ lực tìm ra gen kháng mới ñể chống lại các chủng mới phát sinh

ðể có thể kiểm soát ñược tác nhân gây bệnh, việc hiểu rõ về bản thân tác nhân ñó và cơ chế gây bệnh là vô cùng cần thiết Với thành công của nhóm nghiên cứu do Dean ñứng ñầu, năm 2005 bộ genome của nấm ñã ñược giải trình tự và công bố khá ñầy ñủ trên cơ sở dữ liệu ñã làm sáng tỏ phần nào

bản chất di truyền của nấm M grisea và nguyên nhân dẫn tới sự ña dạng trong quần thể nấm ở ngoài ñồng ruộng Theo ñó M grisea có hơn 11000

gene trong ñó có 8 gene ñược cho là có liên quan tới tính gây bệnh của nấm (Dean và cs, 2005) Các gene này tham gia vào một trong các quá trình nhận biết bề mặt kí chủ, này mầm của bào tử, hình thành vòi áp, xâm nhập vào trong tế bào chủ, hình thành bào tử,…

Công nghệ RNAi nói chung hay miRNA nói riêng là công cụ ñể ñiều hoà ức chế các gen ñơn hoặc các nhóm gen khác nhau trên cơ sở các trình tự ñặc hiệu Về mặt lý thuyết, RNAi có thể sử dụng ñể “làm câm” sự sản xuất bất kỳ protein nào Một số nghiên cứu ứng dụng công nghệ RNAi thương mại trên thực vật như tạo giống chống bệnh virus, vi khuẩn, nấm và côn trùng

ñược báo cáo Hiện tượng câm gen ở ở nấm M grisea gây bệnh ñạo ôn ñã

ñược mô tả bởi Kadotani và cs (2003) khi nó ñược chuyển cấu trúc RNAi Việc chuyển trực tiếp cấu trúc RNAi vào tế bào nấm gây ra hiện tượng “câm gen” rất có ý nghĩa trong các nghiên cứu thực hiện trong phòng thí nghiệm tuy nhiên ñường hướng này khó khăn cho việc áp dụng RNAi trong chiến lược phòng chống bệnh ở cây trồng Trước vấn ñề này, một số tác giả ñã tiến hành chuyển các cấu trúc RNAi ñặc hiệu cho các gen gây bệnh của nấm vào cây ñể tạo nên cây chuyển gen có tính kháng ñối với nấm gây bệnh Trong trường hợp này, RNAi ở bên ngoài thành tế bào của nấm cũng có thể ñược tế bào nấm hấp thu và gây ra ức chế sự biểu hiện của gen mục tiêu ở nấm gây

bệnh, kết quả này ñã ñược kiểm chứng bằng các thí nghiệm in vitro (Van de Craen và cs, 2006) cũng như in vivo (Robert và cs, 2008) Việc tạo cây lúa

chuyển gen kháng bệnh ñạo ôn cũng ñã ñược tiếp cận theo hướng này bởi Valent và cs (2006), Van De Craen và cs (2010) và cho kết quả bước ñầu rất khả quan Những kết quả trên cho thấy có thể ứng dụng công nghệ RNAi ñể tạo ra giống lúa chống bệnh ñạo ôn bằng cách ức chế trực tiếp các gen quan trọng liên quan tới khả năng gây bệnh của nấm Việc bất hoạt các gen bảo thủ giữa các chủng nấm sẽ giúp tạo ra ñược một giống lúa có khả năng kháng lại với ña số các chủng nấm khác nhau

Gen MPG1 (có mã số trên genbank: L20685.2) mã hóa cho một protein

nhỏ thuộc họ hydrophobins ñược tiết ra ngoài màng tế bào của bào tử, có liên quan tới tính gây bệnh ñược biểu hiện trong suốt quá trình hình thành vòi áp, quá trình phát triển triệu chứng bệnh và hình thành bào tử Protein MPG1 rất cần thiết cho việc hình thành và phát triển cấu trúc lây nhiễm, tham gia tương tác với các thành phần kị nước trên bề mặt lá lúa và hoạt ñộng như một thụ thể ñể kích thích sự hình thành vòi áp (Talbot và cộng sự, 1996) Như vậy,

MPG1 ñóng vai trò quan trọng trong sự hình thành và phát triển bệnh ñạo ôn

ở lúa Việc ức chế sự biểu hiện của MPG1 có thể khiến nấm ñạo ôn không

gây ñược bệnh Nghiên cứu “Tạo cây lúa chuyển gen mang miRNA nhân

tạo ức chế ñặc hiệu gen MPG1 ở nấm ñạo ôn Magnaporthe grisea” phục

vụ chiến lược phát triển chọn tạo giống lúa có khả năng kháng ñược nhiều

chủng nấm ñạo ôn ở Việt Nam

2 Mục ñích nghiên cứu

Tạo thành công cây lúa chuyển gen mang miRNA nhân tạo ñược thiết

kế ức chế ñặc hiệu gen MPG1 ở nấm ñạo ôn thông qua vi khuẩn A tumefaciens

3 Yêu cầu

- Xác ñịnh môi trường cảm ứng mô sẹo thích hợp cho một số giống lúa

phục vụ chuyển gen

- Xác ñịnh ñược môi trường tái sinh mô sẹo thích hợp cho một số giống

lúa phục vụ chuyển gen

- Chọn ñược giống lúa có khả năng tái sinh tốt phục vụ cho chuyển gen

- Chuyển cấu trúc miRNA nhân tạo vào lúa thông qua vi khuẩn A

tumefaciens và tái sinh cây lúa chuyển gen

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của ñề tài

4.1 Ý nghĩa khoa học

Việc tạo ñược cây lúa chuyển gen mang cấu trúc miRNA nhân tạo có

khả năng ức chế ñặc hiệu gen MPG1 có liên quan tới tính gây bệnh ñược biểu

hiện trong suốt quá trình hình thành vòi áp, quá trình phát triển triệu chứng bệnh và hình thành bào tử sẽ là tiền ñề ñể nghiên cứu làm sáng tỏ cơ chế gây bệnh của nấm ñạo ôn ở mức phân tử, ñồng thời là cơ sở ñể ñề xuất các

phương pháp mới trong phòng chống bệnh ñạo ôn hại lúa

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Cung cấp cách tiếp cận mới trong tạo giống chống chịu bệnh ñạo ôn có hiệu quả cao bằng cách sử dụng công nghệ RNAi ñể tác ñộng trực tiếp ñến các gen tham gia quá trình xâm nhiễm và phát triển bệnh Các qui trình chuyển gen tạo ñược có thể áp dụng cho các giống lúa khác nhau nhằm tạo các dòng lúa mới mang ñặc tính mong muốn

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát về cây lúa

Cây lúa Oryza spp là một trong năm loại cây lương thực chính của thế

giới Hiện nay, trên thế giới có hai loài lúa trồng dùng làm lương thực là loài

O sativa và O glaberrima có nguồn gốc ở vùng nhiệt ñới và cận nhiệt ñới, phân bố ở khu vực ñông nam châu Á và châu Phi Trong ñó, loài O sativa

ñược trồng phổ biến tại tất cả các châu lục và chiếm phần lớn diện tích ñất

trồng lúa trên thế giới, riêng loài O glaberrima chỉ ñược trồng hạn chế ở một

số vùng của châu Phi (Nguyễn Hữu Tề và cs, 1997)

Về nguồn gốc thực vật học, cây lúa thuộc họ Hòa thảo Gramineae, chi Oryza Lúa trồng hiện nay có nguồn gốc từ lúa dại O fatua Loài lúa dại này

thường gặp ở Ấn ðộ, Việt Nam, Thái Lan, Trung Quốc,…Có 22 loài trong

chi Oryza với 24 hoặc 48 NST (Nguyễn Văn Hoan, 2006) Theo kết luận của Chang (1976) thì O sativa xuất hiện ñầu tiên tại Hymalaya, Miến ðiện, Lào,

