Chọn chủng vi khuẩn escherichia coli, salmonella chế tạo vacxin đa giá phòng bệnh tiêu chảy, phù đầu và bại huyết ở lợn tại một số tỉnh phía bắc việt nam

coli mang các gen quy ñịnh sinh tổng hợp các yếu tố gây bệnh Bảng 3.6: Kết quả kiểm tra một số ñặc tính nuôi cấy của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập ñược Bảng 3.7: Kết quả giám

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

TRẦN VIỆT DŨNG KIÊN

CHỌN CHỦNG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI,

SALMONELLA CHẾ TẠO VACXIN ðA GIÁ PHÒNG

BỆNH TIÊU CHẢY, PHÙ ðẦU VÀ BẠI HUYẾT Ở LỢN TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

TRẦN VIỆT DŨNG KIÊN

CHỌN CHỦNG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI,

SALMONELLA CHẾ TẠO VACXIN ðA GIÁ PHÒNG

BỆNH TIÊU CHẢY, PHÙ ðẦU VÀ BẠI HUYẾT Ở LỢN TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH THÚ Y

MÃ SỐ 60.64.01.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS CÙ HỮU PHÚ 2.PGS.TS NGUYỄN HỮU NAM

HÀ NỘI, NĂM 2013

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, Ngày 31 tháng 9 năm 2013

Tác giả

Trần Việt Dũng Kiên

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn này, cùng với sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi xin ñược ñặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy: PGS.TS Cù Hữu Phú, người ñã trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin ñược chân thành cảm ơn tới thầy: TS Nguyễn Hữu Nam, các thầy cô trong bộ môn Bệnh lý cùng toàn thể các thầy cô giáo Khoa Thú y, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tận tình giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn Ban lãnh ñạo Viện Thú y, các anh, chị, em Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y, các bạn ñồng nghiệp ñặc biệt là gia ñình ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi nhất giúp ñỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 31 tháng 9 năm 2013

Trần Việt Dũng Kiên

MỤC LỤC

MỞ ðẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

I VI KHUẨN E COLI VÀ BỆNH PHÙ ðẦU TIÊU CHẢY Ở LỢN DO E COLI 3

II VI KHUẨN SALMONELLA VÀ BỆNH TIÊU CHẢY, BẠI HUYẾT DO SALMONELLA Ở LỢN 16

III VACXIN PHÒNG PHÙ ðẦU, TIÊU CHẢY, BẠI HUYẾT TRÊN LỢN 28

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

I NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 31

II ðỐI TƯỢNG ðỊA ðIỂM : 31

III NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 31

IV PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Kết quả thu thập các chủng vi khuẩn E coli, Salmonella phân lập ñược dùng cho nghiên cứu38 3.2 Kết quả giám ñịnh, xác ñịnh serotype và một số yếu tố gây bệnh của các chủng E coli nghiên cứu 38

3.3 Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính nuôi cấy và sinh hóa của các chủng Salmonella phân lập 44 3.4 Kết quả kiểm tra ñộc lực của các chủng vi khuẩn E coli và Salmonella nghiên cứu trên chuột nhắt trắng 51

3.5 Kết quả gây bệnh thực nghiệm một số chủng vi khuẩn E coli và Salmonella nghiên cứu trên lợn 55

3.6 Kết quả chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh phù ñầu, tiêu chảy và bại huyết cho lợn 63

KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 66

I Kết luận 66

II ðề nghị 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các chủng E coli gây bệnh trên lợn mang các yếu tố gây bệnh

Bảng 2.1 Các cặp primer ñể xác ñịnh các yếu tố ñộc lực và bám dính của vi khuẩn

E coli

Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi và kích cỡ sản phẩm dùng ñể xác ñịnh một số yếu tố

gây bệnh của các chủng Salmonella phân lập ñược

Bảng 3.1: Kết quả lựa chọn các chủng vi khuẩn dùng cho nghiên cứu

Bảng 3.2: Kết quả kiểm tra một số ñặc tính nuôi cấy của các chủng vi khuẩn E coli Bảng 3.3: Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính sinh hoá của vi khuẩn E coli

Bảng 3.4: Kết quả xác ñịnh serotyp kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn E coli

phân lập ñược

Bảng 3.5: Tỷ lệ các chủng vi khuẩn E coli mang các gen quy ñịnh sinh tổng hợp

các yếu tố gây bệnh

Bảng 3.6: Kết quả kiểm tra một số ñặc tính nuôi cấy của các chủng vi khuẩn

Salmonella phân lập ñược

Bảng 3.7: Kết quả giám ñịnh một số ñặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn

Salmonella phân lập ñược

Bảng 3.8: Kết quả xác ñịnh serotyp của cácchủng vi khuẩn Salmonella phân lập

ñược

Bảng 3.9: Kết quả kiểm tra một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn

Salmonella phân lập ñược

Bảng 3.10: Kết quả kiểm tra ñộc lực một số chủng E coli trên chuột nhắt trắng

Bảng 3.11: Kết quả kiểm tra ñộc lực các chủng Salmonella phân lập ñược

Bảng 3.12 Các chủng vi khuẩn E coli chọn gây bệnh

Bảng 3.13: Kết quả gây bệnh thực nghiệm E coli trên lợn

Bảng 3.14: Các chủng vi khuẩn Salmonella chọn gây bệnh

Bảng 3.15: Kết quả gây bệnh thực nghiệm Salmonella trên lợn 35 ngày tuổi

Bảng 3.16: Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu các lô vacxin

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Quy trình phân lập vi khuẩn ñường ruột

Hình 2.2 Quy trình sản xuất vacxin vô hoạt bổ trợ keo phèn

Hình 3.1 Tỷ lệ kháng nguyên O của các chủng E coli phân lập ñược

Hình 3.2 Sản phẩm PCR xác ñịnh yếu tố gây bệnh của E coli

Hình 3.3 Kết quả của phản ứng PCR xác ñịnh yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella

Hình 3.4 Gây bệnh thực nghiệm cho lợn

Hình 3.5 Lợn Gây bệnh với E coli dung huyết: viêm giác mạc mắt, phù ñầu

Hình 3.6 Lợn Gây bệnh với E coli dung huyết: viêm giác mạc mắt, phù ñầu

Hình 3.7 Lợn Gây bệnh với Salmonella: lách sưng, nhồi huyết

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ADP Adenosine DiPhosphate

ATP Adenosine TriPhosphate

BHI Brain Heart Infusion

BPW Buffered Pepton Water

BG Brillian Green

CHO Chinese Hamster Ovary Cell

CIRAD Centre de Cooperation Internationale en Recherche

Agronomique pour le Developpement DHL Deoxycholate Hydrogen sulfide Lactose

DNA DeoxyriboNucleic Acid

DPF Delayer Permebility Factor

EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid

ETEC EnteroToxigenic E coli

LT Heat- Labile Toxin

mARN Messenger Acide RiboNucleotide

RPF Rapid Permebility Factor

ST Heat- stabile Toxin

Stn Salmonella toxin

TSI Triple- Sugar- Iron

PCR Polymerase Chain Reaction

RV Rappaports Vassiliadis

MỞ ðẦU

Trong những năm gần ñây, cùng với sự phát triển của nền kinh tế, ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi lợn nói riêng của nước ta ñã có những bước phát triển mạnh mẽ, trở thành ngành sản xuất quan trọng, chiếm tỷ trọng ñáng kể trong xuất khẩu các sản phẩm chăn nuôi và góp phần xóa ñói giảm nghèo

Theo số liệu tổng hợp của Tổng Cục Thống kê thì tính sơ bộ ñến năm 2011,

cả nước có trên 27 triệu ñầu lợn Còn theo ñịnh hướng ñược Thủ tướng Chính phủ phê duyệt trong quyết ñịnh số 10/2008/Qð-TTg ngày 16 tháng 01 năm 2008 về chiến lược phát triển chăn nuôi ñến năm 2020, thì ñến năm 2020 mục tiêu là phát triển nhanh quy mô ñàn lợn ngoại theo hướng trang trại, duy trì quy mô nhất ñịnh ñối với chăn nuôi lợn lai, lợn ñặc sản phù hợp với ñiều kiện chăn nuôi của nông hộ và của một số vùng Tăng tổng ñàn lợn bình quân 2% năm, ñạt 35 triệu con trong ñó ñàn lợn ngoại nuôi trang trại công nghiệp chiếm 37%

Tuy nhiên, ngành chăn nuôi lợn ở nước ta luôn phải ñối mặt với nhiều khó khăn như về chất lượng con giống, thức ăn, giá cả thị trường,… ñặc biệt là bệnh dịch vẫn thường xuyên xảy ra trên ñàn lợn gây thiệt hại lớn về kinh tế Một số bệnh thường xuyên xảy ra không những ảnh hưởng ñến mục tiêu phát triển chăn nuôi mà còn ñe dọa

ảnh hưởng ñến sức khỏe của con người Bệnh phù ñầu do vi khuẩn E coli, bệnh do vi khuẩn Salmonella vẫn gây tổn thất nặng nề cho ngành chăn nuôi lợn trong toàn quốc Bệnh do Salmonella gây ra thường ở dạng nhiễm trùng máu cấp tính hoặc viêm ruột

non kết Tuy nhiên hai thể bệnh này thường ít khi xảy ra ñồng thời với nhau

Salmonella cholerasuis thường gây nhiểm trùng máu cấp tính, trong khi ñó Salmonella typhimurium thường gây ra viêm ruột kết Vi khuẩn Salmonella và E coli gây tiêu chảy

cho lợn ở các lứa tuổi, ñặc biệt ở lợn trước và sau cai sữa trong cả chăn nuôi trang trại quy mô lớn hay chăn nuôi nông hộ với quy mô nhỏ

ðể hạn chế thấp nhất thiệt hại cho người chăn nuôi, thuận lợi cho việc sử dụng biện pháp phòng bệnh bằng vacxin và ñảm bảo an toàn thực phẩm không lây nhiễm vi khuẩn gây ngộ ñộc cho người tiêu dùng, việc chế tạo vacxin ña giá, tiêm một mũi

phòng ba bệnh: phù ñầu, tiêu chảy, bại huyết do vi khuẩn E coli và Salmonella sp gây

việc nghiên cứu, xây dựng biện pháp phòng và trị bệnh bằng vacxin, chúng tôi tiến

hành nghiên cứu ñề tài: “Chọn chủng vi khuẩn Escherichia coli, Salmonella chế tạo vacxin ña giá phòng bệnh tiêu chảy, phù ñầu và bại huyết ở lợn tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam”

