phân lập vi khuẩn vibrio trên cá bớp bị lở loét

Năm 2001, Vibrio alginolyticus được xác định là tác nhân gây bệnh trên cá bớp có dấu hiệu lở loét tại Đài Loan Rajan et al., 2001.. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả phân lậ

PHÂN LẬP VI KHUẨN Vibrio TRÊN CÁ BỚP (Rachycentron canadum) BỊ LỞ LOÉT

IDENTIFICATION Vibrio ISOLATES FROM CUTANEOUS ULCERATIONS

ON COBIA (Rachycentron canadum) Nguyễn Thị Thúy An * , Trần Ngọc Hải và Từ Thanh Dung Lớp Cao học NTTS K18, Đại học Cần Thơ Email: ngthuyan803@yahoo.com.vn

ABSTRACT

Vibriosis is one of the most serious diseases, causing severe losses in the World’s marine fish

production In this study, two species of Vibrio alginolyticus and Vibrio parahaemolyticus were identified from cutaneous ulcerations on cobia (Rachycentron canadum) Conventional

identification and rapid identification system, API 20E were used in this study A total of 22 isolates were obtained from infected cobia in the brackish-water hatchery in College of Aquaculture and Fisheries, Cantho University Clinical signs were cutaneous hemorrhage, ulcerations, and bloody peritoneal fluid Pure colonies were observed in TCBS agar (thiosulphate citrate bile salt sucrose) The isolates from diseased cobia were motile and Gram-negative bacilli, able to grow in 4-8% NaCl media with temperature ranging 25-37oC, oxidase, catalase and O/F positive, and sensitive to the vibriostatic agent O/129 (150µg) Antimicrobial susceptibility testing showed that most isolates are sensitive to flofenicol, doxycycline, flumequine but resistant to cephalexin and colistin sulphate The virulence of bacterial isolates and control mesures of the disease should be considered in further studies

Key words: cobia, Rachycentron canadum, bacterial diseases, Vibrio

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, cá bớp đang là đối tượng được quan tâm chú trọng vì chúng có nhiều ưu điểm như

cá có tốc độ tăng trưởng nhanh, khả năng chống chịu cao thích hợp với điều kiện sóng gió ở vùng biển khơi, giá trị kinh tế cao (Nguyễn Quang Huy, 2002) Việc phát triển mở rộng diện tích nuôi cá bớp đòi hỏi một số lượng lớn cá giống, để đáp ứng yêu cầu này, công nghệ sản xuất con giống nhân tạo cá bớp đã được tập trung nghiên cứu và đầu tư phát triển Gần đây trường Đại học Cần Thơ đã nghiên cứu và sản xuất giống thành công cá bớp góp phần đáp ứng nhu cầu thị trường và phát triển đối tượng này tại vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long Tuy nhiên, trong quá trình ương nuôi vẫn còn gặp nhiều khó khăn, tỷ lệ cá hao hụt nhiều do dịch bệnh đã làm giảm hiệu quả sản xuất

Nhóm vi khuẩn Vibrio được xác định là tác nhân gây bệnh phổ biến ở các loài cá biển trên thế giới Theo Peggy and Ruth (2009), tỷ lệ cá chết khi nhiễm Vibrio có thể trên 50% trong một

đợt dịch, cá có dấu hiệu hôn mê, màu sắc cơ thể biến đổi và xuất hiện vùng hoại tử Khi cá bệnh nặng nội quan có thể xuất huyết hoặc bên trong chứa đầy dịch lỏng Năm 2001,

Vibrio alginolyticus được xác định là tác nhân gây bệnh trên cá bớp có dấu hiệu lở loét tại Đài Loan (Rajan et al., 2001) Đến năm 2006 Vibrio vulnificus được Liu et al xác định chính là

nguyên nhân gây bệnh trên cá bớp Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu chính thức nào về cá bớp

bị lở loét nuôi ở ĐBSCL Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả phân lập, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn và xác định độ nhạy của một số loại kháng sinh đối với vi khuẩn phân lập được nhằm cung cấp thông tin cho việc phòng trị bệnh hiệu quả

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp thu mẫu

Cá bớp được thu trực tiếp từ các bể ương composite tại trại thực nghiệm nước lợ - Khoa Thủy Sản – ĐHCT Cá được thu khi cá có dấu hiệu bệnh trong suốt thời gian ương (từ cá bột lên cá giống) Chỉ thu cá (5 – 6 con) ở những bể có xuất hiện cá bệnh và thu 2 cá khỏe ở bể không có dấu hiệu bệnh lý Tổng số 14 đợt thu mẫu gồm 51 mẫu cá bệnh và 12 mẫu cá khỏe

