Nghiên cứu nấm fusarium trên hạt lúa và ngô tại thái bình năm 2013 2014

nhiễm trên hạt một số giống 4.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố tới sự phát sinh gây hại của nấm 4.3.1 Ảnh hưởng của giống, thời vụ tới sự xuất hiện của nấm Fusarium... verticillioides đến

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀPTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

PHẠM VŨ KHIÊM

NGHIÊN CỨU NẤM FUSARIUM TRÊN HẠT LÚA

VÀ NGÔ TẠI THÁI BÌNH NĂM 2013 - 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng:

Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào khác

Mọi sự giúp đỡ cho công việc thực hiện luận văn này đã được cám ơn

và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Phạm Vũ Khiêm

LỜI CẢM ƠN

Để thực hiện được đề tài này, ngoài sự nỗ lực của bản thân tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Trần Nguyễn Hà – Bộ môn Bệnh cây - Khoa Nông học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã dành cho tôi sự chỉ dẫn và giúp đỡ tận tình trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu hoàn thành đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong bộ môn Bệnh cây - Khoa Nông học, những người đã trực tiếp giảng dạy trang bị những kiến thức bổ ích trong thời gian học tập, nghiên cứu

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn của mình đến tất cả các bạn bè, người thân và gia đình những người luôn bên cạnh động viên giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này

Hà Nội, ngày 05tháng 11 năm 2014

Tác giả

Phạm Vũ Khiêm

2.1 Lịch sử nghiên cứu Fusarium trên thế giới 4

2.1.1 Fusarium trong hệ sinh thái tự nhiên 4

2.2 Lịch sử nghiên cứu nấm Fusarium tại Việt Nam 12

3 VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 15

3.2 Phương pháp nghiên cứu 16 3.2.1 Nghiên cứu, xác định thành phần nấm hại trên hạt thóc và ngô giống 16 3.2.2 Phương pháp khử trùng dụng cụ và nuôi cấy nấm trong phòng

3.2.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nấm Fusarium spp đến

3.2.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm Fusarium spp trên lúa

3.2.5 Nghiên cứu khả năng xâm nhiễm của nấm Fusarium spp trên

lúa và ngô bằng phương pháp lây bệnh nhân tạo trong phòng thí

3.2.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của các biện pháp xử lý hạt giống lúa 24 3.2.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của các biện pháp xử lý hạt giống ngô 25 3.3 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu 26

4.1 Thành phần nấm gây hại trên hạt bị bệnh, mức độ nhiễm nấm

4.1.1 Thành phần nấm gây hại trên hạt bị bệnh trên mẫu hạt lúa, ngô 28

4.1.2 Mức độ nhiễm nấm Fusarium spp Trên các mẫu hạt lúa, ngô 30 4.2 Thành phần các loài Fusarium spp nhiễm trên hạt một số giống

4.3 Ảnh hưởng của một số yếu tố tới sự phát sinh gây hại của nấm

4.3.1 Ảnh hưởng của giống, thời vụ tới sự xuất hiện của nấm Fusarium

4.3.2 Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến sự phát triển của nấm

4.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nấm F verticillioides đến khả năng

4.4.3 Ảnh hưởng của mức nhiễm nấm F.verticillioides trên hạt ngô đến

phân bố của nấm F.verticillioides trên các bộ phận của hạt 55 4.4.4 Ảnh hưởng của ẩm độ hạt đến sự phát sinh và phát triển của nấm

4.4.5 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến phát triển của nấm

4.5 Nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết của nấm F.verticillioides đến

sự nảy mầm của hạt và phát triển của cây ngô con 64 4.6 Ảnh hưởng của các biện pháp xử lý đến khả năng nảy mầm và

mức độ nhiễm nấm Fusarium trên hạt thóc và hạt ngô 65 4.6.1 Ảnh hưởng của các biện pháp xử lý đến khả năng nảy mầm và

mức độ nhiễm nấm F.fujikuroi trên hạt giống lúa Hương thơm 1 65 4.6.2 Ảnh hưởng của các biện pháp xử lý đến khả năng nảy nầm của hạt

và mức độ nhiễm của nấm F.verticillioides trên hạt ngô HN88 67

4.8 Thành phần các loài Fusarium spp nhiễm trên hạt một số giống lúa 42 4.9 Thành phần các loài Fusarium spp nhiễm trên hạt một số giống ngô 44 4.10 Tỷ lệ nấm F fujikuroi gây hại trên hạt thóc ở các vụ sản xuất 47

4.11 Tỷ lệ nấm F.verticillioides gây hại trên hạt ngô ở các vụ sản xuất 49

4.12 Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến sự phát triển của nấm

4.13 Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến sự phát triển của nấm

4.14 Ảnh hưởng cuả nấm F fujikuroi đến khả năng nảy mầm trên hạt

4.15 Ảnh hưởng của nấm F.verticillioides đến sức nảy mầm của hạt

ngô theo các mẫu hạt có mức nhiễm khác nhau 55

4.16 Tỷ lệ xuất hiện nấm F.verticillioides trên các bộ phận của hạt ngô

4.17 Ảnh hưởng của ẩm độ hạt đến sự phát sinh và phát triển của nấm

4.18 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến phát triển của nấm

4.19 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến phát triển của nấm

4.20 Ảnh hưởng của mật độ bào tử nấm F.verticillioides đến khả năng

nẩy mầm của hạt và phát triển của cây con 64 4.21 Ảnh hưởng của các biện pháp xử lý đến khả năng nảy mầm và

mức độ nhiễm nấm F.fujikuroi trên hạt giống lúa Hương thơm 1 65 4.22 Ảnh hưởng của các biện pháp xử lý đến khả năng nảy mầm và

mức độ nhiễm nấm F.verticillioides trên hạt giống ngô HN88 67

DANH MỤC HÌNH

4.1 Tỷ lệ xuất hiện nấm Fusarium spp gây bệnh trên thóc giống 314.2 Mức độ nhiễm nấm Fusarium spp gây bệnh trên thóc thương phẩm 324.3 Tỷ lệ xuất hiện nấm Fusarium spp gây bệnh trên ngô giống 344.4 Mức độ nhiễm nấm Fusarium spp gây bệnh trên ngô thương phẩm 35

4.6 Chuỗi bào tử nhỏ của các loại nấm Fusarium phân lập được trên

4.7 Tản nấm F.verticiloides trên môi trường CLA 42

4.10 Thành phần các loài Fusarium spp nhiễm trên hạt một số giống ngô 45

4.12 Tỷ lệ nấm F fujikuroi gây hại trên hạt thóc ở các vụ sản xuất 48

4.13 Tỷ lệ nấm F.verticillioides gây hại trên hạt ngô ở các vụ sản xuất 49

4.14 Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến sự phát triển của nấm

4.15 Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến sự phát triển của nấm

4.16 Ảnh hưởng cuả nấm F.fujikuroi đến khả năng nảy mầm trên hạt

4.17 Nấm F.verticillioides trên trong nội nhũ và phôi 564.18 Ảnh hưởng của ẩm độ hạt đến sự phát sinh và phát triển của nấm

4.19 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến phát triển của nấm

4.20 Tản nấm F fujikuroi trên môi trường PGA, PCA, CLA 61

4.21 Tản nấm F fujikuroi trên môi trường WA 61

4.22 Đường kính tản nấm F verticillioides trên các môi trường khác nhau 634.23 Ảnh hưởng của các biện pháp xử lý đến khả năng nảy mầm và

mức độ nhiễm nấm F.fujikuroi trên hạt giống lúa Hương thơm 1 66

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Lúa (Oryza sativa L) và ngô (Zea mays L.) là hai loại cây lương thực

quan trọng trên thế giới, góp phần nuôi sống hàng tỷ người và đem lại nguồn thu nhập chủ yếu cho các nước nông nghiệp Việt Nam với đặc điểm khí hậu nhiệt đới gió mùa, mưa nhiều, ẩm độ cao, người Việt Nam có truyền thống canh tác lúa nước và ngô lâu đời rất thích hợp cho việc trồng hai loài cây trồng trên