Việt Nam và Trung Quốc

Cây lúa trồng hiện nay ñã trải qua một lịch sử tiến hóa rất lâu dài và khá phức tạp, với nhiều thay ñổi rất lớn về ñặc ñiểm hình thái, nông học, sinh

lý và sinh thái ñể thích nghi với ñiều kiện khác nhau của môi trường thay ñổi theo không gian và thời gian Sự tiến hoá này bị ảnh hưởng rất lớn bởi 2 tiến trình chọn lọc: chọn lọc tự nhiên và chọn lọc nhân tạo Cho ñến nay, hệ thống

phân loại thực vật học của loài lúa trồng O sativa L gồm 3 loài phụ (gồm Indica, Japonica và Javanica), 8 nhóm biến chủng và 284 biến chủng Tuy

nhiên, theo ñịnh luật về dãy biến dị tương ñồng của Vavilov thì cây lúa vẫn tiếp tục tiến hóa và nhiều biến chủng mới vẫn tiếp tục xuất hiện, các nhà khoa

học vẫn ñang tiếp tục nghiên cứu, tập hợp và bổ sung thêm cho hệ thống phân loại này (Nguyễn Văn Hoan, 2006)

1.2 Biến ñổi khí hậu và bệnh ñạo ôn trên lúa

1.2.1 Biến ñổi khí hậu

Theo nghiên cứu của ngân hàng thế giới, nước ta với bờ biển dài và hai vùng ñồng bằng lớn, khi mực nước biển dâng cao từ (0,2 - 0,6)m, sẽ có từ (100.000 - 200.000) ha ñất bị ngập và làm thu hẹp diện tích sản xuất nông nghiệp Nếu nước biển dâng lên 1m sẽ làm ngập khoảng từ 0,3 ñến 0,5 triệu

ha tại ðồng bằng sông Hồng và những năm lũ lớn khoảng trên 90% diện tích của ðồng bằng sông Cửu Long bị ngập từ 4-5 tháng, vào mùa khô khoảng trên 70% diện tích bị xâm nhập mặn với nồng ñộ lớn hơn 4g/l Ước tính Việt Nam sẽ mất ñi khoảng 2 triệu ha ñất trồng lúa trong tổng số hơn 4 triệu ha hiện nay, ñe dọa nghiêm trọng ñến an ninh lương thực quốc gia và ảnh hưởng ñến hàng chục triệu người dân

Biến ñổi khí hậu (BðKH) làm thay ñổi ñiều kiện sinh sống của các loài sinh vật, dẫn ñến tình trạng biến mất của một số loài và ngược lại xuất hiện nguy cơ gia tăng các loại “thiên ñịch” Trong thời gian 2 năm trở lại ñây, dịch rầy nâu, vàng lùn, lùn xoắn lá diễn biễn ngày càng phức tạp ñặc biệt là bệnh ñạo ôn gây hại nặng ở vụ Xuân – miền Bắc Việt Nam

Báo cáo kết quả thực hiện ngành nông nghiệp năm 2012 cho thấy diện tích gieo cấy lúa cả năm ước ñạt 7.753,2 nghìn ha; trong ñó, 294.130 ha bị nhiễm bệnh ñạo ôn lá, tăng 21% với năm 2011, diện tích nhiễm nặng 11,4 ngàn ha, tăng 118% với năm 2011, diện tích mất trắng 8 ha Bệnh tăng mạnh tại các tỉnh phía Bắc, có 54,7 nghìn ha bị nhiễm bệnh, trong ñó có 4.238 ha bị nhiễm bệnh nặng Diện tích nhiễm bệnh ñạo ôn cổ bông 72.282 ha, tăng 40%

so với năm 2011, trong ñó diện tích nhiễm nặng 1.699 ha Bệnh gây hại chủ yếu trên lúa tại các ñịa phương bị nhiễm ñạo ôn lá nặng

BðKH ñang gây ra nhiều thách thức ñối với nền nông nghiệp toàn cầu nói chung và nông nghiệp nước ta nói riêng Các hiện tượng thời tiết, sự phát sinh phát triển của sâu bệnh ñã và ñang gây trở ngại lớn cho sản xuất nông nghiệp nói chung và nghề trồng lúa nói riêng Thực tiễn ñó ñặt ra nhu cầu lớn

về các giống cây trồng mới có khả năng chống chịu ñiều kiện bất thuận và kháng sâu bệnh trong tương lai

1.2.2 Bệnh ñạo ôn trên lúa

Bệnh ñạo ôn là bệnh quan trọng nhất trên lúa trên thế giới và ở Việt Nam Bệnh ñạo ôn ñược phát hiện ñầu tiên ở Italia năm 1560, sau ñó là ở Trung Quốc năm 1637, Nhật Bản năm 1760, Mỹ năm 1906 và Ấn ðộ năm

1913, v.v Ở nước ta, Vincens (người Pháp) ñã phát hiện nguồn bệnh ở Nam

Bộ vào năm 1921 Năm 1951, Roger (người Pháp) cũng ñã xác ñịnh sự xuất hiện và gây hại của bệnh ở vùng Bắc Bộ (Vũ Triệu Mân và cs, 2007) Bệnh ñạo ôn ñã ñược tìm thấy ở ít nhất 85 quốc gia và chưa có nơi nào báo cáo là

ñã từng tiêu diệt ñược hoàn toàn mầm bệnh Thiệt hại về năng suất do bệnh ñạo ôn gây ra có thể lên tới 75% hoặc cao hơn nữa nếu gặp những ñiều kiện thuận lợi cho bệnh phát triển

Triệu chứng:

Nấm có thể xâm nhiễm gây bệnh tất cả các bộ phận trên mặt ñất gồm

lá, ñốt thân, cổ bông, cổ gié (Hình 1.1) Các nghiên cứu gần ñây cho thấy mức

ñộ mẫn cảm của lá tỷ lệ thuận với mức ñộ mẫn cảm trên cổ bông Tính mẫn cảm của cây ñối với nấm phụ thuộc nhiều yếu tố môi trường cũng như các yếu tố liên quan ñến phát triển của cây Tính mẫn cảm thường giảm theo tuổi cây và tuổi lá; tính mẫn cảm tăng mạnh khi bón thừa ñạm Trái lại bón Si làm giảm tính mẫn cảm Ngoài ra, ñặc ñiểm vết bệnh thay ñổi ñáng kể theo mức

ñộ mẫn cảm:

Vết bệnh ñiển hình có hình elip hoặc thoi xuất hiện 5-7 ngày sau lây bệnh Biểu hiện của vết bệnh thay ñổi phụ thuộc theo giống: từ màu lục nhạt, vết bệnh phát triển (mẫn cảm) tới màu lục ñậm với viền vết bênh màu nâu (tính kháng tập nhiễm cục bộ)

Hình 1.1 Triệu chứng bệnh ñạo ôn trên lá

Tác nhân gây bệnh:

Nấm gây bệnh có tên giai ñoạn vô tính là P oryzae (syn Pyricularia oryzae) Giai ñoạn hữu tính của nấm ñã ñược ñặt tên là Magnaporthe grisea

và gần ñây dựa vào các nghiên cứu phân tử, ñược ñặt tên là M oryzae

Nấm thuộc lớp nấm túi (Ascomycetes), tuy nhiên ngoài tự nhiên nấm

chỉ sinh sản vô tính tạo cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh không màu,

2 vách ngăn, hình quả lê (hoặc nụ sen)

Xâm nhiễm gây bệnh:

Nấm ñạo ôn là nấm bán sinh dưỡng (hemibiotroph) với pha sinh dưỡng biotroph ở giai ñoạn sớm của quá trình xâm nhiễm

Giai ñoạn sớm của quá trình xâm nhiễm bao gồm pha tiền xâm nhập (prepeneration): bào tử nấm tiếp xúc trên bề mặt lá, ñỉnh bào tử nứt vỡ và tiết

ra một giọt chất nhầy gắn kết chặt bào tử và bề mặt lá Lớp chất nhày này chứa các hợp chất cacrbonhydrate và glycoprotein

Tiếp theo, bào tử nấm nảy mầm tạo ống mầm, hình thành một tế bào ở ñỉnh ống mầm và phát triển thành vòi áp (appressorium) Vòi áp của nấm là một cấu trúc dạng vòm, có vách dày, mầu ñậm do bị melanin hóa Sự melanin

hóa làm vách vòi áp trở nên chắc chắn hơn Bên trong vòi áp, nấm tích lũy nhiều glycerol và do vậy áp lực trương của vòi áp nấm ñạo ôn rất lớn, có thể tới 80 at

