Xạ khuẩn STREPTOMYCES SINH XYLANASE đặc điểm sinh học và phân loại

Streptomyces là chi lớn nhất của ngành Actinobacteria và là một chi thuộc nhánh streptomycetaceae. Có hơn 500 loài vi khuẩn Streptomyces đã được mô tả. Giống như hầu hết các Actinobacteria khác, Streptomyces là vi khuẩn Gram dương, có bộ gen với tỉ lệ GC% cao. Vi khuẩn này được tìm thấy chủ yếu trong đất và thảm thực vật mục nát. Streptomyces sinh bào tử, tạo mùi đặc trưng, là kết quả từ sản sinh geosmin trong quá trình chuyển hóa các chất. Streptomyces được nghiên cứu rộng rãi và được biết đến nhiều nhất là chi của họ xạ khuẩn (Actinomyces). Streptomyces thường sống ở đất có vai trò là vi sinh vật phân hủy rất quan trọng. Chủng vi sinh này sản xuất hơn một nửa số thuốc kháng sinh trên thế giới và đó là sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế.

XẠ KHUẨN STREPTOMYCES CHARTREUSIS CP23X9 SINH XYLANASE:

ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI

Vũ Văn Lợi, Nguyễn Văn Hiếu, Nguyễn Thị Hồng Liên, Phạm Thị Bích Hợp, Phan Thị Hồng Thảo *

Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *pthongthao@ibt.ac.vn

TÓM TẮT: Xylan là thành phần chính của hemicellulose, được cấu tạo từ các phân tử D-xylopyranose

thông qua liên kết β-1,4 và các chuỗi bên Sự phân hủy xylan bởi xylanase được nghiên cứu nhiều ở vi sinh vật, đặc biệt là nấm và xạ khuẩn Hiện nay, việc phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh xylanase cao được quan tâm bởi tiềm năng ứng dụng rộng rãi của chúng trong nhiều lĩnh vực

khác nhau, đặc biệt là trong công nghiệp giấy và bột giấy Trong nghiên cứu này, chủng CP23X9 có khả

năng phân hủy xylan đã được mô tả đặc điểm sinh học và phân loại Chủng CP23X9 thuộc nhóm xạ khuẩn xanh và vàng xám, có chuỗi bào tử dạng xoắn, bề mặt bào tử dạng gai, số lượng bào tử trên từng chuỗi khoảng từ 10-50 Chủng CP23X9 sinh trưởng tốt trên nhiều loại môi trường, ở điều kiện nhiệt

độ, pH khá rộng (nhiệt độ 15-45oC; pH = 5-10) và chịu được nồng độ muối NaCl đến 6% Xạ khuẩn CP23X9 có khả năng đồng hoá nhiều loại đường như D-glucose, D-xylose, D-mannitol, arabinose và L-rhamnose Đặc biệt, chủng có khả năng sinh enzyme ngoại bào phong phú (ligninase, protease, amylase),

có hoạt tính xylanase cao (42,7 U/ml) và không sinh cellulase Đối chiếu các đặc điểm phân loại của

chủng với khóa phân loại xạ khuẩn ISP, khóa phân loại của Bergey và kết quả phân tích trình tự gen mã

hóa 16S rRNA cho thấy, chủng CP23X9 có đặc điểm tương đồng cao (99%) với loài Streptomyces chartreusis Hoạt tính xylanase của Streptomyces chartreusis CP23X9 có thể ứng dụng trong tẩy trắng bột

giấy

Từ khóa: Streptomyces chartreusis, 16S rDNA, đặc điểm sinh học, phân loại xạ khuẩn, xylanase

MỞ ĐẦU

Xylan là thành phần chính của

hemicellulose, chiếm 20-35% khối lượng chất

khô Thành phần của xylan bao gồm mạch

chính được cấu tạo bởi đường D-xylopyranose

thông qua liên kết β-1,4 và các chuỗi bên

O-acetyl, α-L-arabinofuranosyl, α-D-glucuronosyl

Để thủy phân hoàn toàn xylan cần có sự tham

gia hoạt động của tổ hợp xylanase [4] Đến nay,

xylanase từ vi sinh vật được quan tâm chú ý

mạnh mẽ bởi khả năng ứng dụng trong nhiều

lĩnh vực như bột giấy, thức ăn chăn nuôi,

chuyển hóa lignocellulose, cồn sinh học và công

nghiệp đồ uống

Xylanase được sinh tổng hợp bởi nhiều loài

vi sinh vật khác nhau như vi nấm, vi khuẩn, xạ

khuẩn (Penicillium janthinellum, Arthrobacter

sp., Streptomyces cyaneus, S albus,

S Chromofuscus và S chartreusis) [2, 5, 8]