Lúa được coi là cây lương thực chủ yếu, có ý nghĩa đáng kể trong nền kinh tế và xã hội Nghề trồng lúa chiếm khoảng 70% số lao động và 80% diện tích đất nông nghiệp cả nước Hiện nay, Việt Nam là nước xuất khẩu lúa gạo đứng thứ 2 trên thế giới Xuất khẩu lúa gạo góp phần quan trọng trong công cuộc xây dựng đất nước, làm thay đổi bộ mặt nông thôn Việt Nam, đồng thời khẳng định vị trí tiềm năng, ưu thế to lớn của nông nghiệp nước ta Bên cạnh

đó, ngô là cây lương thực đứng thứ hai sau lúa, là cây trồng quan trọng ở cả đồng bằng, trung du và miền núi Đặc biệt ngô là lương thực chính của những người dân tộc thiểu số sống ở vùng núi Việt Nam vì ở đó cây ngô dễ trồng và

dễ sống nhất

Tuy nhiên năng suất lúa và ngô ở nước ta không được ổn định, luôn bấp bênh theo từng mùa vụ, theo từng năm do khí hậu thời tiết bất thuận, do thiên tai, do dịch hại đặc biệt do các bệnh hại gây ra.Các bệnh có ý nghĩa quan trọng

đối với lúa có thể kể đến là bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia oryzae gây ra, bệnh lúa von do nấm Fusarium moniliforme, bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae, nhưng đến nay hầu như các dịch bệnh này đã bị dập tắt

do có nhiều loại thuốc BVTV đặc hiệu và áp dụng chương trình ICM (quản lý cây trồng tổng hợp) Tuy nhiên các nguồn bệnh vẫn còn tiềm ẩn ở trong hạt giống với các mức độ khác nhau tuỳ theo từng vùng, từng vụ và từng năm Đặc

biệt đối với nấm Fusarium hại lúa do chúng có khả năng sinh độc tố ảnh hưởng đến sức khoẻ của người tiêu dùng, như nấm F moniliforme sinh ra độc tố:

Fumonisin, moniliformin, beauvere,… trong đó chất Fumonisin (Gelderblom et al., 1988) được tổ chức Y tế thế giới (WHO) xếp vào nhóm 2B là nhóm có khả năng gây ung thư Các bệnh quan trọng trên ngô bao gồm: Bệnh ung thư ngô

(Ustilago maydis), đốm lá lớn (Helminthosporium turicum), bệnh đốm lá nhỏ (Helminthosporium maydis), bệnh thối thân, thối bắp (Fusarium), bệnh thối thân (Diplodia sp.) và các bệnh mốc hạt do nấm Aspergillus sp., Penicillium sp.,… gây nên Trong đó nấm Fusarium là loài nấm gây hại phổ biến ở trên ngô

ở những vùng trồng ngô, nó gây ra hiện tượng thối rễ, thối gốc, thối thân, thối bắp làm hạt ngô bị thối đen (khi bị nhiễm nặng) không bảo quản được Loài nấm này không chỉ gây hại trên ngô và hạt ngô mà chúng còn sinh ra một số độc tố như Zearelenone, Vomitoxin,…Những độc tố này rất có hại cho con người và gia súc khi sử dụng những sản phẩm của ngô bị nhiễm loại nấm này làm thực phẩm

Chính vì vậy chúng ta không thể chủ quan không đề phòng vì chỉ cần gặp điều kiện thuận lợi là các bệnh này sẽ bùng phát, gây tổn thất lớn cho sản xuất, không những ảnh hưởng đến lợi ích kinh tế của người dân mà còn ảnh hưởng đến kế hoạch lương thực của cả nước

Xuất phát từ thực tiễn đó, để góp phần vào công tác phòng chống bệnh hại do nấm Fusarium gây ra trên lúa và ngô, đồng thời giúp nâng cao năng

suất chất lượng sản phẩm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên

cứu nấm Fusarium trên hạt lúa và ngô tại Thái Bình năm 2013 - 2014”

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích

- Điều tra xác định thành phấn, mức độ phổ biến và đặc điểm sinh học

của nấm Fusarium trên các mẫu hạt lúa và ngô tại Thái Bình

1.2.2 Yêu cầu

- Điều tra xác đích thành phần nấm Fusarium gây hại trên các mẫu hạt

giống lúa và ngô thương phẩm

- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của loài nấm Fusarium phổ biến trên hạt lúa và ngô

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nấm Fusarium đến sự nảy mầm của hạt giống

- Khảo sát hiệu quả một số biện pháp xử lý hạt giống đến mức độ

nhiễm nấm Fusarium

2 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

TRONG NƯỚC VÀ THẾ GIỚI

2.1 Lịch sử nghiên cứu Fusarium trên thế giới

2.1.1 Fusarium trong hệ sinh thái tự nhiên

Có rất ít thông tin về sự xuất hiện của các loài nấm Fusarium trong hệ sinh thái tự nhiên

Qua kết quả nhiên cứu của Stoner (1981) đã miêu tả sự xuất hiện của các loài nấm Fusarium trong đất trồng trọt trong sự khác nhau về môi trường

như: Rừng, đồng cỏ, sa mạc và đầm lầy Số các loài nấm Fusarium đã được tìm thấy có liên quan với đất trồng trọt Các loài Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium roseum là xuất hiện nhiều nhất Các loài Fusarium

đã được ghi nhận là số nấm quan trọng của đồng cỏ và thảo nguyên Chúng xuất hiện nhiều hơn trên đồng cỏ và vùng rừng mở sau đó mới đến rừng đóng, rừng nguyên sinh và đầm lầy Trước tiên là cộng đồng cây trồng tiếp đến sinh thái học, phân bố không gian, sự tương tác qua lại và môi trường đất đã chi phối việc xuất hiện và phân bố của các loài nấm

Theo những nghiên cứu gần đây của tác giả Caretta et al (1999) trên

quần thể nấm trên đồng cỏ tự nhiên ở Kenya của tác giả Caretta đã xác định

được 92 dạng trong trong 52 giống từ 26 loài cỏ Fusarium chlamydosporium Wollenweb & Reink.; Fusarium equiseti (Corda) Sacc.; Fusarium avenaceum (Corda) Sacc được tìm thấy trong số các loài Fusarium chiếm tỷ

lệ riêng rẽ trong số mẫu cỏ đã lấy là: 19%, 23% và 4% Theo Claridge, Dawah, Wilson (1997) cũng đã chỉ ra rằng các dòng Fusarium tìm thấy từ cây đại kích là nguyên nhân gây hại kinh tế có ý nghĩa (làm mất năng suất lên tới 92%) ở vùng cỏ ở Bắc Mỹ, bằng chứng chứng minh rằng các loài Fusarium

có khả năng xuất hiện và phát triển ở các vùng đất không canh tác

Sự xuất hiện của các loài nấm Fusarium trong đất đồng cỏ và đất rừng

từ các vùng khí hậu khác nhau của Úc đã được tác giả Burgess et al nghiên

cứu kỹ lưỡng đã xác định được 15 loài Fusarium từ đất đồng cỏ ở Tây Úc dựa trên số vùng rộng lớn trồng trọt Sự xuất hiện của chúng có liên quan giữa

thời tiết và mối quan hệ phong phú của một số loài Fusarium oxysporum; Fusarium equiseti (Fusarium solani; Fusarium semitectum) đã được tìm thấy

ở tất cả các vùng khí hậu Tuy nhiên, một số loài đã tìm thấy xuất hiện hạn

chế trong một vùng khí hậu nhất định Ví dụ: Fusarium longipes; Fusarium beomiforme chỉ tìm thấy ở vùng khí hậu nhiệt đới và Fusarium sambucinum

chỉ tìm thấy ở vùng núi cao và vùng có khí hậu lạnh Nghiên cứu của Burgess and Summerell (1992) đã phát hiện thấy các loài nấm Fusarium phát hiện từ đất cỏ, đất rừng và đất rừng trồng ở Queenland Từ những kết quả nghiên cứu trên cho thấy rằng Fusarium phát hiện ở đất cỏ phong phú hơn đất rừng trồng

và đất rừng

2.1.2 Tác hại của nấm Fusarium

Fusarium Link ex Fr là một trong những chi nấm quan trọng nhất về mặt kinh tế Theo những nghiên cứu của Burgess (1981) Các loài Fusarium phân bố rộng khắp ở hầu hết các vùng địa lý khác nhau trên thế giới Chi nấm

