Nghiên cứu sự đa dạng của nấm men trong lên men kombucha từ trà thái nguyên (LV01302)

Lý do chọn đề tài Trà kombucha là loại thức uống lên men trong dung dịch trà đường, có tác dụng bổ dưỡng cho sức khỏe, được sử dụng rộng rãi ở một số nước trên thế giới từ cách đây khá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

-o0o -

TRẦN THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG CỦA NẤM MEN

TRONG LÊN MEN KOMBUCHA TỪ

TRÀ THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Sinh thái học

Mã số: 60 42 01 20

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đinh Thị Kim Nhung

HÀ NỘI, 2014

LỜI CẢM N

Trong quá trình tìm hiểu, nghiên cứu và hoàn thành luận văn tốt ngiệp, tôi đã nhận được những lời chỉ bảo, hướng dẫn tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị em và các bạn Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin bày

tỏ lòng biết ơn tới:

PGS TS.Đinh Thị Kim Nhung – Người đã trực tiếp hướng dẫn, dạy bảo, động viên, và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ phòng Vi sinh trường ĐH Hà Nội

2 Bên cạnh đó, Ban giám hiệu, hòng sau đại học, các hòng, Ban trường

ĐH Hà Nội 2 đã tạo các điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình làm việc

Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã giúp đỡ tôi trong quá trình chụp mẫu để hoàn thành nghiên cứu của mình

Cùng với đó là sự biết ơn chân thành tới những người thân trong gia đình, bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Hà Nội, tháng 12 năm 2014

Học viên

Trần Thị Tâm

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung.Luận văn này không có sự trùng lặp với các đề tài khác

Hà Nội, tháng 12 năm 2014

Học viên

Trần Thị Tâm

MỤC LỤC

L I M N i

L I M ĐO N ii

MỤ LỤ iii

NH MỤ K HI U, H VI T TẮT vii

NH MỤ NG viii

NH MỤ H NH x

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

5 Phư ng pháp nghiên cứu 2

6 Đóng góp mới của đề tài 3

HƯ NG 1 TỔNG QUAN TÀI LI U 4

1.1 S lược về trà 4

1.1.1 Nguồn gốc cây chè 4

1.1.2 Thực vật học 4

1.1.3 Phân loại sản phẩm trà 5

1.1.4 Đặc điểm và phư ng pháp sản xuất trà xanh Tân ư ng - Thái Nguyên 5

1.1.4.1 Phân loại sản phẩm trà xanh Thái Nguyên 6

1.1.4.2 hương pháp sản xuất trà xanh 7

1.1.5 Giá trị và thành phần hóa học của lá chè tư i 7

1.2 Giới thiệu về kombucha 9

1.2.1 S lược về kombucha 9

1.2.2 Đặc điểm vi sinh vật trong kombucha 11

1.2.2.1 Acetobacter 11

1.2.2.2 Giống vi khuẩn lên men lactic 12

1.2.2.3 Nấm men 13

1.2.3 chế của quá trình lên men kombucha 17

1.2.4 Đa dạng nấm men trong kombucha 19

1.3 Tình hình nghiên cứu kombucha hiện nay 21

1.3.1 Trên thế giới 21

1.3.2 Các nghiên cứu kombucha ở Việt Nam 22

HƯ NG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯ NG PH P NGHIÊN ỨU 24

2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.1 Nguyên liệu 24

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ thí nghiệm 24

2.1.2.1 Hóa chất 24

2.1.2.2 Dụng cụ thí nghiệm 24

2.1.3 Các loại môi trường 24

2.2 Phư ng pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Phư ng pháp vi sinh 25

2.2.1.1 hương pháp phân lập nấm men và quá trình quan sát hình thái trên tiêu bản nhuộm gram 25