Tiếp theo quá trình tiền xâm nhập là xâm nhập của bào tử: Từ vòi áp sẽ hình thành một sợi nấm nhỏ gọi là ñế xâm nhập (infection peg) ñể xâm nhập trực tiếp qua tầng cutin và vào bên trong tế bào biểu bì Bên trong tế bào biểu

bì, ñỉnh ñế xâm nhập sẽ phình to tạo thành vòi hút (haustorium) Nấm sẽ tiết các enzyme và effector qua màng vòi hút vào tế bào chất của tế bào ký chủ và hấp thụ dinh dưỡng Trong quá trình dinh dưỡng, vách tế bào ký chủ dần dần sụp ñổ và nấm tiếp tục phát triển sang tế bào bên cạnh (thông qua sợi liên bào) và lại tiếp tục hình thành vòi hút ở tế bào mới bị xâm nhập

Nhiều yếu tố dẫn truyền tín hiệu tham gia vào quá trình nhận biết và

hình thành vòi áp của nấm P oryzae Sự hình thành vòi áp chỉ xuất hiện trên

bề mặt cứng (như bề mặt lá) Hai yếu tố chính tham gia vào quá trình dẫn truyền tín hiệu ñể hình thành vòi áp là chất lượng và bản chất hóa học của sự gắn kết

Bề mặt bào tử nấm có chứa một lớp protein gọi là hydrophobin (MPG1 protein) với phía ưa nước hướng vào tế bào nấm và phía ghét nước hướng về

bề mặt của lá Lớp hydrophobin giúp bào tử nhận biết ñược bề mặt ghét nước của lá và có vai trò quan trọng trong hình thành vòi áp

Một số gen của nấm (MagA, MagB) cảm ứng hình thành cAMP (cyclic

adenosine monophosphate), một phân tử dẫn truyền tín hiệu kích thích hình thành vòi áp

1.3 Phân tích di truyền gen kháng bệnh ñạo ôn của cây lúa

Các nghiên cứu di truyền tính kháng bệnh ñạo ôn lúa cũng xuất hiện rất sớm, ñặc biệt tại Nhật Bản từ năm 1917 Mặc dù nghiên cứu dài hạn như vậy, nhưng giống kháng bệnh ñạo ôn bền vững rất hiếm ðến ñầu thập niên

1960 Goto thiết lập hệ thống giống chuẩn nòi ñối với nấm gây bệnh ñạo ôn trên lúa ở Nhật (Ou, 1985) Một bộ giống lúa chuẩn quốc tế kháng bệnh ñạo

ôn ñược phát triển bởi IRRI và Nhật Bản Những giống chuẩn kháng này mang một gen ñơn và phủ trên 24 kiểu gen khác ðiều ñó sẽ tạo thuận lợi cho việc ñiều tra ngân hàng gen, phát triển hệ thống chuẩn kháng, và làm rõ sự khác biệt của các isolate (Yoshimichi Fukuta, 2006)

Thuyết gen ñối gen của Flor năm 1971 ñã mở ra hướng tiếp cận ñể phòng bệnh thông qua việc sử dụng các gen bảo vệ vật chủ rất hiệu quả và

kinh tế Người ta cũng sử dụng các gen mã hóa PR protein như chitinase và

ß-1, 3 glucanase trong phòng chống bệnh ñạo ôn (Hiroshi và cs, 2010)

Tuy nhiên, một trong những ñặc ñiểm cơ bản của nấm bệnh ñạo ôn là tồn tại rất nhiều chủng khác nhau Mỗi vùng sinh thái, tồn tại một số chủng nhất ñịnh và có mức ñộ gây hại khác nhau Tương ứng với các chủng, có những gen chống khác nhau Trên thế giới ñã phát hiện có 256 chủng nấm ñạo ôn (Veeraraghavan, 1975) Với nỗ lực nghiên cứu không ngừng của các nhà khoa học trên toàn thế giới, khoảng 85 gen và 350 QTL ñiều khiển tính kháng bệnh ñạo ôn, nhưng nhiều gen ñược tìm thấy trên cùng loci, trong ñó

gen pi-21 là gen lặn (Fukuoka và Okun, 2000; Liu và cs, 2003; Gowda và cs,

2006; Jeung và cs, 2007; Lin và cs, 2007; Ballini và cs, 2008; Ramkumar và

cs, 2010; Costanzo và Jia, 2010) Người ta ñã dòng hoá ñược 7 gen Pib, Pita, Pi36, Pi9, Pi2, Pid2, Piz-t (Liu và cs, 2007) tạo cơ cở cho việc chọn tạo giống

mang gen kháng bệnh Gần ñây, Ramkumar và cs (2011) công bố một chỉ thị

gen kháng bệnh ñạo ôn mới Pi54 MAS rất hữu ích cho chọn tạo giống lúa

truyền, ựịnh vị ở tâm ựộng của nhiễm thể số 12 Bên cạnh ựó, Wu và cs (1996) ựã thiết lập bản ựồ di truyền và bản ựồ vật lý bằng cách sử dụng vector

BAC, quét rất kỹ khu vực gen Pi-ta, với 3 marker phân tử liên kết chặt trong

khoảng 0,5 cM Tương tự như vậy, Nakamura và cs (1997) ựã thiết lập một

"contig map", với qui mô quét 300 kb, và marker liên kết với gen Pi-ta2 trong

khoảng 0,3 cM Tuy nhiên, vùng tâm ựộng là nơi thể hiện rất thấp khả năng tái tổ hợp và thể hiện tần suất cao của chuỗi mã lập lại điều này ựặt ra cho chúng ta những khó khăn trong việc tiếp cận với gen mục tiêu bằng kỹ thuật

"chromosome walking" Gần ựây, Rybka và cs (1997) ựã xác ựịnh gen Pi-ta2

liên kết với hai marker kế cận với khoảng cách di truyền khoảng 0,3 cM Gen

Pi-ta ựược ựịnh vị trên bản ựồ ở vị trắ chồng lấp với Pi-ta2 bằng phương pháp

phân tắch kiểu gen theo giản ựồ (graphical genotype) của một dòng ựẳng gen Hai gen này có quan hệ với nhau về chức năng, tương tác allelic, hoặc ắt nhất chúng liên kết với nhau rất chặt, và chúng có thể có cùng một nguồn gen tổ tiên (Rybka và cs, 1997) Jean (thuộc tổ chức CiRAD, Pháp) là một chuyên gia rất nổi tiếng về bệnh ựạo ôn trên cây lúa ựã chứng minh ựược có sự kết hợp giữa di truyền quần thể và di truyền phân tử ựể nghiên cứu giống lúa chống chịu bệnh này (Bùi Chắ Bửu - Viện KHKTNN Miền Nam)

Morel ựã bắt ựầu từ nghiên cứu gen Pi-1, Pi-2 ựể xem xét sự tiến hóa

của tác nhân gây bệnh (pathogen) làm phá vỡ tắnh kháng bệnh ựạo ôn trên cây

lúa ở khu vực đông Nam Á Sự tiến hóa di truyền quần thể của M grisea ựược nghiên cứu trên gen Pi-33 và dòng hóa của nó, gen Pi-33 + Pi-1 + Pi-2 cho thấy một phối hợp tốt cho tắnh kháng bền vững, trong ựó gen Pi-33 biểu

hiện phổ kháng bệnh ựạo ôn rất rộng Sự tương tác của 30 gen thuộc hệ thống

tự vệ của cây lúa cũng ựược ghi nhận (Bùi Chắ Bửu - Viện KHKTNN Miền Nam)

Ở Việt Nam, Viện Lúa ðồng Bằng Sơng Cửu Long đã thành cơng khi thực hiện khai thác lúa hoang, Tẻ Tép, Sĩc Nâu làm nguồn cung cấp gen

kháng và dịng hố gen Pi2, định vị giữa 2 RFLP marker là RG64 (phân cắt bằng XbaI) và LPO111-112 (phân cắt bằng Bgl11) trên nhiễm sắc thể số 6 và

tìm kiếm gen mới kháng dịng nấm cĩ độc tính mạnh nhất trong bộ sưu tập là OMP1 (Nguyễn thị Lang, Bùi chí Bửu, 2002)