Phương pháp nghiên cứu ký sinh trùng

Tổng số 63 mẫu cá gồm cá bột, cá hương và cá giống được kiểm tra ký sinh trùng (KST) tổng thể gồm da, mang, vây và nội quan Phương pháp định danh KST dựa vào đặc điểm hình thái

và cấu tạo của KST theo phương pháp nghiên cứu KST trên cá của Hà Ký (1992), Đỗ Thị

Hòa và ctv (2004) và Bùi Quang Tề (2008)

Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn

Quan sát và ghi nhận dấu hiệu bệnh lý bên ngoài Sử dụng cồn 70% sát trùng mặt ngoài của

cá và lau sạch, dùng dao đã tiệt trùng vạch một đường ở vết thương, gan, thận và tỳ tạng Sau

đó dùng que cấy lấy mẫu bệnh phẩm từ điểm vừa rạch và cấy trên môi trường Tryptic soya agar (TSA, bổ sung 1,5% NaCl) và môi trường Thiosulphate citrate bile salt sucrose agar (TCBS) Ủ đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ 28oC Sau 24 – 48 giờ thì ghi nhận màu sắc, hình dạng khuẩn lạc, tiến hành tách ròng cho đến khi đạt đĩa cấy thuần

Định danh vi khuẩn dựa theo các đặc điểm về hình thái, sinh hóa của vi khuẩn được xác định bằng cách kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản, test O/F, test O/129 và sử dụng bộ kít API 20E

Phương pháp lập kháng sinh đồ

Chọn 10 loại kháng sinh gồm: Rifampicin (RD/5µg), Florfenicol (FFC/30µg ), Cephalexin (CL/30µg ), Doxycycline (DO/30µg), Cefotaxin (CTX/30µg), Ciprofloxacin (CIP/5µg), Flumequine (UB/30µg), Amoxycilin + Clavulanic acid (2:1) (AMC/30µg), Colistin sulphate (CT/10µg) và Erythromycin (E/15µg)

Phương pháp lập kháng sinh đồ được thực hiện theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2006 Sử dụng môi trường TSA (bổ sung thêm 1,5% NaCl) Sau 24h tiến hành đo đường kính vòng vô trùng (mm) nhằm xác định loại kháng sinh nhạy, trung bình và kháng

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả phân lập vi khuẩn trên cá Bớp

Dấu hiệu bệnh lý

Cá bớp có dấu hiệu bệnh lý: cá bỏ ăn, lờ đờ, xuất hiện vùng hoại tử trên thân hoặc xuất huyết nội quan, một số có hiện tượng bụng trương to có chứa dịch lỏng bên trong Vi khuẩn phân lập hầu hết ở vùng nội quan như gan, thận và tỳ tạng Khi quan sát dưới kính hiển vi cho thấy

vi khuẩn gram âm, hình que ngắn

Hình 1: Cá bớp bị lở loét 2 bên thân (trái), bụng cá trương to (phải)

Kết quả phân lập vi khuẩn

Kết quả phân lập được 22 chủng vi khuẩn từ gan, thận và tỳ tạng cá bớp bệnh Trên môi trường TSA (bổ sung 1,5% NaCl) sau 24 giờ, ở 28oC vi khuẩn phát triển thành các khuẩn lạc hình tròn, trơn, màu trắng đục, kích thước từ 1 – 2mm Các khuẩn lạc này được cấy trên môi trường TCBS, kết quả ghi nhận có 2 dạng khuẩn lạc: màu vàng, tròn, hơi lõm, kích thước từ 1 – 2mm và khuẩn lạc màu xanh, tròn, trơn, kích thước khoảng 2mm

Kết quả định danh bằng bộ kít API 20E cho thấy nhóm vi khuẩn có khuẩn lạc màu vàng là

Vibrio alginolyuticus, nhóm vi khuẩn có khuẩn lạc màu xanh là Vibrio parahaemolyticus Sự khác biệt giữa V alginolyuticus và V parahaemolyticus là V alginolyuticus có khả năng sử dụng sucrose trong khi V parahaemolyticus không sử dụng sucrose (Buller, 2004)