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Xác ñịnh yếu tố ñộc lực, yếu tố kháng nguyên các chủng vi khuẩn và E coli, Salmonella gây bệnh tiêu chảy, phù ñầu và bại huyết ở lợn nuôi tại một số tỉnh

phía Bắc

- Chọn chủng vi khuẩn E coli, Salmonella chế tạo thử nghiệm vacxin ña giá

phòng bệnh cho lợn

Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ðỀ TÀI

Kết quả nghiên cứu bước ñầu sẽ là cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm chọn ra ñược một bộ giống vi khuẩn phù hợp, có kháng nguyên tính cao, ổn ñịnh ñể chế tạo vacxin vô hoạt ña giá phòng bệnh phù ñầu, tiêu chảy và bại huyết

do E coli và Salmonella gây ra cho lợn có hiệu lực phòng bệnh cao, giá thành vừa

phải, phù hợp với ñiều kiện thực tế ở nước ta

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I VI KHUẨN E COLI VÀ BỆNH PHÙ ðẦU TIÊU CHẢY Ở LỢN DO E COLI

Vi khuẩn E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, là họ vi khuẩn thường trực ở

trong ruột, chiếm tới 80% các vi khuẩn hiếu khí (Hoàng Thuỷ Nguyên và cs, 1974 ), vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực ñường tiêu hoá, vừa là vi khuẩn gây nhiều bệnh ở ñường ruột và ở các cơ quan khác (Lê Văn Tạo, 1997a)

Trong ñiều kiện bình thường, E coli khu trú thường xuyên ở phần sau của ruột, ít khi có ở

dạ dày hay ñoạn ñầu ruột non của ñộng vật Khi gặp ñiều kiện thuận lợi, chúng phát triển nhanh về số lượng, ñộc lực, gây loạn khuẩn, bội nhiễm ñường tiêu hoá và trở thành nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978 )

1.1 ðặc ñiểm hình thái, cấu trúc của vi khuẩn

1.1.1 ðặc ñiểm hình thái

Vi khuẩn E coli là một trực khuẩn hình gậy ngắn, có kích thước 2 - 3µm x

0,3 - 0,6µm; ở môi trường nuôi cấy, trong canh khuẩn già, xuất hiện những trực khuẩn dài 4 - 8 µm Trong cơ thể người và ñộng vật, vi khuẩn thường có hình cầu

trực khuẩn, ñứng riêng lẻ, ñôi khi xếp thành chuỗi ngắn Phần lớn vi khuẩn E coli có

khả năng di ñộng do có lông ở xung quanh thân, không sinh nha bào, có thể có giáp

mô Vi khuẩn bắt màu gram âm, có thể bắt màu ñều hoặc sẫm ở hai ñầu, khoảng giữa nhạt hơn Nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc nhầy ñể nhuộm, có thể thấy giáp mô, nhưng khi soi tươi thì thường không nhìn thấy ñược

1.1.2 ðặc ñiểm cấu trúc:

Vi khuẩn E coli ñược chia làm các serotype khác nhau dựa vào cấu trúc

ứng ngưng kết, các nhà khoa học ñã tìm ra ñược 250 serotype O, 89 serotype K, 56 serotype H và một số serotype F (Fairbrother.J.M, 1992) Khi xác ñịnh serotype ñầy

ñủ của 1 chủng vi khuẩn E coli thì phải xác ñịnh ñủ cả 3 loại kháng nguyên nói

trên

- Kháng nguyên O (Kháng nguyên thân – Ohne Hauch) ñược coi như là một yếu

tố ñộc lực có thể tìm thấy ở thành tế bào và có liên hệ trực tiếp với hệ thống miễn dịch Kháng nguyên O khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết Ngưng kết kháng nguyên O tạo thành những hạt nhỏ, khó tan

- Kháng nguyên H (kháng nguyên lông - Hauch) là thành phần lông của vi khuẩn, có bản chất protein, kém bền vững hơn so với kháng nguyên O Kháng nguyên H không phải là yếu tố ñộc lực của vi khuẩn, nhưng có khả năng tạo miễn dịch mạnh Phản ứng miễn dịch xảy ra nhanh hơn so với kháng nguyên O

Kháng nguyên H của vi khuẩn E coli không có vai trò bám dính, không có tính ñộc

và cũng không có ý nghĩa trong ñáp ứng miễn dịch phòng vệ nên ít ñược quan tâm nghiên cứu, nhưng nó có ý nghĩa rất lớn trong xác ñịnh giống loài của vi khuẩn (Orskov.F, 1978)

- Kháng nguyên K (Kháng nguyên vỏ bọc - Capsular), còn ñược gọi là kháng nguyên bề mặt (OMP - Outer membrane protein) hoặc kháng nguyên vỏ bọc (Capsular) Vai trò của kháng nguyên K chưa ñược thống nhất Có rất nhiều ý kiến cho rằng, nó không có ý nghĩa về ñộc lực của vi khuẩn, vì thấy rằng ñộc lực của

chủng E coli có kháng nguyên K cũng giống ñộc lực của chủng không có kháng

nguyên K (Orskov.F, 1978) Tuy nhiên, có ý kiến khác cho rằng, nó có ý nghĩa về ñộc lực vì nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trước những yếu tố phòng vệ của vật chủ Tuy vậy, phần lớn các ý kiến ñều thống nhất kháng nguyên K có hai nhiệm vụ sau:

+ Hỗ trợ trong phản ứng ngưng kết của kháng nguyên O, nên thường ghi liền

công thức serotype của vi khuẩn là Ox:Ky như E coli O139: K88, O149: K88

+ Tạo ra hàng rào bảo vệ cho vi khuẩn chống lại tác ñộng của ngoại cảnh và hiện tượng thực bào, yếu tố phòng vệ của vật chủ

- Kháng nguyên F (Kháng nguyên Fimbriae- Kháng nguyên bám dính)

Hầu hết các chủng E coli gây bệnh ñều sản sinh ra một hoặc nhiều kháng nguyên

bám dính Các chủng không gây bệnh thì không có kháng nguyên bám dính Kháng nguyên bám dính giúp vi khuẩn bám vào các thụ thể ñặc hiệu trên bề mặt tế bào biểu

mô ruột và trên lớp màng nhày ñể xâm nhập và gây bệnh, ñồng thời chống lại khả năng ñào thải vi khuẩn của nhu ñộng ruột

Một số loại kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E coli thuộc nhóm ETEC (Enterotoxigenic E coli) gây bệnh chủ yếu cho lợn là F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P),

Vi khuẩn E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường Khi

nuôi cấy trên các môi trường, ñể trong tủ ấm ở 37oC và sau 24 giờ vi khuẩn sẽ phát triển như sau:

- Môi trường thạch thường: Hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, bóng láng không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, ñường kính từ 2-3mm Nuôi lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng ra, có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng R (Rough) và M (Mucous)

- Môi trường nước thịt: Phát triển rất nhanh, tốt, môi trường ñục ñều có lắng cặn

màu tro nhạt ở dưới ñáy, ñôi khi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi phân thối

- Môi trường MacConkey: Khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không trầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường

1.2.2 ðặc tính sinh vật hoá học:

- Phản ứng lên men ñường: Vi khuẩn E coli lên men sinh hơi các loại ñường

Lactose, Fructose, Glucose, Levulose, Galactose, Xylose, Manitol; lên men không chắc chắn các loại ñường Duncitol, Saccarose và Salixin

- Một số phản ứng sinh hoá khác: Phản ứng Indol và MR dương tính, phản

1.3 ðặc tính gây bệnh của vi khuẩn E coli

1.3.1 Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn E coli:

ðể có thể gây bệnh, trước hết vi khuẩn E coli phải bám dính vào tế bào

nhung mao ruột bằng các yếu tố bám dính như kháng nguyên F Sau ñó, nhờ các yếu tố xâm nhập (Invasion), vi khuẩn sẽ xâm nhập vào tế bào biểu mô của thành ruột ở ñó, vi khuẩn phát triển, nhân lên, phá huỷ lớp tế bào biểu mô, gây viêm ruột, ñồng thời sản sinh ñộc tố ñường ruột Enterotoxin ðộc tố ñường ruột tác ñộng vào quá trình trao ñổi muối, nước, làm rối loạn chu trình này Nước từ cơ thể tập trung vào lòng ruột làm căng ruột, cùng với khí do lên men ở ruột gây nên một tác dụng

cơ học, làm nhu ñộng ruột tăng, ñẩy nước và chất chứa ra ngoài, gây nên hiện tượng tiêu chảy Sau khi ñã phát triển ở thành ruột, vi khuẩn vào hệ lâm ba, ñến hệ tuần hoàn, gây nhiễm trùng máu Trong máu, vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào, gây dung huyết, làm cho cơ thể thiếu máu Từ hệ tuần hoàn, vi khuẩn ñến các tổ chức cơ quan ở ñây, vi khuẩn lại phát triển nhân lên lần thứ hai, phá huỷ tế bào tổ chức, gây viêm và sản sinh ñộc tố gồm Enterotoxin và Verotoxin, phá huỷ tế bào tổ chức, gây tụ huyết và xuất huyết

1.3.2 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E coli:

Các yếu tố gây bệnh của E coli bao gồm khả năng kháng khuẩn, yếu tố bám

dính, khả năng xâm nhập, yếu tố gây dung huyết và khả năng sản xuất ñộc tố Các

chủng vi khuẩn E coli không có các yếu tố trên thì không có khả năng gây bệnh

Dựa vào các yếu tố gây bệnh nói trên, người ta ñã phân loại vi khuẩn E coli thành các loại sau: Enterotoxigenic E coli (ETEC), Enteropathogenic E coli (EPEC), Adherence Enteropathogenic E coli (AEEC) và Verotoxingenic E coli

(VTEC) (Lê Văn Tạo, 1997a) Trong ñó, các chủng vi khuẩn thuộc nhóm ETEC và VTEC thường gây bệnh tiêu chảy cho lợn con sơ sinh và lợn sau cai sữa (Fairbrother.J.M, 1992)

* Yếu tố kháng khuẩn:

Nhiều chủng vi khuẩn E coli có khả năng sản sinh ra chất kháng khuẩn có

tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt các loại vi khuẩn khác, gọi là ColicinV Vì vậy, yếu

tố này cũng ñược coi là 1 trong các yếu tố ñộc lực của vi khuẩn E coli gây bệnh

(Smith.H.W và cs, 1967)

* Yếu tố bám dính:

ðể gây bệnh, các chủng ETEC phải bám dính lên trên tế bào biểu mô của ruột non Hầu hết các chủng ETEC ñều có mang 1 hoặc nhiều các yếu tố bám dính như: F4(K88), F5 (K99), F6(987P), F17, F18, F41, F42 và F165 Ở lợn, các chủng vi khuẩn ETEC gây bệnh tiêu chảy thường mang các yếu tố bám dính sau ñây:

- F4 (K88): F4 hay còn gọi là K88 và là một kháng nguyên không chịu nhiệt

Bằng việc sử dụng các kháng huyết thanh ñặc hiệu, Orskov và cs (1964) ñã phân biệt ñược hai loại khác nhau của F4 là F4ab và F4ac Loại thứ 3 ñược phát hiện bởi Guinee

và Jansen ñược ñặt tên là F4ad (Guinee và cs, 1979) Sợi F4giúp cho vi khuẩn bám ñược vào receptor tương ứng của nó trên tế bào biểu mô của lông nhung ruột non, từ ñó

vi khuẩn có thể xâm nhập cố ñịnh và phát triển ñược ở thành ruột non Yếu tố bám dính