Trong đó, xylanase từ xạ khuẩn được công bố

có khả năng chịu nhiệt, chịu kiềm và không có

hoạt tính cellulase [8] Sử dụng xylanase trong

tẩy trắng bột giấy giúp làm giảm lượng chlorine

(Cl2) và hypochlorine (ClO2) dùng trong trong tẩy trắng, đồng thời giảm lượng hóa chất thải ra

môi trường Đến nay, xylanase từ S albus và S chromofuscus đã được ứng dụng thành công

trong tẩy trắng bột giấy, sử dụng xylanase từ

chủng S albus giúp độ sáng của bột giấy tăng 4% và xylanase từ S chromofuscus có hiệu quả

tẩy trắng tăng 9,1% so với không xử lý [8] Trong bài này, chúng tôi nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của chủng xạ khuẩn CP23X9 sinh xylanase cao nhằm ứng dụng trong tẩy trắng bột giấy

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu

Các chủng xạ khuẩn và vi sinh vật kiểm định: Bacillus subtilis ATCC 6633,

Pseudomonas aeruginosa, Sarcina lutea, Escherichia coli PA2, Staphylococcus aureus 208P và Candida albicans nhận từ bộ sưu tập

giống của Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Môi trường nuôi cấy và phân loại: các môi

trường theo ISP (International Streptomyces

Project) Môi trường GI (g/l): Oat spelts xylan

5; K2HPO4 0,5; MgSO4.7H2O 0,5; KNO3 0,5;

NaCl 0,5; FeSO4.H2O 0,0; pH 7,2-7,5 Môi

trường Gause I (g/l): Tinh bột tan 20; K2HPO4

0,5; MgSO4.7H2O 0,5; KNO3 0,5; NaCl 0,5;

FeSO4.H2O 0,01; pH 7,2-7,5 Môi trường Gause

II (g/l): Glucose 10; pepton 5; cao thịt 0,5; NaCl

5; pH 7,2-7,5

Phương pháp

Phương pháp xác định hoạt tính xylanase

Hoạt tính xylanase được xác định bằng đo

lượng đường khử giải phóng ra từ 0,5% (w/v)

oat spelts xylan, sử dụng 3,5- Dinitrosalicylic

acid (DNS) là chất phản ứng [3] và D-xylose

làm đường chuẩn Một đơn vị hoạt tính enzyme

xylanase được định nghĩa là lượng enzyme cần

để giải phóng ra 1µmol xylose từ oat spelts

xylan 0,5% (w/v) trong điều kiện thí nghiệm

[7]

Phân loại CP23X9 bằng quan sát đặc điểm hình

thái, phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA

Nghiên cứu đặc điểm sinh học theo phương

pháp trong ISP (1974) và khóa phân loại Bergey

[6, 12] Màu sắc của khuẩn ty cơ chất (KTCC),

khuẩn ty khí sinh (KTKS) và sắc tố tan tiết ra

môi trường được đánh giá theo Shirling và

Gottlieb (1966) trên bảng màu của Tresner &

Backus [10, 11] Hình dạng cuống sinh bào tử

và bào tử được quan sát và chụp ảnh dưới kính

hiển vi điện tử JSM-5000

Phân tích trình tự gen 16S rDNA

DNA tổng số của chủng CP23X9 được tách chiết theo phương pháp của Sambrook & Russell (2001) [9] Gen mã hóa 16S rRNA của chủng vi khuẩn được khuếch đại bằng phản ứng PCR từ DNA tổng số sử dụng cặp mồi GF1 (5'-TAACACATGCAAGTCGAACG-3') và GR1 (5’-GG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3’) theo chu trình nhiệt: 94oC trong 5 phút, 30 chu trình (94oC trong 60 giây, 60oC trong 60 giây, 72oC trong 90 giây), 72oC trong 10 phút, giữ mẫu ở

