Nghiên cứu sự hình thành một số chất bảo vệ ở cây lạc (arachis hypogaea l ) trong điều kiện thiếu nước (LV01337)

Kết quả nghiên cứu về sự hình thành chất bảo vệ ở thực vật nói chung và cây lạc nói riêng khi bị khô hạn..... Những năm gần đây các nhà nghiên cứu tập trung đi sâu nghiên cứu về ảnh hưởn

VŨ THỊ VÂN

NGHIÊN CỨU SỰ HÌNH THÀNH MỘT SỐ CHẤT BẢO VỆ Ở CÂY LẠC (Arachis hypogaea L.)

TRONG ĐIỀU KIỆN THIẾU NƯỚC

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN VĂN MÃ

HÀ NỘI, 2014

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Nguyễn Văn Mã là người trực tiếp hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2; khoa Sinh – KTNN; Trung tâm Hỗ trợ nghiên cứu khoa học và Chuyển giao công nghệ trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2; các thầy, cô giáo đã giúp

đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình và các anh, chị, em, bạn bè đã giúp đỡ, chia sẻ, động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Hà Nội, tháng 6 năm 2014

Học viên

Vũ Thị Vân

nghiên cứu khoa học và Chuyển giao công nghệ trường Đại học trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Văn Mã Những kết quả, số liệu trong luận văn là trung thực, của riêng tôi và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình khoa học nào khác

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm nội dung khoa học của đề tài

Hà Nội, tháng 6 năm 2014

Học viên

Vũ Thị Vân

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa lí luận và thực tiễn 3

NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÍ LUẬN CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4

1.1 Đặc điểm sinh trưởng, phát triển và nhu cầu về nước của cây lạc 4

1.1.1 Đặc tính sinh học của cây lạc 4

1.1.2 Các thời kì sinh trưởng, phát triển và nhu cầu về nước của cây lạc 5

1.2 Ảnh hưởng của sự thiếu nước đến thực vật nói chung và cây lạc nói riêng 7

1.2.1 Hạn và tác hại của hạn hán 7

1.2.2 Tính chịu hạn ở thực vật 10

1.3 Một số chất bảo vệ liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật 11

1.3.1 Proline 11

1.3.2 Đường khử 14

1.3.3 Glycine betaine 16

1.4 Kết quả nghiên cứu về sự hình thành chất bảo vệ ở thực vật nói chung và cây lạc nói riêng khi bị khô hạn 18

1.4.1 Trên thế giới 18

1.4.2 Ở Việt Nam 22

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Cách bố trí thí nghiệm 25

2.3.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu 26

2.3.3 Phương pháp xử lí số liệu 29

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Kết quả thăm dò nồng độ đường 30

3.2 Ảnh hưởng của khô hạn đến sự hình thành proline 31

3.2.1 Ảnh hưởng của khô hạn đến sự hình thành proline ở giai đoạn nảy mầm 32

3.2.2 Ảnh hưởng của khô hạn đến sự hình thành proline ở lá các giai đoạn cây non, ra hoa và tạo quả 34

3.3 Ảnh hưởng của khô hạn đến sự hình thành đường khử 36

3.3.1 Ảnh hưởng của khô hạn đến sự hình thành đường khử ở giai đoạn nảy mầm 37

3.3.2 Ảnh hưởng của khô hạn đến sự hình thành đường khử ở giai đoạn cây non, ra hoa và tạo quả 39

3.4 Ảnh hưởng của sự khô hạn đến sự hình thành glycine betaine 42

3.4.1 Ảnh hưởng của khô hạn đến sự hình thành glycine betaine ở giai đoạn nảy mầm 42

3.4.2 Ảnh hưởng của khô hạn đến sự hình thành glycine betaine ở giai đoạn cây non, ra hoa và tạo quả 44

KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Lạc (Arachis hypogaea L.), có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ

(Braxin, Boolivia, Paragoay…) Cây lạc là cây công nghiệp ngắn ngày, cây lấy dầu có giá trị kinh tế cao, được trồng ở nhiều nước vùng nhiệt đới nóng ẩm, nóng khô đến á nhiệt đới và cả một số vùng ôn đới có nhiều mưa như Ấn Độ, Trung Quốc, Hoa Kỳ, Thái Lan, Xu Đăng…

Cây lạc là một trong những cây lấy dầu quan trọng trên thế giới Ở Việt Nam, cây lạc đang đứng đầu trong những cây công nghiệp ngắn ngày tham gia vào thị trường xuất khẩu và cùng với đậu tương đang là một trong mười chương trình ưu tiên phát triển của nhà nước Mỗi năm nước ta xuất khẩu khoảng 80 - 127 nghìn tấn lạc hạt, chiếm 30 - 50% tổng sản lượng, do vậy cây lạc đã và đang đem lại nguồn lợi kinh tế lớn cho đất nước Ở nhiều vùng sản xuất, lạc còn là nguồn thu nhập chính cho người nông dân [12]

Hạn hán là vấn đề hạn chế về năng suất và chất lượng của lạc Ở nước

ta đa số vùng trồng lạc bị khô hạn Trong tổng diện tích gieo trồng lạc của cả nước có khoảng gần 2/3 diện tích trồng lạc trong điều kiện phụ thuộc nước trời, riêng ở vùng trung du miền núi phía Bắc lạc chủ yếu trồng trên vùng đất bị hạn và bán khô hạn, chiếm 70 - 80% dẫn đến năng suất và chất lượng lạc ở Việt Nam còn thấp

Khô hạn thường làm mất cân bằng về áp suất thẩm thấu Trong lúc này một trong những phản ứng thường gặp nhất là cơ chế liên quan đến những thay đổi hóa sinh trong tế bào nhằm nhanh chóng bù lại sự thiếu nước, tích lũy các chất bảo vệ như các chất hòa tan; các protein sốc thẩm thấu; proline, alanine, glycine betaine, polyamine; đường khử; mannitol; fructane; ion K+… Chúng có vai trò bảo vệ các phức ezyme, cấu trúc tế bào, đồng thời làm tăng cường áp suất thẩm thấu cho tế bào khi gặp các yếu tố cực đoan [36]

Trên thế giới cũng như ở Việt Nam việc nghiên cứu tính chịu hạn được tiến hành ở nhiều mức độ khác nhau, trên nhiều loại cây trồng khác nhau trong đó có cây lạc Trước đây, các nhà nghiên cứu chủ yếu nghiên cứu theo hướng sinh lý, tập trung về dinh dưỡng khoáng, hàm lượng diệp lục, huỳnh quang diệp lục, cường độ quang hợp… trong điều kiện stress nước Những năm gần đây các nhà nghiên cứu tập trung đi sâu nghiên cứu về ảnh hưởng của hạn hán và một số yếu tố stress môi trường khác, sự hình thành các hợp chất thứ cấp có vai trò bảo vệ tế bào trong điều kiện stress, hoạt động của enzyme trong điều kiện khắc nghiệt, sự truyền tín hiệu stress môi trường… Riêng về các chất bảo vệ cũng có khá nhiều công trình nghiên cứu nhưng còn riêng lẻ, tản mạn và chưa có nghiên cứu nào về sự hình thành các chất bảo vệ

