PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH GEN ĐỘC TỐ CỦA VIBRIOPARAHAEMOLYTICUS TRONG HẢI SẢN TƯƠI SỐNG Ở NHA TRANG ISOLATION AND DETECTION OF TOXIN GENES OF VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS IN FRESH SEAFOOD IN NHA
Trang 1PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH GEN ĐỘC TỐ CỦA VIBRIO
PARAHAEMOLYTICUS TRONG HẢI SẢN TƯƠI SỐNG Ở NHA TRANG
ISOLATION AND DETECTION OF TOXIN GENES OF VIBRIO
PARAHAEMOLYTICUS IN FRESH SEAFOOD IN NHA TRANG
Nguyễn Văn Duy1, Nguyễn Thị Cẩm Ly2
Ngày nhận bài: 16/06/2011; Ngày phản biện thơng qua: 28/09/2011; Ngày duyệt đăng: 10/06/2012
TĨM TẮT
Tiêu thụ hải sản tươi sống là nguyên nhân chính của bệnh tiêu hĩa cấp do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra
Vi khuẩn này cịn cĩ thể gây ra nhiễm trùng vết thương và nhiễm trùng huyết nhưng kém phổ biến hơn Cho đến nay cơ chế gây bệnh của V parahaemolyticus vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ Mục đích của nghiên cứu này là phân lập và xác định một số gen độc tố của V parahaemolyticus từ các mẫu hải sản tại các chợ ở thành phố Nha Trang Sử dụng kỹ thuật PCR
và giải trình tự gen, chúng tơi đã phát hiện được gen điều hịa độc tố toxR và gen mã hĩa độc tố hemolysin khơng bền nhiệt tlh cĩ mặt trong tất cả năm chủng phân lập được Tuy nhiên, khơng tìm thấy chủng dương tính với các gen tdh và trh mã hĩa các độc tố hemolysin bền nhiệt Cĩ thể sử dụng kết quả nghiên cứu này làm cơ sở khoa học cho việc xây dựng phương pháp phát hiện nhanh vi khuẩn này trong các mẫu hải sản, phát triển vaccin điều trị các bệnh do Vibrio gây ra, cũng như cho những nghiên cứu tiếp theo về độc tính của các hemolysin từ Vibrio ở Việt Nam
Từ khĩa: Hemolysin, hải sản, tlh, toxR, Vibrio parahaemolyticus
ABSTRACT
The consumption of raw or undercooked seafood is the predominant reason of the acute gastroenteritis caused by Vibrio parahaemolyticus Primary septicemia and wound infections also occur, but are less common than seafood-borne disease Up to date the disease mechanism of V parahaemolyticus infections has not been fully elucidated The aim of the present work is to isolate and detect some toxin genes of V parahaemolyticus from seafood samples in some markets in Nha Trang city Using PCR and sequence analysis, we detected the presence of the toxin regulatory gene toxR and thermolabile hemolysin gene tlh in all fi ve isolated strains but none of thermostable hemolysin genes tdh and trh were found Our results contribute into establishing a rapid bacterial detection method in seafood, developing a future vaccine against pathogenic Vibrio and building a scientifi c basis for further research on toxicity of hemolysins in Vibrio in Vietnam
Keywords: Hemolysin, seafood, tlh, toxR, Vibrio parahaemolyticus
1 TS Nguyễn Văn Duy: Viện Cơng nghệ Sinh học & Mơi trường - Trường Đại học Nha Trang
2 Nguyễn Thị Cẩm Ly: Sinh viên Khĩa 49 Ngành CNSH - Trường Đại học Nha Trang
THÔNG BÁO KHOA HỌC
I ĐẶT VẤN ĐỀ
Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là tác nhân
phổ biến gây ngộ độc thực phẩm ở nhiều nước châu
Á như Trung Quốc, Nhật Bản và Đài Loan, ở châu