Trong khuơn khổ dự án JICA giữa Chính phủ Nhật Bản-Việt Nam và ðại học Nơng nghiệp Hà Nội, Phan Hữu Tơn và cs đã khảo sát một tập đồn gồm 24 dịng giống lúa chứa các gen kháng bệnh đạo ơn khác nhau ðể sử dụng nguồn gen này trong cơng tác chọn tạo giống kháng bệnh đạo ơn ở Việt Nam, ơng đã tiến hành thu thập, phân lập chủng, rồi lây nhiễm nhân tạo để xác định gen nào chống được các chủng của Việt Nam, đồng thời khảo sát đặc điểm nơng sinh học của các dịng giống Bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo sử dụng 4 chủng nấm bệnh đạo ơn đã phân lập, nhĩm nghiên cứu phát

hiện 8 dịng giống chứa các gen Pi- k s , Pi-k, Pi-z, Piz-5, Pi 1, Pi 3 và Pi 5(t)

biểu hiện khả năng kháng mạnh với cả 4 chủng nấm phân lập và xác định các

gen Pi-1, Pi-5(t), Pi-3, Pi-4(t) kháng tốt với các chủng nấm đạo ơn ở miền

Bắc (Phan Hữu Tơn, 2004; Bùi Chí Bửu - Viện KHKTNN Miền Nam)

Sử dụng kỹ thuật AFLP, Nguyễn Thị Ninh Thuận (2006) đã nghiên cứu mức độ đa dạng và tính gây bệnh của 114 isolates nấm thu thập tại nhiều tỉnh

thuộc miền Bắc Việt Nam Kết quả nghiên cứu cho thấy quần thể nấm M grisea tại đồng bằng sơng Hồng cĩ tính đa dạng cao gồm 7 nhĩm VNG1,

VNG2, , VNG7 Quần thể nấm phân lập trên các giống lúa tẻ khác với quần thể nấm phân lập trên các giống lúa nếp Quần thể nấm trên lúa tẻ gồm 4 nhĩm VNG1, VNG2, VNG3 và VNG4, cịn trên lúa nếp gồm 3 nhĩm VNG 5, VNG6 và VNG7 Các nhĩm VNG1, VNG3, VNG 4 chiếm ưu thế với VNG1 chiếm tới hơn 50% Nhiều giống chỉ thị mang nhiều gen kháng cĩ thể chống

ñược quần thể nấm M grisea của miền Bắc (ví dụ giống Morobenekan mang các gen kháng Pi-7(t), Pi-10(t), Pi-12(t), Pi-44(t), Pi-157), tuy nhiên nghiên

cứu chưa chỉ ra ñược gen nào ñiều khiển tính kháng Dựa trên phản ứng của ñại diện các nhóm ñối với các giống chỉ thị có số lượng gen kháng ít, nhóm ñề

xuất sử dụng các gen Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-ta 2 , Pi-k ñể tạo giống kháng nấm

ñạo ôn ở miền Bắc

Nhiều gen kháng bệnh ñạo ôn ñược xác ñịnh ở trên lúa Tuy nhiên, chủng nấm ñạo ôn rất ña dạng và dễ phát sinh chủng mới, trong khi ñó, mỗi gen kháng chỉ có khả năng chống ñược một số chủng nhất ñịnh, bởi vậy các nhà khoa học luôn phải nỗ lực tìm ra gen kháng mới ñể chống lại các chủng mới phát sinh Ứng dụng công nghệ RNAi ñể tạo ra giống lúa chống bệnh ñạo ôn bằng cách ức chế trực tiếp các gen quan trọng liên quan tới khả năng gây bệnh của nấm ñã và ñang trở thành một hướng mới trong chiến lược tạo ra ñược một giống lúa có khả năng kháng lại với ña số các chủng nấm khác nhau

1.4 Phân tích genome nấm ñạo ôn và công nghệ RNAi trong phòng chống bệnh ñạo ôn trên lúa

1.4.1 Phân loại nấm ñạo ôn

Chi (genus): Magnaporthe

Loài (species): M grisea, P oryzae, M oryzae

Dựa trên những phân tích phân tử ñối với phức hợp các tác nhân gây ra triệu chứng của bệnh ñạo ôn ñược thu thập trên lúa và các cây kí chủ khác

thuộc họ Grassaceae thì nấm ñạo ôn bao gồm một phức hợp các loài lẫn lộn

chứa ít nhất hai loài sinh học có sự khác biệt về di truyền rõ ràng và không

giao phối với nhau Những thành viên ñược phân lập từ chi Digitaria ñược gọi là M grisea, những thành viên còn lại ñược phân lập từ lúa và một số cây trồng khác thì ñược gọi là M oryzae (Couch và Kohn, 2002)

1.4.2 Phân tích genome của nấm ñạo ôn

Năm 2005, nhóm do Dean ñứng ñầu công bố trình tự genome của M grisea khá ñầy ñủ Genome của M grisea có kích thước 40,3Mb với 7 nhiễm

sắc thể, có 11.109 gen, phân bố theo tỉ lệ 1/3,5 kb, bao gồm 45% số gen có

mã di truyền ñược xác ñịnh, trong ñó khoảng 8 gen ñược cho là liên quan ñến quá trình xâm nhập và lây nhiễm sang lúa Chức năng gen gây bệnh hoặc liên

quan ñến quá trình phát triển bệnh của nấm M grisea, hoặc các gen liên quan ñến tương tác giữa cây lúa và nấm M grisea cũng ñược làm sáng tỏ trong các

công trình nghiên cứu trên toàn thế giới Hơn 1000 ESTs ñã ñược giải trình tự

từ một số thư viện cDNA ñại diện cho các giai ñoạn sinh trưởng, phát triển khác nhau của nấm và xâm nhiễm thực vật (Xu J-R và cs, 2002) Một số gen

chức năng như: gen Pth11 mã hóa cho một GPCR (G-protein-coupled

receptor, receptor ) tiếp nhận thông tin môi trường và hoạt hóa chất truyền tin thứ cấp và ñiều hòa sự biểu hiện của gen) cần thiết cho sự hình thành vòi áp

(appressorium) và sự phát triển của bệnh (Talbot và cs, 1993); gen PMK1

kích hoạt protein kinase ñiều hòa quá trình hình thành giác bám (appressorium) và sinh trưởng xâm nhiễm ở thực vật của nấm (Xu J-R và cs,

1996; Xu J-R và cs, 2000); gen MST12 cần thiết cho sự xâm nhập của vòi áp

và ñiều khiển sự xâm nhiễm ở thực vật (Xu J-R và cs, 1998; Park G và cs, 2002; Park G và cs, 2004) Và một số gen khác cũng liên quan ñến sinh

trưởng, xâm nhiễm, hình thành vòi áp, hình thành bào tử của nấm ñược báo

cáo như adenyl cylase (MAC1), tiểu phần xúc tác của protein kinase A (CPKA) và tiểu phần MagB của G protein α trong nấm M grisea (Liu S và Dean, 1997), gen MMT1 (Jeon J và cs, 2004), MCK1 (Jeon và cs, 2008), gen MgATG1 (Liu H X và cs, 2007), PLS1 (Clergeot và cs, 2001), gen CUT2

(Skamnioti và Sarah J., 2007) ñã ñược chứng minh là làm giảm triệu chứng bệnh trong các nghiên cứu chức năng bằng cách làm gián ñoạn hoặc mất gen Theo nghiên cứu mới ñây của Chen và cs năm 2010, các GTPases nhỏ Rac/Rop ở thực vật có chức năng như là các phân tử dẫn truyền tín hiệu liên quan ñến các phản ứng phòng thủ Họ ñã nghiên cứu mô hình biểu hiện của

gen Rac/ Rop bằng RT-PCR và cũng ñịnh vị gen ñó bằng gen chỉ thị GFP ñể

hiểu ñược chức năng cụ thể của mỗi phân tử trong 7 thành viên của họ Rac/ Rop ở lúa Các phân tích lây nhiễm nhân tạo chỉ ra rằng OsRac1 ñiều hòa tích

cực phản ứng kháng bệnh ñạo ôn OsRac1 cũng ñiều hòa tích cực cho phản

ứng kháng vi khuẩn gây bệnh trên lúa Các thông tin về trình tự và chức năng của gen này góp phần quan trọng trong chiến lược tạo cây lúa chuyển gen kháng ñạo ôn bằng công nghệ RNAi ñể ức chế gen mục tiêu ở phạm vi rộng