Fusarium bao gồm các loài hoại sinh, nội ký sinh và cả các loài ký sinh gây hại thực vật Cũng một nghiên cứu khác của Burgess et al (1994) cho thấy

chúng là nguyên nhân gây ra rất nhiều loại bệnh cây trong đó có thối rễ, cổ rễ,

thân, sẹo, cháy bông, thối bắp và các bệnh héo Theo tác giả Moore et al (2001) thì các bệnh héo do các dạng chuyên hoá thuộc loài Fusarium oxysporum gây ra trên rất nhiều loài thực vật thuộc nhiều họ khác nhau Ví dụ: Bệnh Panama trên chuối do Fusarium oxysporum Schlecht f sp Cubense (E F Smith) Snyd & Hans và héo trên bông do Fusarium oxysporum f sp vasinfectum (Atk.) Snyd & Hans đã gây thiệt hại to lớn cho ngành công

nghiệp bông ở Australia

Bệnh lụi bông ngũ cốc vụ đông do Fusarium graminearum Schwabe

(Gibberella zeae (Schwabe) Petch) gây thiệt hại nghiêm trọng ở nhiều nơi

trên thế giới mà những nơi đó có phong tục canh tác không làm đất khi trồng

trọt (Krebs et al 2000) Thối bắp và thối thân ngô do nấm Fusarium verticillioides, Fusarium subglutinans và Fusarium proliferatum (Matsush.)

Nirenberg gây ra đã được phát hiện ở hầu hết các vùng trồng ngô trên khắp thế giới Theo kết quả nghiên cứu của Ploets (2001) thì bệnh bệnh biến dạng

quả xoài là bệnh duy nhất gây hại nặng trên cây xoài do Fusarium subglutinans gây ra làm giảm năng suất quả tới 80% ở Ấn Độ và 90% ở một

biểu hiện triệu chứng ra bên ngoài

Bệnh đã gây thiệt hại về kinh tế rất đáng kể, đã có những ước tính thiệt hại

năng suất do nấm Gibberella fujikuroi gây bệnh lúa von ở một số vùng như

Hokkaido (Nhật Bản) có khoảng 20% sản lượng lúa bị mất, nơi thiệt hại cao nhất

là vùng Kinki - Chugoku (Nhật Bản) sản lượng lúa bị mất lên tới 40 - 50% Ở những vùng phía Đông Uttar Pradesh (Ấn Độ) bị giảm tới 15% sản lượng lúa, những vùng phía Bắc Thái Lan sản lượng lúa bị mất khoảng 3,7 tới 14,7% (Ou, 1985) Còn ở những vùng Đông Nam Á (Châu Á), bệnh lúa von thường xuyên xuất hiện, gây hại nhưng ở tỷ lệ xuất hiện bệnh thấp: ở tỉnh Laguna (Philippin) với

giống lúa IR 42 sản lượng lúa bị mất khoảng 1- 13% (Nuque et al.,1980)

2.1.3 Phân loại

Fusarium được mô tả đầu tiên bởi Link (1809) là loài với các bào tử

dạng hình thoi không có vách ngăn sinh ra từ stroma Đây là chi vô tính được xác nhận bởi Fries (1821) trong điều khoản của ngân hàng bệnh cây IBCN Khi đi sâu nghiên cứu xác định đặc điểm hình thái nấm sự xuất hiện bào tử

lớn với các tế bào cuối hình bàn chân là nét đặc sắc quan trọng của chi thay vì

sự có mặt của stroma (Booth C, 1971)

Lịch sử phân loại Fusarium không ổn định Trong thế kỷ đầu tiên sau

khi chi được thành lập , hơn 1.000 loài đã được xác định trên cơ sở quan sát

bề ngoài và dựa vào phạm vi ký chủ (Toaussoun and Nelson, 1975) Và một

trăm năm sau có rất nhiều loài nấm trong chi Fusarium đã được định tên

Những loài nấm này thường được mô tả một cách không đầy đủ, chỉ dựa vào việc quan sát bào tử được sinh ra trong tế bào cây bệnh chứ không phải từ

việc nuôi cấy thuần khiết trên môi trường nhân tạo (Nelson et al 1983) Từ đó

dẫn đến có rất nhiều tên khác nhau đặt tên cho một loài nấm Cho tới đầu những năm 1900 đã có hơn 100 loài, giống và dạng đã được các tác giả mô tả

(Taylor et al 2000)

Theo chẩn đoán của Link, những nghiên cứu đầu tiên về Fusarium

tập trung vào việc xác định, chẩn đoán và liệt kê các loài gây bệnh thực vật Một điểm chung là phân lập nấm từ các cá thể loài thực vật đại diện cho cá thể loài nấm Có nhiều loài, nhiều đề xuất đặc biệt, và nhiều môi trường cho việc chẩn đoán, xác định chủng và loài rất phức tạp Trong vòng một thời gian tương đối ngắn một số lượng lớn (>1000) các loài

Fusarium được mô tả Giai đoạn nhầm lẫn này kéo dài tới giữa những năm

1930 khi nghiên cứu Wollenweber & Reinking’s cải tiến khái niệm về các loài trong chi này và cung cấp hướng dẫn xác định các ký chủ độc lập dựa trên đặc trưng của các chủng có liên quan

Wollenweber, được coi là người tiên phong của việc phân loại nấm

Fusarium hiện đại nhất làm việc tại Viện quản lý đất và rừng Hoàng gia Đức

đã giám định lại một số lượng lớn các loài nấm Fusarium trong một thời gian dài Ông đã tiến hành lấy mẫu và nuôi cấy các loài nấm Fusarium trên nhiều

loại môi trường khác nhau để nghiên cứu các đặc tính hình thái của chúng

Qua nghiên cứu sâu như vậy ông đã dần dần giảm số loài nấm Fusarium

thông qua quá trình loại bỏ và hợp nhất các loài nấm cùng loài mà khác tên với nhau (Appel, Wollenweber, 1910) Những nghiên cứu của ông cuối cùng cũng được xuất bản thành cuốn sách “Die Fusarien” năm 1935 cùng với đồng tác giả O.A.Reiking Họ đã xác định được 65 loài, 55 giống và 22 dạng và

phân chia chúng theo 16 nhóm (Nelson et al, 1994)

Kể từ đó, phân loại Fusarium đã trải qua nhiều tranh cãi và thay đổi dẫn

đến nhiều hệ thống phân loại khác nhau Một trong những hệ thống phân loại

ra đời đã gây nhiều tranh cãi và thay đổi trong việc phân loại nấm Fusarium là

hệ thống phân loại của Snyder và Hasen ra đời (Snyder and Hasen, 1940,

1941, 1945) Trong hệ thống này số lượng loài Fusarium trong 16 nhóm của

Wollenweber và Reinking đã giảm xuống còn 9 loài Đóng góp lớn nhất của Snyder và Hasen là việc giới thiệu phương pháp cấy đơn bào tử để tạo được những mẫu nấm thuần rất thuận tiện cho việc giám định bằng hình thái và kết quả giám định chính xác và có độ tin cậy rất cao Việc sử dụng hệ thống phân loại này đã dẫn đến việc bỏ qua nhiều thông tin từ những nghiên cứu trước đây về bệnh và sinh thái học của Fusarium Song song với những nghiên cứu

đã được công bố của Snyder và Hasen, một số hệ thống phân loại Fusarium

khác đã ra đời Messiaen and Cassini (1968) đi theo hệ thống phân loại của Snyder và Hasen với 9 loài và 9 giống