Âu như Tây Ban Nha, Pháp và ở khắp Châu Mỹ,
điển hình là Hoa Kỳ (Daniels et al., 2000) Tại Việt
Nam từ năm 1999 đến 2008 đã cĩ khoảng 1000 vụ
ngộ độc thực phẩm được báo cáo với trên 25.000
người mắc, trong đĩ cĩ 300 người tử vong Riêng
tại tỉnh Khánh Hịa, từ 1995 đến 2001 cĩ 548 ca
tiêu chảy (Tuyet et al., 2002), từ năm 2001 đến
2008 cĩ 215 ca ngộ độc thực phẩm, trong đĩ cĩ 7
ca tử vong Phân tích vi sinh cho thấy trong số 548
trường hợp tiêu chảy ở trên, cĩ 53% dương tính với
V parahaemolyticus
V parahaemolyticus cĩ thể gây ra viêm đường
tiêu hĩa, nhiễm trùng vết thương và nhiễm trùng
huyết ở người Nhiễm trùng huyết là mối đe dọa
Trang 2ng-hiêm trọng vì sinh vật gây bệnh lây lan nhanh hoặc
các độc tố của chúng sinh ra có thể tồn tại lâu dài
và lưu thông trong máu Theo khóa phân loại của
Bergey, V parahaemolyticus là vi khuẩn Gram âm,
hình dấu phẩy, có tiêm mao ở một đầu, di động,
kỵ khí tùy tiện và ưa môi trường kiềm mặn Chúng
thường sống ở các cửa sông và ven biển của hầu
hết các vùng trên thế giới Người ta đã phân lập
được chúng trong cát, bùn và nước biển, cũng như
ở hải sản (Vesth et al., 2010)
V parahaemolyticus có thể gây bệnh ở người
thông qua tiêu thụ hải sản nấu chưa chín hoặc qua
vết thương tiếp xúc với động vật biển hoặc vùng
nước ấm ven biển, đặc biệt là ở Đông Nam Á
Tuy nhiên, không phải chủng V parahaemolyticus
nào cũng gây bệnh do chúng mang các gen độc
tố khác nhau Trong số đó, hemolysin là loại độc
tố phổ biến nhất ở các loài Vibrio gây bệnh Đây
là ngoại độc tố làm phân giải tế bào hồng cầu và
giải phóng hemoglobin Ở loài V parahaemolyticus,
có ba gen độc tố hemolysin chính bao gồm tdh và
trh mã hóa các hemolysin bền nhiệt và tlh mã hóa
hemolysin không bền nhiệt Cả hai gen tdh và trh
đều nằm trên operon độc tố Vp-toxRS, được điều
hòa bởi gen toxR có trình tự bảo tồn cao trong loài
(Nishibuchi & Kaper, 1995).
II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Chuẩn bị mẫu và phân lập vi khuẩn
V parahaemolyticus
Tổng số 3 mẫu tôm bạc, 3 mẫu tôm sú, 5
mẫu cua biển và 5 mẫu mực ống được thu mua
từ các chợ ở thành phố Nha Trang vào tháng 3 -
4/2010 Mỗi 1g phần nội tạng của các mẫu được
bổ sung 9 ml dung dịch APW (alkaline peptone
wa-ter) bao gồm pepton 10 g/l và NaCl 30 g/l ở pH
8,5, sau đó được ủ ở 370C trong 6-8 giờ để tăng
sinh vi sinh vật Sau tăng sinh, các vi khuẩn Vibrio
được phân lập trên môi trường chọn lọc TCBS
(Thiosulfate citrate bile sucrose agar) (Marlina et al.,
2007) ở pH 8,6, 370C trong 24 giờ Xác định các
đặc điểm hình thái và hóa sinh (khả năng chịu
muối, lên men đường, sử dụng lysin) theo mô
tả của Trần Linh Thước (2007) Dựa vào khóa
phân loại của Bergey để sơ bộ lựa chọn các
chủng V parahaemolyticus cho các nghiên cứu
tiếp theo
2 Tách chiết DNA hệ gen của
V parahaemolyticus
Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi
trường LB với 3% NaCl, lắc trong 18 giờ ở
150 vòng/phút Dịch nuôi cấy được ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 2 phút ở 4OC để thu tế bào
(Luan et al., 2007) DNA tổng số được tách chiết
bằng bộ kit Wizard® SV Genomic DNA (Promega)
theo hướng dẫn của nhà sản xuất và sau đó bảo
quản ở 40C.