2.2.1.2 hương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật 26

2.2.1.3 Bảo quản chủng giống 27

2.2.1.4 Xác định hoạt lực lên men 27

2.2.1.5 Xác định khả năng kết lắng 27

2.2.2 Phư ng pháp hóa sinh 28

2.2.2.1 Xác định độ cồn 28

2.2.2.2 Xác định pH 28

2.2.3 Phư ng pháp nghiên cứu đa dạng nấm men 29

2.2.3.1 hương pháp đếm đĩa 29

2.2.3.2 Đánh giá sự đa dạng nấm men dựa trên khả năng sử dụng nguồn carbon 29

2.2.3.3 Đánh giá sự đa dạng nấm men dựa trên khả năng sử dụng nguồn nito 29

2.2.3.4 Đánh giá sự đa dạng nấm men dựa trên điều kiện nuôi cấy 30

2.2.4 Phư ng pháp cảm quan 30

2.2.5 Xử lý số liệu bằng thống kê toán học 32

HƯ NG 3 K T QU NGHIÊN CỨU VÀ TH O LUẬN 34

3.1 Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên 34

3.2 Tuyển chọn chúng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên 36

3.2.1 Hoạt lực lên men 37

3.2.2 Khả năng chịu cồn 38

3.2.3 Thử nghiệm khả năng kết lắng 39

3.2.4 Chất lượng cảm quan của kombucha được lên men từ 9 chủng 39

3.2.5 Nghiên cứu hình dạng tế bào của 3 chủng nấm menT1, T17 và T29 41

3.3 Động thái sinh trưởng của ba chủng nấm men T1, T17 và T29 41

3.4 Đánh giá sự đa dạng nấm men dựa vào khả năng sử dụng các nguồn dinh dưỡng 43

3.4.1 Khả năng sử dụng nguồn carbon khác nhau 45

3.4.2 Khả năng sử dụng nguồn nit khác nhau 48

3.4.3 Đánh giá ảnh hưởng của nồng độMgSO4.7H2O 51

3.5.1 nh hưởng của pH ban đầu 53

3.5.2 nh hưởng của nhiệt độ lên men tới quá trình lên men 54

K T LUẬN VÀ KI N NGHỊ 57

1 K T LUẬN 57

2 KI N NGHỊ 57

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GI 58

TÀI LI U THAM KH O 59

Nhà xuất bản Tiêu chuẩn Việt Nam Đại học sư phạm Trước công nguyên

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học chủ yếu của lá chè tư i………… 8

Bảng 2.1 Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha 31

Bảng 2.2 Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu……… 32

Bảng 2.3 Bảng quy định mức đánh giá chất lượng sản phẩm…… 32

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái và kích thước của nấm men trong các

Bảng 3.4 Khả năng kết lắng khác nhau của 9 chủng nấm men… 39

Bảng 3.5 Chất lượng cảm quan của các chủng nấm men………… 40

Bảng 3.6 Độngtháipháttriểncủa3 chủngnấmmen T1, T17, T29 42

Bảng 3.7 nh hưởng của nguồn trà đến quá trình lên men…… 44

ảng 3.8 nh hưởng của nguồn carbon đến hàm lượng ethanol,

hàm lượng O2, số lượng tế bào, cảm quan trong dịch lên men của ba chủng T1, T17 và T29 45 Bảng 3.9 nh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình lên men

của ba chủng nấm men T1, T17 và T29 47 ảng 3.10 nh hưởng của nguồn nit đến hàm lượng ethanol, hàm

lượng O2, số lượng tế bào, cảm quan trong dịch lên men của ba chủng T1, T17 và T29 48

ảng 3.11 nh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4 đến quá trình lên

men của ba chủng nấm men T1, T17 và T29 50 Bảng 3.12 Khả năng lên men của chủng T1, T17 và T291 trên môi

trường có hàm lượng MgSO4.7H2O khác nhau……… 51 ảng 3.13 nh hưởng của pH tới quá trình lên men kombucha 53 Bảng 3.14 nh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men 55

DANH MỤC H NH

Hình 1.1 Trà xanh Tân ư ng – Thái Nguyên………… …… 5

Hình 1.2 Vị trí lá chè……… ……… 6 Hình 1.3 Một số thiết bị c học trong chế biến trà xanh Thái Nguyên 7 Hình 1.4 Trà kombucha…….………… … 10 Hình 1.5 chế phân giải đường trong tế bào nấm men…… 17