ở cây lạc khi bị thiếu nước

Chính vì vậy, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu sự hình thành một số

chất bảo vệ ở cây lạc (Arachis hypogaea L.) trong điều kiện thiếu nước”,

để làm rõ mức độ hình thành một số chất bảo vệ thường gặp ở thực vật nói chung và cây lạc nói riêng khi bị thiếu nước

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu sự hình thành một số chất bảo vệ ở cây lạc trong điều kiện

bị khô hạn

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

Xác định hàm lượng proline, đường khử, glycine betaine giai đoạn nảy mầm, giai đoạn cây non, giai đoạn ra hoa và giai đoạn tạo quả

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng

Đối tượng nghiên cứu là giống lạc L24 (chịu hạn tốt) do Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp

4.2 Phạm vi

Nghiên cứu một số chất bảo vệ (proline, đường khử, glycine betaine) trong điều kiện phòng thí nghiệm (giai đoạn nảy mầm) và trong điều kiện nhà lưới (giai đoạn cây non, ra hoa và tạo quả)

5 Ý nghĩa lí luận và thực tiễn

Bổ sung tài liệu về ảnh hưởng của sự khô hạn tới sự hình thành một số chất bảo vệ ở cây trồng

NỘI DUNG CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÍ LUẬN CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Đặc điểm sinh trưởng, phát triển và nhu cầu về nước của cây lạc 1.1.1 Đặc tính sinh học của cây lạc

Cây lạc (còn có tên gọi khác là đậu phộng, đậu nụ) có tên khoa học là

Arachis hypogaea L là cây thực phẩm, cây công nghiệp lấy dầu trong nhóm

cây trồng cạn Mặc dù cây lạc đã có từ rất lâu đời nhưng vài trò của cây lạc mới được công bố từ khoảng 100 năm trở lại đây Trồng lạc mang lại nguồn lợi có giá trị về kinh tế và dinh dưỡng, đồng thời còn để cải tạo đất rất tốt nhờ

khả năng cộng sinh với vi khuẩn Rhizobium… [3]

Lạc là cây thân thảo hàng năm, có thân chính cao khoảng 25 – 50cm, thân sinh trưởng nhanh từ sau khi mọc đến khi cây có 3 lá, sau đó sinh trưởng chậm dần Từ khi cây bắt đầu ra hoa cho đến khi tắt hoa thì tốc độ sinh trưởng của lạc lại rất nhanh Cây lạc có 2 loại cành là cành cấp I (mọc từ thân chính

ra, có thể phát sinh từ đốt thứ 1 đến đốt thứ 6 trên thân chính) và cành cấp II, tốc độ sinh trưởng của cành cấp II nhanh hơn cành cấp I Khi cây bắt đầu nở hoa thì cành gần như đã đạt mức tối đa

Lá lạc là loại lá kép lông chim, có bốn lá chét hình trái xoan ngược mọc đối nhau, gốc lá tù, đầu lá tròn hoặc lõm, mỏng như màng Lạc còn có hai lá kèm làm thành bẹ bao quanh thân, hình dải nhọn Trên thân chính thường có khoảng 20 – 30 lá Sau khi mọc, diện tích lá tăng dần và tăng nhanh nhất vào thời kì ra hoa rộ

Khi cây lạc có 5 - 6 lá trên thân chính thì bắt đầu có sự phân hóa các mầm hoa từ các mắt của cành Hoa lạc màu vàng, mọc thành từng chùm ở nách lá gồm 2 – 4 hoa nhỏ Hoa lạc là hoa lưỡng tính, tự thụ phấn nghiêm ngặt (tỷ lệ ngoại phấn khoảng 0,25%) Khi hoa nở là cây tự thụ phấn xong rồi Tuy hoa lạc nở hoa trên cành nhưng cuống hoa dài ra đưa xuống đất và hình thành

quả trong đất (nên người ta gọi là củ lạc), do đó những hoa ra muộn, ở trên cao quá sẽ không thành quả được Quả lạc có hình trụ thuôn, hơi thắt lại ở giữa các hạt Vỏ quả cứng, phân mạng, mỗi quả có 1 - 4 hạt Hạt hình trứng,

có rãnh dọc, bên ngoài hạt có lớp vỏ lụa màu đỏ, vàng cánh sen hoặc trắng

Cây lạc có hai loại rễ là rễ cọc và rễ con Khi hạt lạc nảy mầm thì phôi

rễ phát triển trước và chui ra khỏi vỏ hạt sớm nhất Sau đó rễ lạc tăng dần về chiều dài đến khi hết thời kì hoa nở rộ trong đó tăng nhanh nhất vào lúc nở hoa, sau đó tăng chậm lại Đặc biệt rễ cái cắm sâu rất nhanh trước khi cây bắt đầu nở hoa rộ và sau đó chậm dần lại Trên rễ lạc có nhiều nốt sần, bên trong

nốt sần chứa nhiều vi khuẩn Rhizobium sống cộng sinh với rễ cây lạc, chúng

có khả năng cố định nitơ tự do không khí tạo đạm cung cấp cho cây và đất [1], [4], [5]

1.1.2 Các thời kì sinh trưởng, phát triển và nhu cầu về nước của cây lạc

Cây lạc sinh trưởng và phát triển kéo dài trong khoảng 95 -135 ngày tùy vào từng giống và được chia làm 4 thời kì: [1], [4], [5]

 Thời kì nảy mầm là thời kì diễn ra trong thời gian ngắn từ 3 - 8 ngày tùy giống và phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh.Với điều kiện hạt giống tốt,

ẩm độ, nhiệt độ không khí đầy đủ, từ 3-5 ngày sau khi gieo hạt sẽ nảy mầm Khi bắt đầu gieo, hạt hút nước đến khi đủ nước hạt sẽ trương lên nhanh, các enzyme bắt đầu phân giải chuyển hóa các hợp chất hữu cơ tạo nguyên liệu cho quá trình sinh trưởng của rễ và mầm Khi hạt nứt, rễ mầm nhú và chui ra khỏi hạt cắm xuống đất, rồi sau đó lá mầm phát triển nhanh, phôi mầm mọc hình thành cây lạc

Ở thời kì này đòi hỏi nhu cầu về nước rất cao, hạt lạc phải được hút đủ nước thì mới nảy mầm được Nếu bị thiếu nước hoặc thời tiết lạnh thì khả năng nảy mầm của hạt lạc sẽ gặp khó khăn dẫn đến tỷ lệ nảy mầm thấp

 Thời kỳ cây con và trước khi ra hoa là thời kì tính từ khi lạc bắt đầu mọc mầm đến trước khi bắt đầu trổ hoa, kéo dài 25 - 45 ngày tùy vào giống, điều kiện nhiệt độ, ẩm độ Thời kỳ này được chia làm 2 giai đoạn nhỏ là giai đoạn cây non và giai đoạn trước ra hoa Giai đoạn cây non tính từ lúc xòe lá mầm đến khi cây có 4 lá thật Giai đoạn này bộ rễ bắt đầu phát triển hoàn chỉnh nhưng khả năng hoạt động còn yếu, vi khuẩn nốt sần mới hình thành Giai đoạn trước ra hoa được tính từ khi cây có 4 lá thật đến lúc trước khi ra hoa, lúc này cây sinh trưởng tăng dần do sự hoàn thiện của bộ rễ và lá

