Phát triển thuốc trừ sâu thảo mộc phòng trừ sâu xanh bướm trắng (pieris rapae)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực v

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Mã số : 60.42.02.01

Giảng viên hướng dẫn : TS ðặng Xuân Nghiêm

HÀ NỘI - 2013

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm

ơn và các thông tin trích dẫn luận văn ñã ñược ghi rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Lưu Thị Phương

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… ii

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi ñã nhận ñược sự hướng dẫn, giúp ñỡ và góp ý nhiệt tình của quý thầy cô cùng toàn thể cán bộ bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ vi sinh – khoa Công nghệ Sinh học – Trường ñại học Nông nghiệp Hà Nội

Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn ñến quý thầy cô trường Trường ñại học Nông nghiệp Hà Nội, ñặc biệt là những thầy cô ñã tận tình dạy bảo cho tôi suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc ñến thầy giáo TS ðặng Xuân Nghiêm ñã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn tới cùng thầy giáo TS Nguyễn Văn Giang, Kĩ sư Nguyễn Ngọc Hòa, Kĩ sư Nguyễn Khắc Hải, các bạn sinh viên, gia ñình và bạn bè ñã tạo rất nhiều ñiều kiện ñể tôi học tập và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này

Mặc dù tôi ñã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận ñược những ñóng góp quí báu của quí thầy cô và các bạn

Hà Nội, Ngày tháng năm 2013

Học viên

Lưu Thị Phương

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… iii

2.1 Tổng quan về sâu xanh bướm trắng Pieris rapae (Lynnaeus) 5 2.1.1 Sự sinh trưởng và phát triển của sâu xanh bướm trắng 5

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… iv

3.2.1 Chuẩn bị sâu xanh bướm trắng cho nghiên cứu 31

3.2.3 Khảo sát hiệu lực gây ngán ăn cho sâu 31

3.2.5 Thu dịch chiết enzyme tiêu hóa từ sâu xanh (Mehrabadi và Bandani,

3.2.6 Hoạt tính gây ức chế các enzyme có trong ruột sâu của các dịch chiết 32 3.2.7 Khảo sát hiệu lực diệt sâu trên cây trồng trong phòng thí nghiệm 33 3.2.8 Tách chiết quả ớt bằng các dung môi hữu cơ khác nhau 33 3.2.9 Khảo sát hiệu lực gây chết trên ñồng ruộng 33 3.2.10 Ảnh hưởng của các loại dịch chiết tới một vài chỉ tiêu nông sinh học

4.1 Khảo sát hiệu lực gây ngán ăn cho sâu 38

4.3 Khảo sát hiệu lực cộng hưởng của các dịch chiết 42 4.4 Khả năng ức chế enzyme ruột sâu của các loại dịch chiết 43 4.5 Khảo sát hiệu lực diệt sâu với cây trồng trong phòng thí nghiệm 45 4.6 Hiệu lực gây ngán ăn và diệt sâu của dịch chiết gấc và ớt khi tách

4.7 Nồng ñộ tối ưu diệt sâu của dịch chiết ớt và gấc 49 4.8 Khảo sát hiệu lực gây chết trên ñồng ruộng 53 4.9 Ảnh hưởng của các loại dịch chiết tới một vài chỉ tiêu nông sinh học

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… v

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… vi

DMSO : Dimethyl sulfoxide

DNSA : Dinitrosalicylic Acid Reagent Solution

P rapae : Pieris rapae (L.), sâu xanh bướm trắng

TLCK : Na-p-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone hydrochloride TPCK : Tosyl phenylalanyl chloromethyl ketone

TRPV1 : Transient Receptor Potential V1

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… vii

6 Hiệu lực gây ngán ăn với các phương pháp tách chiết khác nhau 47

7 Giá trị trung bình của các chỉ tiêu sinh trưởng phát triển khi thu hoạch 57

8 Một vài chỉ tiêu năng suất và chất lượng của cải bắp sử dụng trong ñề tài 58

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… viii

DANH MỤC HÌNH

1 Các dạng hình thái của sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae

5 Hiệu lực diệt sâu dịch chiết ớt sau 48 giờ 40

6 Hiệu lực diệt sâu xanh bướm trắng của bốn dịch chiết 41

8 Khả năng ức chế của các dịch chiết tới enzyme ruột sâu 44

9 Hiệu lực diệt sâu với cây trồng trong phòng thí nghiệm 46

10 Hiệu lực diệt sâu của dịch chiết gấc và ớt khi tách chiết bằng các dung

13 Nồng ñộ tối ưu diệt sâu của các loại dịch chiết 52

14 Hình ảnh thí nghiệm xác ñịnh nồng ñộ tối ưu diệt sâu của các loại

15 Số lượng sâu con/cây sau 4 tuần phun 54

16 Hiệu lực diệt sâu của các dịch chiết ngoài ñồng ruộng 55

17 Hình ảnh rau cải bắp ñang trong giai ñoạn cuốn bắp 57

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 1

PHẦN I MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Sâu và các sinh vật gây hại là những tác nhân hạn chế ñáng kể năng suất cây trồng trên khắp thế giới Các nhà khoa học ước tính, hàng năm, thiệt hại mùa màng

do sâu hại lên ñến 30% và con số này còn cao hơn ở các nước ñang phát triển

(Thomas và Waage, 1996) Sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.) là sâu hại rau họ

hoa thập tự (cruciferous vegetables) chủ yếu trên toàn thế giới, chúng trực tiếp ăn lá,

lá non, thân, hoa của cây rau với tốc ñộ nhanh, khả năng gây hại lớn, gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới sự sinh trưởng, phát triển của cây trồng và năng suất mùa màng trên diện rộng Mặt khác, sự tồn tại của sâu cùng phân và chất dịch do sâu tiết ra làm ảnh hưởng tới phẩm chất của sản phẩm sau thu hoạch, gây khó khăn cho tiêu thụ và tiêu dùng các sản phẩm rau xanh Chúng có thể gây ra tổn thất từ 90 - 100% mùa màng (Talekar và Shelton, 1993)

Các biện pháp diệt trừ sâu xanh bướm trắng chủ yếu hiện nay dùng thuốc trừ sâu hóa học vì chúng cho hiệu quả nhanh, mạnh, sử dụng thuận tiện, rẻ và dùng ñược trên các diện tích lớn, v.v Biện pháp áp dụng thuốc hóa học ñã trở thành một nội dung không thể thiếu trong quy trình canh tác của nhiều loại cây trồng, trong ñó

có các loại rau hoa thập tự (ñối tượng gây hại chính của sâu xanh bướm trắng) ở trên thế giới và Việt Nam (Phạm Văn Lầm, 1995)

Việc sử dụng thuốc trừ sâu hoá học và sử dụng chúng một cách thiếu kiến thức, tràn lan, không kiểm soát dẫn tới nhiều tác hại lớn ñến sức khoẻ con người, gây ô nhiễm môi trường vùng trồng rau, ảnh hưởng tới nguồn ñất và nước, ñồng thời ảnh hưởng tới sự ña dạng của các sinh vật có lợi, phá vỡ cân bằng sinh thái, và ñặc biệt, nó còn thúc ñẩy quá trình tiến hoá theo hướng kháng thuốc trừ sâu ở các loài sâu bệnh (Roush, 1997) Chính vì vậy, việc tìm ra các thuốc trừ sâu sinh học thân thiện với môi trường, ít ảnh hưởng ñến hệ sinh thái, và không có tác hại ñến sức khoẻ của con người ñã ñược ñặt ra

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 2

Mục tiêu của chúng ta hiện nay là xây dựng một nền nông nghiệp bền vững, ñảm bảo cho hệ sinh thái ổn ñịnh lâu dài, do ñó sự phát triển và thực hiện hệ thống biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) ñang là mối quan tâm ở nhiều nước trên thế giới, trong ñó có Việt Nam ðảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, ñặc biệt ñối với rau xanh ñang là vấn ñề bức xúc hiện nay Cho nên những năm gần ñây các nhà khoa học bảo vệ thực vật ñã tập trung nghiên cứu biện pháp sinh học và coi biện pháp này là biện pháp cốt lõi trong hệ thống phòng trừ dịch hại tổng hợp