1.4.3 Công nghệ RNAi và ứng dụng trong phòng chống bệnh ñạo ôn

Hiện tượng RNA can thiệp (RNA interference-RNAi) mà trước ñây ñã từng ñược gọi là hiện tượng ñồng ức chế (co-suppression), câm gen hậu phiên

mã (post transcriptional gen silencing -PTGS), chế ngự (quelling) là một quá trình xảy ra trong các tế bào sống ñể ñiều khiển sự hoạt ñộng của các gen Trải qua hơn 20 năm phát hiện, phát triển, RNAi ñã và ñang trở thành chủ ñề nóng bỏng trong các nghiên cứu ở mức ñộ cơ bản cho ñến ứng dụng Ngày nay, RNAi vẫn là công cụ hàng ñầu trong các nghiên cứu về genomic, chức năng gen, ñiều hòa biểu hiện gen và rất nhiều ứng dụng trong y học cũng như trong nông nghiệp

Lịch sử phát hiện hiện tượng RNAi:

Sự khám phá ñầu tiên về RNAi khi quan sát sự ức chế phiên mã bởi sợi RNA ñối nghĩa ñược biểu hiện trong cây trồng chuyển gen bởi Napoli và cs vào năm 1990 Tiếp theo, Romano và Macino (1992) cũng phát hiện một hiện

tượng tương tự trong nấm Neurospora crassa khi nấm này ñược chuyển gen albino-3 (al-3) và albino-1 (al-1) chịu trách nhiệm tổng hợp carotenoid, các gen al-3 và al-1 ñã không ñược biểu hiện Các tác giả ñã ñặt tên cho hiện

tượng này là hiện tượng chế ngự (quelling)

Không lâu sau ñó, khi các nhà virus học thực vật làm việc ñể nâng cao tính kháng của cây trồng ñối với các bệnh virus cũng ñã quan sát thấy một hiện tượng tương tự Các tác giả ñã tin rằng có thể tạo ra cây trồng chuyển gen kháng virus bằng cách chuyển một ñoạn RNA của virus vào ñể ức chế sự sinh sản của virus (Covey và cs, 1997) Một thực nghiệm ngược lại trong ñó tác giả ñã gắn một ñoạn trình tự của một gen cây trồng vào virus rồi cho cây trồng lây nhiễm với virus ñó, kết quả cho thấy gen ñích trong cây ñược lây nhiễm cũng bị ức chế Hiện tượng này ñã ñược chú ý và gọi là “ câm gen gây

ra bởi virus” (virus-induced gen silencing), và một loạt những hiện tượng tượng tự cùng ñược gọi tên là sự cân gen ở mức hậu phiên mã (post-transcriptional level)

Fire và cs (1998) ñã báo cáo về hiệu quả làm câm gen sau khi tiêm cấu

trúc dsRNA vào giun tròn Caenorhabditis elegans Các tác giả ñã phát hiện

thấy khi tiêm cấu trúc sợi mRNA hoặc sợi ñối nghĩa ñều không tạo ra hiệu quả làm câm gen mong muốn, chỉ có cấu trúc dsRNA ñược tiêm vào mới tạo

ra hiện tượng “câm” Các tác giả ñã gọi hiện tượng này là RNA tương tác (RNA interference) Phát hiện của Fire và cs rất ñược chú ý vì ñây là phát hiện ñầu tiên ñã xác ñịnh ñược tác nhân là nguyên nhân của các hiện tượng

trên, ñó là dsRNA Fire và cs ñã ñược trao tặng giải thưởng Nobel về vật lý và

y học cho phát hiện của họ vào năm 2006

Cơ chế phân tử của hiện tượng RNAi:

Các nhà khoa học ñã phát hiện thấy các phân tử RNA nhỏ (sRNA) ñược tạo ra từ các phân tử RNA dài hơn qua trung gian là các phân tử dsRNA Các sRNA ñược chia làm hai nhóm chính khác nhau dựa trên mô hình sinh tổng hợp của chúng là siRNA và miRNA

SiRNAs là các phân tử RNA sợi kép nhỏ, kích thước khoảng 21-25 nts, ñược tạo ra bởi Dicer (một RNA endonuclease nhóm III) là thành phần quan trọng của phức hợp RISC gọi là siRISC có chức năng phân hủy mRNA mục tiêu của nó Phần lớn siRNA có nguồn gốc từ mRNAs, các yếu tố di ñộng (transposons), virus hoặc DNA dị nhiễm sắc thể (heterochromatic DNA) Như vậy siRNA có cùng nguồn gốc với gen mục tiêu Các siRNA bình thường có thể ñược hình thành từ các RNA mạch kép (dsRNA), sợi dài nội sinh cũng như ngoại sinh (ví dụ thông qua chuyển gen) thông qua sự phân cắt bởi Dicer RNase, giải phóng một vài phân tử trung gian dạng mạch kép, có kích thước khoảng 21 nts, với 2 nts nhô ra ở ñầu 3’ (Elbashir và cs, 2001) Các siRNA sau ñó tham gia vào thành phần của phức hợp RISC gọi là siRISC, ñưa nó ñi phân cắt các mRNA mục tiêu

MiRNA là các trình tự RNA ñiều hòa nhỏ, nội sinh, không mã hóa, có kích thước 21-24 (nts) Chúng ñóng vai trò quan trọng trong ñiều hòa âm tính

sự biểu hiện của gen ở hầu hết các sinh vật nhân chuẩn (Bartel và cs, 2003) Không giống như siRNA, thường có nguồn gốc ngoại sinh, miRNA ñược hình thành bởi các gen trong genome gọi là các MIR gen Ngoại trừ một phần nhỏ các MIR gen (chẳng hạn khoảng ¼ số lượng miRNA của bộ gen người) nằm ở vùng intron của gen mục tiêu thì phần lớn các gen miRNA nằm ở các

vị trí cách xa gen mục tiêu Chúng có thể biệt lập hoặc phân bố thành cụm và

ñược phiên mã thành các ñơn vị phiên mã riêng biệt Như vậy miRNA có nguồn gốc khác với gen mục tiêu

Quá trình tạo ra các phân tử miRNA có thể ñược tóm tắt qua các bước sau: Hình thành phân tử phiên mã sơ cấp pri-miRNA (primary transcripts): ðầu tiên, gen mã hóa miRNA ñược phiên mã nhờ RNA endonuclepolymerase

II (pol II) ở trong nhân thành các phân tử phiên mã (transcript) có kích thước

từ vài trăm tới hàng ngàn nts Các transcript này ñược gọi là các phân tử phiên

mã sơ cấp pri-miRNA (primary transcripts) chứa môt mũ (cap) ñầu 5’ và một chuỗi poly-A ñầu 3’ Pri-miRNA của thực vật thường dài hơn và phức tạp hơn (chứa nhiều cấu trúc thân – thòng lọng hơn)

Hình thành các phân tử tiền chất pre-miRNA (precusor miRNA): Tiếp theo, các phân tử pri-miRNA ñược cắt bởi một RNA endonuclease nhóm III

là Dicer (ở ñộng vật là Drosa) thành các phân tử RNA có kích thước khoảng

70 nts gọi là các phân tử tiền chất pre-miRNA (precusor miRNA)

Hình thành miRNA thành thục ở thực vật: Các phân tử pre-miRNA ở trong nhân sẽ ñược Dicer cắt thành các phân tử RNA nhỏ sợi kép có kích thước khoảng 22 nts Do bị cắt bởi Dicer, các phân tử này có ñầu so le với gốc phosphat ở ñầu 5’ và 2-3 phân tử nts ñầu 3’ (overhang) Tiếp theo, phân tử RNA nhỏ sợi kép này ñược vận chuyển từ nhân ra tế bào chất Tại tế bào chất, chúng ñược tách bởi helicase thành 2 phân tử sợi ñơn: một sợi là phân tử miRNA thành thục (gọi là sợi hướng dẫn) sẽ tham gia hình thành phức hợp RISC; còn sợi kia sẽ bị phân hủy (Parker và Song, 2004)

như các miRNA tự nhiên Các vector amiRNA ñã ñược chứng mình là ñem lại hiệu quả tương tự như các miRNA tự nhiên trên nhiều ñối tượng khác nhau

(Zeng và cs, 2002), ở trên Arabidopsis (Parizotto và cs, 2004) và các loài thực

vật khác (Schwab và cs, 2006) Hiện nay công nghệ amiRNA ñang ñược ứng dụng rất rộng rãi cho các mục ñích nghiên cứu làm bất hoạt gen (gen knockdown) Trong lĩnh vực nông nghiệp, amiRNA ñang trở thành công cụ có hiệu quả trong việc tạo ra các cây trồng chuyển gen chống lại một số loại tác nhân gây hại trên thực vật bao gồm nấm, côn trùng, Gavilano và cs (2006)