Thời kỳ này cây rất cần đạm và các chất dinh dưỡng để sinh trưởng, còn nhu cầu về nước ở thời kì này thì bình thường nhưng lại cần thiết do nước vừa là môi trường cho các phản ứng sinh hóa trong cây, vừa là nguồn nguyên liệu cho quang hợp để tổng hợp các chất hữu cơ cho cây sinh trưởng Nếu thiếu nước, cây sẽ sinh trưởng chậm, còi cọc và chuyển sang trạng thái phát triển sớm

 Thời kỳ ra hoa, đâm tia và làm quả là thời kì cây diễn ra đồng thời 2 quá trình sinh trưởng sinh dưỡng (thân, cành, lá) và sinh trưởng sinh thực (ra hoa, đâm tia) Hoa nở từ dưới lên trên và từ trong ra ngoài Trong thời gian này có những đợt hoa nở rộ Hoa hình thành trong 2-5 tuần đầu có độ hữu dụng cao nhất Sau khi thụ tinh 6 ngày tia củ sẽ dài ra, 5 - 10 ngày sau tia củ

sẽ chui xuống đất và phát triển ở độ sâu 2-7cm Sau thời kỳ đâm tia, thân lá phát triển chậm dần là điều kiện tốt nhất cho cây đậu quả, quả sẽ được chắc

Trong thời kỳ này cây rất mẫm cảm với điều kiện ngoại cảnh, nếu nhiệt

độ nhỏ hơn 240

C cây sẽ ra hoa ít và ra không tập trung Thời kì này cây lạc chỉ cần đủ nước chứ không cần độ ẩm quá cao, độ ẩm cần thiết là 60-70%, nếu độ ẩm lớn hơn 80% thân sẽ bị đổ ngã, hoa ít, cây bị vống nhưng nếu thiếu nước ở thời kỳ này sẽ tạo điều kiện hình thành tầng rời ở cuống hoa, gây sự rụng hoa, giảm năng suất sản phẩm

 Thời kỳ hình thành quả, hạt và chín kéo dài 60 – 70 ngày, chiếm khoảng một nửa thời gian sinh trưởng và phát triển của cây lạc Khi tia (bầu hoa) đâm vào đất sẽ lớn dần hình thành quả và hạt Lúc này cây phát triển chậm dần đi, tập trung dinh dưỡng phát triển quả và hình thành hạt Quả và hạt của cây lạc có sự biến đổi về hình thái và sinh lí rất nhanh chóng, hàm lượng nước giảm dần, chất khô và lipit trong quả tăng lên

Thời kì này cây lạc có nhu cầu về nước không cao, nếu độ ẩm lớn sẽ gây thối tia, thối quả và gây nảy mầm cho hạt Nhưng nếu thiếu nước bầu hoa

sẽ bị héo và nếu thiếu trầm trọng bầu hoa sẽ ngừng sinh trưởng

Như vậy, ở các thời kì sinh trưởng và phát triển khác nhau của cây lạc thì nhu cầu về nước là khác nhau Tuy nhiên, cũng cần tưới đủ nước cho tất cả các thời kì nảy mầm, cây con, ra hoa và tạo quả Mặc dù cây lạc rất cần nước, nhưng lại không quá ưa ẩm Vì vậy, để cây sinh trưởng tốt, cho năng suất và chất lượng cao cần tưới nước đúng lúc và duy trì độ ẩm đồng ruộng thường xuyên khoảng 65 – 70%, thừa nước làm cây dễ mắc bệnh, hoa rụng, tia thối, hạt dễ nảy mầm gây giảm năng suất

1.2 Ảnh hưởng của sự thiếu nước đến thực vật nói chung và cây lạc nói riêng

1.2.1 Hạn và tác hại của hạn hán

Hạn ở thực vật là khái niệm để chỉ sự thiếu nước của cây trong suốt quá trình hay từng thời kỳ làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển Có nhiều nguyên nhân gây nên hạn như sự thiếu nước do mưa hoặc không tưới nước trong thời gian dài làm cạn kiệt độ ẩm trong đất hoặc đủ nước nhưng do môi trường áp suất thẩm thấu cao cây không lấy được nước Trong thiên nhiên, hạn hán là hiện tượng thường xuyên xảy ra và liên quan trực tiếp đến vấn đề nước trong cây

Hạn hán là một nguyên nhân quan trọng làm giảm năng suất và chất

lượng sản phẩm của cây trồng Khi môi trường hạn hán cây bị stress mất nước dẫn đến nhiều hậu quả nghiêm trọng như: gây nên hiện tượng co nguyên sinh làm cho nước trong tế bào thất thoát ra ngoài nên khối nguyên sinh chất của tế bào co lại, thể tích không bào bị thu hẹp dẫn đến cây bị héo tạm thời hoặc có thể vĩnh viễn nếu sự thiếu nước xảy ra nghiêm trọng và trong thời gian dài; cản trở sự vận chuyển nước trong mạch gỗ do sự cung cấp nước cho rễ trong đêm không đủ để thủy hóa các mô đã bị thiếu nước ban ngày, dẫn đến các lông hút bị tổn thương, lớp ngoài vùng vỏ bị phủ chất sáp (suberin) làm giảm áp suất rễ hoặc hình thành nhiều bọt khí trong mạch gỗ dẫn đến phá vỡ tính liên tục của cột nước trong mạch gỗ; lớp cutin trên bề mặt

lá dày lên làm giảm sự thoát hơi nước qua biểu bì; làm giảm cường độ quang hợp (khi hàm lượng nước trong lá còn khoảng 40 -50% quang hợp của lá bị đình trệ); cản trở sự sinh trưởng của cây trồng do ảnh hưởng đến các hoạt động sinh lý, nhất là quang hợp dẫn đến giảm năng suất cây trồng nghiêm trọng

[37], [42]

Thiếu nước có thể gây ra nhiều mức độ tổn thương khác nhau cho cây trồng như: phát triển không bình thường, chậm phát triển, gây chết Những cây trồng có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất khá ổn định trong điều kiện thiếu nước gọi là cây chịu hạn và khả năng thực vật có thể giảm mức

độ tổn thương do thiếu hụt nước gây ra gọi là tính chịu hạn (tính chịu thiếu nước) Mức độ hạn do môi trường gây nên ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của cây, nhẹ thì làm giảm năng suất, nặng có thể dẫn đến hủy hoại cây cối mùa màng và thường gặp các dạng hạn sau:

* Hạn đất xảy ra khi lượng nước trong đất đã bị cạn kiệt làm cho rễ cây không thể hút đủ nước để bù đắp lại lượng nước đã bị mất qua con đường thoát hơi nước ở lá, dẫn tới sự mất cân bằng nước trong cây và xuất hiện dấu hiệu héo Mức độ khô hạn của đất còn tùy thuộc vào sự bốc hơi nước trên bề

mặt và khả năng giữ nước của đất Hạn đất kéo dài làm cho áp suất thẩm thấu của đất tăng lên đến mức cây không thể cạnh tranh được nước của đất để lấy vào cơ thể qua rễ Chính vì vậy hạn đất thường gây ra hiện tượng héo lâu dài Đối với cây họ đậu trong đó có cây lạc nếu bị hạn đất ở giai đoạn sinh sản sẽ làm cho hạt bị héo, nhăn nheo, phẩm chất kém, thậm chí không cho thu hoạch

[59], [65]

* Hạn không khí xuất hiện do không có mưa một thời gian dài trong thời kì khô hạn, khi độ ẩm tương đối của không khí giảm xuống dưới 65% Hạn không khí làm gia tăng gradient hơi nước giữa khoảng không gian dưới khí khổng và khoảng không gian ngay bên ngoài lá dẫn đến thoát hơi nước tăng nhanh gây nên sự mất cân bằng nước trong mô và cây bị héo Hạn không khí thường tác động chủ yếu đến các bộ phận trên mặt đất như hoa, lá, chồi non Ở cây trồng, hạn không khí có tác hại xấu nhất ở thời kì nảy mầm và thời

kỳ ra hoa làm cho hạt phấn không nảy mầm được rồi khô mà chết, quá trình thụ tinh không xảy ra làm quả không hình thành

Trong nhiều trường hợp, hạn không khí và hạn đất cùng xảy ra sẽ càng làm gia tăng sự mất nước qua quá trình thoát hơi nước, tăng sự bốc hơi nước ở mặt đất vốn đã cạn kiệt và lúc này khô hạn càng trở nên nghiêm trọng hơn Trong điều kiện đó, hạn càng gây khó khăn nhiều hơn cho cây trồng dẫn đến nhiều giống cây trồng dễ bị chết

Đặc biệt hạn sinh lí xuất hiện khi trạng thái sinh lí của cây không cho phép cây hút nước do đất, không khí khô hạn hoặc do môi trường không thiếu nước nhưng đất khị khí thiếu oxi cho nên rễ không đủ năng lượng cho cây hút nước hoặc do nồng độ dung dịch đất quá cao làm áp suất thẩm thấu của đất tăng cũng làm cho rễ không hút được nước Khi đó, quá trình thoát hơi nước vẫn diễn ra nên cây mất cân bằng nước Mức độ hạn sinh lý phụ thuộc vào sự thoát hơi nước trên bề mặt và khả năng giữ nước của các tế bào Hạn sinh lí

kéo dài sẽ gây ảnh hưởng rất nhiều đến chất lượng và năng suất của nông phẩm

1.2.2 Tính chịu hạn ở thực vật

Tính chịu hạn của thực vật là khả năng thích nghi được hình thành trong đời sống để chống chịu với điều kiện hạn hán của môi trường Theo nhận định của Nguyễn Huy Hoàng [7] sự thích nghi đó được thực hiện nhờ cơ thể điều chỉnh các cấu trúc và chức năng ở các mức độ tổ chức khác nhau như: sự tạo thành một hệ thống rễ rộng lớn, giảm diện tích lá, đóng khí khổng, tạo thành những kho chứa nước, hình thành những tuyến muối, tập trung các chất hòa tan Trong điều kiện đất bị khô, độ ẩm không khí thiếu, những giống cây chịu được hạn là những giống có hàm lượng nước liên kết và nồng độ dịch bào tăng, áp suất thẩm thấu cao Chúng có khả năng bảo tồn được quá trình trao đổi chất bình thường hoặc có tốc độ thiết lập các phản ứng bảo vệ trong quá trình trao đổi chất lớn khi tác động của hạn vượt quá giới hạn cho phép

Để chống lại sự mất nước do nguyên nhân từ các tác động của bên ngoài, ở thực vật có hai cơ chế sinh lý chủ yếu được thảo luận, đó là cơ chế bên ngoài liên quan đến hình thái, giải phẫu… và cơ chế bên trong liên quan đến quá trình trao đổi chất, hoạt động của enzim, các chất bảo vệ hay protein sốc thẩm thấu…

Các cơ chế bên ngoài như là: thực vật có thể hoàn thành chu kỳ sống sớm hơn trước khi sự thiếu nước xảy ra, muốn vậy cây phải có sức sinh trưởng và phát triển mạnh để có thể ra hoa và tạo quả sớm dẫn đến thời điểm thiếu nước không ảnh hưởng đên chu kỳ sống của cây; hoặc thực vật có thể nhanh chóng bù lại sự thiếu nước thông qua những biến đổi về hình thái như thay đổi độ mở khí khổng, giảm diện tích lá, định hướng sự phát triển của lá theo hướng giảm sự hấp thụ bức xạ, tăng cường hấp thụ nước bằng sự phát triển sâu rộng của bộ rễ … [47] Cơ chế này phụ thuộc vào sự thích nghi đặc

biệt về hình thái và cấu trúc của lá và rễ nhằm giảm thiểu sự mất nước và tăng cường sự hút nước Cây nào khi bị hạn có hệ thống rễ đâm sâu, lan rộng sẽ không phải chịu đựng khô hạn khắc nghiệt như những cây có hệ thống rễ nằm ngay trên mặt đất Một mặt khác của cơ chế này là sự tạo thành những “u thịt”

ở những cơ quan của cây, nó có vai trò như những cái kho chứa nước, chứa oxi [33]

Cơ chế bên trong (cơ chế chịu mất nước) liên quan đến những thay đổi hóa sinh trong tế bào nhằm sinh tổng hợp ra các chất bảo vệ, hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu nước bằng cách tích lũy các chất hòa tan như các protein sốc thẩm thấu, các acid amine (proline, alanine…), mannitol, fructane, đường khử… để điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào Duy trì được áp suất thẩm thấu nội bào có tác dụng bảo vệ hoặc duy trì sức sống, độ đàn hồi của tế bào ngay cả khi bị mất nước cực đoan, đó là khả năng chịu hạn [33]

Tác dụng bảo vệ tế bào trong điều kiện bị mất nước nhờ các phản ứng hóa sinh là đảm bảo được sự khử độc các sản phẩm tạo nên trong quá trình phân giải các hợp chất cao phân tử hoặc xúc tiến sự phục hồi các cấu trúc phân tử bị hư hại Sau khi hạn ngừng tác động, các quá trình phục hồi diễn ra nhanh nếu bộ gen được bảo tồn khỏi sự hư hại trong thời gian khô hạn.Trong điều kiện hạn hán, áp suất thẩm thấu của tế bào được điều chỉnh tăng lên giúp cho tế bào có thể duy trì lượng nước Tuy nhiên, ở cùng một thời điểm bị hạn thực vật sử dụng nhiều hơn một cơ chế chống hạn [47]

1.3 Một số chất bảo vệ liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật

1.3.1 Proline

Proline hay α - pirolidin cacboxylic là một α - aminoacid ưa nước, có công thức phân tử là C5H9NO2, có mạch bên là hidrocacbua khác với các acid amine khác ở chỗ nhóm amin bậc 1 ở Cα liên kết với cacbon của mạch bên tạo thành vòng pirolidine