3 Xác định gen độc tố bằng kỹ thuật PCR
Để xác định 4 gen độc tố toxR, tdh, trh và tlh, 4
cặp mồi tương ứng đã được tổng hợp bởi IDT (Mỹ)
có trình tự nucleotide như trình bày trong Bảng 1
(Luan et al., 2007; Marlina et al., 2007) Phản ứng
PCR được chuẩn bị trong thể tích 50µl với các thành phần ở nồng độ cuối cùng như sau: DNA (2-20 ng), mỗi mồi (0,1µM), dNTP (0,4µM), MgCl2 (2 mM), Taq polymerase (1,25 U) và đệm Tag (1X) Chu kì nhiệt được chạy với pha đầu ở 94OC trong 3 phút, 35 chu
kì chính gồm 3 giai đoạn lần lượt ở 94, 50 và 720C, mỗi giai đoạn 1 phút, và pha cuối ở 72OC trong 3
phút Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose
1 - 1,5% trong đệm TBE 0,5X, sau đó được nhuộm với ethidium bromide và đọc kết quả trên máy chụp
ảnh gel (Biorad).
4 Giải và phân tích trình tự
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PCR clean up system (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và sử dụng làm khuôn trực tiếp cho phản ứng tiền giải trình tự theo nguyên tắc dye-labelled dideoxy terminator (Big Dye
Terminator v 3.1, Applied Biosystems) với các cặp mồi toxR-F/toxR-R và tlh-F/tlh-R theo chương
trình nhiệt như sau: 960C trong 20 giây, 500C trong 20 giây và 600C trong 4 phút Sản phẩm
phản ứng được phân tích trên máy phân tích trình tự tự động ABI Prism 3700 DNA Analyser
(Applied Biosystems) Các trình tự được phân tích, chỉnh sửa bằng phần mềm BioEdit 7.1.3.0, được
so sánh với các trình tự nucleotide tương đồng trên Genbank và suy diễn tới trình tự amino acid tương
ứng bằng chương trình BLAST (www.ncbi.nlm.nih.
gov/blast/).
III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
1 Phân lập các chủng Vibrio parahaemolyticus
từ mẫu hải sản tươi sống
Chúng tôi đã thu được tổng số 40 chủng vi khuẩn
có đặc điểm hình thái khuẩn lạc rất đa dạng Trong số
đó, có 24 (60%) chủng mang các đặc điểm hình thái
của vi khuẩn Vibrio, được kí hiệu từ C1-C24 Điều
này phù hợp với một thông báo trước đây rằng có khoảng 50% số chủng được phân lập từ nước biển
Trang 3và nhuyễn thể hai mảnh vỏ có khuẩn lạc mọc trên
môi trường TCBS là thuộc về chi Vibrio trong khi các
chủng còn lại có thể là Aeromonas, Pseudomonas,
Flavobacterium, Pasteurella hay Agrobacterium
(Croci et al., 2001) Các khuẩn lạc màu xanh
thường là V parahaemolyticus trong khi đó
V cholerae hoặc V alginolyticus có thể có khuẩn
lạc màu vàng do lên men đường sucrose trong môi trường TCBS Các khuẩn lạc có màu sắc khác sinh trường yếu hơn và chưa được xác định
Hình 1 Khuẩn lạc (trái) và tế bào nhuộm Gram (phải) của chủng V parahaemolyticus C1
Bảng 1 Trình tự nucleotide của các cặp mồi
Mồi Trình tự oligonucleotide (5´- 3´)
toxR-F GTCTTCTGACGCAATCGTTG
toxR-R ATACGAGTGGTTGCTGTCATG
tdh-F GTAAAGGTCTCTGACTTTTGGAC
tdh-R TGGAATAGAACCTTCATCTTCACC
trh-F TTGGCTTCGATATTTTCAGTATCT
trh-R CATAACAAACATATGCCCATTTCC
tlh-F AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG
tlh-R GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC
Bảng 2 Đặc điểm hóa sinh của các chủng
Chủng
NaCl (%)
-3 ++ ++ ++ ++ ++
-Arabinose + + + + +
-Chú thích: (+): sinh trưởng, (-): không sinh trưởng
Dựa theo khóa phân loại của Bergy, chúng
tôi đã lựa chọn được 5 chủng (C1, C2, C7, C15,
C23) có đặc điểm hình thái tương tự với vi khuẩn
V parahaemolyticus như: khuẩn lạc hình tròn, bờ
đều, màu xanh hoặc xanh đậm, tế bào hình phẩy
khuẩn, nhuộm Gram âm tính, đường kính 2 - 4mm
(Hình 1) Về đặc tính hóa sinh, tất cả 5 chủng đều có
khả năng chịu mặn trong khoảng 3 - 6% NaCl, đều
có thể lên men đường arabinose, maltose, mannitol
nhưng không lên men đường lactose và sucrose
Ngoại trừ chủng C23, tất cả các chủng đều có khả
năng sử dụng lysin (Bảng 2) Do đó, tất cả 5 chủng
này đều được tiếp tục giữ lại để nghiên cứu ở mức
độ phân tử.
2 Xác định gen độc tố của các chủng Vibrio
bằng kỹ thuật PCR
Kết quả điện di từ Hình 3 cho thấy, các sản phẩm PCR dài khoảng 370 bp và 450 bp tương
ứng với một đoạn gen toxR và một đoạn gen
tlh đã được phát hiện ở tất cả 5 chủng Vibrio.
Gen toxR có trình tự bảo tồn đặc trưng cho
V parahaemolyticus (Nishibuchi, Kaper, 1995) nên
các sản phẩm PCR quan sát được là bằng chứng xác nhận cả 5 chủng nghiên cứu đều thuộc loài vi
khuẩn này
Gen tlh mã hóa độc tố hemolysin không bền
nhiệt TLH Độc tố này bị bất hoạt ở 60oC trong
10 phút và tính độc trên người chưa được
ng-hiên cứu, nhưng sự có mặt của gen tlh trong tất cả các chủng V parahaemolyticus phân
Trang 4lập được cho thấy tiềm năng gây bệnh của
chúng đối với người ăn sống hải sản vẫn rất
lớn Tuy nhiên, không có chủng nào được phát
hiện mang gen tdh hoặc trh mã hóa các độc tố
hemolysin bền nhiệt Kết quả này cũng phù hợp
với các nghiên cứu trước đây cho thấy gần như
tất cả các mẫu từ môi trường không có (Iida et
al., 1997) hoặc có với tỉ lệ thấp 1 - 5%
(Nishibu-chi, Kaper, 1995) các chủng mang các gen này
Hình 2 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen toxR và tlh ở các chủng Vibrio
M: Marker 1 kb; 1- chủng C1; 2- chủng C2; 3- chủng C7; 4- chủng C15; 5- chủng C23
3 Giải trình tự các đoạn gen độc tố toxR và tlh ở
V parahaemolyticus
Kết quả giải trình tự các đoạn gen toxR và tlh
của hai chủng C1 và C2 cho thấy trình tự đoạn
gen toxR và tlh ở 2 chủng này là hoàn toàn giống
nhau với tổng số 366 bp và 451 bp tương ứng
Thông tin về hai trình tự này đã được gửi đi lưu
trữ tại Ngân hàng Gen Quốc tế (Genbank) với các
số hiệu gen là toxR JQ929913 và tlh JQ929914
Theo Bảng 3, khi so sánh với các trình tự tương
đồng của toxR trên Genbank bằng chương trình
BLAST đã xác nhận chắc chắn các chủng C1 và
C2 thuộc loài Vibrio parahaemolyticus Tỉ lệ tương
đồng của chủng phân tích với các chủng khác
thuộc loài V parahaemolyticus là rất cao, trong
đó giống hoàn toàn (100%) về trình tự nucleotide
của gen toxR với 6 chủng và tương đồng tới 99% với hàng chục chủng khác Gen toxR ở loài
V alginolyticus chỉ đạt 84 - 91% độ tương đồng so
với gen này ở chủng C1 (Bảng 3).