Ứng dụng công nghệ RNAi trong phòng chống bệnh ñạo ôn trên lúa: Hiện tượng RNAi trên nấm M grisea ñược quan sát lần ñầu tiên vào

năm 2003 bởi Kadotani và cs Trong nghiên cứu này, các tác giả ñã chuyển một

cấu trúc gồm nhiều bản copy của gen GFP vào nấm M grisea ñể làm mô hình

cho gen ñích Sau ñó các dòng nấm chuyển gen GFP cũng ñược chuyển với một vector mang cấu trúc DNA mã hóa cho các phân tử RNA sợi ñơn, sợi ñôi

ở dạng sense-sense, antisense-antisense, sense-antisense và cấu trúc RNA kẹp tóc Kết quả các tác giả ñã xác ñịnh ñược cấu trúc cho hiệu quả làm câm gen

cao nhất trong nấm M grisea là cấu trúc mã hóa cho phân tử RNA kẹp tóc Các

siRNA ñược cho là các phân tử chìa khóa của quá trình làm câm gen thông qua RNA Khi cho lai với mẫu dò là trình tự ñối nghĩa của gen GFP, các tác giả ñã xác ñịnh ñược những phân tử siRNA với kích thước biến ñộng 19-23 nts (Kadotani và cs, 2003) Trong khi các ñoạn siRNA kích thước 25 nts ñã ñược

báo cáo trên nấm Neurospora crassa (Catalanotto và cs, 2002), chứng tỏ những

ñoạn siRNA ñược sinh ra trong các loài nấm khác nhau thậm chí ngay trong chính một loài cũng biến ñộng ở các kích thước khác nhau Nghiên cứu này ñã xác ñịnh ñược cấu trúc có hiệu quả gây ra sự câm gen rõ nhất ở mức phân tử Tuy nhiên, RNAi mới chỉ thu ñược khi sự phiên mã các dsRNA diễn ra bên trong tế bào nấm khi một gen chuyển ñược chuyển vào trong tế bào nấm Công

nghệ RNAi cần thiết sự chuyển vào trong tế bào nấm một cấu trúc DNA có thể phiên mã ñể tao ra các dsRNA bên trong tế bào nấm chỉ hữu ích với những nghiên cứu thực nghiệm trong phòng thí nghiệm Nó gần như không phù hợp cho những những ứng dụng thực tiễn mà ñòi hỏi dsRNA phải ñược tạo ra trong nhiều tế bào nấm trên một phạm vi rộng hoặc trên ñồng ruộng

Một nghiên cứu mới ñây nhất về hiện tượng RNAi trên nấm M grisea bởi

Van De Craen và cs ñược báo cáo năm 2010 Nhóm nghiên cứu ñã quan sát thấy hiện tượng RNAi không phải trên những gen mô hình ñược chuyển vào tế bào

nấm nữa mà trực tiếp trên những gen của nấm M grisea bằng các thực nghiệm

in vitro Trong thực nghiệm hình thành vòi áp trên bề mặt kị nước, các tác giả sử

dụng bào tử nấm ñạo ôn ở nồng ñộ 104 bào tử/ml và nuôi cấy trên bề mặt kị nước của màng nhân tạo (gelbondRflim); 20µl dsRNA ñược bổ sung lên trên bề mặt nuôi cấy ở các nồng ñộ 0.1-1 mg/ml ðối chứng âm sử dụng ñược chuẩn bị theo quy trình tương tự dsRNA cần kiểm tra, là một phần trình tự gene GFP (hoặc có thể sử dụng cấu trúc pre-miRNA tự nhiên) Sau 16-24 giờ nuôi cấy ở

280C, các bào tử bắt ñầu này mầm ñược nhuộm với acid Fucshin ñể quan sát sự nảy mầm của bào tử Sự hình thành vòi áp trên bề mặt màng nhân tạo ñược quan sát dưới kính hiển vi Sự ức chế hình thành vòi áp là dấu hiệu trực tiếp của việc

ức chế sự biểu hiện của gene ñích bởi RNAi do sự hấp thu dsRNA Phần trăm hình thành vòi áp ñược tính toán bởi số vòi áp hình thành trên tổng số bào tử quan sát trên 3 quang trường Thực nghiệm về sự phát triển của hệ sợi trên bề mặt ưa nước: Bào tử vô tính ñược thu và hòa loãng trong môi trường PDB ñể ñảm bảo có 1250 bào tử trong 90µl dịch ñược ñưa vào mỗi giếng của tấm 96-wells(Falcon 3072) Sau 0-2 giờ, bổ sung thêm 10µl dsRNA ở các nồng ñộ 0,1-0,5 mg/ml ðối chứng âm sử dụng là ñoạn dsRNA của gene GFP, GST hoặc Seastar (sử dụng ít nhất 2 ñối chứng âm) Sau 16-24 giờ nuôi cấy ở 280C trong ñiều kiện tối Sự sinh trưởng của hệ sợi trong mỗi giếng ñược ñịnh lượng bằng

cách ño mật ñộ quang của các giếng nuôi cấy ở bước song 595nm, sử dụng máy ñọc GENios Tecan, Australia Tính phần trăm mẫu bị ức chế và so sánh với mẫu ñối chứng Thực nghiệm sự hình thành bào tử bố trí tương tự nhưng trong ñiều kiện sángñể kích thích sự sinh bào tử Sự hình thành bào tử ñược quan sát liên

tục sau 4-6 ngày nuôi cấy Các thực nghiệm này ñã chứng minh việc tạo ra hiệu

quả làm câm gen mà không cần phải chuyển trực tiếp cấu trúc DNA có khả năng

mã hóa dsRNA vào trong tế bào nấm ðiều này có ý nghĩa rất lớn vì nó mở ra một tiềm năng có thể áp dụng hiện tượng RNAi ñể tạo ra những cây trồng biến ñổi gen (GMO) có thể trực tiếp mã hóa ra cấu trúc dsRNA tương ứng với một trong số những gen ñích trong bản thân tác nhân gây bệnh trên cây trồng ñó Quan trọng hơn nữa là các tác giả ñã thành công trong việc tạo ra hiệu quả làm câm gen mà không cần phải chuyển trực tiếp cấu trúc DNA có khả năng mã hóa

dsRNA vào trong tế bào nấm trong những thực nghiệm in vitro ðiều này có ý

nghĩa rất lớn vì nó mở ra một tiềm năng có thể áp dụng hiện tượng RNAi ñể tạo

ra những cây trồng GMO có thể trực tiếp mã hóa ra cấu trúc dsRNA tương ứng với một trong số những gen ñích trong bản thân tác nhân gây bệnh trên cây trồng

ñó Trong trường hợp này, các ñoạn dsRNA ñược tạo ra bên ngoài thành tế bào

của nấm M grisea có thể ñược hấp thu qua thành tế bào ñể tạo ra hiệu quả làm

câm các mRNA mục tiêu tương ứng bên trong tế bào nấm Tác ñộng của RNAi

ñã ñược chứng minh trong những thực nghiệm in vitro với hiệu quả làm câm cao nhất lên tới 90% so với ñối chứng Bên cạnh ñó những thực nghiệm in vivo cũng

ñã ñược thực hiện với hiệu quả làm câm ñem lại cũng rất khả quan (Van De

Craen và cs, 2010) Những kết quả thực nghiệm in vitro và in vivo ñã khẳng ñịnh

có thể tạo ra cây lúa chuyển gen mang cấu trúc mã hóa cho dsRNA tương ứng

với một hay nhiều gen ñích trong nấm M grisea có thể kháng lại với bệnh ñạo

ôn lúa do nấm này gây ra

1.5 Ứng dụng cây trồng biến ựổi gen và thực trạng nghiên cứu chuyển gen vào lúa

1.5.1 Ứng dụng cây trồng biến ựổi gen

Trong khoảng thời gian 1996 - 2005 cây trồng GMO ựã ựược triển khai trên một diện tắch rất rộng lớn Ờ khoảng 900.000 km2, trong ựó có tới 55% là