4oC Sản phẩm của phản ứng PCR được phân tích trên máy đọc trình tự ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, xử lý bằng phần mềm SeqAssem version 01/2005 và Sequencher version 4.0.5 Mức độ tương đồng gen 16S rDNA của chủng nghiên cứu được so sánh với các trình tự gen 16S rDNA trong Genbank Mức độ tương đồng di truyền của các chủng được xây dựng dựa trên phần mềm ClustalX 2.0.11

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tuyển chọn xạ khuẩn sinh xylanase

Từ các mẫu mùn gỗ mục đã phân lập được

12 chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp xylanase Trong số đó, chủng CP23X9 sinh tổng hợp xylanase mạnh nhất (42,70 U/ml) được lựa chọn để định tên đến loài nhằm sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo (bảng 1)

Bảng 1 Hoạt tính xylanase của một số chủng xạ khuẩn tuyển chọn

Chủng xạ khuẩn tuyển chọn có hoạt tính

xylanase tương đương với hoạt tính xylanase

thu nhận từ các chủng xạ khuẩn được một số tác

giả công bố trên thế giới như Streptomyces

chartreusis L1105 (45,16 U/ml), S albus (32,53

U/ml), S chromofuscus (43,01U/ml) [2, 8]

Đặc điểm sinh học của chủng CP23X9

Đặc điểm nuôi cấy

Chủng CP23X9 thuộc nhóm xạ khuẩn vàng xám, sinh trưởng tốt trên các môi trường

ISP1-3, ISP5-7, Gause I, Gause II và sinh trưởng yếu

trên môi trường ISP4 và Gause I Khuẩn ty khí

sinh có màu vàng trên môi trường ISP1 và ISP6,

màu xanh trên ISP2-ISP5, Gause I và Gause II

Trên các môi trường ISP1, ISP4, ISP5, ISP6 và

Gause I, khuẩn ty cơ chất có màu vàng và có màu xám trên ISP2, ISP3, ISP7 và Gause II Chủng CP23X9 không tạo sắc tố melanin trên các môi trường nghiên cứu (hình 1a, 1b)

Hình 1 Khuẩn lạc mặt trước (a), mặt sau (b), bề mặt bào tử (c)

và cuống sinh bào tử (d) của chủng CP23X9

Đặc điểm bào tử dưới kính hiển vi điện tử

Chủng CP23X9 được nuôi trên môi trường

ISP2 sau 5 ngày Quan sát dưới kính hiển vi

điện tử JSM-5000 ở độ phóng đại 5000 lần cho

thấy, cuống sinh bào tử của chủng CP23X9 có

dạng xoắn (S) (hình 1d), trên một chuỗi có

khoảng 10-50 bào tử Ở độ phóng đại 10000

lần, bề mặt bào tử dạng gai (sp) (hình 1c)

Đặc điểm sinh lý sinh hóa

Nghiên cứu khả năng đồng hóa các nguồn

đường là chỉ tiêu quan trọng để tiến hành phân

loại xạ khuẩn theo khóa phân loại của

Nomomura trong ISP (1974) [6] Kết quả cho

thấy chủng CP23X9 có khả năng đồng hoá

nhiều loại đường, phát triển tốt trên các môi

trường có bổ sung D-glucose, D-xylose,

D-mannitol, L-arabinose và L-rhamnose, phát

triển yếu trên môi trường có lactose, D-fructose

và saccharose nhưng không phát triển trên môi

trường có sorbitol Xạ khuẩn CP23X9 có thể sinh trưởng được ở điều kiện nhiệt độ từ 15-45C, pH 5-10 và chịu được nồng độ muối NaCl tới 6% w/v Dịch nuôi cấy từ chủng CP23X9 có khả năng ức chế một số chủng vi

khuẩn kiểm định như Bacillus subtilis 6630, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus 208P Tuy nhiên, chủng này lại không

có khả năng ức chế Sarcina lutea, Escherichia coli PA2 và nấm Candida albicans Chủng có

hệ enzyme ngoại bào phong phú như ligninase, protease, amylase, nhưng không sinh tổng hợp cellulolase