Hình 3.1 Tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học có độ phóng

đại 1000 lần

35

Hình 3.2 nh chụp khuẩn lạc nấm men trên môi trường thạch đĩa… 36

Hình 3.3 nh chụp khuẩn lạc nấm men trên môi trường thạch nghiêng 36 Hình 3.4 Tế bào nấm men chụp kính hiển vi điện tử quét SEM-

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Trà kombucha là loại thức uống lên men trong dung dịch trà đường, có tác dụng bổ dưỡng cho sức khỏe, được sử dụng rộng rãi ở một số nước trên thế giới từ cách đây khá lâu, người Pháp gọi là Champignon De Longuc Vie (nấm trường sinh), người Nhật gọi nó là kombucha, người Trung Quốc gọi là thủy hoài sâm, Nga gọi là nấm trà Kombucha được sản xuất do quá trình lên men dịch chiết trà nhờ nấm trà, nó là một hỗn hợp phức tạp giữa nấm men và

vi khuẩn Nhờ quá trình lên men trong trà kombucha có chứa rượu ethanol, các loại vi sinh vật khác nhau, các acid amin, acid hữu c , enzyme, polyphenol, vitamin C và một lượng lớn vitamin nhóm B

Trà kombucha được sử dụng làm thức uống giải khát ở các nước Đông

Âu, Nhật Bản, Trung Quốc , từ rất lâu Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về trà kombucha, kết quả ban đầu cho thấy trong dịch trà kombucha có chứa chất kháng sinh (diệt khuẩn và kìm hãm vi khuẩn) có tác dụng chống lại một số vi sinh vật gây bệnh Theo nghiên cứu của Neil Campbell – Brown, trà kombucha có tác dụng: giải độc c thể, cải thiện chức năng gan, tăng cường hệ thống miễn dịch, ngăn ngừa bệnh, hỗ trợ tiêu hóa

Thành phần vi sinh vật trong kombucha có vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình lên men Ở giai đoạn đầu của quá trình lên men đường sẽ được

nấm men chuyển hóa thành rượu, sau đó các vi khuẩn Acetobacter sẽ biến

rượu thành acid Nếu thiếu vi khuẩn hoặc nấm men thì quá trình lên men sẽ không diễn ra Ở Việt Nam việc sử dụng trà kombucha còn khá mới mẻ, các công trình nghiên cứu về trà kombucha vẫn còn khiêm tốn nhất là các nghiên cứu về nấm men Do đó, để hiểu rõ h n về quá trình lên men kombucha

chúng tôi quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu sự đa dạng của nấm men trong lên men kombucha từ trà Thái Nguyên”

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu sự đa dạng của nấm men trong lên men tạo sản phẩm kombuchath m ngon, bổ dưỡng từ trà Thái Nguyên

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

3.1 Phân lập nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên 3.2 Tuyển chọn nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên.Xác định độ thuần chủng của nấm men trong lên men kombucha

3.5 Đánh giá sự đa dạng nấm men dựa vào điều kiện nuôi cấy

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng nghiên cứu

5 Phư ng ph p nghiên cứu

5.1 hương pháp vi sinh: gồm có phư ng pháp phân lập nấm men và quan

sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram, Phư ng pháp xác định số

lượng tế bào vi sinh vật; ảo quản chủng giống; Phư ng pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men

5.2 hương pháp hóa sinh: bao gồm phư ng pháp Xác định hàm lượng

đường khử; Xác định độ cồn; Phư ng pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường, nit , dinh dưỡng khoáng đến quá trình lên men kombucha

5.3 Phươngphápcảmquan: Sử dụng c quan cảm giác của con người để tìm

hiểu mô tả và định lượng các tính chất cảm quan vốn có của thực phẩm

5.4 Xử lísố liệubằngthốngkê toánhọc Chúng tôi xử lý các kết quả thống kê

thí nghiệm theo một số phư ng pháp như: Số trung bình cộng, trung bình bình phư ng các sai lệch, sai số đại diện của trung bình cộng, hệ số biến thiên

6 Đóng góp mới của đề tài

Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về đa dạng nấm mendựa trên khả năng dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy trong lên men kombucha từ trà Thái Nguyên