Theo nghiên cứu của tác giả Raillo (1950) công nhận 55 loài nấm Fusarium, 10 chủng (dưới loài), 55 giống, 61 dạng thuộc 17 nhóm và 12 dưới nhóm (nhóm phụ) Bà cho rằng dạng của tế bào đỉnh bào tử là một đặc tính quan trọng cho việc xác định loài Tiếp theo công việc của Raillo, Bilai đã sửa

chữa lại hệ thống phân loại Fusarium và chia chi này thành 9 nhóm gồm 26 loài và 29 giống Hệ thống phân loại Fusarium của Raillo và Bilai không được

biết đến nhiều và không được sử dụng rộng rãi như các hệ thống phân loại

nấm Fusarium khác

Hệ thống phân loại của Booth (1971) là sự dung hòa giữa hai hệ thống

phân loại nấm Fusarium của Wollenweber, Reinking và Snyder, Hasen (1940,

1941, 1945) Sự đóng góp lớn nhất của Booth là sự phát hiện tế bào sinh bào

tử để dựa vào đó làm cơ sở cho việc định loại các loài nấm của Fusarium Các tiêu chí này cho phép phân biệt các loài sản sinh ra các bào tử nhỏ một cách đáng tin cậy hơn bởi vì đặc tính này khá ổn định trên các môi trường khác

nhau và dưới các điều kiện môi trường khác nhau (Nelson et al, 1994)

Giai đoạn hữu tính (Giai đoạn quả thể) của 28 loài Fusarium đã được

Booth (1981) liệt kê tập trung ở 3 chi: Gibberella Sacc., Calonectria de Not

Và Nectria Fries (Booth C, 1981) Tuy nhiên giai đoạn hữu tính của một số

loài nấm Fusarium có tầm quan trọng về kinh tế như: Fusarium oxysporum và Fusarium culmorum vẫn chưa tìm thấy Gibberella là chi hữu tính phổ biến

nhất của rất nhiều loài nấm Fusarium Chi này do Sacardo đưa ra năm 1877

và được xác định bằng quả thể mà đen hoặc màu xanh đậm Hầu hết các loài Gibberella được mô tả ở cuối thế kỷ 19 và đầu thế kỷ 20 đều dựa vào những quả thể lấy từ các cây gỗ trong tự nhiên Theo hai nhóm tác giả Dejardins

(2003) và Samuel et al (2001) qua kết quả nghiên cứu đã cho rằng rất nhiều

trong số chúng vẫn chưa được kiểm tra lại Gần đây, một khóa học phân loại các loài Gibberella đã được Samuels công bố và xuất bản thành sách với 21 loài chính

Khái niệm loài trong phân loại nấm Fusarium

Cũng trong công trình nghiên cứu của mình tác giả Leslie et al (2001)

đã cho rằng những thay đổi trong phân loại chi nấm này đã liên tục xảy ra kể

từ khi việc áp dụng khái niệm loài sinh học và loài phát sinh trở nên quan trọng Sự kết hợp của khái niệm loài hình thái, loài sinh học và loài phát sinh

đã làm nên một khái niệm loài trong phân loại nấm Fusarium

Khái niệm loài hình thái:

Khái niệm loài hình thái được coi là khái niệm phổ biến nhất mà các nhà khoa học và các nhà sinh học nói chung sử dụng (Mayden RL, 1997)

Theo nghiên cứu của các tác giả Taylor et al (2000) đã cho rằng hầu hết các

loài nấm được mô tả dựa vào đặc tính hình thái Các đặc tính hình thái được

sử dụng cho việc phân loại các loài Fusarium bao gồm kích thước và hình

dạng bào tử, dạng hình thành bào tử, loại cành bào tử, sự có mặt của hậu bào

tử và các đặc tính thứ cấp như: màu sắc và hình thái tản nấm

Khái niệm loài sinh học:

Kết quả nghiên cứu của các tác giả Mayr E (1940), (1963) đã nghiên cứu sâu về các loài sinh học Loài sinh học là loài “nhóm các quần thể tự nhiên mà các cá thể giao phối hoặc có khả năng giao phối nhau và không có khả năng sinh sản với các nhóm quần thể khác” Một nghiên cứu khác của các

tác giả Taylor et al (2000) thì cho rằng khái niệm loài sinh học có vai trò quan

trọng trong nấm học và đã được áp dụng để phân biệt giữa các loài khác nhau

về di truyền mà đặc điểm hình thái không thể phân biệt được Khái niệm loài

sinh học được áp dụng rộng rãi trong nhóm nấm có tên gọi “Gibberella fujikuroi complex” thuộc chi Fusarium

Khái niệm loài phát sinh:

Có nhiều định nghĩa khác nhau về loài phát sinh (Phylogenetic), nhưng định nghĩa được sử dụng nhiều nhất là của Cracraft (1983), trong đó loài phát sinh được định nghĩa là “nhóm cá thể sinh vật nhỏ nhất có thể phân loại được

mà trong đó có mẫu hình cha mẹ của tổ tiên và dòng dõi” Theo kết quả nghiên cứu của các tác giả O’Donnell K, Cigelnik E (1997); O’Donnell K, Gray

LE (1995); O’Donnell K, Cigelnik E, Nirenberg H (1988a) và nghiên cứu của

các tác giả Steenkamp et al (2000) cho rằng khái niệm loài phát sinh đã được sử dụng trong phân loại nấm Fusarium trong khoảng 10 năm và hầu hết các nghiên cứu đều tập trung vào Fusarium oxysporum, Fusarium solani và đặc biệt là

“Gibberella fujikuroi complex” số lượng loài trong Gibberella fujikuroi complex

đã tăng lên gấp 3 lần kể từ khi khái niệm loài phát sinh được áp dụng Tên gọi

“Gibberella fujikuroi complex” được sử dụng như một tiện lợi trong quá trình

nghiên cứu và phân loại các loài nấm Fusarium

2.1.4 Độc tố của nấm

Một số nhóm độc tố quan trọng do nấm Fusarium sản sinh ra là

Fumonisins (Fumonisin B1, Fumonisin B2, Fumonisin B3) Trong kết quả nghiên cứu của các tác giả Marasas WFO, Miller JD, Riley RT, Visconti A (2001b); Nelson PE Desjardins AE, plattner RD (1993) chúng đã được chứng

minh là có khả năng gây bệnh Equine leucoencephalomalacia cho ngựa, ung

thư gan ở chuột, và hội chứng sưng phổi ở lợn Một số nghiên cứu dịch tễ học của nhóm tác giả Marasas WFO, Nelson PE, Toussoun TA (1984) cũng phát

hiện ra rằng Fumonisins có liên quan đến bệnh ung thư thực quản ở người

Một số loại độc tố như: Fusaric acid, 5-(butyl)-2-pyridinecarboxylic

acid là một trong những độc tố phổ biến nhất do một số loài nấm Fusarium sản sinh ra như: Fusarium verticiloides (Sacc.) Nirenberg, Fusarium subglutinans (Matsush) Nirenberg, Fusarium oxysporum, Fusarium protiferatum (Matsush) Nirenberg Fusaric acid có tác động hóa học rất lớn

đối với hệ thần kinh và có thể ảnh hưởng đến hệ sinh sản, sự sinh trưởng và các hoạt động của động vật (Leslie JF và các cộng tác viên, 1990)

Một loại độc tố khác là moniliformin là loại độc tố có tính độc rất cao

do một số loài nấm Fusarium sản sinh ra như Fusarium oxysporum, Fusarium protiferatum, Fusarium semitectum , Fusarium subglutinans Độc tố này có

thể tìm thấy trong tự nhiên, thấy cả trong thức ăn và trên cả các sản phẩm dùng làm thức ăn gia súc (Leslie JF, Pearson CAS, Nelson PE, Toussoun TA, 1990) Kết quả nghiên cứu khác của nhóm tác giả Marasas WFO, Miller JD, Riley RT, Visconti A (2001b) cho thấy độc tố Deoxynivalenol được sản sinh

ra từ một số loài nấm gây hại trên ngũ cốc như: Fusarium graminearum và Fusarium culmorum và một số loài khác, là một loại độc tố có ảnh hưởng

mạnh nhất khi tiếp xúc với cơ thể con người Zearalenon là một loại độc tố

khác của nấm Fusarium có thể gây ra hiện tượng vô sinh cho động vật đã

được phát hiện trên nhiều cây trồng nông nghiệp Zearalenon do các loài nấm

F graminearum, F culmorum, F equiseti và F crookwellens sản sinh ra

2.2 Lịch sử nghiên cứu nấm Fusarium tại Việt Nam

Ở Việt Nam nấm Fusarium đã được rất nhiều nhà khoa học nghiên cứu Theo Nguyễn Đức Trí (1992 - 1993), nấm gây bệnh mốc hồng trên hạt ngô, gây chết khô thân ngô và bó cờ ngô

Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Đức Trí – Nguyễn Hồng Nga (1995) cho thấy tất cả các giống ngô trồng ở đồng bằng sông Hồng đều nhiễm

bệnh do nấm Fusarium moniliforme Giai đoạn trỗ nhiễm bệnh nặng nhất và

gây hại từ khi cây đã trỗ cho đến khi thu hoạch Các giống ngô đều nhiễm bệnh khô thân gây hiện tượng thối khô thân, cây sinh trưởng kém, cây và thân

bị dị hình, bắp chín ép, bệnh nặng gây hiện tượng cây đổ gục và chết Những nghiên cứu về sự phân bố của nấm ở tất cả các vùng địa lý và có mặt ở tất cả phần trên mặt đất của cây ngô, do vậy tỷ lệ xuất hiện bệnh của hầu hết các giống ngô chịu ảnh hưởng trước tiên là điều kiện bảo quản Bảo quản hạt ẩm

là điều kiện gây bệnh và sản sinh ra hàm lượng độc tố cao

Khi nghiên cứu về đặc điểm sinh học của nấm Fusarium moniliforme

và một số loài nấm Fusarium sp gây hại cây trồng, cây cảnh và cỏ dại vùng

Hà Nội, Đỗ Tấn Dũng (1996) đã mô tả nấm F moniliforme có rất nhiều bào

tử nhỏ hình chuỳ một đầu bằng, trong, đơn bào, bào tử lớn thon dài, hơi cong,

đa bào, có từ 3 – 5 vách ngăn ngang, đầu hơi thon nhọn, đuôi hình bàn chân

và không hình thành hậu bào tử Nấm còn gây bệnh lúa von, những cây lúa bị bệnh, rễ thường mọc ngược, cây mọc cao vồng, yếu ớt, là xanh nhạt (Vũ Triệu Mân và ctv (2007)

Năm 1999, Ngô Bích Hảo kết hợp với Viện Nghiên cứu bệnh hạt giống Đan Mạch điều tra giám định thành phần bệnh hạt giống ngô sản xuất ở trong nước và nhập khẩu cho thấy các loài nấm phổ biến trên hạt giống ngô gồm có:

Fusarium moniliforme, F.graminearum, F.subglutinans, Acremonium strictum, Bipolaris maydis, Penicillium sp và Aspegillus sp

Tác giả Nguyễn Đức Trí (1995) cũng cho thấy nấm Fusarium gây hại

trên cây có phạm vi tồn tại rộng khắp và tồn tại trong đất ở nhiều dạng khác nhau Mặt khác, thành phần và mức độ phân bố của nấm Fusarium trong đất

có liên quan chặt chẽ tới sự xuất hiện và mức độ gây bệnh trên cây ở mỗi

vùng sinh thái trồng trọt khác nhau Tám loài Fusarium đã được xác định tồn

tại trong đất rau màu ở một số khu vực trồng rau phía Bắc trong đó có

Fusarium moniliforme, Fusarium solani, Fusarium oxysporum đã được xác

định từ trước Fusarium proliferatum, Fusarium compactum, Fusarium semitectum, Fusarium equisete và Fusarium subglutinans là những loài đầu

tiên được xác định có mặt ở Việt Nam Ba loài đầu phân bố rộng, 5 loài sau xuất hiện chủ yếu vùng đồng bằng

Bệnh do nấm Fusarium moniliforme gây ra rất phổ biến trên nhiều cây

trồng quan trọng ở Việt Nam đặc biệt là cây thuộc họ hoà thảo Nấm đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu nhưng chưa đưa ra những thiệt hại cụ thể về kinh tế do nấm bệnh gây ra Nghiên cứu về mức độ nhiễm bệnh mốc hồng trên một số giống ngô, Nguyễn Đức Trí và Nguyễn Hồng Nga (1995) đã thử nghiệm trên các giống ngô TSB2, VM1, MSB49 và thấy giống TSB2 có tỷ lệ xuất hiện bệnh mốc hồng cao nhất là 34% sau đó đến giống VM1 nhiễm 22%

và giống bị nhiễm thấp nhất là MSB49 khoảng 10%

Cũng theo một nghiên cứu khác của Nguyễn Đức Trí (1992 - 1993) đã

chỉ ra rằng Fusarium là loại nấm có thành phần loài rất phong phú gây hại trên

rất nhiều cây trồng và trên rất nhiều vị trí khác nhau Bệnh khô thân ngô, bệnh vết xám cành quýt, thối khô quả đậu đen, chết đen ngọn nhãn, bệnh thối khô hoa và đốm lá hoa cúc là những bệnh đầu tiên được xác định gây hại ở vùng đồng bằng sông Hồng Kết quả xác định bệnh xuất hiện trên 10 cây ký chủ

khác nhau đã chỉ ra hai loài nấm mới Fusarium logipes, Fusarium semitectum

lần đầu tiên được xác định gây hại ở Việt Nam

Một nghiên cứu khác về Fusarium gây bệnh héo rũ trên cây chuối ở

Việt Nam đó là tác giả Nguyễn Văn Kiêm, Đỗ Năng Vịnh, Lê Huy Hàm

(2000) kết quả cho thấy có hai giống chuối Tây và chuối Cơm rất mẫn cảm với bệnh Các tác giả cũng tiến hành lây bệnh nhân tạo trong nhà lưới kết quả cho thấy các giống chuối Tây và chuối Cơm là những giống rất mẫn

cảm với bệnh héo rũ do nấm Fusarium Khả năng gây bệnh của các nhóm

nấm VCG 0124, VCG 0124/5 ở giống chuối Tây và chuối Cơm lá là không đáng kể Cũng như trong một công bố khác của các tác giả Nguyễn Văn Kiêm, Đỗ Năng Vịnh, Chu Bá Phúc, Lê Huy Hàm (2000) nghiên cứu về

trường hợp dinh dưỡng và phân bố của các chủng Fusarium oxysporum f

sp cubense cho thấy nấm gây bệnh héo rũ chuối ở một số tỉnh miền Bắc

thuộc chủng I, nhóm nấm VCG 0124, VCG 0124/5, VCG 0125, VCG 0124/5, VCG 0124 – 0124/5 – 0125

Theo nhóm tác giả Nguyễn Đức Huy, Trần Nhật Dũng, Phạm Thị Hoa

và Trần Thị Hưng (2002) nghiên cứu về việc sử dụng thuốc hoá học xử lý cho

nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von thì cho biết sau 14 ngày thuốc

Cabendazim có hiệu quả cao trong phòng chống và ngăn cản sự lây lan của nấm từ nguồn hạt giống ra ngoài đồng ruộng

3 VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu

- Các mẫu hạt được thu thập tại Thái Bình và các vùng phụ cận

• Mẫu thóc

1 BC15 An Mỹ - Quỳnh Phụ - Thái Bình

2 Q5 Đông Phương - Đông Hưng - Thái Bình

3 Hương Thơm 1 An Hòa - An Dương – Hải Phòng

4 Nếp 97 Lưu Kiếm - Thủy Nguyên – Hải Phòng

5 D.Ưu 527 Hải Bắc - Hải Hậu – Nam Định

6 Nhị ưu 63 Hải Minh – Hải Hậu – Nam Định

• Mẫu ngô

3 HN88 Tân Lập – Vũ Thư – Thái Bình

4 LVN4 Thắng Thủy - Vĩnh Bảo - Hải Phòng

5 AG59 Quyết Tiến - Vĩnh Bảo - Hải Phòng

- Dụng cụ thí nghiệm : Ống nghiệm, đĩa Petri, cốc đong, bình tam giác, panh, dao cắt mẫu, bình thuỷ tinh, đũa thủy tinh, bình tia, vải màn lọc, phễu, que cấy, bơm môi trường, cân tiểu ly, tủ định ôn, tủ lạnh, tủ lạnh âm sâu, bếp điện, nồi hấp, máy ly tâm, máy khuấy từ, buồng cấy

- Hoá chất Agar, đường Glucose, cồn 70o, cồn 96o, Streptomycin sulfate, Dichloran, Neomycin sulfate, nước cất, nước cất vô trùng,…