ở Hoa Kỳ

Ngày 04/03/2010, tại Hà Nội, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Việt Nam phối hợp với Tổ chức quốc tế về tiếp thu các ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp (ISAAA) tổ chức Hội nghị ỘCây trồng biến ựổi gen trên thế giới năm 2009: Hiện trạng, tác ựộng và triển vọngỢ Hội nghị ựã tổng kết tắnh ựến hết năm 2009, ựã có 14 triệu nông dân trồng các giống cây biến ựổi gen ở 25 quốc gia trên thế giới, trên diện tắch 134 triệu ha tăng 7%, tương ựương 9 triệu ha so với năm 2008 Tổng diện tắch ựất trồng cây biến ựổi gen qua các năm từ 1996 ựến 2009 ựã ựạt gần 1 tỷ ha đáng chú ý là gần 1 nửa diện tắch ựất trồng cây biến ựổi gen trên thế giới (46%) nằm ở các nước ựang phát triển, có tiềm năng vượt các nước công nghiệp phát triển trước năm

2015 Cây trồng GMO hiện ựang có những ựóng góp rất to lớn cho mục tiêu này và sẽ còn ựóng góp ựáng kể trong tương lai (http://www.agrov iet.gov.vn/Pages/news_detail.aspx?NewsId=10586)

đến năm 2010, có 29 nước ựã trồng cây trồng GMO trên ựồng ruộng, trong ựó có 8 nước thuộc EU là Tây Ban Nha, Bồ đào Nha, Tiệp Khắc, Ba Lan, Rumani, đức và Slovakia Tổng diện tắch cây trồng GMO trên thế giới năm 2010 là 148 triệu ha, trong ựó ba cây trồng GMO chiếm diện tắch lớn nhất là ựậu tương (73,3 triệu ha), ngô (46,8 triệu ha), bông vải (21 triệu ha) Ở châu Á có 4 nước ựã trồng giống cây trồng GMO là Ấn độ (9,4 triệu ha), Trung Quốc (3,5 triệu ha), Philipin (540.000 ha) và Myanma (270.000 ha) Ngoài các nước trồng và sử dụng giống cây trồng GMO, còn có 30 nước khác

cho phép nhập khẩu sản phẩm của cây trồng GMO làm thực phẩm hoặc thức

ăn chăn nuôi Như vậy, tổng số trên thế giới ñã có 59 nước chấp thuận sử dụng sản phẩm cây trồng GMO

Theo ước tính của Tổ chức quốc tế về tiếp thu các ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp (ISAAA), năm 2012 diện tích trồng cây biến ñổi gen ở các nước ñang phát triển chiếm khoảng 52% diện tích trồng cây biến ñổi gen trên toàn cầu, tăng cao hơn con số 50% của năm 2011 và cao hơn con

số 48% của các nước công nghiệp trong năm 2012 Năm 2013, Mỹ cho phép trồng ngô mang gen chịu hạn, ñậu tương mang tính trạng tổng hợp ñược trồng

ở Brazil và các nước láng giềng Nam Mỹ Tại Philippines, lúa gạo vàng tăng cường Vitamin A có thể ñược ñưa ra vào niên vụ 2013/2014 sau khi ñược phê duyệt Triển vọng trong thời gian tới, mức tăng diện tích cây trồng công nghệ sinh học toàn cầu có thể khiêm tốn hơn do tỷ lệ áp dụng ñã khá cao ñối với tất

cả các loại cây trồng chủ yếu ở các thị trường tại các nước ñang phát triển và công nghiệp(http://vaas.vn/news_details.asp?newsID=NEW_132912082703)

Ở Việt Nam năm 2010, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ñã thực hiện khảo nghiệm 7 giống ngô biến ñổi gen, trong ñó 3 giống của công

ty Syngenta, 3 giống của công ty Dekalb Việt Nam (công ty Monsanto) và 1 giống của công ty Pioneer Hibred Việt Nam

1.5.2 Nghiên cứu chuyển gen vào cây lúa trên thế giới

Năm 1958, báo cáo ñầu tiên về tái sinh cây từ mô sẹo cây ngũ cốc ñược công bố bởi Tamaoki và Ullstrup Những năm tiếp theo ñã có vài báo cáo tái

sinh thành công một số giống lúa Japonica (Abdullah và cs, 1986; Fujimura

và cs 1985; Kyozuka và cs, 1987; Toriyama và cs, 1986; Yamada và cs, 1986)

và một vài giống lúa Indica (Kyozuka và cs, 1988; Lee và cs, 1989; Wang và

cs, 1989) Chu và cs (1975) ñã xây dựng hệ thống tái sinh có hiệu quả cao cho

cây lúa thuộc loài phụ japonica trên môi trường cơ bản N6

Năm 1989, Lee và cs ñã mô tả phương pháp chuyển gen sử dụng mô sẹo 4 tuần tuổi có nguồn gốc từ hạt trưởng thành giống IR54 sử dụng làm vật liệu tạo huyền phù tế bào Môi trường nuôi cấy tạo huyền phù tế bào là môi trường N6 (Chu và cs, 1975) bổ sung 4mg/l 2,4D, 20mM proline, 30g/l ñường sucrose trong ñiều kiện 260C, lắc 80 vòng/ phút Tế bào trần của giống lúa IR54 ñược sử dụng làm vật liệu chuyển gen Sau 3 tuần chuyển gen cấy chuyển mẫu sang môi trường chọn lọc MS bổ sung 2mg/l 2,4D, 0,5mg/l cytokinin 30g/l ñường và 100mg/l kanamycine Môi trường tái sinh là môi trường N6 bổ sung 10mg/l kinetin, 0,1 mg/l NAA và 30g/l ñường sucrose trong ñiều kiện 10 giờ sáng 280C, 14 giờ tối 240C

Kế thừa và phát triển kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học ñi trước, những năm sau ñó ñã có rất nhiều công trình nghiên cứu trên khắp thế giới công bố chuyển gen vào lúa thành công Năm 1999, Tran Thi Cuc

Hoa và cs ñã tiến hành chuyển gen vào 5 giống lúa indica trồng tại Việt

Nam (ðS20, OMCS96, OMCS97, IR64 và IR72) thông qua chủng vi khuẩn

A tumefaciens LBA4044 mang plasmid pSBbarB-UbiCre và plasmid

pSB35L Hyg- L-Gus Mô sẹo 3 tuần tuổi của các giống lúa ñược tạo ra từ phôi hạt lúa chín trên môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962), 30 g/l ñường sucrose, 2mg/l 2,4-D, 1 g/l casein hydrolysate, 6 g/l agar, pH 5,8 Hiệu quả chuyển gen trong khoảng 1,78 – 13,33% Kết quả phân tích Southern Blot cho thấy ở hầu hết các cây chuyển gen, gen chuyển ñược kết nạp vào nhiễm sắc thể ở một vị trí (locus)

ðến năm 2002, Tran Thi Cuc Hoa và Bui Ba Bong sử dụng tế bào huyền

phù của giống lúa indica làm vật liệu khởi ñầu chuyển gen phosphomannose isomerease thông qua vi khuẩn Agrobacterium Hệ thống chọn lọc sử dụng gen pmi tạo các tế bào ñược chuyển nạp gen sử dụng mannose là nguồn

carbohydrate và chọn lọc các tế bào mang gen chuyển nạp trong môi trường

nuôi cấy bổ sung manose Họ ñã tạo ra ñược các dòng lúa chuyển gen từ hai

giống lúa indica là Một Bụi và MTL250 Các cây mang gen chuyển sinh

trưởng và phát triển bình thường

Chuyển gen sử dụng A tumefaciens ñã ñược sử dụng rộng rãi ñể tạo

giống lúa biến ñổi gen (Roy và cs, 2000; Ignacimuthu và cs, 2000) Mô sẹo hình thành từ phôi hạt trưởng thành (Hiei và cs, 1994; Tran Thi Cuc Hoa, 1999; Datta và cs, 2006; Ozawa, 2008; Rahman, 2010; Sahoo và Tuteja, 2012), hay chưa trưởng thành (Hiei và Komari, 2006) ñược sử dụng chuyển gen Hầu hết các nghiên cứu cho rằng các hiệu quả chuyển gen của các giống

lúa japonica là cao hơn so với các giống indica (Datta và cs, 2006; Rahman,

2010; Tie và cs, 2012) Hiei và cs (1994) báo cáo tỷ lệ chuyển nạp gen vào

giống lúa japonica thông qua vi khuẩn A tumefaciens chủng LBA4404 và

EHA101 ñạt 10 – 30% sau 4 tháng kể từ khi bắt ñầu tạo mô sẹo từ phôi hạt trưởng thành Quy trình chuyển gen thực hiện theo 7 bước, môi trường ñồng nuôi cấy ñược bổ sung thêm Acetosyringone Nishimura và cs (2006) ñã tối