Hình 1.1 Công thức cấu tạo và cấu trúc không gian của proline [83]

Proline thuộc nhóm các chất điều hòa thẩm thấu, có khối lượng phân tử nhỏ, có tính chất không tích điện ở pH trung tính (như các ion vô cơ) và có khả năng hòa tan tốt trong nước, không độc khi tập trung với nồng độ cao và làm ổn định cấu trúc các phân tử protein Khi tế bào có sự tâp trung muối cao

và các chất tan có hại khác làm biến tính tế bào thì proline giúp thành tế bào chống lại ảnh hưởng của sự biến tính đó Sự tích lũy các chất điều hòa thẩm thấu có ý nghĩa rất quan trọng bởi vì chúng đóng vai trò nòng cốt trong việc duy trì sức trương của tế bào và hấp thụ ngược gradient nồng độ dưới tác động của stress (Balibrea et all, 2000 [40]; Naidoo G and Naidoo Y 2001

[64]

Proline được tổng hợp từ L.glutamate bởi enzyme chìa khóa δ - pyrroline - carboxilate - synthentase (P5CS), enzyme này được điều hòa bởi proline thông qua cơ chế ức chế ngược Đối với những thực vật chịu được stress nước thì sự điều hòa ngược này đã biến mất và đây có thể là nguyên nhân làm tăng tích lũy proline dưới các điều kiện stress

Theo Kuznetsov (1999) con đường tổng hợp proline trong thực vật diễn

ra như sau:

Hình 1.2 Sơ đồ sinh tổng hợp prolin ở thực vật (theo Kuznetsov 1999)

Proline có cấu trúc vòng pyrolidine tạo cho proline có một cấu trúc vững chắc hơn so với các acid amine khác Proline có vai trò lớn trong chống chịu stress ở thực vật do proline tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào và tham gia vào chức năng bảo vệ màng và protein Proline được tích lũy trong mô lá, mô phân sinh chóp rễ của những thực vật được rèn luyện trong điều kiện stress nước, tích lũy trong hạt phấn bị làm khô, tích lũy ở vùng chóp

rễ đang sinh trưởng nơi thế năng nước thấp và những tế bào thực vật nuôi cấy trong môi trường huyền phù đã thích nghi với stress nước hay stress muối

[33]

Hầu hết trong tế bào và các mô của thực vật khi sống trong những điều kiện sinh lý bình thường đã có một lượng proline rất nhỏ bé [33] Nhưng dưới ảnh hưởng của môi trường khắc nghiệt như hạn hán, băng giá, muối mặn,

bệnh truyền nhiễm… thì hầu hết hoặc ít nhất cũng là một phần lớn proline đều tập trung ở tế bào chất Tại đây, proline có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc điều hòa áp suất thẩm thấu của tế bào chất Hàm lượng proline và sự sinh trưởng của cây có mối liên quan với nhau thể hiện qua sự tăng hàm lượng proline có liên quan chặt chẽ với sự bắt đầu giảm bớt sinh trưởng của thực vật

[63], [73]

Như vậy, proline có ảnh hưởng lớn đến tính chịu hạn ở thực vật Sự tổng hợp proline ở thực vật hay cây trồng diễn ra khi chúng sống trong môi trường khắc nghiệt Những nghiên cứu về proline trên các đối tượng khác nhau cho thấy sự tương quan thuận giữa gia tăng hàm lượng proline với tính chống chịu sự thiếu hụt nước hay stress muối Do đó, có thể xem proline như một chất chỉ thị về khả năng chịu hạn và là biểu hiện của phản ứng thích nghi của thực vật với điều kiện stress nước môi trường

1.3.2 Đường khử

Đường khử là các loại monosaccharide (hay còn gọi là đường đơn), là

trong nước Các ví dụ về monosaccharide bao gồm: glucose, fructose, galactose, levulose, dextrose xylose và ribose trong đó quan trọng và điển hình nhất phải kể đến là glucose, fructose và galactose Chúng có chung công thức phân tử là C6H12O6 nhưng lại có công thức cấu tạo khác nhau Một monosaccharide đơn giản có một mạch hở không phân nhánh chứa một nguyên tử cacbon liên kết với nhóm chức cacbonyl (-C=O) và một cacbon liên kết với nhóm hidroxyl (-OH glucozit) cho nên chúng đều có tính khử

[82]

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử và cấu trúc không gian của glucose [81]

Fructose là một chất giữ nước tuyệt vời trong một thời gian dài thậm

được độ nhớt khá cao vì fructose làm giảm nhiệt độ cần thiết, gây ra một độ

Vì vậy, hàm lượng đường khử trong cây cũng là một chỉ tiêu phản ánh khả năng giữ nước của tế bào do nó có vai trò trong điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong dịch bào Đường khử thuộc các chất có hoạt tính thẩm thấu, nó

giúp tăng cường khả năng giữ nước cho tế bào, tăng khả năng chống chịu của cây đối với các điều kiện bất lợi của môi trường Ở điều kiện thiếu nước hạt mầm và cây con thường bị chết do mất nước và không lấy được nước từ môi trường, vì thế sự tổng hợp và tích lũy đường chính là phản ứng của cây với điều kiện ngoại cảnh bất lợi Theo nghiên cứu của nhiều tác giả còn cho biết hàm lượng đường tan trong cây liên quan trực tiếp đến khả năng chống chịu như chịu hạn, chịu lạnh (Borhnert và cs, 1996; Nguyễn Hoàng Lộc và cs, 2002) [13].

1.3.3 Glycine betaine

Glycine betaine được phát hiện đầu tiên trong củ cải đường ở thế kỷ thứ XIX, nó là một amino acid-trimethylated rất dễ tan trong nước, tích tụ

Glycine betaine là một trong những chất hòa tan tương thích hiệu quả nhất và được tìm thấy trong một phạm vi rộng của các loài động vật, vi khuẩn

và một số loài thực vật hạt kín chịu hạn hán và chịu mặn [45] Trước đây, glycine betaine đã được đề xuất rằng nếu tăng tích lũy các glycine betaine trong các loài thực vật thì nó đóng một vai trò sinh lý quan trọng làm giảm bớt căng thẳng thẩm thấu [77] Trong tự nhiên, ngô, củ cải đường và lúa mạch, nhanh chóng tích lũy glycine betaine trong quá trình cây bị căng thẳng (stress) với muối, hạn hán và nhiệt độ thấp [43] Glycine betaine bảo vệ cây bằng cách hoạt động như một chất hữu cơ có ảnh hưởng đến thẩm thấu (osmolyte), duy trì cân bằng nước giữa các tế bào thực vật và môi trường, ổn định các đại phân tử dưới điều kiện khô hạn và nồng độ muối cao [67]