Các nghiên cứu nhằm kiểm soát sâu hại tập trung vào 3 hướng chính: nghiên cứu sử dụng các vi khuẩn, virus, nấm bệnh là thiên ñịch của mỗi loài sâu bệnh, nghiên

cứu sản xuất các protein ñộc cho sâu hại và côn trùng từ vi khuẩn, như Bt từ Bacillus

thuringensis (Tabashnik, 1994); nghiên cứu tạo ra các thuốc trừ sâu hại từ protein và các hợp chất thứ sinh của thực vật như các protein ức chế enzyme tiêu hoá (PPIs) từ một số loại hạt (Phạm Thị Trân Châu và cộng sự, 2000) hay azadirachtin và các chất có

trong dịch chiết lá và hạt cây xoan Ấn ðộ (Azadirachta indica) (Amadioha, 2000,

Dương Anh Tuấn, 2002, Montes-Molina và cộng sự, 2008) Nước ta có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và ña dạng, nhiều trong số này ñã ñược dùng làm thuốc chữa bệnh (ðỗ Tất Lợi, 2006) Khả năng kháng khuẩn và kháng sâu bệnh của một số cây thuốc cũng ñã ñược các nhà khoa học nước ta khảo sát và nghiên cứu (Lê Doãn Liên và cộng sự, 2000, Lê Thị Lan Oanh và cộng sự, 2000, ðặng Xuân Nghiêm, 2002) Tuy nhiên, số lượng những nghiên cứu ñó còn rất ít ỏi so với tiềm năng ứng dụng thực vật làm thuốc trừ sâu sinh học ở nước ta

Vì thực tế nêu trên chúng tôi thực hiện ñề tài: “Phát triển thuốc trừ sâu

thảo mộc phòng trừ sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae)” nhằm nghiên cứu hiệu

lực diệt và gây ngán ăn của một số dịch chiết từ các thực vật tiềm năng có hiệu lực

cao ñối với sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae) ðồng thời, nghiên cứu phối hợp

các dịch chiết/hợp chất từ các thực vật khác nhau ñể phát triển chế phẩm trừ sâu hiệu quả hơn

1.2 Mục ñích và yêu cầu

1.2.1 Mục ñích

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 3

Khảo sát nhằm tìm ra loại dịch chiết từ thực vật có khả năng diệt trừ và gây ngán ăn ựối với sâu xanh bướm trắng từ các loại thực vật có trong ựề tài Tìm hiểu hoạt tắnh gây ức chế enzyme có trong ruột sâu và tối ưu hóa việc tách chiết các chất

có hoạt tắnh phòng trừ sâu của các loại dịch chiết có hoạt tắnh Nghiên cứu phối hợp các dịch chiết/hợp chất từ các thực vật khác nhau ựể phát triển chế phẩm trừ sâu hiệu quả hơn Khảo sát hiệu lực gây chết sâu trên cây trồng trong phòng thắ nghiệm

và ngoài ựồng ruộng của các công thức thử nghiệm đánh giá một số chỉ tiêu nông sinh học và dinh dưỡng của cải bắp sau khi phun các công thức dịch chiết thực vật

1.2.2 Yêu cầu

- Khảo sát hiệu lực gây ngán ăn của các dịch chiết ựối với sâu xanh bướm trắng

- Khảo sát hiệu lực diệt sâu của các dịch chiết ựối với sâu xanh bướm trắng

- Khảo sát hoạt tắnh gây ức chế các enzyme có trong ruột sâu của các dịch chiết

- Khảo sát hiệu lực diệt sâu trên cây trồng trong phòng thắ nghiệm

- Lựa chọn dung môi tách chiết hiệu quả nhất cho các chất có hoạt tắnh

phòng trừ sâu từ các dịch chiết ựã chọn

- Khảo sát hiệu lực diệt sâu trên ựồng ruộng

- đánh giá sơ bộ một số chỉ tiêu nông sinh học và dinh dưỡng của cải bắp sau khi phun các công thức dịch chiết thực vật

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 4

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 5

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về sâu xanh bướm trắng Pieris rapae (Lynnaeus)

2.1.1 Sự sinh trưởng và phát triển của sâu xanh bướm trắng

Sâu xanh bướm trắng phấn bố rộng rãi trên toàn châu Âu, Bắc Phi và châu Á

và cũng ñã vô tình ñược ñưa vào Bắc Mỹ, Australia và New Zealand Sâu xanh có phạm vi ký chủ rộng gồm 9 họ và 35 loài thực vật khác nhau như họ hoa thập tự, họ cúc, họ bách hợp v.v Tuy nhiên chúng chỉ phá hại nặng trên rau họ hoa thập tự và

là ñối tượng phải phòng trừ ở một số nước như Trung Quốc, Malaysia, Nhật Bản, Philippin, khu vực Trung Mỹ và Australia.v.v

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 6

(Pieris rapae (Lynnaeus))

Nguồn: Capiner, 2008: http://en.wikipedia.org/wiki/Small_White(12456)

Bướm có thân màu ñen, hai cánh trắng, ñỉnh cánh có vết ñen hình tam giác Trứng màu hơi vàng, sâu non màu xanh lục, trên lưng có những ñiểm ñen nhỏ Sâu non có 5 tuổi, khi ñẫy sức dài khoảng 28 - 35mm Nhộng màu xanh, khi gần vũ hóa chuyển màu xanh hơi vàng (hình 1) ðặc tính sinh hoạt và phát sinh: bướm hoạt ñộng ban ngày Sau vũ hóa 3 - 4 ngày thì ñẻ trứng, trứng ñẻ từng qủa, rải rác mặt sau của lá rau Một bướm có thể ñẻ từ 50 - 200 trứng Bướm sâu xanh sống khá lâu

từ 2 - 5 tuần lễ Sâu xanh mới nở gặm chất xanh của lá rau, từ tuổi hai trở lên gặm thủng lá rau và ăn kiệt chỉ còn gân lá Vì vậy nếu ñể mật ñộ cao thì ruộng rau sẽ bị trơ trụi, xơ xác Vòng ñời của sâu xanh bướm trắng từ 26 - 30 ngày Trong ñó giai ñoạn trứng từ 6 - 8 ngày, sâu non 10 - 14 ngày, nhộng 7 - 8 ngày Bướm vũ hóa sau

3 - 4 ngày thì ñẻ trứng (Lyu và cộng sự, 1995)

Sâu phát sinh và gây hại nặng từ tháng 10 năm trước ñến tháng 5 năm sau, nhưng thường nặng nhất từ tháng 2 ñến tháng 5 vì thời tiết lúc này phù hợp với sinh trưởng và phát triển của sâu Sâu xanh thường tập trung và gây hại nặng ở những ruộng rau xanh tốt (Capinera, 2008) Các nghiên cứu về sinh thái quần thể ñều cho rằng sâu xanh bướm trắng có khả năng sinh sản và phát tán mạnh khi nhiệt ñộ thích hợp là 29 - 31°C và chúng luôn có mật ñộ cao ở những khu có trồng xen các loại cây có hoa hoặc nhiều cây hoa dại trên bờ ruộng

Ở Việt Nam trước ñây sâu xanh bướm trắng có phát sinh và gây hại trên rau

họ hoa thập tự nhưng chưa nghiêm trọng Các nhà côn trùng học ở nước ta xếp sâu xanh bướm trắng vào hạng thứ yếu, tuy nhiên trong nhiều năm gần ñây sâu xanh bướm trắng phát sinh gây hại nặng và ñược coi là ñối tượng phải phòng trừ ở nhiều ruộng rau trong cả nước Các nghiên cứu của Lê Văn Trịnh (1998) cho tới nay là một trong những nghiên cứu khá ñầy ñủ về sâu xanh bướm trắng, và kết quả cho thấy vòng ñời của sâu xanh bướm trắng từ 19 - 30 ngày tuỳ theo ñiều kiện nhiệt ñộ,