CHƯ NG 1 TỔNG QUAN TÀI LI U

1.1 S lược về trà

1.1.1 Nguồn gốc cây chè

Năm 1753, arl Von Lenne - nhà thực vật học Thụy Điển đã đặt tên khoa học cho cây chè là Thea Sinensis, chia thành Thea bochea (chè đen) và Thea viridis (chè xanh), và nguồn gốc của cây chè là ở Trung Quốc 1823, R Bruce (Anh) phát hiện ra những rừng chè dại cao 17-20m ở vùng Sadiya thuộc Assam - Ấn Độ, sau đó ở Miến Điện, Việt Nam, Lào, thượng nguồn sông Mê Kông và Vân Nam – Trung Quốc Djemukhatze, viện hàn lâm khoa học Liên Xô (1961 - 1977) khẳng định nguồn gốc cây chè có ở Việt Nam

Thực tế hiện nay phần đông các nhà khoa học cho rằng nguyên sản của cây chè là cả một vùng từ Assam Ấn Độ sang Miến Điện, Vân Nam - Trung Quốc, Việt Nam, Thái Lan Từ đó chia làm hai nhánh, một đi xuống phía Nam và một đi lên phía ắc, trung tâm là vùng Vân Nam – Trung Quốc.Điều kiện khí hậu ở đây lý tưởng cho cây chè sinh trưởng quanh năm[1], [10]

Chi: Chè - Camellia (Thea)

Loài: Camellia (Thea) sinensis

- úp chè: là giai đoạn non của một cành chè , được hình thành từ các mầm dinh dưỡng gồm có tôm và hai hoặc ba lá non

- Hoa chè: thuộc hoa lưỡng tính, tràng 5 – 7 cánh, màu trắng hoặc phớt hồng Phư ng thức giao phấn là chủ yếu, tự thụ phấn chỉ chiếm 2 – 3%

- Quả chè: thường mọc thành từng chùm 3 an đầu có màu xanh của chồi, sau màu nâu chứa hạt Hạt bên trong có thể dùng để gieo trồng [1], [16]

1.1.3 Phân loại sản phẩm trà

Trà là sản phẩm đã qua chế biến của lá chè Trên thị trường có rất nhiều các loại sản phẩm trà khác nhau, mỗi loại đều có những tính chất đặc trưng riêng, khác nhau về ngoại hình, màu nước và hư ng vị của chúng như trà xanh, trà đen, trà đỏ, trà vàng [1]

1.1.4 Đặc điểm và phương pháp sản xuất trà xanh Tân Cương - Thái Nguyên

Hình 1.1 Trà xanh Tân Cư ng – Thái Nguyên

Thái Nguyên có nhiều dãy núi cao chạy theo hướng Bắc - Nam, địa hình tại xã Tân ư ng chủ yếu dạng gò đồi và bát úp, độ cao từ 30 m – 100m

so với mực nước biển, rải rác một số đồi đỉnh tròn cao khoảng 150m Xã Tân

ư ng chủ yếu là đất Feralit vàng đỏ, đất xám Feralit trên đá cát, đất phù sa ít được bồi hàng năm, đặc biệt thích hợp với cây chè Tân ư ng mang đặc trưng của vùng nhiệt đới ẩm, có hai mùa rõ rệt là mùa nóng và mùa lạnh Lượng mưa trung bình năm đạt khoảng 1600 – 1800mm, nhiệt độ khoảng

220C – 230C, ở các vùng đồi cao trên 900 – 1000m nhiệt độ trung bình chỉ còn dưới 180

C Độ ẩm tư ng đối cao, trung bình năm đạt khoảng 82 – 84% Với đặc điểm khí hậu và điều kiện địa lý lí tưởng trên đã ảnh hưởng lớn đến hệ vi sinh vật có trên bề mặt lá chè làm cho sản phẩm trà có hư ng vị đặc trưng ác loại enzyme và nấm men có mặt ở lá chè rất ưa nhiệt độ từ khoảng

200C – 250C, do vậy mật độ nấm men khá cao so với chè ở một số vùng khác

1.1.4.1 hân loại sản phẩm trà xanh Thái Nguyên

Phân loại sản phẩm trà xanh thư ng phẩm theo đặc điểm thu hái, gồm các loại sau:

1.1.4.2 hương pháp sản xuất trà xanh

Quy trình chế biến trà xanh bằng thiết bị c giới

Hình 1.3 Một số thiết bị c học trong chế biến trà xanh Thái Nguyên

Thông thường, người trồng chè sẽ thu hái và phân loại sản phẩm cho đến trà đặc sản để là trà thư ng phẩm, do lá chè ở giai đoạn này cho hư ng vị

th m ngon nhất ên cạnh đó mật độ vi sinh vật nhất là nấm men là lớn nhất,

hệ vi sinh vật góp phần quan trọng tạo nên chất lượng của sản phẩm trà

1.1.5 Giá trị và thành phần hóa học của lá chè tươi

Trà xanh có tác dụng tránh đau đầu, trầm cảm, tinh thần minh mẫn sảng khoái Ngoài ra uống trà xanh có thể phòng ngừa và điều trị đa x cứng, chống

lại một số bệnh như tiêu chảy, tả lỵ, thư ng hàn Đặc biệt trà xanh là một nguồn

tự nhiên của chất chống oxy hóa, sát khuẩn làm giảm nhiễm trùng [1], [10]

Bảng 1.1 Thành phần hóa học chủ yếu của l chè tư i

Acid hữu c ( itric, malic, oxalic ) 0,5 – 0,6

Đường (glucose, fructose, raffinose, stachyose ) 4 – 5

Chất x (cellulose, hemicellulose, lignin) 7 – 20

Nguồn: Tổng hợp các tài liệu về cây chè, 2010

Thành phần các chất hóa học có trong lá chè tư i một mặt tham gia trực tiếp vào sự hình thành chất lượng trà sản phẩm (như pectin, caffeine ) Mặt khác quan trọng h n là qua sự biến đổi hóa học (như sự biến đổi của tannin, protein, glucid ) để tạo nên các tính chất đặc trưng cho trà sản phẩm.Thành phần hóa học của lá chè rất đa dạng và phong phú về số lượng các chất, đồng thời cũng có chứa một lượng lớn các chất có giá trị sinh học cao mà có tính chất đặc trưng cho sản phẩm trà Các nhóm chất có ý nghĩa lớn đó là hợp chất phenol thực vật, các hợp chất chứa nit và hệ enzyme có sẵn trong trà[1]

1.2 Giới thiệu về kombucha

1.2.1 Sơ lược về kombucha

Kombucha là một loại đồ uống lên men nhờ vi sinh vật từ dịch chiết trà, có lợi cho sức khỏe, có vị ngọt và hư ng th m đặc trưng

Kombucha đến từ đâu? Cho tới nay có rất nhiều ý kiến khác nhau về kombucha và chưa ai dám khẳng định chắc chắn nguồn gốc của kombucha Tuy nhiên, cũng có vài giả thuyết về sự ra đời của kombucha Một trong những giả thuyết đó là kombucha xuất hiện vào triều đại nhà Tần ở Trung Quốc khoảng năm 221 T N, nó được mệnh danh là “trà của sự bất tử” Một giả thuyết khác lại cho thấy, kombucha là một loại trà dược do một bác sỹ người Hàn Quốc tên là Kombu đem về cho Hoàng đế Inyoko của Nhật Bản năm 414 T N và được các chiến binh Samurai sử dụng nhằm tăng sức chiến đấu Hay như có lời đồn đại rằng kombucha xuất phát từ Nhật Bản “Kombu”

là tên của một loại rong biển, còn “cha” có nghĩa là trà và kombucha nghĩa là trà rong biển Tuy vậy giả thuyết này không mang tính thuyết phục Một số ít thì cho rằng kombucha có nguồn gốc từ Ai Cập cổ đại Lại có người viết rằng kombucha đã từng được đựng đầy bình trong các cuộc chinh chiến của Thành