F4 ñược mang trong vi khuẩn E coli thuộc nhóm ETEC, gây bệnh tiêu chảy ở lợn

trước và sau cai sữa (Nagy và cs, 1999)

- F5 (K99): F5 trước kia ñược cho là kháng nguyên bám dính của E coli chỉ

gây bệnh ở bê, nghé và cừu Tuy nhiên, hiện nay chúng cũng ñược tìm thấy với tỷ lệ thấp ở các chủng ETEC phân lập từ lợn tiêu chảy (Links và cs, 1985) Sự sản sinh F5 phụ thuộc vào nhiều yếu tố của vi khuẩn như: Tốc ñộ sinh trưởng, pha sinh trưởng, nhiệt ñộ và alanine trong môi trường Các gen mã hóa cho sự tổng hợp F5 nằm trên ADN của plasmid (Isaacson, 1977)

- F6 (987p): Các nhà khoa học cho rằng, fimbriae này ñóng vai trò quan trọng trong việc gây bệnh của ETEC F6 của ETEC ở lợn có thể giúp vi khuẩn bám vào cả các receptor cấu tạo bởi glycoprotein và glycolipid trên riềm trải của các tế bào biểu mô ruột (Dean và cs, 1989, 1994) F6 bám dính ở màng nhầy ñể phân phối ñộc tố ñường ruột tối ña ñến vật chủ

- F18: F18 là tên ñặt cho nhân tố bám dính 8813 Bởi vậy, một loại fimbriae mới ñã ñược ñề nghị công nhận là F18ab và F18ac (Rippinger và cs, 1995) Một nghiên cứu của Nagy và cs (1996) thấy rằng F18ab và F18ac khác nhau về mặt sinh

Chúng thường thấy cùng với việc sản xuất SLT-2e ở các chủng VTEC, trong khi F18ac thể hiện rất rõ ở cả trong thực tế và trong phòng thí nghiệm, chúng mang các ñặc tính của các chủng ETEC

Một ñặc ñiểm ñáng chú ý ở F18ac là chúng không bám vào riềm bàn chải của lợn sơ sinh trong ñiều kiện thực tế và trong phòng thí nghiệm (Nagy và cs, 1992 ), cũng không tập trung ở lớp màng nhầy của ruột ở lợn con mới sinh (Casey và cs, 1992) ðiều này ngược với F5 và F6, chúng bám vào các tế bào biểu mô ruột Khả năng bám này ở lợn cai sữa nhiều hơn so với lợn sơ sinh Lý do xác ñáng ñể giải thích về việc tăng sự mẫn cảm với bám dính của F18ab và F18ac theo tuổi của lợn vẫn chưa ñược làm rõ, nhưng có thể là do sự tăng dần các receptor ñặc hiệu ở lông nhung của ruột lợn từ sơ sinh ñến 21 ngày tuổi Sự thiếu hụt các receptor của F18ab

và F18ac ở lợn sơ sinh có thể giải thích cho lý do vì sao chỉ thấy các chủng VTEC

và ETEC ở lợn cai sữa (Nagy và cs, 1999)

* Yếu tố xâm nhập của vi khuẩn E coli: là một khái niệm dùng ñể chỉ quá trình chưa ñược xác ñịnh một cách rõ ràng mà nhờ ñó vi khuẩn E coli qua ñược hàng rào

bảo vệ của lớp màng nhầy (mucosa) trên bề mặt niêm mạc ñể xâm nhập vào tế bào biểu mô (Epithel), ñồng thời sinh sản và phát triển trong lớp tế bào này Trong khi ñó những vi khuẩn khác không có khả năng xâm nhập, không thể qua ñược hàng rào bảo

vệ của lớp màng nhầy hoặc khi qua ñược hàng rào này, sẽ bị giữ lại bởi tế bào ñại thực bào của tổ chức hạ niêm mạc (Giannella và cs, 1976)

* ðộc tố của vi khuẩn E coli:

Vi khuẩn E coli sản sinh nhiều loại ñộc tố: Enterotoxin, Verotoxin, Neurotoxin

Mỗi loại ñộc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra

- Nhóm ñộc tố ñường ruột (Enterotoxin): gồm hai loại:

+ ðộc tố chịu nhiệt (Heat Stable Toxin - ST): ðộc tố này chịu ñược

nhiệt ñộ 1000C trong vòng 15 phút ðộc tố ST chia thành hai nhóm STa và STb dựa trên ñặc tính sinh học và khả năng hòa tan trong methanol STa kích thích sản sinh

ra cGMP mức cao trong tế bào, ngăn trở hệ thống chuyển Na+ và Cl-, làm giảm khả năng hấp thu chất ñiện giải và nước ở ruột STa thường thấy ở ETEC gây bệnh ở

STb kích thích vòng nucleotid phân tiết dịch ñộc lập ở ruột, nhưng phương thức tác dụng của STb vẫn chưa ñược hiểu rõ STb hoạt ñộng ở ruột non lợn, nhưng không hoạt ñộng ở ruột non chuột, bê và bị vô hoạt bởi Trypsin

Cả STa và STb ñều có vai trò quan trọng trong việc gây tiêu chảy do các chủng E coli gây bệnh ở bê, nghé, dê, cừu, lợn con và trẻ sơ sinh

+ ðộc tố không chịu nhiệt (Heat Labile Toxin - LT): ðộc tố này bị vô hoạt ở nhiệt ñộ 600C trong vòng 15 phút LT cũng có hai nhóm phụ LT1 và LT2, nhưng chỉ

có LT1 bị trung hòa bởi Anticholerae toxin LT là một trong những yếu tố quan trọng gây triệu chứng tiêu chảy (Faibrother và cs, 1992) Cả 2 loại ñộc tố ST và LT ñều bền vững ở nhiệt ñộ âm, thậm chí cả ở nhiệt ñộ âm 200C

- Nhóm ñộc tố tế bào (Shiga /Verotoxin):

Konowalchuck và cs (1977) ñã phát hiện một loại ñộc tố hoạt ñộng trong môi trường nuôi cấy tế bào Vero (nên chúng ñược ñặt tên là ñộc tố tế bào Vero), ñược sản

sinh bởi vi khuẩn E coli gây bệnh tiêu chảy ở người, tiêu chảy và bệnh phù ñầu ở lợn

con Ảnh hưởng gây bệnh ở tế bào của ñộc tố Vero rất khác so với ảnh hưởng của ñộc

tố ñường ruột không chịu nhiệt cổ ñiển ở nhóm vi khuẩn E coli gây bệnh ñường ruột

(ETEC) ðộc tố Vero (VTs) hay Shiga (SLTs) là thuật ngữ ñược sử dụng trước ñây Gần ñây, các nhà khoa học ñã ñề nghị sử dụng tên ñộc tố Shiga (Stx) cho tất cả

những ñộc tố tế bào này Stx sản sinh bởi E coli bao gồm 2 nhóm: Stx1và Stx2 ðộc

tố Shiga ở lợn là một loại trong nhóm ñộc tố Stx2 với một số khác biệt trong ñặc tính sinh học Stx1 và Stx2 gây ñộc cho tế bào Hela Stx2e kém ñộc hơn, nhưng gây ñộc mạnh cho tế bào Vero

* Vai trò gây bệnh của các loại kháng nguyên:

Theo ý kiến của nhiều tác giả, mặc dù các vi khuẩn E coli có nhiều loại kháng

nguyên, trong ñó, có loại tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ, có loại không tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ nhưng ñều tham gia vào quá trình gây bệnh bằng cách tạo ñiều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào tế bào vật chủ và tham gia vào quá trình kháng lại các yếu tố phòng vệ tự nhiên của vật chủ Các kháng nguyên tham gia quá trình trên phải

kể ñến là kháng nguyên O, kháng nguyên K, kháng nguyên F

ðể phát triển trong cơ thể, vi khuẩn E coli cần ñược cung cấp sắt Hầu hết những chủng E coli gây bệnh thường có khả năng gây dung huyết ðể chiếm dụng sắt của vật chủ, vi khuẩn E coli tiết men Heamolyzin phá vỡ hồng cầu, giải phóng

sắt trong nhân HEM

Có 4 kiểu dung huyết của vi khuẩn E coli là: α-haemolysin, β-haemolysin,

γ-haemolysin, ε-γ-haemolysin, nhưng quan trọng nhất là kiểu α-haemolysin và haemolysin (Ketyle và cs, 1975) Căn cứ vào kết quả nghiên cứu các yếu tố gây bệnh ở

β-từng chủng E coli phân lập từ các thể bệnh khác nhau, Fairbrother (1992) ñã ñặt tên các nhóm vi khuẩn E coli theo những yếu tố gây bệnh mà chúng có khả năng sản sinh như: Enterotoxigenic E coli ( ETEC), Enteropathogenic E coli (EPEC), Verotoxigenic E coli (VTEC), Adhenicia Enteropathogenic E coli (AEEC) Ông

ñã sắp xếp các serotyp cùng mang các yếu tố gây bệnh ñặc trưng cho tưng lứa tuổi thể hiện ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Các chủng E coli gây bệnh trên lợn mang các yếu tố gây bệnh

(Fairbrother, 1992 )

Các yếu tố gây bệnh Serotyp

KNO

Thể bệnh gây ra

Loại vi khuẩn ST Stb LT VT D4

K88

F5 K99

T6 987P

và lợn con, xuất huyết ñường tiêu hóa

và sau cai sữa

O141K85 VTEC +

2 Bệnh tiêu chảy ở lợn do vi khuẩn E coli

Bệnh xảy ra ở tất cả các lứa tuổi của lợn, nhưng tỷ lệ mắc bệnh, mức ñộ trầm trọng và tỷ lệ chết tập trung vào lợn con từ 4 tuần tuổi ñến sau cai sữa 1 tháng Bệnh

do các serotype E coli O8, O141, O147, O149, và O157, trong ñó O149 F4 thường chiếm tỷ lệ cao Các chủng E coli này do lợn con bị nhiễm từ môi trường, từ vú mẹ

khi bú hoặc có sẵn trong ruột, gặp ñiều kiện thuận lợi phát triển nhân lên với số lượng lớn, chiếm tỷ lệ áp ñảo các vi khuẩn ñường ruột khác, ñồng thời tiếp nhận các yếu tố gây bệnh trong quá trình phát triển, gặp khi cơ thể lợn chịu các tác ñộng bất lợi như: chăm sóc nuôi dưỡng kém, thay ñổi thức ăn ñột ngột, nhiệt ñộ, ñộ ẩm, thời tiết chuồng nuôi thay ñổi vi khuẩn tác ñộng gây bệnh

Các serotype E coli gây bệnh tiêu chảy thường mang các yếu tố bám dính

F4, F6 và F5; ñộc tố ñường ruột, chủ yếu LT1 và ST1, ñôi khi có Stx2e hoặc LT, STa và STb Cơ chế gây bệnh tiêu chảy ở lợn giống như ở bệnh lợn con phân trắng, nhưng do hệ thống thần kinh của lợn ñã hoàn chỉnh, ñiều tiết ñược các chức năng sinh lý, lợn ñã ăn các thức ăn tinh và thô thay cho bú sữa, nên phân có màu vàng