ẩm ñộ khác nhau Số trứng một bướm cái ñẻ là 120,5 - 141,6 và tỷ lệ nở của trứng

là 90,2 - 95,5% Mỗi năm có 15 lứa sâu phát sinh với khoảng cách giữa cao ñiểm

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 7

hai lứa là 20 - 26 ngày Trên ruộng rau xuất hiện mật ựộ cao từ tháng 1 ựến tháng 5 (mật ựộ lên tới 9 con/cây), thời gian khác trong năm mật ựộ sâu thấp, ựặc biệt giữa tháng 7 tới tháng 9 (ắt khi vượt quá 1 con/cây) Thời vụ gieo trồng cũng là một vấn

ựề có ý nghĩa không nhỏ ựối với sự phát sinh gây hại của sâu xanh bướm trắng Hiện tại sản xuất cải bắp ở ựồng bằng sông Hồng có 3 thời vụ (vụ sớm, chắnh vụ, vụ muộn), trong ựó sâu xanh bướm trắng phát sinh gây hại nặng nhất vào vụ muộn

Sâu xanh bướm trắng là loại côn trùng ựa thực gây hại chủ yếu trên các phần xanh của cây rau ở tất cả các giai ựoạn phát triển của cây từ lúc non cho tới lúc già, các bộ phận bị hại gồm: lá, thân non, hoa, mà quan trọng và gây hại nặng nhất là trên lá cây Sâu xanh phàm ăn và ăn các phần xanh trên cây rất nhanh tạo thành các

lỗ, mảng rách lớn trên lá chỉ trong một thời gian ngắn, khiến cho diện tắch quang hợp của cây bị giảm, cây sinh trưởng phát triển kém, còi cọc, ắt tắch lũy Sâu xanh mới nở gặm chất xanh của lá rau, từ tuổi hai trở lên gặm thủng lá rau và ăn kiệt chỉ còn gân lá (Lê Văn Trịnh, 1998)

Mức ựộ gây hại trên rau của sâu xanh bướm trắng ở mức trung bình tới nghiêm trọng Mức trung bình là khả năng cây rau vẫn có thể cho thu hoạch nhưng khối lượng và chất lượng bị giảm, mức nghiêm trọng có thể không cho thu hoạch, chất lượng sản phẩm thấp không thể ựưa ra thị trường tiêu thụ Loài sâu này phát sinh và gây hại nặng ở tất cả các vùng và các mùa vụ trồng rau làm giảm năng suất rau từ 30 Ờ 50%, thậm chắ còn có thể gây mất trắng (Lê Văn Trịnh, 1998) Như vậy thiệt hại do sâu xanh gây ra trên các cây rau họ thập tự là rất ựáng lo ngại, rất cần sự quan tâm giải quyết của các nhà nông học và bảo vệ thực vật

2.1.2 Các biện pháp phòng chống

Sâu xanh bướm trắng là ựối tượng của nhiều ựộng vật ăn thịt, ký sinh, và gây bệnh Các côn trùng săn mồi như bọ lá chắn (Hemiptera: Pentatomidae), và ong bắp

cày vespid (Hymenoptera: Vespidae) Chim Apanteles glomeratus (L.), chim sẻ

ngô, v.v, tấn công trước giai ựoạn nhộng và giai ựoạn bướm đáng chú ý là loài ong bắp cày ựẻ trứng ký sinh trên ấu trùng của sâu, ấu trùng phát triển và phá vỡ cơ thể sâu Trên 90% tỷ lệ tử vong của ấu trùng do sự xuất hiện tự nhiên của bệnh ựã ựược

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 8

báo cáo Trong giai ñoạn ñầu của nhiễm trùng, ấu trùng không hoạt ñộng và có màu nhạt màu Khi bệnh tiến triển, cơ thể sâu bướm biến màu vàng, và có xu hướng xuất hiện phình to Sau khi chết, cơ thể hóa ñen, lớp da bị vỡ, và sau ñó cơ thể bị thối rữa (Capinera, 2008)

Các biện pháp phòng chống sâu xanh bướm trắng chủ yếu hiện nay là sử dụng các loại thuốc trừ sâu hóa học Các loại thuốc ñược sử dụng phổ biến hiện nay

ñó là: VISERIN 4.5EC thuốc có nguồn gốc hóa học thuộc gốc Pyrethroid, Cymerin 10EC, Karate 2.5EC, Catex 1,8EC, 3,6 EC, v.v .Ưu ñiểm của phương pháp này là cho hiệu quả nhanh, mạnh, rõ rệt, dễ dàng sử dụng trên diện rộng và giá thành rẻ Tuy nhiên nếu không sử dụng ñúng cách, liều lượng, loại, thời ñiểm có thể gây tác hại rất lớn tới chính con người và môi trường ñất, nước, không khí cùng với việc làm giảm chất lượng nông sản ñưa ra thị trường Hiện nay còn có các biện pháp phòng trừ bằng các phương pháp sinh học, như thuốc trừ sâu sinh học (Vimatox 1.9

EC, Ratoin10EC, Delfin WG (32BIU), Biocin 16WP) chủ yếu dùng vi khuẩn

Bacillus thuringiensis (chế phẩm Bt), sử dụng các loại thiên ñịch (ong bắp cày)

Ngoài ra, sâu xanh bướm trắng hại chủ yếu trên lá rau, vì vậy khi phát hiện có thể dùng biện pháp thủ công (dùng tay) giết sâu non và nhộng ñối với những vùng có diện tích nhỏ, các biện pháp canh tác, cách ly các vùng trồng rau bị bệnh v.v Tuy nhiên, các biện pháp này chưa thực sự hiệu quả và có tác dụng phòng trừ chưa cao

2.1.3 Các loại enzyme chính trong dịch tiêu hóa của sâu

Sâu xanh bướm trắng gây hại chủ yếu trên các cây rau thuộc họ thập tự như cải bắp, súp lơ, cải xanh, v.v Các loại cây này chứa các vật chất hữu cơ chủ yếu là tinh bột, cellulose, protein tương ứng với các nhóm enzyme chính cần nghiên cứu

ñó là amylase, cellulase và protease

* Tổng quan về protease

Là nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptide NH)n trong phân tử protein, polypeptide ñến sản phẩm thủy phân cuối cùng là các acid amin, ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este Protease có chức năng sinh học rất ña dạng, ñóng vai trò quan trọng trong việc ñiều

(-CO-Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 9

hòa quá trình trao ñổi chất ở sinh vật sống Ngoài chức năng xúc tác cho phản ứng thủy phân protein thành amino acid và các peptide có phân tử lượng thấp mà các tế bào có thể dễ dàng hấp thu, nhất là vai trò trong thủy phân các hợp chất protein xảy

ra ở hệ tiêu hóa của ñộng vật, protease còn có vai trò quyết ñịnh trong thiết lập, duy trì sự cân bằng giữa tổng hợp và phân giải protein Bên cạnh ñó chúng còn tham gia vào quá trình hình thành và nảy mầm bào tử của vi sinh vật, quá trình ñông tụ máu, ñiều chỉnh huyết áp, ñiều hòa cấu hình các enzyme và ñiều hòa biểu hiện gen (Nguyễn Văn Mùi, 2001) Protease rất ña dạng về chức năng ở mức ñộ tế bào, cơ quan ñến cơ thể nên ñược phân bố rất rộng rãi trên nhiều ñối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) ñến thực vật (ñu ñủ, dứa.v.v.) và ñộng vật (gan, dạ dày

bê.v.v.) Trong cơ thể côn trùng protease trong hệ tiêu hóa của côn trùng có vai trò

trong thủy phân các hợp chất có bản chất là protein trong thức ăn

Phân loại:

Theo hệ thống phân loại quốc tế (International Union of Biochemistry and Molecular Biology, 1992), enzyme protease ñược phân thành các lớp như trong hình 2

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 10

Hình 2 Phân loại protease

Protease ñược phân chia thành hai nhóm lớn là endopeptidase và exopeptidase dựa vào vào vị trí tác ñộng trên mạch polypeptide Exopeptidase lại ñược phân chia thành hai loại: aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở ñầu N tự do của chuỗi polypeptide ñể giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide; carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở ñầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

Dựa vào ñộng học của cơ chế xúc tác, endopeptidase ñược chia thành bốn nhóm:

Nhóm thứ nhất: Serine proteinase là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt ñộng và có vai trò ñặc biệt quan trọng ñối với hoạt ñộng xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ là chymotrypsin và subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme ñộng vật như chymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt ñộng mạnh ở vùng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 11

kiềm tính và thể hiện tính ñặc hiệu cơ chất tương ñối rộng

Nhóm thứ 2: Cysteine proteinase là các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt ñộng Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein ñộng vật và proteinase ký sinh trùng Các cystein proteinase thường hoạt ñộng ở vùng pH trung tính, có tính ñặc hiệu cơ chất rộng

Nhóm thứ 3: Aspartic proteinase hầu hết thuộc nhóm pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt ñộng và thường hoạt ñộng mạnh ở pH trung tính

Nhóm thứ 4: Metallo proteinase là nhóm proteinase ñược tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Chúng thường ñòi hỏi sự có mặt của các ion kim loại, ñặc biệt là các kim loại hóa trị hai, như là các cofactor Các metallo proteinase thường hoạt ñộng vùng pH trung tính và hoạt ñộ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

Ngoài ra, protease ñược phân loại một cách ñơn giản hơn thành ba nhóm căn

cứ vào dải pH tối thích:

- Protease acid: pH 2 - 4

- Protease trung tính: pH 7 - 8

- Protease kiềm: pH 9 - 11

Tuy nhiên sự phân loại này chỉ có ý nghĩa thực dụng không thật sự chính xác

vì pH hoạt ñộng tối thích của mỗi enzyme còn phụ thuộc vào bản chất cơ chất và nhiều yếu tố khác nữa (Nguyễn Trọng Cẩn, 1998)

Các nghiên cứu trên thế giới về protease trong cơ thể côn trùng chỉ ra rằng hầu hết các protease thuộc các loại cystein, metallo, serine Nghiên cứu của Atsushi Mochizuki (1998) có thống kê các nhóm phân loại của protease trong một số loài côn trùng (bảng 1)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 12

Bảng 1 Các nhóm enzyme protease tiêu hóa trong ruột một số loại côn trùng

EDTA

1mm o- Phe

3mm PMSF

1mm TPCK

0,7mm TLCK

10

µM Leu

1mM pHMB

0,1mM E-64

5mM DAN

Thuộc loại Ephemeroptera

+ + +

+

+

+

+ +

+

+ + +

+

+ +

+

+

+

+ + + +

+ +

+ +

+

++

+ + + ++

+ +

+ + +

+ +

+ + ++

+ ++

+ ++

Cy

Cy

Cy M+S (C)

S (T) M+S (T)

M+Cy

Cy

S+Cy M+Cy M+Cy

Cy M+S+Cy M+S+Cy M+S+Cy

? M+S (T)

S (T) M+S (T)

Ký hiệu: Cy: cystein M: metallo S: serine C: chymoTrypsin T:

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 13

Trypsin +: ức chế một phần, ++: ức chế mạnh

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 14

Các hoạt chất ức chế protease

ðể chống lại côn trùng, vi sinh vật gây bệnh.v.v một số loại cây trồng có khả năng tổng hợp các chất chống lại chúng Một trong các hợp chất là chất ức chế protease, các chất ức chế này ñược phân loại thành các họ khác nhau dựa trên sự tương quan về cấu trúc, phương thức tác ñộng và vị trí trung tâm xúc tác của chúng (Barrett,

1986, Grudkowska và Zagdanska, 2004)

Vào năm 1947, lần ñầu tiên các nhà khoa học ñã chứng minh ñược vai trò bảo vệ thực vật của PPI khi Mickel và Standish quan sát thấy ấu trùng của một số loài côn trùng không thể phát triển bình thường trong các sản phẩm ñậu tương Sau

ñó các chất kìm hãm trypsin trong ñậu ñương cho thấy ñộc tính với ấu trùng của bọ

cánh cứng (flour beetle), Tribolium confusum (Haq và cộng sự, 2004) PPI chủ yếu

có trong củ và hạt, tuy nhiên nó cũng xuất hiện các bộ phận khác trên cây (De Leo

và cộng sự, 2002), chúng sinh ra ñể chống lại côn trùng sâu hại và các mầm bệnh (Ryan, 1990) PPI có khả năng ức chế protease trong ruột côn trùng ngăn cản và dừng sự sinh trưởng và phát triển của chúng (Lawrence và Koundal, 2002) Hầu hết PPIs tương tác với các protease mục tiêu của chúng bằng cách tiếp xúc với các vị trí hoạt ñộng (xúc tác) của protease (ức chế cạnh tranh), dẫn ñến sự hình thành của một phức chất ổn ñịnh ức chế protease không còn khả năng hoạt ñộng (Dorrah, 2004)

PPI có chứa một ñơn vị duy nhất ñược gọi là chất ức chế ñơn giản, và các PPI có chứa nhiều ñơn vị ức chế ñược gọi là chất ức chế phức tạp và chúng ñược chia thành 48 họ thuộc 26 siêu họ khác nhau và không có mối quan hệ trong cấu trúc phân tử giữa các họ PPI này (Rawlings và Barrett, 1993) Năm 2004, Rawlings

và các cộng sự ñã giới thiệu một bảng phân loại các chất ức chế protease dựa trên tương tác phát hiện ở cấp ñộ của chuỗi axit amin Danh sách phân loại này ban ñầu xác ñịnh ñược 48 họ các chất ức chế và có thể ñược nhóm lại thành 26 siêu họ liên quan ñến cấu trúc của chúng Theo cơ sở dữ liệu MEROPS hiện nay có 85 họ của các chất ức chế Cùng với các chất ức chế phi protein khác, PPI có thể ñược sử dụng

ñể phân loại protease (bảng 2)

Hiện nay, việc nghiên cứu tìm ra các PPI mới vẫn ñang ñược các nhà khoa

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 15

học trên thế giới quan tâm

proteases

H2O, DMSO dung dịch nước + cồn

in aqueous solution

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 16

* Tổng quan về amylase

Vào năm 1814, Kirchoff Saint Petercburg (Nga) ñã chứng minh hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành ñường ở nhiệt ñộ từ 40°C - 60°C Năm 1833, Payen và Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu ñược kết tủa có khả năng phân giải tinh bột thành ñường, và ñặt tên là diastase (xuất phát từ tiếng

Hy Lạp, diastatics, có nghĩa là phân giải, ñó là amylase) Năm 1851, Leuchs ñã phát hiện nước bọt cũng có khả năng phân giải tinh bột thành ñường Sau ñó, các enzyme amylase trong nước bọt, trong dịch tiêu hóa của người và ñộng vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn bắt ñầu ñược quan tâm nghiên cứu (Nguyễn Hữu Chấn, 1983)

Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử polysaccharide với sự tham gia của nước:

RR’ + H-OH => RH + R’-OH

Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen

Trong cơ thể côn trùng amylase ñóng vai trò trong việc thủy phân các chất có trong thức ăn như các hạt tinh bột trong lá cây, các chất ñường, các hạt dự trữ trong

cơ thể

Phân loại:

Dựa vào thành phần cấu trúc, chức năng, vị trí của enzyme trong cơ thể sinh vật, enzyme amylase ñược phân loại theo sơ ñồ ở hình 3 (International Union of Biochemistry and Molecular Biology, 1992):

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 17

Hình 3 Phân loại amylase

β-amylase (β-1,4-glucan-maltohydrolase) (EC 3.2.1.2): β–amylase xúc tác từ

sự thủy phân các liên kết 1,4-glucan trong tinh bột, glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ ñầu không khử của mạch Maltose ñược hình thành

do sự xúc tác của β-amylase có cấu hình β

γ-amylase (gluco amylase) (EC 3.2.1.3): Gluco-amylase có khả năng thủy phân liên kết -1,4 lẫn -1,6-glucoside, ngoài ra còn có khả năng thủy phân liên kết -1,2 và -1,3-glucoside Gluco-amylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin, dextrin v.v thành glucose mà không cần có sự tham gia của

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 18

các loại enzyme amylase khác (Laemmli, 2009).