- Các môi trường nuôi cấy nấm : PGA, WA, PCA, RLA, CA, CMA

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu

- Phòng thí nghiệm Trung tâm bệnh cây nhiệt đới - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

- Một số cơ sở sản xuất nông nghiệp tại Thái Bình và một số vùng phụ cận: Nam Định, Hải Phòng

3.1.3 Nội dung nghiên cứu

- Điều tra xác định thành phần nấm gây hại trên hại thóc, ngô ở Thái Bình và phụ cận

- Điều tra mức độ phổ biến của nấm Fusarium trên hại thóc, ngô ở Thái Bình và phụ cận

- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, đặc điểm hình thái của một số loài nấm Fusarium phân lập từ hạt thóc, ngô bị nhiễm nấm thu thập từ các vùng trồng lúa, ngô trên các môi trường WA, PGA, CLA, PCA

- Khảo sát tính gây bệnh của các loài Fusarium đã phân lập được từ các mẫu bệnh trên hạt thóc, ngô ở giai đoạn hạt trước gieo, sau gieo và giai đoạn lúa mạ, cây ngô con

- Thử nghiệm một số phương pháp phòng trừ nấm Fusarium hại lúa, ngô trong sản xuất và trong bảo quản

3.1.4 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 7/2013 đến tháng 7/2014

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Nghiên cứu, xác định thành phần nấm hại trên hạt thóc và ngô giống

3.2.1.1 Phương pháp lấy mẫu

Mỗi mẫu hạt được dàn đều trên khay, lấy hạt ngẫu nhiên theo phương pháp 5 điểm chéo góc

Các mẫu thu thập được chia thành ba mức khác nhau:

Mức nhiễm nhẹ: Quan sát hạt thóc, ngô bằng mắt thường, chọn những hạt mẩy, sáng, trên bề mặt hạt có 1 đến 2 chấm bệnh (diện tích hạt bị biến màu <10%)

Mức nhiễm trung bình: Quan sát hạt thóc bằng mắt thường, chọn những hạt trên bề mặt có 10 - 40% diện tích hạt bị biến màu

Mức nhiễm nặng: Quan sát hạt thóc và ngô bằng mắt thường, chọn những hạt trên bề mặt có nhiều chấm bệnh số chấm bệnh trên hạt chiếm 2/3 hạt (diện tích hạt bị biến màu >40%)

3.2.1.2 Phương pháp kiểm nghiệm hạt giống

Sử dụng phương pháp giấy thấm:

+ Lấy 400 hạt/1 mẫu chia thành 16 phần, mỗi phần 25 hạt

+ Chuẩn bị đĩa Petri và giấy thấm (Blotter paper) đường kính 9cm, lấy

12 đĩa/ mẫu Hộp petri rửa sạch, khử trùng bằng cồn

+ Lấy 3 tờ giấy thấm nhúng vào nước cất sao cho toàn bộ giấy thấm được thấm ướt đều, sau đó đặt vào hộp Petri (3 tờ/ hộp)

+ Cách đặt hạt: Đặt 25 hạt/ đĩa Petri, đặt thành 3 vòng Vòng ngoài 15 hạt, vòng giữa 9 hạt, và 1 hạt trung tâm của đĩa, khoảng cách giữa các hạt và các vòng bằng nhau Sau khi đặt xong ghi mã số hoặc tên mẫu giống, ngày đặt

và ngày kiểm tra trên mặt đĩa Để mẫu hạt trong điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ thích hợp 20 – 25 oC, ánh sáng đèn huỳnh quang hoặc đèn cực tím, chiếu sáng

12 giờ tối xen kẽ 12 giờ sáng Sau 7 ngày đem kiểm tra hạt dưới kính hiển vi soi nổi, soi lần lượt từ vòng ngoài vào vòng trong tâm đĩa Dùng que khêu nấm ra lam kính để soi, quan sát hình thái, màu sắc của bào tử phân sinh để xác định thành phần nấm bệnh

Sau khi kiểm tra tiến hành đếm số hạt nhiễm bệnh do nấm

Fusarium spp., từ đó tính tỷ lệ hạt bị nhiễm bệnh

- Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ xuất hiện nấm (%) Mức độ nhiễm nấm

Fusarium spp trên các mẫu hạt giống và hạt thương phẩm So sánh mức độ

nhiễm giữa 2 mẫu này

3.2.1.3 Phương pháp phân lập, giám định mẫu hạt thóc bị bệnh

- Phân lập các nấm từ hạt thóc bị bệnh theo phương phương pháp phân lập trên môi trường nhân tạo (Agar plate method) Môi trường được dùng để phân lập nấm là môi trường WA, CLA

Sau khi thu được mẫu hạt thóc bị bệnh, dùng cồn 700 khử trùng bề mặt hạt trong vòng 10 - 15 phút, cho những hạt đã khử trùng vào ống nghiệm đựng 10 ml nước cất vô trùng (mỗi một ống nghiệm chỉ bỏ được tối đa là 25 hạt) Ngâm hạt trong nước cất vô trùng khoảng 12 giờ Sau đó gạn hết nước, dùng giấy thấm vô trùng thấm khô hạt Đặt hạt lên môi trường WA, mỗi đĩa đặt 25 hạt, đặt hạt theo vòng tròn Để đĩa môi trường đã cấy hạt dưới dàn đèn trong phòng nuôi cấy nấm

- Giám định nấm: Môi trường dùng để giám định nấm là môi trường CLA, PGA

Hạt thóc bị bệnh cấy trên môi trường WA, quan sát thấy sợi nấm bắt đầu xuất hiện trên bề mặt môi trường và bề mặt hạt, dùng que cấy vô trùng cắt phần đỉnh của sợi nấm chuyển sang môi trường mới – môi trường thích hợp cho nấm (PGA, CLA) Môi trường CLA là môi trường kích thích sinh bào tử của một số nấm gây bệnh Còn môi trường PGA kích thích sợi nấm phát triển

ta có thể xem màu sắc tản nấm, cách mọc của sợi nấm

Khi bào tử xuất hiện trên môi trường CLA, dùng que cấy khều một ít bào tử của nấm đó ra một chiếc lam kính sạch, đậy lamen rồi đưa lên kinh hiển vi quan sát và giám định

3.2.1.4 Phương pháp phân lập, giám định mẫu hạt ngô bị bệnh

- Phân lập các nấm từ hạt ngô bị bệnh trên môi trường nhân tạo (Agar plate method) Môi trường được dùng để phân lập nấm là môi trường WA Sau khi thu được mẫu hạt ngô bị bệnh, dùng cồn 700 khử trùng bề mặt

hạt trong vòng 1 phút, cho những hạt đã khử trùng vào ống nghiệm đựng 10

ml nước cất vô trùng (mỗi một ống nghiệm chỉ bỏ được tối đa là 10 hạt) Ngâm hạt trong nước cất vô trùng khoảng 12 giờ Sau đó gạn hết nước, dùng giấy thấm vô trùng thấm khô hạt, lấy panh vô trùng gắp hạt và giữ hạt rồi dùng dao cắt mẫu vô trùng cắt phôi hạt Đặt hạt đã cắt phôi lên trên môi trường WA, mỗi đĩa đặt từ 6 – 8 hạt, đặt hạt theo vòng tròn Để đĩa môi trường đã cấy hạt ngô nuôi dưới dàn đèn trong phòng nuôi nấm

- Phương pháp giấy thấm:

+ Lấy 600 hạt/1 mẫu, 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 200 hạt

+ Chuẩn bị đĩa Petri và giấy thấm (Blotter paper) đường kính 9cm, lấy

và ngày kiểm tra trên mặt đĩa Để mẫu hạt trong điều kiện nhiệt độ thích hợp 20– 25oC, thời gian 6 – 7 ngày Sau 7 ngày đem kiểm tra hạt dưới kính hiển vi soi nổi, soi lần lượt từ vòng ngoài vào vòng trong tâm đĩa

+ Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh (%)