2.1 Triệu chứng

Khi lợn bị tiêu chảy do vi khuẩn E coli, triệu chứng trước tiên là lợn bị tiêu

chảy với mức ñộ khác nhau, ñi ngoài nhiều lần trong ngày, phân có nhiều nước, do

ñi ngoài mất nước nên lợn gầy còm, hốc hác, dơ xương, hông hõm, xương sườn, xương sống nhô lên, lợn cụp ñuôi hoặc ñuôi hay vẫy qua vẫy lại Lợn ăn ít, uống nước nhiều Xuất hiện những vùng da tím tái ở mũi, chóp tai và bụng Một vài lợn

có biểu hiện thần kinh, ñi vòng tròn theo một chiều nhất ñịnh hoặc liệt 2 chân sau, vào giai ñoạn cuối lợn nằm nghiêng chân bơi chèo, xác gầy và bẩn Tiêu chảy nhiều nước, phân thường có màu nâu hoặc xanh xám Lơn con theo mẹ, lợn con trước và sau cai sữa mắc bệnh, không ñiều trị kịp thời, bị mất nước, trụy tim, mạch nhanh, tỷ

lệ chết cao Lợn con bị tiêu chảy sau khi khỏi bệnh còi cọc, khả năng tăng trọng

kém Lợn choai, lợn mẹ, lợn lớn, lợn ñực giống mắc bệnh thường nhẹ, tỷ lệ chết thấp hơn, nhiều con tự khỏi, không ảnh hưởng ñến phát triển sau này

2.2 Bệnh tích mổ khám

Sự biến ñổi bệnh tích ở lợn bị tiêu chảy do vi khuẩn E coli phụ thuộc rất

nhiều vào tuổi mắc bệnh, thời gian kéo dài của bệnh, nhìn chung xác lợn chết do tiêu chảy thường gầy, bẩn, thân bê bết phân, mắt trũng sâu, tím tái ở mũi, tai Phổi nhợt nhạt và khô, hạch treo ruột bị tụ huyết tím bầm Niêm mạc mắt, miệng nhợt nhạt Niêm mạc ruột, dạ dày xuất huyết, nếu bị tiêu chảy lâu niêm mạc bị tróc từng mảng Trực tràng bị loét chảy máu Gan mất màu, có những nốt hoại tử trên mặt

Cơ tim nhão, mất trương lực Bàng quang xẹp, niêm mạc xuất huyết Dạ dày chứa ñầy thức ăn Xuất huyết ở niêm mạc ñường cong lớn của dạ dày Ruột non chứa ñầy dịch loãng, niêm mạc phù nhẹ và xuất huyết Chất chứa trong các ñoạn ruột có trạng thái khác nhau từ nhiều nước ñến sền sệt, nhưng ñều có mùi ñặc trưng Trong ruột già thức ăn có dạng nhày, màu xanh xám hoặc vàng xám Niêm mạc ñường tiêu hoa

có nhiều vết loét, nhưng vết loét sâu và nặng thường thấy ở niêm mạc ñường cong lớn của dạ dày Một số trường hợp lợn tiêu chảy trong phân toàn máu do niêm mạc

ñường tiêu hóa bị tổn thương sâu vì bị nhiếm E coli có khả năng sản sinh kháng

nguyên bám dính F4 mạnh

Quan sát bệnh tích vi thể thấy lẫn trong lớp tế bào lông nhung là vi khuẩn E coli Lớp tế bào lông nhung bị phá hủy nặng

2.3 Phòng bệnh tiêu chảy do E coli ở lợn

Vi khuẩn E coli gây bệnh tiêu chảy ở lợn là vi khuẩn tồn tại trong môi sinh,

nơi ñường tiêu hóa vật chủ Vì vậy khâu vệ sinh chăm sóc có một ý nghĩa to lớn trong phòng bệnh

Chuồng trại, thức ăn, nước uống phải ñảm bảo vệ sinh, chỉ ñược nhiễm E coli trong tiêu chuẩn cho phép của TCVN Ổ ñẻ của lợn mẹ phải ñược tiêu ñộc

trước khi ñưa lợn nái vào ñẻ Nhiệt ñộ chuồng phải ñảm bảo 32-340C ñối với lợn sơ sinh và 28 - 300C với lợn cai sữa, chuồng phải luôn khô ráo, không ẩm ướt Không thay ñổi thức ăn ñột ngột

Có chuồng nuôi riêng từng loại lợn, lợn con nuôi trên sàn, không cho tiếp xúc với nền chuồng Cho lợn con bú sữa ñầu ñầy ñủ Tập cho lợn con ăn sớm và cai sữa sớm

Ngoài vệ sinh phòng bệnh tốt cần dùng các loại vacxin tiêm phòng cho lợn

mẹ hai lần vào lúc 6 và 12 tuần tuổi trước khi ñẻ ñể tạo kháng thể truyền qua sữa ñầu, bảo vệ lợn con trong một vài tuần lễ ñầu sau khi ñẻ hoặc dùng vacxin cho lợn con uống 3 - 5 ngày, 1 lần/ngày sau khi sinh ñể tạo miễn dịch chủ ñộng ở ñường ruột Sau ñó tiêm vacxin Salco cho lợn khi ñược 3 tuần tuổi ñể chống tiêu chảy trước và sau cai sữa Hiện nay trên thị trường Việt Nam, ngoài vacxin trong nước sản xuất ñang lưu hành các loại vacxin do nước ngoài sản xuất như: Neocolipor của Nissan Chemical Indutries, vacxin Litter Guard LT-C của Embrex INC sản xuất

phòng tiêu chảy do E coli và Clostridium perfringens, Rokovac của hãng Bioveta, A.S phòng bệnh tiêu chảy do E coli và rotavirus suis ở lợn, Porcili coli của Intervet

3 Bệnh phù ñầu lợn con (Edema disease)

Bệnh phù ñầu lợn con do một số serotyp kháng nguyên O của E coli sau ñây

gây ra: O138, O139K12H1, O141K85q, O141K85ac Ở Việt Nam, Nguyễn Khả

Ngự (2000) phân lập, ñịnh typ vi khuẩn E coli gây bệnh phù ñầu lợn ở các tỉnh

ñồng bằng sông Cửu Long ñã phát hiên ñược 11 serotyp, nhưng chiếm tỷ lệ cao

nhất là O26 và O139 Trịnh Quang Tuyên (2004) phân lập E coli gây bệnh phù ñầu

ở trại chăn nuôi tập trung các tỉnh phía Bắc, phát hiện 7 serotyp, trong ñó chủ yếu là O139 chiếm 34,8% và O138 chiếm 18,5% ðể gây ñược bệnh, ngoài các yếu tố gây

bệnh có ở E coli gây tiêu chảy cần phải có yếu tố bám dính F18 thay cho F4, ñộc tố

tế bào(Stx2e), ñộc tố thần kinh và các yếu tố gây dung huyết mà chủ yếu là haemolytic Nhờ các yếu tố gây bệnh, vi khuẩn vào máu gây nhiễm trùng huyết, trong máu yếu tố dung huyết phá vỡ hồng cầu làm máu loãng, ñộc tố tế bào vừa phá hủy tế bào tổ chức gây bệnh tích, vừa tăng tính thành mạch, nước từ hệ tuần hoàn ñi vào mô bào gây hiện tượng phù ðộc tố thần kinh tác ñộng vào trung ương thần kinh gây nên các triệu chứng thần kinh như: run rẩy, co giật

α-3.1 Triệu chứng

Theo Nguyễn Khả Ngự (2000) theo dõi bệnh ở ñồng bằng sông Cửu Long và Phan Trọng Hổ (2001) theo dõi bệnh ở Bình ðịnh thấy bệnh xảy ra ở hai thể: quá cấp tính rất hay gặp và cấp tính ít gặp hơn Trong trường hợp quá cấp tính, lợn thường chết nhanh, không có biểu hiện triệu chứng Những trường hợp bệnh cấp tính, lợn nằm tụm thành ñống ở góc chuồng, ít hoạt ñộng Lợn ñi loạng choạng, mất thăng bằng, run rảy, ho, nhiều nước mũi chảy ñặc như mủ ðầu, mặt, mí mắt sưng phù, niêm mạc nhợt nhạt Khi ñứng 2 chân trước chụm lại, 2 chân sau choãi ra gọi

là “lợn ñứng 3 chân” Tiêu chảy xuất hiện vào ngày thứ 4, phân lỏng có màu xám hoặc trắng, có chất nhầy, có trường hợp toàn nước lẫn máu tươi, có mùi hôi tanh khó chịu Thân nhiệt thường tăng nhẹ 39,5-40oC, nhưng không kéo dài Triệu chứng thần kinh thường xuất hiện vào ngày thứ 6, mắt sưng, viêm giác mạc Biểu hiện thần kinh ngày càng tăng với mức ñộ khác nhau Vào giai ñoạn cuối, lợn thở rất khó, co giật Khi nằm xuống, gần chết, nhiệt ñộ lợn ở mức bình thường hoặc thấp hơn một chút, chân có hiện tượng bơi chèo Ở một số trường hợp sưng tai, cơ nhão, nhợt nhạt, sưng mũi, mắt, môi, ñầu, mặt Ở thể quá cấp tính, lợn chết nhanh trong vòng 6-20 giờ Thể cấp tính chết nhanh sau 2-4 ngày Qua theo dõi ở 6 tỉnh ñồng bằng sông Cửu Long, từ tháng 6/1995 – 4/1996 thấy tỷ lệ lợn ốm là 58,78%, tỷ lệ chết/sinh là 53,34%

3.2 Bệnh tích mổ khám

Nhìn bề ngoài xác lợn chết do bệnh phù ñầu, thấy da ñỏ lên ở phần bụng, thâm ñen ở phần tai, 4 chân, vùng bẹn 100% lợn chết thấy máu ñặc màu sẫm, hạch bẹn nông và hạch ruột sưng, 80% thấy viêm phổi và viêm màng phổi 70% thấy gan sưng tụ huyết, xuất huyết, ñôi khi thấy xơ gan Mật sưng căng, chứa ñầy dịch mật Niêm mạc dạ dày viêm, phù thũng, vuất huyết vùng hạ vị Toàn bộ ruột viêm thể cata 60% thấy xoang bao tim tích nước vàng, tim nhão 50% thấy lách sưng, tụ huyết hoặc xuất huyết ñen 40% thận tụ huyết hoặc xuất huyết từng ñám Ngoài ra còn thấy ở một số trường hợp ruột non viêm nặng, xoang bụng và xoang ngực tích nước Mắt, vùng trước trán, mũi, vùng bụng sưng, phù thũng Trong dạ dày chứa

đầy thức ăn khơ, mủn, nhưng trong ruột non gần như trống rỗng Trong trường hợp thể bệnh khơng điển hình, thường khĩ phát hiện bệnh tích phù