át Tư Hãn và quân đội của ông vào cuối thế kỉ 12 đầu thế kỉ 13 Kombucha

và thịt nướng là hai món không thể thiếu trong các bữa ăn của vị Đại Hãn này cùng quân đội của mình Như vậy, đa số các ý kiến cho rằng kombucha có nguồn gốc từ Trung Quốc n i mà các phư ng thuốc luôn được bắt nguồn từ thiên nhiên với mục đích sử dụng đầu tiên trong y thuật Từ châu , nó đi qua con đường t lụa sang châu Âu bắt đầu ở Ukraine và Nga vào cuối thế kỷ 19 Kombucha trở thành thức uống phổ biến ở Nga và châu Âu cho đến khi việc mua bán trà và đường trở nên khó khăn vào thời điểm đại chiến Thế giới thứ

II xảy ra Tuy nhiên, sau chiến tranh trào lưu sử dụng kombucha được phục hồi và lan rộng Trong một vài thập kỉ qua, kombucha đã hồi sinh và trở nên phổ biến ở cả Úc và Hoa Kỳ, đặc biệt là kể từ năm 2000 đến nay [43]

Trà kombucha được lên men từ nước trà đường, hệ vi sinh vật lên men gọi là SCOBY (symbiotic culture of bacteria and yeast) – môi trường cộng sinh giữa vi khuẩn và nấm men Thành phần của kombucha chứa các chủng vi

sinh vật khác nhau (các chủng vi khuẩn Acetobacter và nấm men) cùng với

các acid hữu c , các enzyme có lợi, amino acid, và polyphenol chống oxy hóa Trong kombucha còn có thể chứa acid acetic, acid butyric, acid gluconic, acid lactic, acid usnic, acid oxalic, các vitamin nhóm B (B1, B2, B3,

B6, B12), các vitamin nhóm và một lượng nhỏ cafein Kombucha hay nấm trà

có khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường nước trà đường, sự có mặt của

các chủng Acetobacter (đặc biệt là Acetobacter xylinum) đã tạo ra lớp màng

hemicellulose dày và chắc Trong quá trình lên men, kombucha sẽ tạo ra một lớp màng mỏng trên bề mặt dịch trà sau đó tăng dần bề dày, cuối cùng hình thành một kombucha thứ hai (kombucha con) tách biệt với kombucha khởi đầu Hình dạng và kích thước của kombucha phụ thuộc dụng cụ chứa [47]

Hình 1.4 Trà kombucha

Nhiều nghiên cứu cho thấy, sản phẩm trà kombucha có lợi cho sức khỏe

h n so với những sản phẩm lên men từ sữa Những lợi ích mà kombucha đem lại là sự kết hợp hoàn hảo giữa hai yếu tố, đó là tác dụng của giấm và tác dụng của lá chè ác nghiên cứu hiện đại đã khẳng định, giấm có tác dụng kích thích tiêu hóa, nâng cao khả năng miễn dịch, điều hòa huyết áp và chống lão hóa

Lá chè vị ngọt đắng, tính mát, thành phần các chất có trong lá chè đem lại tác

dụng dược lí cao như hạ huyết áp, làm giảm mỡ máu, chống đông máu, kháng khuẩn và virus, chống lại quá trình lão hóa, chống mệt mỏi, gây hưng phấn thần kinh Như vậy, trà giấm kombucha không có nhiều tác dụng như những lời đồn thổi Kombucha chỉ là một loại đồ uống lên men với nguồn gốc từ thiên nhiên giúp giải khát, cung cấp một số lợi khuẩn, các vitamin và khoáng chất có tác dụng giúp c thể cân bằng tự nhiên, tăng cường sức đề kháng, giảm stress, chống lão hóa, cải thiện chức năng gan và ngăn ngừa một số bệnh tật, nhất là đối với những người cao huyết áp, rối loạn lipid máu hay tiểu đường [44].