Glycine betaine tích lũy ở nồng độ cao không gây cản trở chức năng của tế bào chất và có tác dụng đảm bảo tính ổn định cấu trúc và chức năng của các đại phân tử Glycine betaine xuất hiện như một yếu tố quyết định tới khả năng chống chịu điều kiện bất lợi ở cây trồng Chất này có hiệu quả lớn

và liên quan mật thiết đến khả năng sinh trưởng của cây trồng trong điều kiện môi trường hạn hán và nhiễm mặn Mức độ tích lũy glycine betaine tương quan với khả năng chống chịu điều kiện bất lợi Glycine betaine được tích lũy chủ yếu trong lục lạp, nó đóng vai trò quan trọng trong điều chỉnh và duy trì màng thylacoid, do đó duy trì hiệu quả quang hợp [78]

Trong nhiều loài cây trồng, sự tích lũy tự nhiên của glycine betaine đủ

để cải thiện tác động tiêu cực của tình trạng mất nước gây ra bởi những vấn

đề môi trường khác nhau Bên cạnh đó, một số loài cây trồng như lúa, khoai tây, cà chua, thuốc lá… trong tự nhiên không sản xuất glycine betaine trong điều kiện stress hoặc không stress Các ứng dụng của glycine betaine ngoại sinh có thể giúp giảm thiểu tác động tiêu cực của môi trường bên ngoài Glycine betaine ngoại sinh có thể thâm nhập qua lá và được vận chuyển đến các cơ quan nơi mà nó sẽ góp phần tăng cường khả năng chịu đựng stress Ngoài ra, những loài cây này là mục tiêu tiềm năng cho việc ứng dụng kỹ thuật di truyền của quá trình sinh tổng hợp glycine betaine [62]

Ở thực vật bậc cao, glycine betaine được tổng hợp từ serine qua ethanolamine, choline và betaine aldehyde Quá trình sinh tổng hợp glycine betaine ở thực vật trải qua hai bước như sau: (1) Đầu tiên, tiền chất choline được chuyển thành betaine aldehyde (một hợp chất trung gian độc với thực vật) nhờ sự xúc tác của choline monooxygenase (2) Tiếp theo, betaine aldehyde được chuyển thành glycine betaine dưới hoạt động của betaine aldehyde dehydrogenase [70] Mặc dù, con đường tổng hợp glycine betaine trực tiếp từ sự methyl hóa glycine cũng được biết đến, nhưng sự tích lũy

glycine betaine ở tất cả các loài nói chung, thực vật nói riêng được xác định là con đường tổng hợp từ choline theo sơ đồ sau:

Hình 1.6 Con đường tổng hợp glycine betaine 1.4 Kết quả nghiên cứu về sự hình thành chất bảo vệ ở thực vật nói chung và cây lạc nói riêng khi bị khô hạn

1.4.1 Trên thế giới

Việc nghiên cứu về các chất bảo vệ cũng như tính chịu hạn ở thực vật trên thế giới đã được tiến hành ở nhiều nước, trên nhiều loại cây trồng khác nhau, trong đó có cây lạc Đặc biệt sự nghiên cứu về các chất bảo vệ đã được tiến hành rất nhiều nhưng sự nghiên cứu các chất này còn tản mạn, chưa tập trung

Lạc có nhu cầu đặc biệt về độ ẩm do đặc điểm riêng là rễ cắm sâu, không có lông hút và quả hình thành dưới đất Các giai đoạn khác nhau của cây lạc mẫn cảm với sự thiếu hụt nước khác nhau, nhưng không có một giai đoạn nào cây phát triển bình thường với một lượng nước tối thiểu Những nghiên cứu để tìm được giới hạn chịu sự thiếu nước ở mỗi giai đoạn là phức tạp vì trạng thái này là kết quả của sự cân bằng giữa quá trình hút và thoát hơi nước Thời kì mẫn cảm nhất với nước là giai đoạn nảy mầm và giai đoạn ra hoa Giai đoạn hình thành quả, đâm tia xuống đất và quả già ít mẫn cảm với nước hơn Ảnh hưởng của sự thiếu nước rõ nhất là giảm sự tăng trưởng của

các tế bào trên toàn bộ cây, diện tích lá và sự phát triển của cây giảm [14], [36]

Sự tích lũy proline là một sự chuyển hóa thông thường ở thực vât trong điều kiện thiếu hụt nước và stress muối Đây là chủ đề được các nhà khoa học nghiên cứu hơn 20 năm qua ( Delauney and Verma, Ketchum R.E.B, Rhodes

D, and Handa S, Serpil Unyayar, Yiiksel Kiles and Elif Unal) [44], [71],[73], [84]

Các nghiên cứu về sự tập trung proline tự do ở trong các tế bào và mô thực vật dưới ảnh hưởng của những điều kiện khắc nghiệt được tạo nên bởi sự thiếu hụt chất dinh dưỡng như: sự tăng hà lượng proline ở lúa mạch khi có sự thiếu hụt nitơ và bor; sự tăng proline ở củ cải đỏ dưới ảnh hưởng của sự thiếu hụt nitơ, photpho và lưu huỳnh Sự tăng lượng proline cũng được nhận thấy khi có sự kìm hãm sinh trưởng cở rễ thực vật bởi nồng độ cao của hormon thực vật (như auxin) Ngoài ra, trong các thí nghiệm với các chất kìm hãm hoặc các chất ức chế ở lúa mạch (như chlor chloin chlorid – CCC) cũng nhận thấy hàm lượng của proline tự do tăng lên [53]

Sự tăng trưởng của thực vật bị kìm hãm bởi sự khô hạn có thể trở lại bình thường dưới sự ảnh hưởng của axit gibberelic và nhận thấy đồng thời có

sự giảm của hàm lượng proline tự do trong các tổ chức thực vật Sự tập trung proline theo thời gian cũng xuất hiện ở những tổ chức thực vật được nuôi cấy nhân tạo và ở những thực vật bị bệnh truyền nhiễm bởi những vi sinh vật gây bệnh Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy sự tích lũy proline tăng từ 10 -

100 lần ở thực vật dưới sự tác động của áp suất thẩm thấu [30]

Có rất nhiều công trình đã phát hiện có mối quan hệ giữa sự tập trung proline với sự có mặt của axit abscisic: acid abscisic đã kích thích sự tổng hợp acid ribonucleic, kích thích sinh tổng hợp protein trong tế bào Điều đó đã dẫn

đến sự biến đổi hàm lượng các amino acid tự do ở trong các tổ chức thực vật, đặc biệt là hàm lượng proline tự do [11], [73]

Trong dòng tế bào thuốc lá được nuôi cấy thích nghi với nồng độ 428

mM NaCl, proline chiếm trên 80 % acid amine tự do [71] Người ta cũng thừa nhận rằng có sự phân bố đồng đều proline trong toàn bộ thể tích nước của nội bào, kết quả xác định acid amine tại thời điểm này vượt quá 129 nM Tuy nhiên, nếu chỉ hạn chế trong nội bào thì sự tích lũy proline có thể vượt quá nồng độ 200 nM trong các tế bào này, vì thế góp phần căn bản vào việc điều chỉnh thẩm thấu nội bào Tương tự như vậy, sự tích lũy proline nội bào ở các

tế bào Distichlis spicata trong điều kiện stress muối (xử lý ở nồng độ 200 mM

NaCl) ước tính trên 230 mM [44]