3.3 Chẩn đốn

Chẩn đốn bệnh phù đầu lợn cấp tính cần dựa vào các đặc điểm dịch tễ học: bệnh xuất hiện đột ngột, những lợn béo khỏe nhất đàn mắc bệnh trước, bệnh xảy ra trước và sau cai sữa 1-2 tuần, bệnh ít lây lan, mang tính địa phương ðồng thời căn

cứ và triệu chứng bệnh tích điển hình như: phù, tiêu chảy, thần kinh, tỷ lệ chết cao

ðể chẩn đốn chính xác khẳng định bệnh, bắt buộc phải lấy bệnh phẩm chẩn đốn phịng thí nghiệm Bệnh phẩm chẩn đốn phịng thí nghiệm gồm: máu tim, hạch ruột, ruột và chất chứa trong ruột, gan, lách Ở phịng thí nghiệm tiến hành phân lập

xác định vi khuẩn E coli, xác định các yếu tố gây bệnh trong các vi khuẩn phân lập

bằng các phương pháp sinh học, huyết thanh học, phản ứng PCR Trong đĩ đặc biệt chú ý xác định yếu tố bám dính F18, độc tố tế bào (Stx2e) và khả năng dung huyết

3.4 Phịng bệnh

- Dùng thuốc kháng sinh mẫn cảm như: Colistin, Tetracycline để trộn thức

ăn cho đến sau cai sữa 2-3 tuần Theo Holm (1996) bổ sung kẽm vào thức ăn với hàm lượng 2,400-3,400 ppm sẽ làm giảm tỷ lệ lợn mắc bệnh và chết do bệnh phù đầu, đồng thời cải thiện sự tăng trưởng của lợn Tuy vậy dùng biện pháp này khá tốn kém

-Giống như các bệnh E coli nĩi chung, việc phịng bệnh bằng các biện pháp

vệ sinh là vơ cùng quan trọng Nuơi lợn con trên snf, tập cho lợn con ăn sớm khi mới 2 tuần tuổi, cai sữa sớm lúc 35-45 ngày tuổi Thực hiện biện pháp “cùng vào, cùng ra”

-Miễn dịch bằng cách cho uống hoặc tiêm vacxin vơ hoạt được chế tạo từ các

chủng vi khuẩn E coli mang các kháng nguyên của yếu tố gây bệnh như: F18, F4,

dung huyết, độc tố tế bào, độc tố đường ruột khi lợn được 3-5 tuần tuổi hoặc cho

uống E coli nhược độc sau khi cai sữa (Moon, 1997)

Ở Việt Nam, Viện Thú y đã nghiên cứu chế tạo thành cơng vacxin vơ hoạt

keo phèn phịng bệnh phù đầu lợn con bằng các chủng E coli gây bệnh ở Việt Nam

Vacxin tiêm cho lơn con vào lúc 3 tuần tuổi với liều 1ml/con, lợn có miễn dịch sau

14 ngày, bảo hộ 90% lợn con không mắc bệnh phù ñầu

II VI KHUẨN SALMONELLA VÀ BỆNH TIÊU CHẢY, BẠI HUYẾT DO

là những tác nhân gây bệnh cho người và ñộng vật (Quinn và cs, 2002)

1.1 ðặc ñiểm hình thái

Theo Bergey’s (1994) vi khuẩn Salmonella là những trực khuẩn ngắn, hai

ñầu tròn, có kích thước 0,4-0,6 x 1,0-3,0 µm, bắt màu Gram âm, không hình thành

nha bào và giáp mô ða số loài Salmonella có lông (flagella) từ 7-12 chiếc xung quanh thân (trừ S gallinarum-pullorum)

Ngoài ra, trên bề mặt màng ngoài của vi khuẩn Salmonella ñều có các cấu

trúc sợi nhỏ hơn, còn gọi là Fimbriae hay Pili Chúng có kích thước chừng 0,01- 0,03 x 1,0 µm Số lượng fimbriae trên 1 vi khuẩn có khoảng 250- 400 cái vươn thẳng ra xung quanh bề mặt tế bào Fimbriae có cấu trúc là protein và có tính kháng nguyên ñặc trưng Theo Jones và cs (1981): Fimbriae tạo cho vi khuẩn khả năng bám dính (adhesion) lên các tế bào biểu mô ruột và xâm nhập vào lớp niêm mạc

1.2 Tính chất nuôi cấy

Salmonella là vi khuẩn vừa hiếu khí, vừa kỵ khí không bắt buộc, dễ nuôi cấy

Nhiệt ñộ nuôi cấy thích hợp là 37oC, nhưng có thể phát triển ñược ở nhiệt ñộ từ 6-

42oC Nuôi cấy ở 43oC có thể loại trừ ñược tạp khuẩn mà Salmonella vẫn phát triển

ñược (Timoney và cs, 1988) pH thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 7,6, tuy nhiên

vi khuẩn vẫn phát triển ñược ở pH từ 6-9

Khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường BPW (Buffered Pepton Water) và môi trường RV (Rappaports Vassiliadis) sau vài giờ nuôi cấy thấy môi trường vẩn ñục nhẹ, sau 18 ñến 24 giờ thấy canh trùng ñục ñều, trên mặt môi trường có màng mỏng, ñáy ống nghiệm có cặn

Môi trường thạch MacConkey: Vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc tròn lồi, trong không màu, nhẵn bóng

Trên môi trường thạch CHROMTM Salmonella, sau 24 giờ nuôi cấy, vi

khuẩn hình thành khuẩn lạc trơn, tròn, bóng láng (dạng S) và có màu tím hồng

Trong môi trường thạch TSI (Triple Sugar Iron), vi khuẩn Salmonella do sản

sinh alkaline nên phần thạch nghiêng có màu ñỏ (pH=7,3), ñáy ống nghiệm màu vàng (pH=6,8) do vi khuẩn chỉ lên men ñường Glucose Phần giữa ống nghiệm có màu ñen do vi khuẩn sản sinh ra khí H2S Nếu ñể lâu (quá 24 giờ), màu ñen môi trường thường làm át phản ứng tạo axit ở phần ñáy ống nghiệm (không nhìn thấy màu vàng) Vi khuẩn sinh hơi làm nứt thạch, có khi ñẩy thạch khỏi ñáy ống nghiệm (Quinn và cs, 2002)

Trong môi trường LIM (Lysine Indole Motility), vi khuẩn không làm chuyển màu môi trường, môi trường có màu tím nhạt

1.3 ðặc tính sinh hoá

Theo Quinn và cs (2002), giống vi khuẩn Salmonella ñược chia thành 7 phân

nhóm, mỗi phân nhóm có khả năng lên men một số loại ñường nhất ñịnh và không

ñổi Phần lớn phân loài S enterica subsp enterica gây bệnh cho ñộng vật máu

nóng Chúng lên men và sinh hơi: Glucoza, Mannit, Mantoza, Galactoza, Dulcitol,

Arabonoza, Sorbitol Cũng ở nhóm này, hầu như các chủng vi khuẩn Salmonella

ñều không lên men Lactoza và Saccaroza

ða số các vi khuẩn thuộc giống Salmonella không làm tan chảy Gelatin,

không phân giải Urê, không sản sinh Indol Phản ứng MR, Catalaza dương tính (trừ

tắnh Phản ứng sinh H2S dương tắnh (trừ S paratyphi A, S typhisuis, S choleraesuis) (Ewing và Edwards, 1970)

1.4 Sức ựề kháng của vi khuẩn Salmonella

Vi khuẩn Salmonella mẫn cảm với nhiệt ựộ và các chất sát trùng mạnh Ở

nhiệt ựộ 50oC trong 1 giờ, 70oC trong 20 phút, 100oC trong 15 phút hoặc ánh sáng mặt trời chiếu thẳng trong 5 giờ có thể diệt ựược vi khuẩn (Laval, 2000)

Các chất sát trùng thông thường dễ phá hủy vi khuẩn hoàn toàn như: Phenol 5%, Formon 1/500 diệt vi khuẩn trong 15- 20 phút

Theo Laval (2000), vi khuẩn Salmonella sống ựược lâu trong ựiều kiện lạnh,

chúng có thể sống trong bột thịt 8 tháng, nhưng ở ựiều kiện môi trường có ựộ pH ≤

5 chúng chỉ sống ựược trong thời gian ngắn

Vi khuẩn Salmonella tồn tại trong chất ựộn chuồng tới trên 30 tuần, có thể

sống ở trong ựất với ựộ sâu 0,5cm trong thời gian 2 tháng Ở sàn gỗ, tường gỗ trong ựiều kiện ắt ánh sáng là 87 ngày, máng gỗ 108 ngày (đào Trọng đạt và cs, 1996)

Trong nước tù ựọng, ựồng cỏ ẩm thấp S typhimurium có thể tồn tại trên 7 tháng Trong xác súc vật chết, Salmonella có thể sống trên 100 ngày, trong thịt ướp muối

từ 6-8 tháng (Nguyễn Vĩnh Phước và cs, 1974)

1.5 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella

Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Salmoenlla hết sức phức tạp, bao gồm 3

loại chắnh:

Kháng nguyên O (O- Antigen): Kháng nguyên thân

Kháng nguyên H (H- Antigen): Kháng nguyên lông

Kháng nguyên K (K- Antigen) hay kháng nguyên vỏ

1.5.1 Kháng nguyên thân O (O- Antigen)

Kháng nguyên O nằm ở thành tế bào vi khuẩn, có cấu trúc LipoPolySaccharide (LPS) là thành phần chắnh cấu tạo nên lớp màng ngoài của thành tế bào vi khuẩn Gram âm Kháng nguyên O chịu nhiệt (Heat-stable) và kháng cồn, bị biến tắnh khi sử lý bằng formaldehyde Kháng nguyên O gồm 2 nhóm chắnh:

- Polysaccharide không có nhóm hydro, không mang tính ñặc trưng của kháng nguyên và chỉ tạo sự khác biệt về hình thái khuẩn lạc từ dạng S (Smooth) sang dạng R (Rough) và dẫn ñến giảm ñộc lực của vi khuẩn (Selbitz, 1995)

- Polysaccharide nằm ở ngoài có nhóm hydro quyết ñịnh tính kháng nguyên

và ñặc trưng cho từng serotyp

Kháng nguyên O ñược xem như là một nội ñộc tố (Endotoxin) mà nó ñược cấu tạo bởi nhóm hỗn hợp Glyco- polypeptide có thể tìm thấy ở màng ngoài của vỏ bọc vi khuẩn

Theo CIRAD (2006), kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella có 67 loại

chính, ñược chia thành hơn 50 nhóm, số còn lại ñóng vai trò phụ

1.5.2 Kháng nguyên lông H (H- Antigen)

- Kháng nguyên H (H-Antigen) là protein nằm trong thành phần lông của vi khuẩn, là loại kháng nguyên không chịu nhiệt (Heat labile), rất kém bền vững so với kháng nguyên O, bị phá hủy ở nhiệt ñộ 60oC sau 1 giờ, dễ phá hủy bởi cồn và axit yếu (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001)