ðặc tính

α–amylase: có những ñặc tính rất ñặc trưng về cơ chế tác ñộng, chuyển hóa tinh bột, khả năng chịu nhiệt (α-amylase bền với nhiệt ñộ hơn các enzyme khác) ðiều kiện hoạt ñộng của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau

pH tối thích cho hoạt ñộng của α-amylase từ nấm sợi là 4,0 - 4,8 (có thể hoạt ñộng tốt trong vùng pH từ 4,5 - 5,8 ) (Bernfeld, 1955) ðộ bền ñối với tác dụng của acid

cũng khác nhau amylase của Asp.oryzae bền vững ñối với acid tốt hơn là amylase của malt và vi khuẩn B.subtilys

α-α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phần tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên Nó không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên với tốc ñộ rất chậm

Giai ñoạn 1 (dextrin hóa)

Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), ñộ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin ñều bị dịch hóa nhanh)

Giai ñoạn 2 (giai ñoạn ñường hóa )

Dextrin phân tử thấp bị thủy phân tetra và trimaltose (không cho màu với iodine) thủy phân rất chậm disaccharide và monosaccharide

Amylose phân giải nhanh olygosacharide  polyglucose (gồm 6 -7 gốc glucose)

bị phân cách mạch polyglucose colagen ngắn Maltose  maltotriose  maltotetrose

Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt ñược liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các ñường nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8% (Trần Xuân Ngạch, 2008)

* Tổng quan về cellulase

Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết β-1,4-O

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 19

glucoside trong phân tử cellulose và một số cơ chất tương tự khác Cellulase ñược chia ra làm năm loại khác nhau dựa trên các phản ứng xúc tác Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất ñịnh và nhờ có sự phối hợp hoạt ñộng của các enzyme ñó mà phân tử cơ chất ñược thủy phân hoàn toàn tạo thành các sản phẩm ñơn giản nhất

Phân loại:

Theo Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử Quốc tế, cellulase ñược chia ra làm năm loại dựa vào phản ứng xúc tác và ñược phân loại theo hình 4 (International Union of Biochemistry and Molecular Biology, 1992)

Hình 4: Phân loại cellulase

Trong ñó dạng 1 là endoglucanase hoặc 1,4- β -D-glucan-4-glucanohydrolase hay carboxylmethylcellulase (CMCase)(EC 3.2.1.4), dạng 2 là exoglucanase bao gồm 1,4- β -D-glucanglucanohydrolase (còn gọi là cellodextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4- β -D-glucan cellobiohydrolase (cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91), dạng 3 là β -glucosidase hoặc β –glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) Endoglucanase xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết ở bên trong phân tử cellulose Exoglucanase thủy phân các liên kết ở ñầu khử và ñầu không khử của phân tử

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 20

cellulose β -glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose thành

glucose (M Gielkens và công sự (1999)

2.2 Tổng quan về các loại thực vật sử dụng trong ñề tài

2.2.1 Hạt gấc

Nhân hạt Gấc có khoảng 6% nước, 8,9% chất vô cơ, 55,3% acid béo, 16,5% protein, 2,9% ñường, 1,8% tanin, 2,8% cellulose và một số enzym Hạt gấc chứa acid momordic, axit momordin, gypsogenin, acid oleanolic, acid α- elacostearic, còn có acid amin, alcol Momordin là một trong các saponin có nguồn gốc từ axit oleanolic, triterpenoid Những hợp chất hóa học ñược tìm thấy trong hạt của chi

Momordica , trong ñó bao gồm mướp ñắng (M charantia) và táo nhựa (M

balsamina ), hạt gấc (M cochinchinensis cũng như trong các cây thuốc thảo dược như Kochia scoparia và Ampelopsis (Matsuda và cộng sự, 1999, Iwamoto và cộng

sự, 1985) Các momordin có trong hạt gấc bao gồm: momordin I, momordin Ia, momordin Ib, momordin Ic, momordin Id, momordin II, momordin IIa, momordin IIb, momordin IId, momordin III (Okabe và cộng sự, 1985, Juhyung và cộng sự,

2006, Khesort và Patoomratana, 2009, Kim và cộng sự, 2005, Wang và cộng sự,

2000, Murakami và cộng sự, 1966, Yeung 1987, Stirpe Fiorenzo và cộng sự, 1990, Bolognesi và cộng sự, 1989)

Trong hạt gấc chứa PPI (protein kìm hãm protease hay còn gọi là chất kìm hãm protease có bản chất protein) Nghiên cứu về PPI xuất hiện ñồng thời với các nghiên cứu về protease Tới nay ñã xác ñịnh ñược hàng trăm PPI và chúng là ñối tượng của hàng ngàn cộng ñồng nghiên cứu PPI xuất hiện phổ biến ở nhiều loài thực vật Các PPI này thường là những protein có kích thước nhỏ, thường nằm ở các

mô dự trữ như hạt hoặc củ, tuy nhiên, chúng có thể ñược tìm thấy ở các bộ phận trên mặt ñất của cây (De Leo và cộng sự, 2002) Hầu hết các PPI ñược tìm thấy từ các cây thuộc họ hòa thảo (Gramineae), họ ñậu (Fabacea) và họ cà (Solanaceae) (Brzin và Kidric, 1995) Bên cạnh ñó, hạt của các loại cây thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae) có chứa nhiều nhóm protein ức chế serine nhỏ mà ñã ñược mô tả kĩ

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 21

(Phạm Thị Trân Châu và cộng sự, 2004) Vai trò của PPI ñược biết ñến rộng rãi trong việc giúp cho thực vật chống lại sự tấn công của sâu bệnh, ñặc biệt là các loài côn trùng gây hại (Fan và Wu, 2005; Habeeb và Khalid, 2007) Những PPI này hoạt ñộng như những protein ức chế quá trình phân giải protease trong ruột của côn trùng, từ ñó ức chế quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng Phạm Thị Trân Châu và cộng sự (2000) ñã sản xuất chế phẩm phòng trừ sâu rau (momosertatin) tách

từ hạt gấc (momordica cochinchinensis) ðây là chế phẩm diệt sâu sinh học có hiệu quả

tương ñối cao, protein trong thuốc (PPI) sẽ kìm hãm protease trong ruột côn trùng, và tiêu diệt chúng PPI của hạt gấc có tác dụng kìm hãm mạnh nhất proteinase của các loại sâu rau so với nhiều loại PPI từ các thực vật khác (Phạm Thị Trân Châu và cộng sự, 2000) Nghiên cứu còn cho thấy chế phẩm còn có tác dụng xấu ñến cả quá trình biến thái từ sâu sang nhộng và từ nhộng sang bướm của cả hai loài trên: Tỉ lệ sâu hóa nhộng

và tỉ lệ nhộng vũ hóa ñều thấp ñi Tỉ lệ bướm dị dạng cũng tăng lên Kết quả thử nghiệm trên chuột nhắt trắng cho thấy ở liều cao nhất (lượng tối ña chuột chịu ñựng ñược 1 lần là 50ml/kg chuột) không có các triệu chứng ngộ ñộc cấp

Một ñề tài nghiên cứu của ðại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh ñã dùng cao hạt gấc cho 96 con chuột nhắt trắng uống với liều hoạt chất tăng dần ñể xác ñịnh ñộc tính cấp LD50 Kết quả cho thấy dùng dưới liều 20g/kg không làm chuột chết, nhưng dùng trên 180g/kg tất cả chuột ñều chết, và LD50 ñược tính bằng phương pháp Behrens và Karber là 92,27g bột hạt gấc/kg Dựa vào tính ñộc của nhân hạt gấc, chúng ta có thể sử dụng ñể bảo vệ cây trồng khỏi các loại sâu hại mà không ảnh hưởng tới môi trường cũng như sức khỏe con người Trên thế giới, chủ yêu nhân hạt gấc ñược nghiên cứu trong lĩnh vực y học, chưa có nhiều nghiên cứu chú trọng tới lĩnh vực bảo vệ thực vật

Ngoài ra trong hạt gấc còn có momordin, ñược biết ñến là chất gây ức chế sự hoạt ñộng của ribosome ñối với sinh vật nhân chuẩn, dẫn tới ức chế mạnh sự tổng hợp các protein (Marcelo và Marc, 1992 ) Một thí nghiệm sử dụng momordin và capsaicin trên chuột cho thấy có sự ức chế ñáng kể ñối với sự hoạt ñộng của dạ dày trong quá trình tiêu hóa thức ăn (Matsuda và cộng sự, 1998) Trong các phương