Bảng 1: Đặc điểm hình thái, sinh-hóa của các chủng vi khuẩn phân lập trên cá bớp và 2 chủng

tham khảo

Chỉ tiêu

V alginolyticus V parahaemolyticus

Phân lập Buller, 2004 Phân lập ATCC 43996

Sinh Tryptophane

Ghi chú: (+) dương tính; (-) âm tính; Y = màu vàng; G= màu xanh; v = variable reaction;

w = weak

Qua bảng 1 cho thấy, các vi khuẩn phân lập là vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, di động, phản ứng dương tính với oxidase và catalase, có khả năng lên men trong cả hai điều kiện hiếu khí và yếm khí Tất cả các chủng đều cho phản ứng âm tính với β-Galactosidaza, arginine và phản ứng Voges-Proskauer nhưng cho phản ứng dương tính với lysine, chúng không sinh ureaza và H2S nhưng sinh indole Tất cả đều mọc trên môi trường TCBS, sử dụng đường glucose và manitol nhưng không sử dụng đường inositol, sorbitol, rhamnose và arabinose,

nhạy cảm với hợp chất 2,4-diamino-6,7-diisopropyl pteridine (O/129) ở nồng độ 150µg nhưng lại kháng với hợp chất này ở nồng độ 10µg Khi so sánh đặc điểm sinh hóa của các

chủng phân lập được với 2 chủng tham khảo của Buller (2004) nhận thấy các chủng V alginolyticus có một vài chỉ tiêu sai khác nhưng trong mức độ cho phép còn các chủng V parahaemolyticus tất cả các chỉ tiêu đều phù hợp với chủng tham khảo

Theo Rajan et al (2001), đã phân lập và xác định V alginolyticus từ cá bớp bị xuất huyết và

lở loét trên thân tại Đài Loan Theo Liu et al (2004), V alginolyticus được xác định là tác

nhân gây bệnh trên cá bớp có dấu hiệu da có màu tối, mắt bị hư hỏng và có chứa dịch trong xoang bụng

Bên cạnh đó, khi khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn ở 5 nồng độ 0, 1, 2, 4, 8% NaCl trong môi trường lỏng BHI (Brain Heart Infusion) Kết quả cho thấy vi khuẩn có thể sinh trưởng ở môi trường có nồng độ NaCl từ 0 – 8% Và đa số các chủng vi khuẩn đều có thể phát triển ở nhiệt độ từ 25-37oC Tuy nhiên, kết quả trong nghiên cứu này hơi cao hơn so với

kết quả của những nghiên cứu khác như V parahaemolyticus (ATCC 43996) chỉ có thể phát triển ở môi trường chứa 0–3% NaCl (Buller (2004) Theo Rajan et al (2001), V alginolyticus

phát triển ở 3-6% NaCl không phát triển ở NaCl 8%

Kết quả kháng sinh đồ

Trong nghiên cứu này đã tìm thấy hầu hết các chủng vi khuẩn (V alginolyticus và V parahaemolyticus) đều nhạy với flofenicol, doxycyclin và flumequine Ngoài ra, cũng tìm

thấy hầu như các chủng vi khuẩn đều kháng với 2 loại kháng sinh cephalexin và colistin sulphate Đối với các loại kháng sinh còn lại, rifamicin và ciprofloxacin đều nhạy đến 90% và 10% nhạy trung bình; cefotaxin có 80% nhạy và 20% nhạy trung bình; amoxycillin tính nhạy thấp hơn chỉ 60% còn lại 40% nhạy trung bình; riêng erythromycin nhạy chỉ 30%, nhạy trung bình đến 60% và 10% các chủng vi khuẩn nói trên kháng lại loại kháng sinh này

Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Rajan et al (2001), khi phân lập V alginolyticus trên cá bớp tại Đài Loan nhận thấy rằng V alginolyticus đều nhạy cảm với

flumequine Trong nghiên cứu của Viên Đại Phúc (2011), có 4 loại kháng sinh là Kanamycin,

erythromycin, cephalexin và ampicicllin đều kháng với V alginolyticus phân lập trên cá chẽm

bị lở loét tại Khánh Hòa

Qua kết quả kháng sinh đồ cho thấy có thể sử dụng flofenicol, doxycyclin, flumequine, rifamicin và ciprofloxacin để điều trị cho cá bớp khi cá bị xuất huyết, lở loét Tuy nhiên, cũng cần có nhiều nghiên cứu hơn nữa về liều lượng cũng như phương pháp sử dụng kháng sinh để hiệu quả điều trị cao hơn