Định tên đến loài chủng CP23X9

Đối chiếu các đặc điểm phân loại của chủng

nghiên cứu theo các khóa định tên loài xạ khuẩn

trong ISP, so sánh với khóa phân loại Bergey, chúng tôi xác định chủng CP23X9 có thể xếp

vào nhóm xạ khuẩn Streptomyces Tuy nhiên,

để phân loại chủng CP23X9 đến loài, cần kết

hợp kết quả về đặc điểm sinh hóa và trình tự

gen 16S rDNA

Từ kết quả xác định trình tự cho thấy, gen

16S rDNA của chủng CP23X9 có độ tương

đồng cao (98-99%) với các gen tương ứng của

một số xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces (hình

2): S chartreusis XSD08102, S chartreusis

DA10203, S chartreusis HA10304,

S flavovariabilis 1184, S phaeoluteigriseus ISP5182, S bobili NBRC13199, S galilaeus JCM 4757, S pseudovenezuelae HBUM174623

(98%) Như vậy, kết quả phân loại cho thấy chủng xạ khuẩn CP23X9 có đặc điểm rất gần gũi và có độ tương đồng cao với loài

Streptomyces chartreusis nên chủng xạ khuẩn này được đặt tên là Streptomyces chartreusis

CP23X9

Hình 2 Mức độ tương đồng di truyền giữa chủng Streptomyces chartreusis CP23X9

với các loài xạ khuẩn có họ hàng gần dựa vào 16S rRNA

Khả năng sinh tổng hợp xylanase

Trong những năm gần đây, khả năng sinh

tổng hợp xylanase từ các chủng xạ khuẩn cũng

được nhiều tác giả công bố như S cyaneus [5],

S albus, S chromofuscus [8], Streptomyces sp

Lb24 [7], S chartreusis [2] và Streptomyces

AMT-3 [40] Theo Li et al (2011) [2], chủng

S chartreusis L1105 sinh xylanase đạt cực đại

(45,16 U/ml) sau 7 ngày trên môi trường sử

dụng oat spelt xylan làm nguồn cacbon Chủng

xạ khuẩn CP23X9 trong công bố này thể hiện

khả năng sinh tổng hợp xylanase cao (42,70

U/ml) không sinh tổng hợp cellulose và qua

phân loại cho thấy đây là một trong những loài

xạ khuẩn có ý nghĩa trong việc ứng dụng xử lý

tẩy trắng bột giấy đã được nhiều tác giả công

bố Thí dụ, sau quá trình ủ bột giấy với xylanase

từ S chartreusis L1105, S Thermoviolaceus và Streptomyces sp QG-11-3 hệ số kappa (thể hiện

mức độ khử lignin) giảm lần lượt là 12,2; 16 và

23% [2] Sử dụng xylanase từ chủng S albus

giúp độ sáng của bột giấy tăng 4% so với không

xử lý Trong khi đó, hiệu quả tăng độ sáng của bột giấy nhận được là 9,1% khi sử dụng

xylanase từ S chromofuscus [8] Khả năng sinh tổng hợp xylanase của Streptomyces chartreusis

CP23X9 trong nghiên cứu này đạt tới 42,70

U/ml cho thấy là đây là một trong những chủng

xạ khuẩn bản địa quí, có triển vọng trong xử lý tẩy trắng bột giấy

KẾT LUẬN

Chủng CP23X9 phân lập từ gỗ mục, sinh

trưởng tốt trên nhiều loại môi trường, trong

khoảng nhiệt độ và pH khá rộng (nhiệt độ

15-45oC; pH 5-10) và chịu được nồng độ NaCl đến

6% Chủng CP23X9 thuộc nhóm xạ khuẩn

xanh hoặc vàng xám, có chuỗi bào tử dạng

xoắn, bề mặt bào tử dạng gai, số lượng bào tử

trên từng chuỗi khoảng từ 10-50 Chủng có hệ

enzyme ngoại bào phong phú (ligninase,

protease, amylase), có hoạt tính xylanase cao

(42,7 U/ml) và không sinh cellulase Đối chiếu

các đặc điểm phân loại của chủng nghiên cứu

theo các khóa phân loại ISP, so sánh với khóa

phân loại Bergey và kết hợp với kết quả phân

tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA cho thấy,

chủng CP23X9 thuộc loài Streptomyces

chartreusis với độ tương đồng 99%

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Bajai B K., Razdan K., Sharma A., 2010