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 22

thức hoạt ñộng hạ ñường huyết của các loại saponin ñại diện là: momordin Ic, axit oleanolic 3-O-glucuronide, escins Ia, IIa, và senegin II Ngoài ức chế sự hoạt ñộng của dạ dày chuột, chúng còn ức chế sự hấp thu glucose ở ruột non trong ống nghiệm và là nguyên nhân gây bệnh tiểu ñường hoặc hạ ñường huyết.v.v (Matsuda

và cộng sự, 1998a, c) Nghiên cứu cho thấy momordin Ic có ảnh hưởng trực tiếp tới lượng ñường trong máu của chuột bình thường và capsaicin có ảnh hưởng trực tiếp tới sự hoạt ñộng của dạ dày chuột (Kuratani và cộng sự, 1994, Stein và cộng sự, 1994) Ngoài ra, các acid momordic và momordin trong hạt gấc ñược cho rằng có tính kháng khuẩn (Kawamura và công sự, 1988, Kuwada và cộng sự, 1940)

2.2.2 Quả ớt

Ớt thuộc chi Capsicum, họ Cà (Solanaceae) Ớt là một loại quả gia vị cũng như loại quả làm rau phổ biển trên thế giới Ớt có nguồn gốc từ châu Mỹ, ngày nay

nó ñược trồng khắp nơi trên thế giới và ñược sử dụng làm gia vị, rau, và thuốc Quả

ớt có chứa 1,27% các capsaicinoid và 0,03% capsaicin (Azizan và Blevins, 1995), sắc tố carotenoid là capsanthine (0,4%), adenine, betaine và cholien Quả chín ñỏ chứa một lượng lớn vitamin C lên tới 200 - 400mg Capsaicin là một hợp chất phenylpropanoid (Flomenbaum và cộng sự, 2006) hòa tan trong cồn và mỡ, ít hòa tan trong nước

Capsaicin ñược ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như bảo vệ thực vật, trong y học, thực phẩm, mỹ phẩm v.v Capsaicin trong y khoa ñược liệt kê vào loại ñộc dược Capsaicin gây nóng và bỏng rát khi tiếp xúc với da người (Burnett, 1989, Williams và cộng sự, 1995) Tuy nhiên bắt ñầu từ lượng nào ñó nó mới tác hại ñến

cơ thể Những phủ tạng như ruột, bao tử, hệ hô hấp, da và da nhờn trong khoang miệng mũi sẽ bị thiệt hại, nếu ăn cay quá ñộ Dùng ớt quá ñộ và trong một thời gian dài có thể làm hệ thần kinh chết dần Những cơ quan thần kinh bị ảnh hưởng: vị giác, cơ quai hàm, và do ñó sự cảm nhận về ñộ cay cũng giảm ñi

Khi phun capsaicin vào ñất thì vi khuẩn trong ñất có thể phân hủy cấu trúc của capsaicin Một nửa capsaicin nếu ñược phun vào ñất sẽ bị phá vỡ trong 2 - 8 ngày Capsaicin có thể ảnh hưởng ñến các loài chim, cá, hoặc ñộng vật hoang dã

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 23

khác nhưng hầu hết các ñộng vật hoang dã sẽ tránh capsaicin bởi vì nó có mùi và hương vị mạnh mẽ Capsaicin là chất ñộc với ong và côn trùng có ích khác, nó ñược coi là chất xua ñuổi côn trùng hay là giết chết chúng (Copping, 2001, Antonious và cộng sự, 2006) ðối với ñộng vật có vú, capsaicin liên kết với thụ thể TRPV1 (Reilly và cộng sự, 2003) kích thích tín hiệu ở các sợi thần kinh cảm giác loại C (Flomenbaum và cộng sự, 2006) dẫn tới phản ứng viêm thần kinh (Pall và Anderson, 2004, Gharat và Szallasi, 2007) Ở một thí nghiệm với chuột cho thấy hàm lượng capsaicin gây ñộc cấp tính theo ñường miệng (LD50- medium letalisdosis) tương ứng ñối với chuột cái là 97,4mg/kg và chuột ñực là 118mg/kg (Saito và Yamamoto, 1996)

Capsaicin có khả năng diệt khuẩn, nên chất này thường ñược dùng ñể bảo quản thực phẩm, giữ cho thức ăn lâu hư, làm thành phần trong mỹ phẩm (Johnson, 2007) Trong y tế, capasicin và các ñồng hỗn hợp của nó ñược sử dụng ñể làm thuốc

mỡ, thuốc bột và thuốc cồn vì những ñặc tính có chất làm se, chống kích ứng và giảm ñau của chúng Các công thức này ñã ñược sử dụng trong liệu pháp chữa viêm khớp, ñau thần kinh mụn giộp, ñau cơ v.v (Mori và cộng sự, 2006)

Những năm gần ñây có nhiều nghiên cứu trên thế giới về ảnh hưởng chất capsaicin có trong quả ớt tới các loài ñộng vật Capsaicin ñược sử dụng chống lại côn trùng và nhện và lần ñầu tiên ñăng ký sử dụng tại Hoa Kỳ vào năm 1962 (theo U.S Environmental Protection Agency) Cơ quan bảo vệ môi trường Hoa Kỳ coi nó

là một loại thuốc trừ sâu sinh hóa bởi vì nó là một chất tự nhiên (Pesticide Products Pest-Bank [CD-ROM], 2007) Năm 2001, Copping ñã nghiên cứu trên chuột ñể tìm hiểu về cơ chế tác ñộng của capsaisin tới cơ thể ñộng vật cho thấy capsaicin trong ớt ban ñầu gây ra sự sưng tấy khi tiếp xúc với màng dịch nhầy mỏng của khoang miệng, cổ họng và dạ dày, ñồng thời nhanh chóng tạo ra cảm giác bỏng mạnh ñược cảm nhận là ‘cay’ thông qua các ñầu dây thần kinh tự do trong niêm mạc, capsaicin gây tổn thương màng trong tế bào, rối loạn chuyển hóa và phá hủy hệ thần kinh của côn trùng như bọ ve, rệp, nhện và các ñộng vật không xương sống khác Năm 2003, Reilly và cộng sự cho rằng ở một lượng nhất ñịnh thì capsaisin rất dễ gây kích thích

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 24

da và mắt, ngoài ra nó còn gây sưng tấy các mô trong phổi nếu chúng ta hít phải chất này nhiều Xu và cộng sự (2005) ñã nghiên cứu tác ñộng của capsaicin lên một

số loại vi khuẩn và cho kết quả rất tốt, kết quả của họ cho thấy capsaicin là một chất ñộc ñối với nhiều loại vi khuẩn có hại cho cây trồng Năm 2007, Johnson và Wilbur

ñã tìm ra các chất hóa học nhất ñịnh như aflatoxin (là chất diệt nấm) trong quả ớt hỏng bị nhiễm nấm, chất này ñược biết là có khả năng gây ung thư dạ dày và ruột kết Capsaicin trong quả ớt chủ yếu ñược nghiên cứu phục vụ cho các lĩnh vực y học, thực phẩm, còn trong lĩnh vực bảo vệ thực vật vẫn chưa ñược chú trọng nhiều (Fazekas và cộng sự, 2005, Vrabcheva, 2000, Reddy và cộng sự, 2001, Tricker và cộng sự, 1988, Mathew và cộng sự, 2000, López-Carrillo và cộng sự, 2003, Archer

và Jones, 2002, López-Carrillo và cộng sự, 1994)

2.2 3 Xoan ta

Hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu tác ñộng của cây xoan ta (Melia

azedarach L) ở Việt Nam tuy nhiên với cây xoan chịu hạn (Azadirachta indica) thì

ñã có rất nhiều nghiên cứu trên thế giới ñể ứng dụng vào việc bảo vệ thực vật

Quả xoan ñược cho là ñộc hại cho con người nếu ăn với số lượng lớn Tuy nhiên, như những cây Yew, các chất ñộc này không gây hại cho các loài chim Một

số loài chim có thể ăn trái cây, tán hạt giống trong phân của chúng Các ñộc tố là chất ñộc thần kinh và nhựa không rõ nguồn gốc, ñược tìm thấy chủ yếu trong quả Các triệu chứng ñầu tiên của ngộ ñộc xuất hiện một vài giờ sau khi uống như chán