Cũng trên đối tượng cây thuốc lá, tác giả Kishor P.B.K và cộng sự [54]

nghiên cứu cây thuốc lá được chuyển gen P5CS (gen liên quan đến sinh tổng hợp proline) trong điều kiện stress nước Kết quả cho thấy hàm lượng proline gấp khoảng từ 10 - 18 lần so với đối chứng Trên cây đậu tương, tác giả J.A.de Ronde và cộng sự [52] tiến hành so sánh giữa dòng đậu tương chuyển gen P5CS và dòng đậu tương không được chuyển gen thì thấy dòng chuyển gen có khả năng chịu hạn tốt hơn

Với những hiểu biết sâu sắc về con đường sinh tổng hợp glycine betaine ở sinh vật, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của lĩnh vực công nghệ gen, đặc biệt là kỹ thuật tạo cây trồng biến đổi gen Các nhà khoa học đã phân lập được các gen: codA (COD), COX, BADH, betA (CDH), CMO, GSMT và SDMT từ nhiều nguồn khác nhau, mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp glycine betaine Các gen này đã được thiết kế với các promoter biểu hiện đặc hiệu, mạnh và chuyển thành công vào nhiều loài cây trồng, các loài cây trồng biến đổi các gen đã được phân tích có sự tích lũy glycine betaine dẫn đến tăng cường được khả năng chống chịu điều kiện bất

lợi của môi trường như mặn muối, khô hạn, lạnh, băng giá, nhiệt độ cao và tác nhân oxy hóa

Những nghiên cứu gần đây đã tiết lộ rằng, ứng dụng glycine betaine ngoại sinh và kỹ thuật di truyền, chuyển gen tham gia sinh tổng hợp glycine betaine đều tăng cường khả năng chịu hạn của cây trồng Quan và đtg (2004) báo cáo, cây ngô chuyển gen CDH biểu hiện và tích lũy glycine betaine ở trong lục lạp có khả năng chịu hạn Ngô chuyển gen cho thấy cải thiện khả năng chịu hạn ở các giai đoạn phát triển khác nhau, năng suất hạt của cây chuyển gen cao hơn đáng kể so với các cây đối chứng không chuyển gen [69]

Cây bông chuyển gen CDH cho thấy cải thiện khả năng chịu hạn Các cây bông biến đổi gen tích lũy hàm lượng glycine betaine cao hơn 2,3 - 2,9 lần so với các cây đối chứng không chuyển và cho thấy khả năng chịu hạn của cây chuyển gen cao hơn hẳn so với cây không chuyển gen từ giai đoạn cây con đến giai đoạn cây ra hoa [58] Tương tự như vậy, cây lúa chuyển gen codA cũng tăng cường tích lũy glycine betaine và cải thiện khả năng chịu hạn [72]

Hơn nữa, một vài thí nghiệm cho thấy những tác động tích cực của việc ứng dụng glycine betaine ngoại sinh trên các loài thực vật bị stress nước Hiệu quả tương tự cũng được tìm thấy ở cây hướng dương và cây thuốc lá dưới điều kiện hạn hán [46],[61] Ứng dụng glycine betaine ngoại sinh trong việc cải thiện tình trạng stress nước và cho kết quả là sản xuất sinh khối tăng lên trong các loài thực vật này

Ngoài việc nghiên cứu các chất bảo vệ ở trên thì trên thế giới còn rất nhiều công trình nghiên cứu về polyamine cũng được coi là một chất bảo vệ Theo quan sát ban đầu của Richards và Coleman (1952) trên cây lúa mạch nuôi cấy thủy canh và xử lí bằng cách không có mái che đã thấy được nồng

độ của polyamine putrescine tăng lên đồng thời khống chế nồng độ ion K+

Kể từ đó, những nghiên cứu về sự tích lũy polyamine putrescine tăng cao

trong các điều kiện stress khác nhau như: khi thiếu nước cao [49]; khi nồng

độ của một chất làm tăng áp suất thẩm thấu bên ngoài [50] [51]; khi cây ở trong nồng độ cao NH4+ [56], [57]; khi cây ở trong môi trường có H+ và các ion cation khác [74], [75]; khi cây trong môi trường tiếp xúc với các chất gây

ô nhiễm không khí SO2[68], Cd2+ [76], O3 [66], Pb+[38]; khi cây trồng nhiệt đới cũng như một số loại cây trồng khác ở trong điều kiện nhiệt độ cao[55],[63]

1.4.2 Ở Việt Nam

Việc nghiên cứu khả năng chịu hạn ở thực vật nói chung, ở cây lạc nói riêng cũng được tiến hành ở nhiều mức độ khác nhau như: nghiên cứu về các chỉ tiêu sinh lí như hàm lượng diệp lục tổng số, huỳnh quang diệp lục, cường

độ thoát hơi nước; nghiên cứu một số chỉ tiêu hóa sinh như hoạt độ của một

số emzyme (amilase, protease, lipase), hàm lượng proline, đường khử và thành phần hóa sinh của hạt… nhưng chưa có công trình nào nghiên cứu cụ thể, rõ ràng về sự hình thành các chất bảo vệ khi bị khô hạn Một số hướng nghiên cứu ở Việt Nam đã tiến hành trong thời gian qua:

Hướng nghiên cứu về sinh lí, chủ yếu tập trung nghiên cứu về hàm lượng diệp lục tổng số, huỳnh quang diệp lục trong điều kiện stress nước [15],

trong điều kiện hạn thì huỳnh quang diệp lục có sự biến đổi mạnh so với điều kiện thường Nguyễn Văn Mã và một số cộng sự đã nghiên cứu rất nhiều về

sự chống chịu với hạn hán trên cây lạc đã chỉ ra rằng: trong điều kiện thiếu nước ảnh hưởng rất rõ rệt tới khả năng quang hợp, huỳnh quang; sự trao đổi nước; sự ra hoa tạo quả, phẩm chất của cây lạc; hàm lượng diệp lục [6], [18], [20], [21], [24], [25], [35].Hay một số nghiên cứu sâu hơn về sinh lí, sinh hóa cho thấy hoạt độ một số emzyme, hàm lượng proline và thành phần hóa sinh của hạt trên các giống lạc khác nhau trong điều kiện stress nước tăng mạnh hơn so với điều kiện thường [22], [23], [26] Ngoài ra, tác giả còn có các

nghiên cứu trên các loài thực vật khác như: trên cây đậu xanh khi sử dụng phân vi lượng sẽ nâng cao khả năng chịu hạn [19]; sự biến đổi proline trong rễ

và lá đậu xanh khi bị hạn [8]; sự biến đổi hàm lượng proline ở cây đậu tương khi thiếu nước [8]; sự thiếu nước ảnh hưởng rõ rệt tới khả năng trao đổi nước,

sự tạo quả và hạt [17]; sự thiếu nước cũng ảnh hưởng rõ rệt tới các chỉ tiêu sinh lí, sinh hóa của cây đậu tương trong điều kiện gây hạn [16]