Bảng 3 So sánh trình tự đoạn gen toxR của V parahaemolyticus C1 với các trình tự tương đồng trên
Genbank bằng công cụ BLAST
AB372519.1 V parahaemolyticus p4 (071022) 675 99% 0,0 100%
AB029914.1 V parahaemolyticus AN-8917 675 99% 0,0 100%
AB029910.1 V parahaemolyticus Y-27669 675 99% 0,0 100%
EU155587.1 V parahaemolyticus Vp252 580 85% 1e-162 100%
EU155586.1 V parahaemolyticus Vp250 580 85% 1e-162 100%
EU155584.1 V parahaemolyticus Vp136 580 85% 1e-162 100%
……… ………
AB372526.1 V alginolyticus a20-6-23 335 66% 1e-88 91%
……… ………
AB372534.1 V alginolyticus a12 (071022) 230 63% 6e-57 84%
Không giố ng như toxR là gen bả o thủ đặc
trưng cho loà i V parahaemolyticus, gen tlh còn
có trình tự tương đồng cao với các trình tự ở
một số loà i khá c như Oceanimonas sp (98%) (dữ liệu không được chỉ ra) Giống như Vibrio,
Oceanimonas cũng là một nhóm vi khuẩn biển
Trang 5thuộc bộ Proteobacteria nhưng chúng thuộc về họ
Aeromonadaceae, khác xa với họ Vibrionaceae
trong hệ thống phân loại Tuy vậy, các gen tlh
của chúng lại có tỉ lệ tương đồng rất cao, chứng
tỏ trình tự gen tlh không đặc trưng cho loài
V parahaemolyticus, thậm chí còn phân bố bên
ngoài họ Vibrionaceae.
Hình 3 Cây phát sinh chủng loại của các taxon có trình tự amino acid tương đồng với trình tự amino acid suy diễn từ đoạn gen
tlh của V parahaemolyticus C1
Kết quả được tiến hành trên chương trình BLAST, sử dụng phương pháp Neighbor Joining với độ sai khác trình tự tối đa là 0,7 Kí hiệu
“unknown” là cho V parahaemolyticus C1.
Trang 6Điều thú vị là khi chạy chương trình BLAST
cho trình tự amino acid suy diễn từ đoạn gen
tlh của V parahaemolyticus C1, chúng tôi thấy
trình tự amino acid của protein TLH bảo thủ
khá cao trong họ Vibrionaceae (chi Vibrio và chi
Photobacterium) (Hình 3) Điều này phù hợp với
một nghiên cứu trước đây cho rằng nhóm gen
vhh/tlh là phổ biến ở các loài Vibrio, nhất là các
loài gần gũi với V harveyi và V fi scheri (Wang
et al., 2007) Gần đây, một nghiên cứu về TLH ở
V alginolyticus V05 đã cho thấy trình tự amino acid
của protein này có tỉ lệ tương đồng lần lượt là 94 và
83% so với TLH ở V parahaemolyticus và VHH ở
V harveyi (Jia et al., 2010) Người ta cũng đã thành
công khi tạo được protein tái tổ hợp TLH thể hiện
hoạt tính phospholipase đối với lòng đỏ trứng gà và
hoạt tính hemolysin chống lại hồng cầu của cá bơn
Khi gây nhiễm vào cá ngựa đã cho thấy độc tính
của TLH với liều gây chết (LD50) vào khoảng 0,8µg
protein/g cá (Jia et al., 2010) Do đó, TLH có tiềm
năng được phát triển làm vaccin điều trị bệnh thủy
sản và làm marker chẩn đoán bệnh do Vibrio gây ra
IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Dựa trên các đặc điểm hình thái, hóa sinh và sinh học phân tử, chúng tôi đã phân lập và tuyển
chọn được 5 chủng V parahaemolyticus từ mẫu hải sản tại các chợ ở Nha Trang Tất cả các chủng này đều mang các gen toxR và tlh nhưng không chủng nào có gen tdh hay trh Gen toxR là gen
điều hòa các gen độc tố, có trình tự bảo tồn đặc trưng cho loài nên có thể được sử dụng làm gen đích để xây dựng phương pháp phát hiện nhanh