* Kháng nguyên vỏ (K- Antigen)( hay Vi- Antigen)

Theo Quinn và cs (2002), kháng nguyên vỏ chỉ có ở một số loài như S typhi,

làm che các kháng nguyên thân O Cũng theo tác giả, nếu đun sơi huyễn dịch của

các lồi Salmonella này trong 10 đến 12 phút sẽ phá hủy được kháng nguyên vỏ

Kháng nguyên vỏ là một loại kháng nguyên cĩ khả năng ngưng kết kháng

thể O khi phát triển nhiều Kháng nguyên này chỉ gặp ở 2 serotyp là: S typhi và S paratyphi C, ký hiệu kháng nguyên hay Vi trong cơng thức đứng sau kháng nguyên

O Theo sơ đồ của Kauffmann – White; cơng thức kháng nguyên của S paratyphi C là: 6,7, Vi: -1,5 và S Typhi là: 9, 12, Vi: c,d

Trong 3 kháng nguyên chủ yếu trên, kháng nguyên O và kháng nguyên H là

2 loại kháng nguyên cĩ ý nghĩa quan trọng trong cơng tác chẩn đốn

1.6 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella

1.6.1 Các yếu tố khơng phải là độc tố

a) Kháng nguyên O

Chất lượng thành phần hĩa học, cấu trúc kháng nguyên O đều ảnh hưởng tới

độc lực của vi khuẩn Salmonella Cụ thể là: S typhimurium nếu thay đổi thành

phần kháng nguyên từ cơng thức 1, 4, 12 sang 1, 9, 12 thì vi khuẩn từ dạng cĩ độc lực chuyển sang dạng khơng cĩ độc lực (Valtonen, 1977) Kháng nguyên O là yếu

tố độc lực giúp vi khuẩn chống lại khả năng phịng vệ của vật chủ, giúp vi khuẩn phát triển trong tế bào tổ chức, chống lại sự thực bào của đại thực bào (Morris và cs, 1976)

Kháng nguyên O khích thích các cơ quan đáp ứng miễn dịch hình thành kháng thể đặc hiệu ngưng kết với kháng nguyên tương ứng Cơ chế phịng vệ này giúp cơ thể vật chủ chống lại quá trình tái xâm nhập của vi khuẩn ðến nay, người

ta đã xác định được trên 3000 serotyp kháng nguyên O của Salmonella, thành phần kháng nguyên của vi khuẩn S choleraesuis gồm: O6, O7; S typhimurium gồm: O1, O4, O5, O12; S enteritidis gồm: O1, O9, O12

b) Kháng nguyên H

Kháng nguyên H khơng cĩ ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phịng bệnh, cũng khơng quyết định yếu tố độc lực, tuy vậy nĩ cĩ vai trị bảo vệ cho vi khuẩn khơng bị tiêu diệt bởi quá trình thực bào, giúp vi khuẩn sống và nhân lên trong các

c) Kháng nguyên K

Bản chất hóa học của kháng nguyên K là Polysaccharide, nhưng thực chất chúng chỉ là thành phần của kháng nguyên O Kháng nguyên K tạo hàng rào bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại tác ñộng ngoại cảnh và hiện tượng thực bào (Nguyễn Như Thanh, 2001)

d) Yếu tố bám dính

Theo Jones và Richardson (1981) khả năng bám dính của vi khuẩn

Salmonella lên tế bào nhung mao ruột là bước khởi ñầu quan trọng trong quá trình

gây bệnh Hiện tượng bám dính của vi khuẩn lên bề mặt tế bào vừa mang tính chất

lý hóa, vừa mang tính chất sinh học và ñược thực hiện theo 3 bước:

Bước 1: Vi khuẩn liên kết từng phần với bề mặt tế bào, thực hiện quá trình này ñòi hỏi vi khuẩn phải có khả năng di ñộng

Bước 2: Là quá trình hấp phụ, phụ thuộc vào ñặc tính bề mặt của vi khuẩn và

tế bào mà vi khuẩn bám dính và ñược thực hiện theo hướng thuận nghịch với sự tương hỗ của những tác ñộng khác nhau

Bước 3: Là quá trình tương tác giữa yếu tố bám dính của vi khuẩn với các ñiểm tiếp nhận trên bề mặt tế bào Yếu tố bám dính của vi khuẩn ñược sắp xếp trên các fimbriae

Theo Lê Văn Tạo (1993), trên mỗi tế bào vi khuẩn Salmonella có từ 250-

400 fimbriae, chúng giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào nhung mao ruột non ñể gây bệnh

e) Yếu tố xâm nhập

Theo Finlay và cs (1988), khả năng xâm nhập vào tế bào có nhân hoặc lớp

niêm mạc của ñường ruột là ñặc tính của một số chủng Salmonella có ñộc lực Các biến chủng Salmonella không có khả năng xâm nhập vào tế bào thường là các

chủng không có ñộc lực

Sau khi tiếp cận tế bào vật chủ, vi khuẩn Salmonella tác ñộng làm tăng hàm

lượng Ca++ nội bào, hoạt hóa Actin Depolimeriring Enzyme, làm thay ñổi cấu trúc, hình dạng các sợi actin, biến ñổi màng tế bào, dẫn ñến hình thành giả túc bao vây tế

nhập vào trong tế bào, tồn tại, tiếp tục nhân lên với số lượng lớn, phá vỡ tế bào vật chủ, sản sinh ñộc tố ñường ruột (Enterotoxin), làm xuất hiện quá trình tiêu chảy của vật chủ (Frost và cs, 1997)

f) Khả năng tổng hợp sắt

Theo Benjamin (1985), ñây là một yếu tố giúp vi khuẩn Salmonella tăng

nhanh về số lượng làm suy yếu khả năng chống ñỡ của vật chủ do bị thiếu sắt Cũng

theo tác giả, vi khuẩn Salmonella có phản ứng với sự thay ñổi cơ chế chu chuyển

sắt; khi quá trình tổng hợp sắt bị ức chế, chúng sẽ chuyển toàn bộ protein màng ñiều phối sắt lên bề mặt của tế bào vi khuẩn, làm cho khả năng hấp thu sắt tăng cường một cách rõ rệt

và môi trường

Khả năng kháng kháng sinh có thể thay ñổi, phụ thuộc vào ñịa phương, thời ñiểm làm kháng sinh ñồ và loại vật nuôi

Trên ñây là 7 yếu tố gây bệnh không phải là ñộc tố của vi khuẩn Salmonella

Các yếu tố này bằng những cơ chế tác ñộng khác nhau, phương thức tác ñộng khác nhau, ñã tạo ñiều kiện bất lợi cho cơ thể vật chủ, ñồng thời chúng lại tạo ñiều kiện

thuận lợi cho vi khuẩn Salmonella gây bệnh Chính vì thế các yếu tố không phải là

ñộc tố ñóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn

Salmonella Vì vậy, việc nghiên cứu các yếu tố này là hết sức cần thiết, góp phần quan trọng trong việc phòng chống bệnh do vi khuẩn Salmonella gây nên

1.6.2 Các yếu tố là ñộc tố

Nếu như các yếu tố gây bệnh không phải là ñộc tố là những tác nhân gián

tiếp, quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella, thì các yếu tố

tố gây bệnh là ñộc tố của Salmonella bao gồm: nội ñộc tố (Endotoxin), ngoại ñộc tố

ñường ruột (Enterotoxin) và ñộc tố tế bào (Cytotoxin) (Finlay và Falkov, 1988)

a) ðộc tố ñường ruột (Enterotoxin)

ðộc tố ñường ruột của vi khuẩn Salmonella có hai thành phần chính: ðộc tố

thẩm xuất nhanh RPF (Rapid Permeability Factor) và ñộc tố thẩm xuất chậm DPF (Delayed Permeability Factor) (Peterson, 1980)

+ Theo Clarke và cs (1988), ñộc tố thẩm xuất nhanh có cấu trúc thành phần

giống với ñộc tố chịu nhiệt của vi khuẩn E coli

Yếu tố thẩm xuất nhanh giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô của

ruột, và thực hiện khả năng thẩm xuất sau 1- 2 giờ, kéo dài 48 giờ và làm trương tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell) ðộc tố RPF kích thích lên hệ thống men Guanylate Cyclase trong tế bào biểu mô ruột, chuyển GTP thành GDP Trong tế bào, GDP tăng cao làm cho nồng ñộ ion Ca++ cũng tăng cao, dẫn ñến ngăn cản hấp thu chất ñiện giải và nước ở trong xoang ruột Do vậy, lượng nước trong ruột tăng cao, kích thích niêm mạc ruột, tăng co bóp, làm gia súc ỉa chảy

Theo ðỗ Trung Cứ và cs (2001): 72,7% các chủng Salmonella phân lập ñược từ

lợn sau cai sữa bị ốm, chết nghi Phó thương hàn sản sinh ñộc tố chịu nhiệt

+ Yếu tố thẩm xuất chậm của Salmonella có cấu trúc, thành phần giống ñộc

tố không chịu nhiệt của vi khuẩn E coli (LT) Nó thực hiện chức năng thẩm xuất

chậm từ 18- 24 giờ, có thể kéo dài 36- 48 giờ DPF bị phá hủy ở 70oC trong vòng

30 phút và ở 56oC trong vòng 4 giờ ðộc tố thẩm xuất chậm của Salmonella làm

thay ñổi quá trình trao ñổi nước và chất ñiện giải, dẫn ñến tăng cường bài xuất nước

và chất ñiện giải từ mô bào vào lòng ruột, cản trở sự hấp thu, gây thoái hóa lớp tế bào villi của thành ruột gây tiêu chảy

ðỗ Trung Cứ và cs (2003) ñã kết luận: 81,81% số chủng S typhimurium

phân lập từ lợn mắc bệnh tiêu chảy sản sinh ñộc tố không chịu nhiệt (LT) có khả năng gây tích nước trong ruột non của lợn thí nghiệm

b) Nội ñộc tố (Endotoxin)

Nội ñộc tố nằm ở lớp màng ngoài của tế bào vi khuẩn và ñược cấu tạo bởi

vùng riêng biệt với các ñặc tính và chức năng riêng biệt: Vùng ưa nước, vùng lõi và vùng lipit A

Nội ñộc tố là LPS ñược tiết ra từ vách tế bào vi khuẩn khi bị dung giải Trước khi thể hiện ñộc tính, LPS cần phải liên kết với các yếu tố liên kết tế bào hoặc các receptor bề mặt các tế bào như: Tế bào lâm bao cầu B, lâm bao cầu T, tế bào ñại thực bào, tiểu cầu, tế bào gan lách

Rất nhiều các cơ quan trong cơ thể vật chủ chịu sự tác ñộng của nội ñộc tố LPS: Gan, thận, cơ, hệ tim mạch, hệ tiêu hóa và hệ thống miễn dịch với các biểu hiện bệnh lý như: Tắc mạch máu, giảm trương lực cơ, thiếu oxy mô bào, toan huyết, rối loạn tiêu hóa, mất tính thèm ăn

c) ðộc tố tế bào (Cytotoxin)