Thermoactive alkali-stable xylanase

production from a newly isolated

Streptomyces sp SU9 Indian J Chem

Technol., 17: 375-380

2 Li X., Sun B., Zhao J., Lv Y., Song H., Li

E., Zhu Y., 2011 Production and improved

bleaching abilities of a thermostable

xylanase from a newly isolated

Streptomyces chartreusis strain Afr J

Biotechnol., 10(64): 14132-14142

3 Miller L., 1959 Use of dinitrosalicylic acid

reagent for determination of reducing sugar

Anal Chem., 31: 426-431

4 Nascimento R P., Coelho R R R.,

Marques S., Alves L., Gírio F M., Bon E

P S., Amaral-Collaco M T., 2002

Production and partial characterisation of

xylanase from Streptomyces sp strain

AMT-3 isolated from Brazilian cerrado soil Enzyme Microb Technol., 31: 549-555

5 Ninawe S., Kapoor M., Kuhad R C., 2008 Purification and characterization of

extracellular xylanase from Streptomyces cyaneus SN32 Bioresour Technol., 99:

1252-1258

6 Nomomura H., 1974 Key for classification and identification of 458 species of the

Streptomyces included in ISP J Ferment

Technol., 52(2): 78-92

7 Rawashded R., Saadoun I., Mahasneh A.,

2005 Effect of cultural conditions on

xylanase production by Streptomyces sp

(strain Ib 24D) and its potential to utilize tomato pomace Afr J Biotechnol., 4(3): 251-255

8 Rifaat H M., Nagieb Z A., Ahmed Y M.,

2005 Production of xylanase by

Streptomyces species and their bleaching

effect on rice straw pulp Appl Ecol Environ Res., 4(1): 151-160

9 Sambrook J., Russell D W., 2001 Molecular cloning A laboratory manual, 3rd ed Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York

10 Shirling E B., Gottlieb D., 1966 Cooperative description of type culture of

Streptomyces species Int J Sys Bacteriol.,

19(4): 391-512

11 Shirling E B., Gottlieb D., 1966 Methods

for characterisation of Streptomyces species

Int J Sys Bacteriol., 16(3): 313-340

12 Wilkins W., 1989 Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Vol 2, Vol 3, Vol 4 Publisher Springer-Verlag, New York

STREPTOMYCES CHARTREUSIS CP23X9 PRODUCING XYLANASE:

BIOLOGICAL CHARACTERISTICS AND CLASSIFICATION

Vu Van Loi, Nguyen Van Hieu, Nguyen Thi Hong Lien, Pham Thi Bich Hop, Phan Thi Hong Thao

Institute of Biotechnology, VAST

SUMMARY

Xylan is the major component of hemicellulose that makes up for plant cell It is constructed by 1,4-β-linked-D-xylopyranosyl units with several side-groups Xylan can be degraded by xylanase from microorganisms such as fungi, bacteria and actinomyces Enzyme xylanase is widely applied in industry, such

as textile, paper and pulp, and food production In this study, an Actinomyces strain CP23X9 producing xylanase was characterized and identified The results showed that strain CP23X9 can grow well on different media with a wide range of temperature between 15-45oC; pH 5-10, and salinity of 0-6% On the agar plate, the strain has blue aerial mycelia and pale yellow vegetative mycelia The mature spore chains appeared spirals, moderately long, bearing 10 to 50 spores each; the spore surface spiny The strain utilized carbon sources such as D-glucose, D-xylose, D-mannitol, L-arabinose và L-rhamnose Strain CP23X9 capable of extracellular enzymes producing, such as ligninase, protease, amylase and with high xylanase activity (42.7 U/ml) Based on the biological characteristics and phylogenetic analysis of 16S rDNA, it can be concluded

that strain CP23X9 is close to Streptomyces chartreusis (99%), hence identified as Streptomyces chartreusis CP23X9 The xylanase activity of Streptomyces chartreusis CP23X9 will be used in improved bleaching

abilities in future

Keywords: Streptomyces chartreusis, 16S rDNA, Actinomyces classification, biological characteristics, xylanase

Ngày nhận bài: 30-6-2013