V parahaemolyticus trong mẫu hải sản bằng kỹ
thuật PCR Trong khi đó, gen tlh mã hóa một
hemolysin không bền nhiệt có trình tự amino acid bảo thủ trong họ Vibrionaceae, nên có tiềm năng làm vaccin điều trị bệnh thủy sản và marker chẩn
đoán bệnh do Vibrio Chúng tôi khuyến cáo người
tiêu dùng nên ăn hải sản chín để phòng tránh độc
tính của các hemolysin không bền nhiệt từ Vibrio
Hơn nữa, nghiên cứu này cũng khẳng định thêm về
ưu điểm nổi bật của phương pháp sinh học phân tử,
không chỉ cho phép định danh chính xác V
para-haemolyticus đến loài mà còn giúp phân biệt giữa
chủng mang gen độc tố với chủng không độc trong cùng một loài
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Trần Linh Thước (2007) Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm Nxb Giáo dục, Hà Nội.
2 Croci L, Serratore P, Cozzi L, Stacchini A, Milandri S, Suffredini E, Toti L (2001) Detection of Vibrionaceae in mussels and
in their seawater growing area Lett Appl Microbiol, 32(1): 57-61.
3 Daniels NA, MacKinnon L, Bishop R, Altekruse S, Ray B, Hammond RM, Thompson S, Wilson S, Bean NH, Griffi n PM,
Slutsker L (2000) Vibrio parahaemolyticus infections in the United States, 1973-1998 J Infect Dis, 181(5):1661-6.
4 Iida T, Suthienkul O, Park KS, Tang GQ, Yamamoto RK, Ishibashi M, Yamamoto K, Honda T (1997) Evidence for genetic
linkage between the ure and trh genes in Vibrio parahaemolyticus J Med Microbiol 46(8):639-45.
5 Jia A, Woo NY, Zhang XH (2010) Expression, purifi cation, and characterization of thermolabile hemolysin (TLH) from
Vibrio alginolyticus Dis Aquat Organ, 90(2):121-7.
6 Luan XY, Chen JX, Zhang XH, Jia JT, Sun FR, Li Y (2007) Comparison of different primers for rapid detection of Vibrio
parahaemolyticus using the polymerase chain reaction Lett Appl Microbiol, 44(3):242-7
7 Marlina E, Radu S, Kqueen C Y, Napis S, Zakaria Z, Mutalib S A and Nishibuchi M (2007) Detection of tdh and trh genes
in Vibrio parahaemolyticus isolated from Corbicula moltkiana prime in West Sumatera, Indonesia Southeast Asian J Trop
Med Public Health, 38(2): 349-355.
8 Nishibuchi M, Kaper JB (1995) Thermostable direct hemolysin gene of Vibrio parahaemolyticus: a virulence gene acquired
by a marine bacterium Infect Immun 63(6):2093-9.
9 Tuyet DT, Thiem VD, Von Seidlein L, Chowdhury A, Park E, Canh DG, Chien BT, Van Tung T, Nafi cy A, Rao MR, Ali M, Lee H, Sy TH, Nichibuchi M, Clemens J and Trach DD (2002) Clinical, epidemiological, and socioeconomic analysis of an
outbreak of Vibrio parahaemolyticus in Khanh Hoa Province, Vietnam Infect Dis, 186(11):1615-1620.
10 Vesth T, Wassenaar T M, Hallin P F, Snipen L, Lagesen K and Ussery D W (2010) On the origins of a Vibrio species Microb
Ecol, 59:1-13.
11 Wang SX, Zhang XH, Zhong YB, Sun BG, Chen JX (2007) Genes encoding the Vibrio harveyi hemolysin (VHH)/thermolabile hemolysin (TLH) are widespread in vibrios Wei Sheng Wu Xue Bao, 47(5):874-81.