* Phương pháp giám định nấm: Môi trường dùng để giám định nấm

là môi trường CLA

Hạt ngô bị bệnh cấy trên môi trường WA được 14 ngày thì sợi nấm bắt đầu xuất hện trên bề mặt môi trường và bề mặt hạt Dùng que cấy vô trùng cắt phần đỉnh của sợi nấm chuyển sang môi trường mới – môi trường CLA Môi trường CLA kích thích sinh bào tử của một số nấm gây bệnh, đồng thời kích thích sợi nấm phát triển giúp ta có thể quan sát màu sắc tản nấm, cách mọc của sợi nấm, có những nấm hình thành hạch trên môi trường này

Khi bào tử xuất hiện trên môi trường CLA, dùng que cấy khêu bào tử của nấm ra một chiếc lam kính sạch, đậy lamen rồi đưa lên kính hiển vi quan sát và giám định

3.2.2 Phương pháp khử trùng dụng cụ và nuôi cấy nấm trong phòng thí nghiệm

3.2.2.1 Phương pháp khử trùng dụng cụ

Các dụng cụ bằng thuỷ tinh như: ống nghiệm, bình tam giác, hộp petri được khử trùng ở nhiệt độ 1600C trong 3h bằng tủ sấy Dao kẹp, que cấy được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn Môi trường nuôi cấy được khử trùng trong hơi nước nóng ở 1210C, 1,5 atm từ 35 - 45 phút trong nồi hấp

3.2.2.2 Phương pháp nấu môi trường

Tạo môi trường WA 2% (Warter Agar) :

- Cách điều chế :

Cân 250 g khoai tây đã được rửa sạch, thái lát mỏng hình vuông, cho

vào nồi cùng 1 ít nước cất rồi đun sôi Sau khi đun sôi được khoảng 30 phút, lọc lấy phần dịch nước chiết, bổ sung thêm nước cất cho đủ 1000 ml

Pha dung dịch nước trên với 20 g đường và 20 g thạch rau câu, cho vào bình tam giác và lắc đều để tạo thành dung dịch đồng nhất Môi trường được đưa vào bình thuỷ tinh sau đó đem hấp vô trùng ở 1210C tại 1,5 atm trong thời gian 30 phút Sau đó để nguội tới khoảng 550C rồi đưa vào buồng cấy để rót vào đĩa petri đã được sấy khử trùng

Môi trường này giàu dinh dưỡng, dễ bị tạp, dùng làm môi trường cấy truyền cho các loại nấm sau khi đã được cấy phân lập và làm thuần nấm

Tạo môi trường PCA (Potato Carrot Agar):

- Thành phần :

Khoai tây : 20 g

Cà rôt : 20 g Agar : 20 g Nước cất : 1000 ml

- Cách điều chế :

Giống như điều chế môi trường PGA, dùng để nuôi cấy nấm đã được phân lập từ môi trường WA nhằm nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh học của nấm

Tạo môi trường CA (Carrot Agar):

- Thành phần:

Cà rôt : 200 g Agar : 20 g Nước cất : 1000 ml

- Cách điều chế:

Tương tự như môi trường PGA, dùng để nuôi cấy nấm đã được phân lập từ môi trường WA nhằm nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh học của nấm

Tạo môi trường CLA (Carnation leaf Agar):

và được khủ trùng trong nồi hấp

Nước cất đun sôi, cho Agar vào khuấy đều cho tan hết Đổ môi trường vào bình, hấp ở điều kiện 1210C; 1,5 atm trong thời gian 45 phút Để nguội, đổ vào các đĩa Petri vô trùng đã có sẵn 3 – 4 mẩu lá cẩm chướng

Nhiều loại nấm sinh bào tử trên môi trường này trong vòng 6 - 10 ngày Trên môi trường này, hình thái những bào tử vô tính đồng nhất hơn so với khi dùng môi trường nhiều hydrat cacbon như PGA Sử dụng môi trường này để xác định loại nấm gây hại cây trồng vì bào tử hình thành trên lá cẩm chướng có hình dạng và chiều dài ổn định so với bào tử hình thành đơn độc từ cành bào tử phân sinh trên sợi nấm trong môi trường khác (Trần Nguyễn Hà và CTV, 2005)

3.2.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nấm Fusarium spp đến khả năng nảy mầm của hạt

Lấy 30 mẫu, mỗi mẫu 50 hạt đối với hạt giống lúa Hương thơm 1 và

giống ngô HN88 Tiến hành đặt ẩm thống kê mẫu theo tỷ lệ % hạt nhiễm nấm Fusarium và xác định tỷ lệ hạt nảy mầm

Tỷ lệ hạt xuất hiện(%) = Số hạt xuất hiện triệu chứng nhiễm nấm Fusarium

Tổng số hạt trong 1 mẫu

Phân cấp mức nhiễm nấm Fusarium spp dựa vào tỷ lệ (%) hạt xuất hiện nấm Fusarium spp Chia thành 3 mức khác nhau:

- Mức nhiễm nhẹ: tỷ lệ % hạt xuất hiện <10%

- Mức nhiễm trung bình: tỷ lệ % xuất hiện 10 – 40%

- Mức nhiễm nặng: tỷ lệ % xuất hiện >40%

Chỉ tiêu theo dõi: Trong mỗi mức nhiễm tính tỷ lệ hạt mầm khỏe, mầm bất thường, hạt thối không nảy mầm

3.2.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm Fusarium spp trên lúa và ngô

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến sự phát triển của tản nấm Fusarium

Tiến hành nuôi cấy nấm trên 4 môi trường khác nhau là WA 2%, PCA, CLA, PGA

- Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính tản nấm (mm) sau 1, 2, 3, 4 ngày nuôi cấy, từ đó so sánh để rút ra môi trường thích hợp nhất cho sự phát triển của tản nấm

* Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của tản nấm Fusarium

Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường PGA (môi trường thích hợp nhất cho nấm) ở các ngưỡng nhiệt độ 200C, 250C, 300C, 350C

- Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm (mm) sau 1, 2, 3, 4 ngày nuôi cấy, từ đó so sánh rút ra ngưỡng nhiệt độ thuận lợi cho sự phát triển của

nấm Fusarium và ngưỡng nhiệt độ ứng chế sự phát triển của nấm Fusarium

3.2.5 Nghiên cứu khả năng xâm nhiễm của nấm Fusarium spp trên lúa

và ngô bằng phương pháp lây bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm và trong điều kiện chậu vại

- Cách pha dung dịch bào tử nấm Fusarium: Cho 10 ml nước vô trùng vào

hộp petri cấy nấm F fujikuroi Sau đó dùng que cấy gạt nhẹ trên bề mặt Điều chỉnh

nước để bào tử đạt 107 bào tử/ml

- Phương pháp đo mật độ bào tử : Đo bằng buồng đếm

+ Dùng pipet hút 1 ml dung dịch vừa pha nhỏ vào buồng đếm, đậy lamen, sau đó dùng pipet hút hết phần dung dịch thừa

+ Đưa buồng đếm soi dưới kính hiển vi

+ Đến mật độ bào tử trong 30 ô nhỏ Tính mật độ trung bình trong 30 ô

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ bào tử nấm Fusarium đến khả năng gây bệnh trên cây mạ 3 – 5 lá

Áp dụng phương pháp chẩn đoán nhanh:

- Tiến hành pha loãng dịch bào tử nấm Fusarium ở các nồng độ: 104,

105, 106, 107, 108

- Cây lúa (giống Hương thơm 1) sau khi trồng được 3 – 5 lá cho nhúng ngập rễ vào cốc đựng dung dịch bào tử nấm ở các nồng độ khác nhau trong vòng 10 phút Sau đó đưa cây lên cao đảm bảo 1/3 rễ ngâm trong dung dịch bào tử Quan sát triệu chứng cây nhiễm bệnh (cây dần dần bị héo, xuất hiện triệu chứng lá bị biến vàng) sau các ngày theo dõi Theo dõi trong 10 ngày

- Cây Ngô (giống HN88)

Công thức đối chứng : Nhúng rễ cây mạ 3 – 5 lá ngậm trong nước vô trùng trong 10 phút, sau đó đưa cây lên cao đảm bảo 1/3 rễ ngâm trong nước (cây hút nước)

- Chỉ tiêu theo dõi : Tỷ lệ cây bị nhiễm bệnh (%) ở các công thức sau

các ngày theo dõi

3.2.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của các biện pháp xử lý hạt giống lúa