ăn, nôn, táo bón hoặc tiêu chảy, phân có máu, ñau dạ dày, tắc nghẽn phổi, tim ngừng ñập, ñộ cứng, thiếu sự phối hợp và sự yếu kém chung Cái chết có thể xảy ra sau khi khoảng 24 giờ

Các hợp chất chính trong xoan thuộc về nhóm các hợp chất tự nhiên triterpenoid, chuyên biệt hơn, ñó là các limonoid (tetranotriterpenoid) Cho ñến nay,

9 limonoid trong xoan ñã ñược chứng minh là có khả năng ngăn cản sự phát triển của côn trùng, ñặc biệt là những côn trùng gây dịch bệnh cho nông nghiệp và ảnh hưởng xấu ñến sức khỏe con người Nhiều limonoid mới vẫn ñang tiếp tục ñược phát hiện trong cây, các limonoid như salannin, meliantriol, nimbin, nimbidin ñược xem là thành phần hoạt chất chính trong xoan Tetranortriterpenoids tạo thành một

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 25

chất ựộc có liên quan hóa học với Azadirachtin, các hợp chất diệt côn trùng chắnh trong dầu Neem ựã ựược nghiên cứu nhiều Các hợp chất này có thể liên quan ựến

gỗ và khả năng chống sâu bệnh của hạt giống, tetranortriterpenoids có thể ựể hấp dẫn ựộng vật của hoa giúp cho quá trình thụ phấn (Russell và cộng sự, 1997) Theo Mitra (1963), lá cây chứa alkaloid ỘParisianỢ, xoan tự bảo vệ nó khỏi nhiều loại côn trùng gây hại do nó chứa nhiều thành phần có hoạt tắnh kháng côn trùng Xoan chứa hỗn hợp của 3 ựến 4 hợp chất chắnh và khoảng hơn 20 các hợp chất phụ khác, các hợp chất phụ này có tác ựộng theo phương cách này hay phương cách khác

2.3 Tình hình nghiên cứu thuốc bảo vệ thực vật nguồn gốc sinh học

Thuốc trừ sâu hóa học ựã ựể lại nhiều hậu quả nặng nề, làm mất cân bằng sinh thái, ảnh hưởng tới sức khỏe con người, hơn thế nữa nó có thể tác ựộng trên tất

cả các lĩnh vực của nền kinh tế sản xuất và ựặt ra một mối ựe dọa về hệ sinh thái trên toàn thế giới để giảm thiểu tác ựộng xấu của thuốc BVTV ựến môi trường và cộng ựồng, xu hướng sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc sinh học thay thế dần các thuốc hóa học ựang ngày càng phát triển Các thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học cũng là một trong những lĩnh vực mà Hóa học xanh quan tâm và hướng tới

Theo Cơ quan Bảo vệ môi trường Mỹ (US EPA), Thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học (Biopesticide) là các loại thuốc phòng trừ dịch hại có nguồn gốc nguyên liệu tự nhiên như thực vật, ựộng vật, vi khuẩn và khoáng chất Khái niệm này bao hàm cả các chất tạo ra từ gene ựược chuyển vào ựối tượng cây cần bảo vệ nhằm tạo các kháng thể có khả năng phòng trừ dịch hại (Ranasingh, 2007)

- Thuốc BVTV vi sinh (Microbial Pesticides): Bao gồm các loại vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, virus, sinh vật ựơn bào hoặc tảo) có khả năng phòng trừ dịch hại, vắ dụ

thuốc trừ sâu vi sinh Bt (Bacillus thuringiensis)

- Thuốc BVTV có nguồn gốc hóa sinh (Biochemical Pesticides) bao gồm các chất có nguồn gốc tự nhiên có khả năng kiểm soát dịch hại theo cơ chế không ựộc

đó là các chất dẫn dụ (sinh dục hoặc thức ăn), các chất xua ựuổi, các chất ựiều khiển sinh trưởng côn trùng

- Thuốc BVTV có nguồn gốc thảo mộc (Botanical/Herbal hoặc Plant Pesticides): hoạt chất là các chất thu ựược từ cây, cỏ, kể cả tinh dầu, vắ dụ: Nicotin

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 26

trong cây thuốc lào hoặc thuốc lá, D-limonen từ tinh dầu cam, chanh

Các nhà nghiên cứu hóa nông ñưa ra ñịnh nghĩa về thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học ñơn giản là các thuốc có nguồn gốc tự nhiên có thể kiểm soát dịch hại theo

cơ chế không ñộc với người, thân thiện với môi trường sinh thái và dễ sử dụng (Barlow và Goldson, 2002) Các nhà nghiên cứu trên thế giới ñã tìm ra nhiều chất

có hoạt tính trong thực vật Copping (1998) ñã liệt kê ra hơn 170 chất có khả năng chống lại côn trùng, sâu hại có sẵn trong tự nhiên Các sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học có ở nhiều dạng khác nhau như: các chất chiết xuất từ thực vật, từ vi khuẩn, nấm men v.v nhằm diệt các loài côn trùng, các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng Các hoạt chất ức chế enzyme tiêu hóa và enzyme tiêu hóa của côn trùng, sâu hại

ñã ñược nghiên cứu rất sâu (Copedge và cộng sự, 1994, Roxanme và Broadway,

1996, Turlyngs và Benrey, 1998, Moataza và Dorrah, 2004, Sengottayan, 2006, Qingchun Huang và cộng sự, 2008, Yannick và cộng sự, 2009) Nghiên cứu của Mochizuki (1998) có thống kê các nhóm phân loại của protease trong một số loài côn trùng (bảng 1), cho thấy mức ñộ quan tâm trong các nghiên cứu về enzyme Một số nghiên cứu ñã chỉ ra việc ức chế enzyme của các hoạt chất trong việc tiêu diệt các loại côn trùng như: oxadiazolyl 3(2H)-pyridazinone, trypsin trong ñậu tương, v.v (Qingchun Huang và cộng sự, 2008, Dorrah, 2004) Năm 2007, Liao và cộng sự ñã nghiên cứu trên cây quế và tìm ra chất ức chế trypsin có khả năng gây ngán ăn và tiêu diệt ñối với sâu xanh bướm trắng ðây thực sự làm một trong những hướng quan trọng trong mục tiêu tiêu diệt các loại côn trùng gây hại nói chung và trên thực vật nói riêng

Hiện nay công nghệ gen cho phép các nhà khoa học chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ, côn trùng, sâu hại.v.v Năm 1997, Hao và cộng sự ñã chuyển gen ức chế trypsin ñậu ñũa (CPTI) vào cây cải bắp cho thấy khả năng kháng hai loại sâu bệnh

chính là Pieris rapae và Heliothis armigera rất cao Ngoài ra, các nhà nghiên cứu còn

hướng tới việc tìm ra các pheromone ñể thu hút côn trùng nhằm làm gián ñoạn sự giao phối của chúng hoặc giết chúng, từ ñó làm giảm ñược sâu hại Việc sử dụng các kí sinh trong quản lí dịch hại cũng rất ñược quan tâm (Cameron và cộng sự, 1993)

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 27

Các thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học ựã ựược quan tâm nghiên cứu, ựưa vào sử dụng tại Việt Nam từ ựầu những năm 80 của thế kỷ trước và ựã mang lại hiệu quả tắch cực cho người nông dân, giảm một phần ô nhiễm môi trường đặc biệt, từ năm 1990 trở lại ựây, việc nghiên cứu, ứng dụng các chế phẩm sinh học trong BVTV ựã ựược Nhà nước và các cơ quan khoa học quan tâm ựầu tư và ựã ựạt ựược những kết quả bước ựầu (đào Văn Hoằng, 2011)