ðặc tính chung của Cytotoxin là có khả năng ức chế tổng hợp Protein của tế bào có nhân và làm trương tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell) ða phần ñộc

tố của chúng bị phá hủy bởi nhiệt ñộ

Theo Clarke và cs (1988), làm tổn thương tế bào biểu mô là ñặc tính quan trọng của Cytotoxin

Trên ñây là 3 loại ñộc tố gây bệnh chính của vi khuẩn Salmonella, chúng là

các tác nhân trực tiếp, quyết ñịnh khả năng gây bệnh của vi khuẩn

Một số serotyp như: S choleraesuis, S typhimurium, S enteritidis, S dublin, S gallinarum, S pullorum có mang các plasmid có kích thước lớn (khoảng từ 50- 100

kb) Chính những plasmid này có mang các yếu tố di truyền quyết ñịnh khả năng sản sinh các yếu tố ñộc lực gây bệnh cho người và gia súc với tỷ lệ ốm và chết cao (Krause và Fang, 1995)

2 Bệnh tiêu chảy bại huyết ở lợn do Salmonella

2.1 ðặc tính sinh bệnh

Theo Quinn và cs (2002), sự lây truyền Salmonella thường qua con ñường

phân-miệng, nhưng nhiễm trùng qua niêm mạc của kết mạc mắt và ñường hô hấp trên cũng có khả năng xảy ra

Cũng theo Quinn và cs (2002), Salmonella cần xâm nhập vào ruột non và kết

bởi hệ vi sinh vật yếm khí bình thường trong ñường ruột có khả năng ức chế sự phát

triển của Salmonella Hệ vi sinh vật hiếu khí bình thường cũng có thể ngăn cản việc tiếp xúc với các vị trí bám gắn cần cho loài Salmonella Sự rối loạn của hệ vi sinh

vật do các yếu tố như: Dùng kháng sinh, khẩu phần ăn, mất nước làm tăng khả năng mẫn cảm của vật chủ với sự nhiễm trùng Nhu ñộng ruột giảm, stress do vận chuyển

và chật chội cũng tạo ñiều kiện cho sự xâm nhập ñường ruột của Salmonella

Mầm bệnh sau khi nhiễm vào ñường tiêu hoá, nhanh chóng ñi vào hệ lâm ba của ruột gây viêm sưng hạch, từ ñó vào hệ tuần hoàn, gây bại huyết, làm cho lá lách sưng to, lúc ñầu do tụ máu, về sau do tăng sinh, sản sinh nội ñộc tố, gây viêm hoại

tử gan và hạch

Bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn có 2 dạng chủ yếu: Thể nhiễm trùng huyết do S choleraesuis var kunzendorf gây ra và thể viêm ruột do S typhimurium

2.2 Thể nhiễm trùng huyết do S choleraesuis var kunzendorf gây ra

Bệnh Phó thương hàn lợn thể nhiễm trùng máu xảy ra chủ yếu ở lợn sau cai

sữa do S choleraesuis var Kunzendorf gây nên (Laval, 2000) Lợn bệnh bỏ ăn, ủ rũ,

thích nằm tập trung lại với nhau ở góc chuồng tối hay chui vào ổ rơm, thân nhiệt tăng cao 40,5 – 41,6oC Mí mắt sưng mọng có nốt tím bầm, viêm kết mạc Khi bị biến chứng, gây viêm phổi, ho khan, có dịch ñờm Xuất huyết lấm tấm dưới da, tụ lại thành những vết ñỏ thẫm trên da bụng và tai Sau 3 – 4 ngày bị mắc bệnh, lợn ỉa chảy có màu vàng Tác ñộng lâm sàng của bệnh Phó thương hàn thể nhiễm trùng máu rất nghiêm trọng và gây chết Trong các ổ dịch, tỷ lệ lợn bệnh chết ở mức cao,

tỷ lệ những con ốm không cố ñịnh, thường dưới 10% tổng ñàn (Wilcock, 1995)

Ở thể á cấp tính, hiện tượng ỉa chảy xuất hiện sau 2 – 3 ngày, rồi kéo dài cho ñến khi lợn chết hoặc khỏi bệnh Phân bài xuất nhiều lần trong ngày, sau ñó phân chảy ra liên tục, phân có màu vàng, vàng xám, vàng nâu ở lợn con, còn ở lợn trưởng thành phân nhão, phân nước có lẫn máu Lợn gầy sút nhanh (Laval, 2000)

Trên da lợn trưởng thành mắc bệnh cũng xuất hiện các mảng da bị ñỏ, hoặc tím bầm ở vùng bụng, tai, bẹn,… sau ñó xuất hiện chứng viêm phổi, lợn ho, thở

khi bị bệnh Tỷ lệ lợn chết ở lợn bị bệnh thể á cấp tắnh khoảng 40 Ờ 45% Lợn bị bệnh thường mang trùng và ựều ựặn thải mầm bệnh ra ngoài theo phân, nhưng khó phát hiện một cách chắnh xác (Laval, 2000)

2.2.1 Bệnh tắch ựại thể:

Khi mổ khám lợn bệnh, những bệnh tắch ựại thể quan sát ựược bao gồm: Các vết tắm xanh ở rìa tai, trên bề mặt da bụng, bẹn, chân và ựuôi; xuất huyết lấm tấm dưới da; hạch màng treo ruột, lách và hạch bạch huyết xưng phồng lên, các thuỳ lách cứng lại Trên bề mặt gan có ựiểm hoại tử nhỏ màu hơi trắng Xuất hiện những ựám hoại tử màu hồng như trứng gà tây ở thận và phổi viêm (Trương Văn Dung và Yoshihara Shinobu, 2002)

2.2.2 Bệnh tắch vi thể:

Lưới nội mô và hạch bạch huyết tăng trưởng; hoại tử ựiểm trắng ở gan; xuất huyết và hoại tử ở hạch bạch huyết của màng treo ruột, màng phổi, màng bụng, màng bao tim, thận và màng não lấm tấm xuất huyết (Trương Văn Dung và Yoshihara Shinobu, 2002)

Theo Wilcock (1995), dấu hiệu biến ựổi bệnh tắch vi thể là do Salmonella

gây ra là ở hạch lympho màng treo ruột: Sưng, xung huyết, xuất huyết và có ựiểm hoại tử màu xám, trên bề mặt gan thấy xuất hiện ựiểm hoại tử mô bào Những biến

ựổi bệnh tắch vi thể ở lợn do Salmonella gây ra là không hề trùng lặp với bất cứ

bệnh nào khác ở lợn

2.2.3 Chẩn ựoán:

Chẩn ựoán bệnh Phó thương hàn thể nhiễm trùng máu do S choleraesuis var Kunzendorf gây nên không thể chỉ dựa trên các triệu chứng lâm sàng ựơn lẻ, vì các triệu

chứng lâm sàng của bệnh giống như nhiều triệu chứng nhiễm trùng khác ở lợn như bệnh

nhiễm trùng do Streptoccocus, bệnh đóng dấu lợnẦ

2.3 Thể viêm ruột do S typhimurium

Bệnh Phó thương hàn thể viêm ruột thường do các serotyp S typhimurium

gây ra ở lợn con từ sau cai sữa ựến khoảng 4 Ờ 6 tháng tuổi Các thể bệnh hay gặp là

cấp tắnh hoặc mãn tắnh (Laval, 2000)

Thời kỳ nung bệnh thường từ 3 – 4 ngày Một trong những triệu chứng ñầu tiên là ỉa chảy, phân dạng nước màu vàng, lẫn máu và chất nhầy Lợn ốm bỏ ăn, thường uống nhiều nước ðợt sốt ñầu tiên kéo dài chừng một tuần, tiếp theo một thời kỳ không sốt mấy ngày, rồi lại tiếp tục sốt Ở một số lợn ốm thấy bị viêm khớp, chân bị què, ñứng không vững, ñi xiêu vẹo Ngoài triệu chứng tiêu chảy, lợn ốm còn bị viêm phổi, lợn ho, thở gấp, nước mũi chảy nhiều Hầu hết lợn bệnh bình phục nếu ñược ñiều trị kịp thời, nhưng chủ yếu chuyển sang thể mãn tính kéo dài vài tháng Tỷ lệ lợn chết dao ñộng từ 40% – 50% Số con còn sống sót chậm lớn, còi cọc Những lợn khỏi bệnh thường mang trùng và thải mầm bệnh ra ngoài môi trường (Laval, 2000)

2.3.3 Bệnh tích vi thể:

Sự hoại tử nông hay sâu trên bề mặt của lớp tế bào biểu mô ruột là những bệnh lý vi thể ñặc trưng của thể viêm ruột; có trường hợp thấy nổi gồ lên khỏi niêm mạc xung huyết của ruột những hạt tròn như hạt ñậu màu trắng vàng Phần ñầu lông nhung trong hồi tràng bị teo ngắn lại ða số trường hợp thấy mảng payer bị loét dưới ñáy như phủ một lớp tổ chức hoại tử màu vàng trắng, niêm mạc dạ dày có ñiểm chảy máu rải rác, có một số loét nhỏ tập trung ở bờ cong nhỏ Gan xung huyết, trên bề mặt gan có thể thấy những nốt u nhỏ (áp xe) mang tính ñặc trưng cho thể bệnh không giống với ñiểm hoại tử trong thể nhiễm trùng huyết (Phạm Sỹ Lăng và

cs, (1997)

+ Chẩn đốn lâm sàng: Ở thể viêm ruột của bệnh Phĩ thương hàn, căn cứ vào các triệu chứng điển hình như viêm ruột và dạ dày ở lợn con từ sau cai sữa đến

4 tháng tuổi ðồng thời, dựa vào kết quả nuơi cấy, phân lập vi khuẩn trên mơi trường pepton và kiểm tra di động trên mơi trường thạch và xét nghiệm huyết thanh học

+ Chẩn đốn phân biệt với bệnh hồng lỵ; Chứng viêm ruột do

Campylobacter (PHE); Viêm ruột hoại tử; bệnh viêm dạ dày ruột (Transmission Gasto Enteritis- TGE); tiêu chảy ở lợn do E coli Một số tác nhân gây tiêu chảy do

vi rút như Rotavirus và Coronavirus gây viêm ruột, bệnh dịch tả lợn, các loại ký sinh trùng như cầu trùng Coccidia…

ðể cĩ thể phân biệt rõ các loại bệnh này thường phải tiến hành các xét nghiệm kiểm tra vi khuẩn trong phịng thí nghiệm

Chẩn đốn phân biệt bệnh do Salmonella gây ra ở lợn với các bệnh do E coli và

bệnh dịch tả lợn cĩ ý nghĩa rất quan trọng trong thực tiễn

III VACXIN PHỊNG PHÙ ðẦU, TIÊU CHẢY, BẠI HUYẾT TRÊN LỢN

ðiều kiện cần của một vacxin: một vacxin phải cĩ đủ 3 điều kiện chính là an tồn, vơ trùng và cĩ hiệu lực