ưu hóa quy trình chuyển gen, hiệu quả chuyển gen thu ñược từ 30 – 50% ñối

với các giống japonica sau 2-3 tháng

Kumar và cs (2005) báo cáo tỉ lệ chuyển gen vào giống lúa indica

IR-64 ñạt 4,6-5,5% Nghiên cứu của Tie và cs (2012) chuyển gen thông qua vi

khuẩn Agrobacterium vào hai giống indica là MH và ZS cho hiệu suất chuyển

gen từ 1,5 ñến 3,5% Lin Zhang (2005) ñã chỉ ra nguyên nhân chính dẫn ñến

tỷ lệ chuyển gen ở các giống lúa indica thấp hơn japonica có thể do hiệu quả tái sinh cây từ mô sẹo của các giống lúa indica kém hơn

Bằng phương pháp chèn gen mã hóa protein chống lại vi sinh vật AMP2 từ cây hoa “four o'clock flower”, tên khoa học là Mirabilis jalapa,

Mj-Prasad và cs thuộc ðại học Baroda - Ấn ðộ ñã phát triển thành công cây lúa

biến ñổi gen kháng nhiều loại nấm bệnh, trong ñó có bệnh ñạo ôn do M

grisea Sự thể hiện protein chống nấm ñạo ôn này biến thiến từ 0,32% ñến

0,38% protein tổng số trong cây lúa chuyển gen Protein này làm giảm tăng trưởng của nấm ñạo ôn ñến 63% so với cây bình thường, và không có ảnh hưởng gì ñến kiểu hình của cây Sự thể hiện của gen chuyển không liên quan ñến hình thức thể hiện theo cơ chế PR (pathogenesis-related), các nhà khoa

học kết luận rằng Mj-AMP2 trực tiếp tác ñộng ñến tác nhân gây bệnh

(pathogen) (Prasad và cs, 2008)

1.5.3 Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây lúa ở Việt Nam

Ở Việt Nam, một số kết quả bước ñầu trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô ñã ñược báo cáo Năm 1989, Nghiêm

Thị Như Vân ñã tạo mô sự từ hạt phấn lúa trong ñiều kiện in vitro trên môi

trường dinh dưỡng bổ sung 2mg/l 2,4D, nuôi cấy trong ñiều kiện tối

Năm 2009, một nhóm nhà nghiên cứu ñã phân lập gen ñiều khiển tính

chịu hạn MtOsDREB2A từ giống lúa Mộc Tuyền, thiết kế vector chuyển gen bằng kỹ thuật Gateway và chuyển vector biểu hiện mang gen MtOsDREB2A vào giống lúa Chành trụi thông qua Agrobacterium Quá trình tạo mô sẹo

(callus), lây nhiễm nhân tạo và tái sinh cây tiến hành theo phương pháp của Nishimura và cs (2007) Kết quả, hiệu suất chuyển gen của giống lúa Chành trụi thu ñược là 25% và 16/21 dòng chuyển gen ñược kiểm tra PCR có mặt của

gen MtOsDREB2A Các cây chuyển gen sau ñó có khả năng sinh trưởng và

phát triển bình thường trong ñiều kiện trồng trọt trong nhà kính và ñồng ruộng (Cao Lệ Quyên và cs, 2009)

Phan Thị Thu Hiền (2012) báo cáo kết quả khảo sát khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ phôi hạt của 31 giống lúa nương miền Bắc Việt Nam và

hoàn thiện các quy trình nuôi cấy in vitro trên các giống lúa có khả năng tái

sinh cao phục vụ công tác chuyển gen Trong 31 giống lúa, 25 giống có khả năng tạo mô sẹo cao nhất trong môi trường thích hợp với tỷ lệ trên 50% và 4

giống có tiềm năng tạo mô sẹo rất cao từ 76,3% (giống Kháu trặm họm) ñến 85% (Kháu công ton) Môi trường thích hợp cho sự hình thành mô sẹo của các giống Kháu kè ñè trặm và Kháu công ton là môi trường có bổ sung 1,5mg/l 2,4D và 2 giống tạo mô sẹo tốt trên môi trường có bổ sung 2mg/l 2,4-

D 25/31 giống lúa có khả năng tái sinh tốt trên môi trường MS có bổ sung 2mg/l BAP, 0,5mg/l kinetin và 0,1mg/l casein Tác giả cũng ñã nhận ñịnh khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây của các giống lúa bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường và di truyền, hai yếu tố này có sự tương tác lẫn nhau Bước ñầu nhóm

ñã chuyển thành công gen OsDREB2ACA vào giống Kháu trặm họm thông

qua A tumefaciens

ðối với gen ñược chuyển, bên cạnh tính chất mà gen ñó quy ñịnh thì sự thể hiện của gen ñó ở vị trí nào ñó trong cây ñược chuyển cũng rất quan trọng Trong cây chuyển gen, sự thể hiện của các gen ñược chuyển chịu sự ñiều khiển trực tiếp của promoter, vì thế việc sử dụng promoter phù hợp có vai trò quyết ñịnh thành công của việc chuyển gen mong ñợi cũng như khả năng sử sụng của cây chuyển gen ñó; và việc thiết kế lựa chọn promoter sao cho sự thể hiện của gen ñược phù hợp với mục ñích mà nhà tạo giống mong ñợi là phần không thể thiếu ñược trong quá trình chuyển gen Vì quá trình tổng hợp DNA của các ñoạn gen ngoại lai ñó mà thông qua sự biểu hiện của các gen ñược chuyển trong cây có thể so sánh sự khác nhau của các promoter một cách trực tiếp Năm 2008, ðoàn Thu Thủy và cs ñã báo cáo nghiên cứu ñánh giá sự hoạt ñộng của các promoter ñể chọn ra promoter thích hợp cho biểu hiện gen trong cây lúa chuyển gen Kết quả ñánh giá hoạt ñộng của 4 promoter (Rd29A, Gt1, RCg2, và CaMV35S) trong việc ñiều khiển quá trình tổng hợp của các gen chuyển trong cây lúa thông qua sự

biểu hiện của gen gus (β-glucuronidase) cho thấy, sự biểu hiện tạm thời của gen gus ở phôi non của lúa sau khi bắn gen không phụ thuộc vào

promoter Trong khi ñó, sự biểu hiện bền vững của gen gus chỉ quan sát

ñược ở cây lúa chuyển gen với sự ñiều khiển của promoter RCg2 Trong

số các cây lúa chuyển gen thu ñược ở thế hệ T0, 11 cây có biểu hiện sự

hoạt ñộng của gen gus với sự ñiều khiển của promoter RCg2 Kết quả

phân tích ở mức ñộ phân tử thông qua kỹ thuật PCR và lai Southern blot ñối với những cây thế hệ T0 này cũng ñều thấy sự có mặt của gen gus tại

1,1 kb và gen hph tại 0,76kb, trong khi ở cây ñối chứng không có

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Hạt giống trưởng thành, sạch bệnh, có sức nảy mầm tốt của 7 giống lúa trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh sách giống lúa sử dụng trong nghiên cứu

Viện Nghiên cứu và Phát triển cây trồng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội

- Cấu trúc pre-amiR-P1 nhân tạo ức chế gen mục tiêu MPG1 (Bảng

2.2) ñược thiết kế bởi Nguyễn Thị Phương Thảo và cs, bộ môn Công nghệ sinh học thực vật – Trường ñại học Nông nghiệp Hà Nội

Bảng 2.2 Một số ñặc ñiểm của trình tự miRNA ñã thiết kế

Năng lượng liên kết

Vị trí tác ñộng trên mRNA

2.2 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

2.2.1 ðịa ñiểm nghiên cứu

- Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công nghệ sinh học, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội

2.2.2 Thời gian nghiên cứu

- Từ tháng 4/2012 ñến tháng 9/2013

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Khảo sát khả năng tái sinh của một số giống lúa Indica và Japonica Việt Nam

Nội dung 1: Khảo sát khả năng cảm ứng tạo mô sẹo của một số giống lúa