Việt Nam là nước có hệ thực vật phong phú với nhiều loại cây có dầu, tinh dầu, các chất có hoạt tắnh sinh học cao và ựa dạng Tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn

có này có thể tạo ra nhiều sản phẩm thuốc sinh học có giá trị sử dụng cao đây là lợi thế quan trọng giúp phát triển các thuốc sinh học phục vụ sản xuất nông nghiệp bền vững Tuy nhiên, so với các loại thuốc BVTV hóa học, các chế phẩm sinh học còn một số yếu ựiểm như: giá thành cao, hiệu lực chậm hơn thuốc hóa học nên nông dân không thắch Do vậy, việc ứng dụng chế phẩm sinh học vào thực tế ở nước ta còn ắt Công tác nghiên cứu triển khai trong lĩnh vực sinh học gặp khó khăn do chúng ta còn thiếu ựiều kiện, trang thiết bị và cả con người Hơn nữa ở nước ta, hệ thống nguồn giống và bảo quản, lưu trữ còn hạn chế, trong khi nhiều nước trên thế giới ựều có hệ thống giống quốc gia phong phú Từ ựó dẫn ựến số lượng thuốc phòng trừ dịch hại có nguồn gốc sinh học, ựặc biệt, nhóm thuốc vi khuẩn, vi sinh vật còn ắt

Tỷ trọng thuốc BVTV sinh học ựược sử dụng chỉ chiếm khoảng 5% so với tổng lượng thuốc BVTV hàng năm (Lê Ngọc Thạch, 2008)

Mặc dù vậy, cho ựến nay ựã có nhiều chế phẩm thuốc sinh học ựược nghiên cứu và ứng dụng thành công vào thực tế tại nước ta Số lượng các sản phẩm ựược ựăng ký sử dụng tăng theo từng năm (năm 2000 chỉ có 2 sản phẩm ựăng ký, năm

2005 có 57, năm 2007 có 193, năm 2010 có 374 hoạt chất ựăng ký, chiếm 37,3 % tổng số) Các sản phẩm này ựã góp phần không nhỏ vào công tác phòng trừ dịch hại, hạn chế tối ựa nguy cơ ựộc hại ựến sức khỏe con người và ô nhiễm môi trường

do thuốc BVTV hóa học gây nên (Lê Ngọc Thạch, 2008) Một số chất có

trong thuốc trừ sâu thảo mộc ựã ựược sử dụng từ lâu như nicotin chiết từ cây thuốc

lào hoặc thuốc lá, rotenon từ cây ruốc cá, củ ựậu, hạt thàn mát Hai chất này cũng ựã

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 28

ñược nghiên cứu chiết, tách từ những năm 70, 80 của thế kỷ trước Gần ñây, hoạt chất trừ sâu rất hiệu quả là azadirachtin có trong hạt xoan Ấn ñộ, trồng ở Ninh Thuận cũng ñã ñược nghiên cứu chiết tách và sử dụng thành công ngoài ñồng ruộng (Phùng Hà và Phạm Ngọc Thảnh, 2009) Năm 2000, Phạm Thị Trân Châu và các cộng sự ñã nghiên cứu tác dụng trừ sâu hại rau của chế phẩm momosertatin tách từ

hạt gấc (Momordica cochinchinensis) và ñã cho kết quả khá tốt Năm 2001, Nguyễn

Thị Thủy ñã khảo sát hoạt tính ức chế sinh trưởng rầy nâu và ngài gạo của sản phẩm chiết xuất từ nhân hạt xoan chịu hạn Năm 2005, Vũ Văn ðộ, Vũ ðănh Khánh và Nguyễn Tiến Thắng ñã ñánh giá ñược ñộ ñộc của chế phẩm phối trộn giữa dầu

neem và Bt (Baccillus thuringiensis) ñối với sâu xanh (Heliothis armigara ), sâu tơ (Plutella xylostella)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 29

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu và ñối tượng nghiên cứu

3.1.1 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu

ðề tài ñược tiến hành từ tháng 12 năm 2011 ñến tháng 3 năm 2013 tại: + Phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Vinh Sinh – Khoa Công Nghệ Sinh Học – trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội, Gia Lâm Hà Nội

+ Khu thí nghiệm ñồng ruộng thuốc Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Gia Lâm - Hà Nội

3.1.2 ðối tượng nghiên cứu

Sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae Linnaeus)

3.1.3 Vật liệu nghiên cứu

- Dịch chiết từ các loài thực vật: hạt gấc, quả ớt, lá xoan, lá trầu không, lá bạch ñàn, lá tía tô, hạt hòe, lá kinh giới, lá húng quế, hoa cúc vạn thọ

- Thuốc hóa học Viserin 4.5 EC: thuốc có nguồn gốc hóa học thuộc gốc Pyrethroid: pha 12ml thuốc/ 8 lít nước

- Giống cải bắp lai F1 Pakse 287

3.1.4 Thiết bị và hóa chất sử sụng

Các dụng cụ thiết bị và hóa chất của phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ

vi sinh - Khoa Công nghệ sinh học - trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội

Thiết bị

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 30

Bảng 3: Máy móc dùng trong ñề tài

Máy ño pH Meter S20 Mettler Toledo Thụy sỹ

Máy sản xuất ñá lạnh cho thí nghiệm Evermed Italy

Cân kĩ thuật ñộ chính xác 0.01 g Mettler Toledo Thuỵ Sỹ

Cân phân tích ñộ chính xác 0.1 mg Mettler Toledo Thuỵ Sỹ

Máy ly tâm lạnh 15000 vòng/phút Hettich Hàn Quốc

Máy li tâm lạnh Universal 320R Hettich ðức

CMC (carbonmethyl cellulose) Kanto chemicals Nhật Bản

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 31

3.2 Phương pháp nghiên cứu

Các thắ nghiệm dưới ựây chúng tôi thực hiện lặp lại từ 3 tới 5 lần ựể ựảm bảo kết quả có tắnh chắnh xác

3.2.1 Chuẩn bị sâu xanh bướm trắng cho nghiên cứu

Dùng phương pháp thủ công thu bắt sâu xanh trên các ruộng trồng rau Các ruộng rau thu mẫu phải chưa phun thuốc trừ sâu, sâu thu ựược ở các ựộ tuổi từ tuổi 1 tới tuổi 5 tại Cổ Loa - đông Anh và đặng Xá - Gia Lâm, Hà Nội Ngoài ra, việc nuôi sâu trong phòng thắ nghiệm ựược thực hiện ựể ựảm bảo nguồn sâu liên tục cho nghiên cứu

3.2.2 Chuẩn bị dịch chiết từ thực vật

Mẫu lá, hoa, và quả của thực vật ựược rửa sạch và nghiền nhỏ bằng máy xay sinh

tố còn mẫu hạt ựược sấy khô ở 30oC và nghiền thành bột bằng cối chày sứ Sau ựó các mẫu ựã nghiền ựược bổ sung nước (hoặc ựệm Sorensen 0,133M, pH 7.6 với mẫu hạt) theo tỉ lệ về khối lượng là 1 mẫu: 3 nước/ựệm Phần bã thực vật ựược loại bỏ khỏi dung dịch bằng ly tâm ở 4oC, tốc ựộ 9000 vòng/phút Dung môi khác ựược bổ sung theo tỉ lệ như trên và ựược làm bay hơi hoàn toàn bằng máy minvac ở 30oC Sau ựó các chất không bay hơi ựược hòa tan lại trong nước theo tỉ lệ 1: 3 như ban ựầu

3.2.3 Khảo sát hiệu lực gây ngán ăn cho sâu

Hiệu lực gây ngán ăn của các dịch chiết ựối với sâu ựược xác ựịnh theo phương pháp cải tiến từ phương pháp Ộleaf disc no-choiceỢ (Kubo và Nakanishi, 1977) Diện tắch lá bị ăn trong ảnh chụp ựược tắnh bằng phần mềm Compu Eye (Bakr, 2005)

Tiến hành:

Lá bắp cải (Brassica oleracea) ựược cắt thành miếng hình chữ nhật với

kắch thước bằng nhau (6x10 cm) Lá dùng ựể cho sâu ăn ựược nhúng vào các mẫu dịch chiết pha loãng 5 lần (mẫu ựối chứng nhúng vào nước) và ựể cho ráo trước khi ựể vào trong các hộp có lót giấy ẩm và thả 10 cá thể sâu vào mỗi hộp Hiệu