Thí nghiệm được tiến hành trên giống lúa Hương thơm 1

Thí nghiệm gồm 5 công thức, mỗi công thức kiểm tra 300 hạt, 100 hạt cho một lần nhắc lại

- Công thức 1: Đối chứng (không xử lý hạt giống): Hạt lúa được ngâm trong nước vô trùng 10 phút

- Công thức 2: Xử lý hạt giống bằng cồn: Hạt lúa được ngâm trong cồn

700C trong vòng 15 phút

- Công thức 3: Xử lý hạt giống bằng muối: Dùng muối ăn (NaCl) tỷ lệ 15% hòa với nước (cho 150gram muối pha trong 1000ml nước, khuấy đều cho muối tan hết), ngâm hạt lúa trong vòng 15 phút

- Công thức 4: Xử lý hạt giống bằng nhiệt độ: Hạt lúa được ngâm qua nước nóng 540C trong 30 phút

- Công thức 5: Xử lý hạt lúa, ngô bằng thuốc Cruiser Plus 312,5 FS: Pha Cruiser plus theo liều lượng khuyến cáo 0,2ml thuốc với 10ml nước (cho 1kg hạt giống), rồi trộn đều với hạt giống lúa đã được ngâm ủ

3.2.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của các biện pháp xử lý hạt giống ngô

Thí nghiệm được tiến hành trên giống ngô HN88

Thí nghiệm gồm 5 công thức, mỗi công thức kiểm tra 300 hạt, 100 hạt cho một lần nhắc lại

- Công thức 1: Đối chứng (không xử lý hạt giống): Hạt ngô được ngâm trong nước vô trùng 10 phút

- Công thức 2: Xử lý hạt giống bằng cồn: Hạt ngô được ngâm trong cồn

700C trong vòng 15 phút

- Công thức 3: Xử lý hạt giống bằng muối: Dùng muối ăn (NaCl) tỷ lệ 15% hòa với nước (cho 150gram muối pha trong 1000ml nước, khuấy đều cho muối tan hết), ngâm hạt ngô trong vòng 15 phút

- Công thức 4: Xử lý hạt ngô, lúa bằng thuốc Cruiser Plus 312,5 FS: Pha Cruiser plus theo liều lượng khuyến cáo 0,2ml thuốc với 10ml nước (c ho

1kg hạt giống), rồi trộn đều với hạt giống lúa, ngô đã được ngâm ủ

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ hạt nhiễm nấm F fujikuoi (%) trên lúa và F verticillioides (%) trên ngô, tỷ lệ hạt nảy mầm

3.3 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu

N : Số bào tử trung bình của 30 ô

- Hiệu lực thuốc trong phòng thí nghiệm tính theo công thức Abbott:

HLT(%) = C – T x 100%

C Trong đó:

C: đường kính tản nấm ở công thức đối chứng T: đường kính tản nấm ở công thức thí nghiệm

3.3.2 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý thống kê theo phương pháp xử lý thống kê sinh học IRRISTAT và Excel (Phạm Tiến Dũng, 2003; Nguyễn Thị Lan và Phạm Tiến Dũng, 2006)

4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

4.1 Thành phần nấm gây hại trên hạt bị bệnh, mức độ nhiễm nấm Fusarium spp Trên các mẫu hạt lúa, ngô

4.1.1 Thành phần nấm gây hại trên hạt bị bệnh trên mẫu hạt lúa, ngô

4.1.1.1 Thành phần nấm gây hại trên hạt bị bệnh trên mẫu hạt lúa

Chúng tôi tiến hành thu hạt một số giống lúa đang được gieo trồng tại Thái Bình đem về phòng thí nghiệm để kiểm tra các tác nhân gây bệnh cho hạt giống; việc kiểm tra sức khoẻ hạt giống là rất cần thiết cho việc xác định

sự có mặt của tác nhân gây bệnh trên hạt giống, từ đó sẽ có biện pháp phòng trừ ngay từ bước đầu trong quá trình trồng trọt, chăm sóc, nhằm đem lại năng suất cao cho người dân

Bảng 4.1: Mức độ phổ biến của nấm gây bệnh trên hạt lúa

Ghi chú: + : Mức gây hại nhẹ (TLB<10%)

++ : Mức gây hại trung bình (TLB từ 10 – 25%) +++ : Mức gây hại nặng (TLB >25%)

Qua bảng 4.1 cho thấy:

Trên các lô hạt giống thu thập được tại các địa phương khác nhau thành phần nấm gây hại trên hạt rất đa dạng và mức độ phổ biến của nấm gây hại là khác nhau giữa các tỉnh thành khác nhau và giữa các nấm với nhau mức độ nhiễm cũng khác nhau

Đã xác định được 5 loài nấm bệnh gây hại trên các lô hạt giống lúa thu thập ở 4 tỉnh và mức độ nhiễm là khác nhau Trong đó nấm xuất hiện phổ biến

trên tất cả các lô hạt giống tại các tỉnh thành lần lượt là nấm Fusarium spp, Aspergilus , Alternaria sp, Bipolaris oryzae, Curvularia sp

Ở khu vực Thái Bình, xuất hiện cả 5 loại nấm và mức độ nhiễm nặng

nhất là nấm Fusarium spp., Alternaria với tỷ lệ bệnh >25% Nhiễm nhẹ nhất

là nấm Bipolaris oryzae, Curvularia, với tỷ lệ bệnh <10% Nấm Aspergillus

sp xuất hiện với mức độ nhiễm trung bình với tỷ lệ bệnh từ 10 – 20%

Đặc điểm hình thái là một chỉ tiêu quan trọng để ta có thể phân biệt sự khác nhau giữa các nấm gây bệnh Từ các hạt nhiễm nấm xác định được ở bảng 4.1.1, chúng tôi tiến hành phân tích đặc điểm hình thái của một số nấm gây hại trên hạt thóc thu thập được qua phương pháp đặt ẩm hạt và quan sát dưới kính hiển vi sau 7 ngày đặt ẩm

4.1.1.2 Thành phần nấm gây hại trên hạt bị bệnh trên mẫu hạt ngô

Bảng 4.2 Thành phần và mức độ phổ biến của nấm gây bệnh trên hạt

Ngô tại Thái Bình

Ghi chú: + : Mức gây hại nhẹ (TLB<10%)

++ : Mức gây hại trung bình (TLB từ 10 – 25%) +++ : Mức gây hại nặng (TLB >25%)

Qua bảng 4.2 cho thấy:

Trên các lô hạt giống thu thập được tại Thái Bình thành phần nấm gây hại trên hạt rất đa dạng và mức độ phổ biến của nấm gây hại là khác nhau Đã xác định được 6 loài nấm bệnh gây hại trên các lô hạt giố ngô và mức độ nhiễm là khác nhau Trong đó nấm xuất hiện phổ biến trên tất cả các lô hạt

giống tại tỉnh Thái Bình thành lần lượt là nấm Fusarium spp., Aspergilus sp., Penicillium sp., Mucor sp., Rhizopus sp., Curvularia sp

Ở khu vực Thái Bình, trên hạt ngô cho thấy xuất hiện cả 6 loại nấm và

mức độ nhiễm nặng nhất là nấm Fusarium spp và nấm Aspergillus sp với tỷ lệ bệnh >25% Sau đó là nấm Nhiễm nhẹ nhất là nấm Penicillium sp tỷ lệ bệnh từ

10 – 20% Rhizopus sp., Mucor sp Curvularia sp với tỷ lệ bệnh <10%

4.1.2 Mức độ nhiễm nấm Fusarium spp Trên các mẫu hạt lúa, ngô

4.1.2.1 Mức độ nhiễm nấm Fusarium spp Trên các mẫu hạt lúa

Để xác định được mức độ nhiễm nấm Fusarium spp trên các mẫu hạt

giống, chúng tôi tiến hành thu thập giống sau đó mang về phòng thí nghiệm đặt ẩm, quan sát triệu chứng hạt nhiễm, tính tỷ lệ % hạt xuất hiện nấm và xuất

hiệnnấm Fusarium spp Kết quả trình bày ở bảng 4.3

Bảng 4.3 Tỷ lệ xuất hiện nấm Fusarium spp gây bệnh trên thóc giống