0 10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Tỷ lệ %

Loại kháng sinh

Nhạy Trung Bình Kháng

Hình 3: Tỷ lệ phần trăm các chủng vi khuẩn nhạy với các loại thuốc kháng sinh

Ghi chú: FFC: Flofernicol, RD: Rifamicin, DO: Doxycycline, CL: Cephalexin,

E: Erythromycin, CIP: Ciprofloxacin, AMC: Amoxycillin, CTX: Cefotaxin, UB: Flumequine và CT: Colistin sulphate

KẾT LUẬN

Vi khuẩn Vibrio alginolyticus và Vibrio parahaemolyticus đã được phân lập trên cá bớp có

dấu hiệu xuất huyết, lở loét và bụng trương to có chứa dịch bên trong Kết quả kháng sinh đồ cho thấy hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập đều nhạy với flofenicol, doxycycin, flumequine

và hầu hết đều kháng với cephalexin và colistin sulphate

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

Đỗ Thị Hòa, Trần Vỹ Hích, Nguyễn Thị Thùy Giang, Phan Văn Út và Nguyễn Thị Nguyệt Huệ (2008) Các loại bệnh thường gặp trên cá biển nuôi ở Khánh Hòa Tạp chí Khoa Học – Công Nghệ Thủy Sản số 2/2008: 16-23 Trường Đại học Nha Trang

Hà Ký, 1992 Phương pháp nghiên cứu tác nhân gây bệnh ký sinh trùng ở cá Dịch từ bản gốc của V.A Musselius Bộ Thủy sản, Hà Nội

Nguyễn Quang Huy, 2002 Tình hình sản xuất và nuôi thương phẩm cá bớp (Rachycentron canadum) Tạp chí thủy sản, số 7: 14 – 16

Viên Đại Phúc, 2011 Tìm hiểu tác nhân gây bệnh lở loét trên cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi

lồng biển tại Nha Trang – Khánh Hòa Luận văn thạc sĩ sinh học Đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh 73 trang

Tài liệu tiếng Anh

Buller, N.B (Editor), 2004 Bacteria from fish and other aquatic animal: A practical identification manual 361pp

Health Protection Agency (2007) Identification of Vibrio species National Standard Method BSOP ID 19 Issue 2 http://www.hpa-standardmethods.org.uk/pdf sops.asp

Inglis, V., R J Roberts and N R Bromage, 1993 Bacterial diseases of fish Institute of Aquaculture, University of Stirling, 312pp

Kaiser, J B and G J Hoff, 2005 Species profile cobia SRAC publication No 7202

Liu, P., J Lin, P Hsiao, and K Lee, 2004 Isolation and characterzation of pathogenic vibrio anginolyticus from diseased cobia (Rachycertron canadum) Journal of Basic Microbiolory

44: 23 – 28

Matthew, J M., A Kenneth, J Webb and G J Holt, 2006 Growth and survival of juvenile

cobia, Rachycentron canadum, at different salinities in a recirculating aquaculture system

Aquaculture 253, 398–407

McLean, E., G Salze, S R Craig, 2008 Parasites, diseases and defomities of cobia Ribarstvo 66 (1): 1 – 6

Rajan, P R., C Lopez, J H Y Lin and H L Yang, 2001 Vibrio alginolyticus infection in cobia (Rachycentron canadum) cultured in Taiwan Bulletin of the European Association of

Fish Pathologists 21: 228 – 234

Shaffer, R V and E.L Nakamura, 1989 Synopsis of Biological Data on the cobia,

Rachycentron canadum, (Pisces: Rachycentridae) FAO Fisheries syynop 153 (NMFS/S 153)

U.S DEP Commer, NOAA Technical report NMFS 82-21p

Supranee, C and R J Robert, 1999 Pathology and Histopathology of Eppizootic Ulcerative Syndrome (EUS) Aquatic Animal Healh Research Institue Department of Fisheries Bangkok, Thailand 33pp

Svennevig, N 2001 Farming of Cobia or Black kingfish (Rachycertron canadum) Internet

http://www.eraca.org/grouper/News/02/Cobia-Niels.htm

Toranzo, A E., B Magariños, J L Romalde, 2005 A review of the main bacterial fish diseases in mariculture systems Aquaculture 246: 37 – 61