Hiện nay đã cĩ nhiều loại vacxin để phịng bệnh Phĩ thương hàn như vacxin nhược độc chủng TS – 177 và vacxin nhược độc cĩ bổ trợ như vacxin keo phèn hay

vacxin nhũ hố cĩ bổ trợ dầu Vacxin chống một số chủng phổ biến là S typhimurium, S dublin, S choleraesuis,…

Ở nước ta, để phịng bệnh Phĩ thương hàn, các loại vacxin đã được một số cơng

ty, xí nghiệp thuốc thú y sản xuất và sử dụng phổ biến hiện nay như sau:

+ Vacxin Phĩ thương hàn heo do cơng ty thuốc Thú y Trung Ương

(NAVETCO) sản xuất, là vacxin vơ hoạt chế từ vi khuẩn S choleraesuis chủng Kunzendorf 1 ml vacxin chứa 1010 tế bào vi khuẩn, chất bổ trợ là keo phèn Tiêm dưới da hoặc bắp thịt cho heo con 2 lần: lần 1 (heo từ 20 – 30 ngày tuổi) liều 1 ml/con; lần 2 cách lần một sau 3 tuần, liều tiêm như lần 1

+ Vacxin Phĩ thương hàn lợn do Xí nghiệp thuốc thú y Trung Ương sản

choleraesuis kháng nguyên typ O: 6,7; H: 1,5 vô hoạt bằng formalin, bổ trợ keo

phèn Tiêm dưới da cho lợn con từ 20 ngày tuổi 2 lần, cách nhau 7 – 15 ngày; lợn sau cai sữa 5 ml/con/lần Có thể tiêm vacxin 2 – 3 lần cho lợn mẹ ở thời kỳ tháng ñầu có chửa ñể phòng bệnh cho lợn con ngay sau khi ñẻ qua sữa mẹ

- Vacxin Phó thương hàn nhược ñộc ñông khô, ñược chế tạo từ vi khuẩn

nhược ñộc S choleraesuis typ O: 6,7; H: 1,5 qua tổ chức FAO, vacxin ñược chế ở

dạng ñông khô Mỗi liều vacxin có chứa 2 – 2,5 tỷ vi khuẩn Vacxin gây miễn dịch nhanh và mạnh Sau khi tiêm 9 – 10 ngày bắt ñầu có miễn dịch vững chắc Vacxin ñược pha với nước sinh lý hoặc nước cất vô trùng, mỗi liều pha ra 1 ml, tiêm dưới

da hay bắp thịt cho lợn con từ 25 ngày tuổi trở lên, kể cả lợn mẹ có thai ở nửa thời

kỳ ñầu Liều tiêm là 1 ml ñồng ñều cho các loại lợn

+ Vacxin tam liên do phân viện Thú y Miền Trung sản xuất: Phòng 3 bệnh: Phó thương hàn, dịch tả, tụ huyết trùng lợn; vacxin dạng ñông khô, tiêm dưới da cho lợn từ 20 ngày tuổi trở lên; liều 2 ml/con/lần, nhắc lại liều trên sau một tuần ðây là loại vacxin có ý nghĩa sử dụng cao trong thực tiễn

Ở Việt Nam, vacxin E coli chết dựa trên cơ sở kháng nguyên F4 do Viện

Thú y sản xuất và vacxin phòng bệnh phù ñầu ñã ñược thử nghiệm thành công ở các

ñịa phương trên phạm vi cả nước ðể giảm thiệt hại do E coli gây ra, cần thực hiện

một hệ thống biện pháp tổng hợp, trong ñó chú ý quản lý tốt lợn nái trong thời kỳ mang thai và lợn con sơ sinh

Năm 1993, Lê Văn Tạo chế vacxin E coli vô hoạt từ các chủng gây bệnh ở lợn

con có mang các yếu tố (Ent, Hly, Colv, F4), sử dụng cho lợn con uống sau khi ñẻ 2 giờ với liều 1ml/ con, uống liên tục 3-5 ngày Kết quả giảm tỉ lệ mắc bệnh từ 46% xuống còn 11% Sau ñó tiêm vacxin Salco cho lợn khi ñược 3 tuần tuổi ñể chống tiêu chảy trước và sau cai sữa (Nguyễn Thị Nội và cộng sự, 1989),

Tại vùng ñồng bằng sông Cửu long, Lê Văn tạo và cộng sự (1996) ñã xác

ñịnh ñược nguyên nhân gây bệnh phù ñầu ở lợn là các chủng vi khuẩn E coli có

mang các yếu tố gây bệnh, bước ñầu chọn chủng và chế tạo và thử nghiệm vacxin phòng bệnh

Hiện nay, Cù Hữu Phú và cộng sự tại Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y ñã hoàn thiện quy trình sản xuất loại Autovacxin vừa an toàn vừa có hiệu quả phòng bệnh cao Tiêm vacxin cho lợn ở diện hẹp ñã làm giảm tỷ lệ tiêu chảy từ 20,45% xuống 4,21% và giảm tỷ lệ chết từ 4,3% xuống 0,7% Nếu tiêm vacxin ñại trà, hiệu quả phụ thuộc vào tình trạng mắc bệnh, mức ñộ ô nhiễm của từng trại, thấp nhất là giảm

từ 2,4% xuống còn 1,2% và cao từ 21,5% xuống 3,5% so với tổng ñàn Từ ñó, ñã

kết luận phòng bệnh E coli cho lợn con trước và sau cai sữa là tiêm phòng bằng

vacxin (Cù Hữu Phú và cs, 2004)

Tại Việt Nam, ngoài vacxin trong nước sản xuất, ñang lưu hành các loại vacxin do nước ngoài sản xuất như: Neocolipor của hãng Nissan Chemical Indutries, vacxin Litter Guard LT-C của hãng Embrex INC sản xuất phòng tiêu

chảy do E coli và Clostridium perfrin-gens, Rokovac của hãng Bioveta, A.S phòng bệnh tiêu chảy do E coli và Rotavirus suis ở lợn, Porcili Coli của hãng Intervet Trên thị trường có bán một số vacxin phòng bệnh bại huyết do vi khuẩn Salmonella cholerae suis gây ra cho lợn Nhưng các công trình nghiên cứu gần ñây ñã cho thấy:

vi khuẩn Salmonella typhimurium lại gây viêm ruột và tiêu chảy rất nặng cho lợn Chính vì vậy, việc phòng bệnh viêm ruột và tiêu chảy cho lợn do Salmonella typhimurium bằng vacxin là yêu cầu cấp thiết của sản xuất hiện nay

Những năm trước ñây, Bộ môn Vi trùng Viện Thú y ñã nghiên cứu và chế tạo thành công vacxin ña giá SALSCO phòng bệnh tiêu chảy bại huyết cho lợn do

vi khuẩn E coli gây tiêu chảy cho lợn, vi khuẩn Salmonella cholerasuis gây bệnh phó thương hàn lợn và vi khuẩn Streptococcus gây bệnh tiêu chảy lợn Vacxin

SALSCO ñã ñược sử dụng phòng bệnh tiêu chảy cho lợn và ñạt kết quả tốt

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:

- Thu thập các chủng vi khuẩn E coli, Salmonella ở các lợn mắc tiêu chảy,

phù ñầu và bại huyết phân lập ñược ñang lưu giữ tại Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y;

- Xác ñịnh ñặc tính sinh vật, hóa học của các chủng E coli, Salmonella phân

lập ñược;

- Xác ñịnh yếu tố gây bệnh của các chủng E coli, Salmonella phân lập ñược;

- Xác ñịnh ñộc lực của các chủng vi khuẩn E coli, Salmonella phân lập

ñược;

- Xác ñịnh tính kháng nguyên các chủng vi khuẩn E coli, Salmonella phân

lập ñược;

- Chọn chủng ñề xuất chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh tiêu chảy, phù

ñầu và bại huyết ở lợn

II ðỐI TƯỢNG ðỊA ðIỂM :

- ðối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn E coli, Salmonella phân lập ñược từ lợn

mắc bệnh phù ñầu, tiêu chảy, bại huyết ở một số tỉnh phía Bắc

- ðịa ñiểm nghiên cứu: Các nội dung nghiên cứu của ñề tài ñược tiến hành tại Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y

III NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU

3.1 Các loại hóa chất, môi trường dùng ñể nuôi cấy, giám ñịnh vi khuẩn

Các loại hóa chất, môi trường dùng ñể nuôi cấy và giám ñịnh các loại vi

khuẩn E coli, Salmonella bao gồm:

- Môi trường thạch:

+ Thạch máu (Blood Agar Base)

+ Môi trường BPW, RV, Mac Conkey, Môi trường thạch CHROMTM

Salmonella và thạch DHL

+ Môi trường TSI, LIM và môi trường Malonate dùng ñể giám ñịnh vi khuẩn

- Môi trường BHI (Brain Heart Infusion) dùng ñể ñịnh typ và giữ giống vi khuẩn

- Môi trường nước thịt: Nước thịt thường (Nutrient broth), nước thịt BHI (Brain Heart Infusion broth), nước thịt TSB (Tryptone Soya Broth),…

- Môi trường, hóa chất xác ñịnh các ñặc tính sinh hóa: Oxidase, Catalase, Indol, Urease, ONPG; Các loại ñường: Glucose, Lactose, Maltose, Mannitol, Arabinose, Trehalose, Raffinose,…

- Kháng huyết thanh chuẩn (do hãng Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Nhật Bản sản xuất) dùng ñể ñịnh typ kháng nguyên vi khuẩn

3.2 Các loại hóa chất dùng trong phản ứng PCR

Bao gồm các hóa chất dùng trong phản ứng PCR ñể giám ñịnh, xác ñịnh

serotype và yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E coli, Salmonella như: PCR buffer,

dNTPs, primers, Taq DNA polymerase, DNA ladder, loading dye,…

3.3 Giống vi khuẩn

- Các chủng vi khuẩn dùng làm ñối chứng dương gồm: E coli, S choleraesuis, S typhimurium, S enteritidis do Viện Thú y Nhật Bản, Úc cung cấp

3.4 ðộng vật thí nghiệm

- Chuột nhắt trắng khỏe mạnh (18-20 g/con)

- Lợn 30 – 40 ngày tuổi, khỏe mạnh, chưa ñược tiêm vacxin phòng bệnh phù ñầu, tiêu chảy, bại huyết

3.5 Máy móc, thiết bị phòng thí nghiệm

Bao gồm các dụng cụ thí nghiệm, buồng cấy, nồi hấp vô trùng, tủ sấy, máy

ly tâm, máy nhân gen PCR, máy ñiện di sản phẩm PCR,…

IV PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

4.1 Phương pháp phân lập và giám ñịnh vi khuẩn:

Các phương pháp nuôi cấy và giám ñịnh vi khuẩn ñược thực hiện theo quy trình nghiên cứu thường quy của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú Y