Đinh Thị Phòng và cộng sự [30] bằng việc xử lý lạnh, mặn và hạn của 6 giống lúa đã cho thấy mối tương quan thuận giữa tính chống chịu của cây và hàm lượng proline Trong đó, các giống khi bị xử lý hạn thì lượng proline trung bình tăng lên 7,5 lần, xử lý mặn là 2,3 lần và xử lý lạnh chỉ tăng 1,5 lần

so với đối chứng Khi nuôi cấy callus mía, Nguyễn Hoàng Lộc và cộng sự

[13] cũng nhận thấy hàm lượng proline của callus được xử lý thêm acid abscisic nồng độ 10-5M đã tăng lên 5,1 lần trên môi trường có 3-9% mannitol, còn ở môi trường có 12% mannitol hàm lượng proline giảm mạnh Trên các đối tượng đậu xanh [8] và đậu tương [52] các nghiên cứu cũng cho thấy có sự tích lũy proline trong cây khi chúng sống trong điều kiện stress nước hay stress muối

Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Hoa Lan tiến hành nghiên cứu đặc điểm hóa sinh của hạt tiềm sinh và hạt nảy mầm ở một số giống lạc có khả năng chịu hạn khác nhau, được công bố trên tạp chí Nông nghiệp và phát triển Nông thôn tháng 8 năm 2005 Công trình này đi sâu nghiên cứu về thành phần hóa sinh và hoạt độ emzyme của các giống lạc Tác giả đã đi sâu nghiên cứu hàm lượng lipid, protein và hoạt độ các emzyme của 12 giống lạc khác nhau và đều cho kết quả là hoạt độ của các emzyme có sự gia tăng mạnh ở điều kiện hạn [29]

Nguyễn Thị Thúy Hường và cộng sự (2010) đã chứng minh cây

thuốc lá chuyển gen P5CSm đột biến dưới sự điều khiển của promoter

rd29A chống chịu tốt hơn một cách rõ rệt so với cây đối chứng không chuyển gen ở điều kiện gây hạn nhân tạo Phân tích hàm lượng proline

cho thấy các dòng thuốc lá chuyển gen P5CS đột biến tích lũy proline

ở mức độ cao hơn hẳn so với cây đối chứng không chuyển gen Những kết quả này là dẫn chứng rất rõ ràng rằng hiệu ứng ức chế phản hồi ngược enzyme P5CS bởi proline giữ vai trò rất quan trọng đối với quá trình sinh tổng hợp proline của thực vật trong cả điều kiện bình thường

và điều kiện bất lợi về áp suất thẩm thấu [10]

Bùi Văn Thắng đã nghiên cứu chuyển gen P5CSm (gen đột biến

loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi ngược) dưới sự điều khiển đặc hiệu của promoter rd29A cảm ứng hạn vào Xoan ta Kết quả cho thấy các

dòng Xoan ta chuyển gen P5CSm tăng cường sinh tổng hợp và tích lũy

hàm lượng proline cao trong điều kiện môi trường bị khô hạn giúp cây chuyển gen chống chịu với điều kiện khô hạn tốt hơn cây đối chứng không chuyển gen Cũng trong công trình đó, Nguyễn Văn Thắng đã tạo

được 68 dòng Xoan ta chuyển cấu trúc gen TP-codA (mã hóa cho các

enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp glycine betaine) có hàm lượng glycine betaine tích lũy trong lá cao hơn nhiều so với dòng đối chứng không chuyển gen ở điều kiện xử lý bởi hạn và mặn nhân tạo Đánh giá các dòng Xoan ta chuyển gen ở điều kiện hạn và mặn nhân tạo thu được 5 dòng (TX4, TX12, TX27, TX28 và TX54) chịu hạn và mặn tốt hơn so với dòng cây đối chứng không chuyển gen [31]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Giống lạc L24 (chịu hạn tốt) do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển đậu đỗ - Viện cây lương thực và cây thực phẩm thuộc Viện Khoa học và Nông

nghiệp Việt Nam cung cấp

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu tại Trung tâm Hỗ trợ và chuyển giao công nghệ và nhà lưới của khoa Sinh trường Đại học Sư phạm Hà Nội II từ tháng 2 năm 2014 đến tháng 5 năm 2014

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Cách bố trí thí nghiệm

* Nhóm thí nghiệm trong phòng thí nghiệm gồm:

- Thí nghiệm thăm dò nồng độ: ươm hạt trong điều kiện bình thường và trong các nồng độ đường 0,2M; 0,3M; 0,4M; 0,5M Chọn để nghiên cứu ở nồng độ hạt vẫn nảy mầm nhưng kém hơn hẳn so với hạt ở điều kiện bình thường

- Thí nghiệm xác định các chỉ tiêu giai đoạn nảy mầm: tiến hành ươm mầm chia làm 2 lô (mỗi lô 3 khay): lô đối chứng (nảy mầm trong nước cất) và

lô thí nghiệm (nảy mầm trong dung dịch gây hạn)

* Nhóm thí nghiệm trong nhà lưới:

- Tiến hành trồng cây trong nhà lưới chia làm 2 lô là lô đối chứng (trồng cây trong đất không gây hạn) và lô thí nghiệm (trồng cây trong đất và gây hạn) Mỗi lô tiến hành gieo trong 10 - 15 chậu, mỗi chậu gieo 3-4 hạt đến lúc trước khi ra hoa thì chỉ để lại mỗi chậu 1 cây

- Cách gây hạn trong nhà lưới:

+ Giai đoạn cây non: khi cây được 4 lá thật gây hạn bằng cách không tưới nước liên tục đến lúc héo 2 lá thật dưới cùng thì xác định các chỉ tiêu (lấy mẫu xác định là là thứ 2 tính từ trên ngọn xuống)

+ Giai đoạn ra hoa: khi cây bắt đầu ra nụ hoa thì không tưới nước ở lô thí nghiệm đến khi héo 2 lá dưới cùng thì xác định các chỉ tiêu (lấy mẫu xác định là lá thứ 3 tính từ trên ngọn xuống)

+ Giai đoạn tạo quả: cũng gây hạn và lấy mẫu xác định như giai đoạn

ra hoa khi cây bắt đầu hình thành quả

2.3.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu

 Giai đoạn nảy mầm:

Xác định các chỉ tiêu ở ngày thứ 2, 4, 6, 8 sau khi ươm

 Giai đoạn cây non, ra hoa và tạo quả

Xác định các chỉ tiêu lúc cây hình thành 4 lá thật, bắt đầu ra nụ và bắt đầu tạo quả

 Cách xác định các chỉ tiêu:

- Hàm lượng acid amine proline:

Xác định hàm lượng acid amine proline theo phương pháp so màu của Bates và cộng sự (1973) [27] [41]:

Cân 0,5g/mẫu nghiền kĩ, thêm 10ml dung dịch acid sufosalicylic 3%, ly tâm 7000 vòng/phút trong 20 phút, lấy dịch chiết

Lấy 2ml dịch chiết cho vào bình, thêm 2ml acid acetic và 2ml dung dịch ninhydrin, ủ trong nước nóng 1000C trong thời gian 1 giờ sau đó ủ đá 5 phút

Bổ sung vào bình phản ứng 4ml toluen, lắc đều Lấy phần dịch màu hồng ở trên đem so màu ở bước sóng λ = 520nm bằng máy UV 2450 do hãng SHIMADZU - Nhật Bản sản xuất