1.2.2 Đặc điểm vi sinh vật trong kombucha

Hệ vi sinh vật lên men kombucha là một tập đoàn vi sinh vật cộng sinh

bao gồm các vi khuẩn thuộc giống Acetobacter và nấm men

men acetic thuộc nhóm Acetobacter [14]

Về hình dạng tế bào vi khuẩn Acetobacter là những trực khuẩn hình que

hay hình elip, hình chỉ, hình cầu hoặc có hình bán nguyệt, kích thước tế bào thay đổi tùy loài (0.3-0.6 x 1.0-8.0μm) ác tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi, có hoặc không có tiêm mao, sống và phát triển trong điều kiện hiếu khí bắt buộc hóa dị dưỡng hữu c , không sinh bào tử Ở môi trường dịch thể vi

khuẩn Acetobacter có sự hình thành màng trên mặt thoáng, màng tạo thành có

độ dày mỏng khác nhau và đặc điểm của các loại màng cũng khác nhau tùy loại Hiện nay đã tìm được khoảng trên 20 loài có khả năng tạo màng, tuy nhiên trong phạm vi nghiên cứu của mình chúng tôi chỉ quan tâm tới một số loài vi

khuẩn Acetobacter sau:

Acetobacter xylinum: tạo màng cellulose dày và chắc

Acetobacter orleanoe: tạo màng mỏng, chắc

Acetobacter pasteurianum: tạo màng khô và nhăn nheo

Acetobactersuboxydans: tạo màng mỏng và dễ tan rã

Acetobacter curvum: sinh acid acetic nồng độ cao nhưng tạo màng

không chắc chắn

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn

Acetobacter rất phong phú Nguồn carbon có thể được cung cấp từ các hợp chất

đường, rượu etylic và các acid hữu c Vi khuẩn Acetobacter có thể sử dụng các

muối amon làm nguồn cung cấp nit và phân giải pepton Một số acid amin như acid pantothenic và các chất khoáng K, Mg, Ca, Fe, P, S… cũng có vai trò quan

trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của Acetobacter o đó bia, dịch tự

phân nấm men, nước mạch nha, nước trái cây… là nguồn dinh dưỡng rất tốt cho

sự phát triển của vi khuẩn Acetobacter Một số loài Acetobacter còn tổng hợp

được vitamin B1, vitamin B2, oxy hoá sorbit thành đường sorbose (dùng trong

công nghiệp sản xuất vitamin ), hay như Acetobacter xylinum có thể tổng hợp được sợi cellulose giống như những sợi bông[5], [47]

1.2.2.2 Giống vi khuẩn lên men lactic

Vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium (Lactobacillaceae), là

những vi khuẩn Gram dư ng, bất động và không sinh bào tử, không chứa các men hô hấp như xitocromvà catalaza Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng gồm nhiều giống khác nhau, tế bào của chúng có thể hình cầu hoặc hình que, hô hấp tùy tiện Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đ n và đường đôi nhưng không có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột Các vi khuẩn này rất cần các acid amin, peptit, các base nucleotit, các vitamin… Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men từ 15÷500C Tuy nhiên mỗi loài có khoảng

nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn h n 800C vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn [4], [14], [47]

1.2.2.3 Nấm men

*Hình thái và cấu tạo tế bào

Tế bào nấm men thường có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ, hình quả chanh… kích thướct ư ng đối lớn: đường kính khoảng 7μm, chiều dài: 8–12μm Hình dạng và kích thước tế bào thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau

Nấm men thuộc nhóm sinh vật nhân chuẩn đ n bào, tế bào nấm men

có thành phần và cấu tạo khá phức tạp gồm thành tế bào, màng nguyên sinh chất, tế bào chất, ty thể, riboxom, nhân, không bào và các hạt dự trữ

- Thành tế bào: thành phần chính là glucan và mannan chiếm khoảng 90%, phần còn lại là protein, lipid và một số thành phần nhỏ khác như kitin…

- Màng nguyên sinh chất: là một lớp màng mỏng bao quanh tế bào chất gồm các chợp chất phức tạp như phospholipit, protein, enzyme permeaza…

- Tế bào chất: dạng thể keo không đồng nhất, chứa đầy đủ các c quan tử của tế bào như ty thể, nhân, riboxom, không bào, các hạt dự trữ,… Thành phần cấu tạo chủ yếu là nước, protit, gluxit, lipit và các muối khoáng, enzyme

- Ty thể: cấu tạo từ khoảng 30% chất béo, 60 – 70% protein, ngoài ra còn chứa các enzyme thực hiện các phản ứng oxy hóa vòng ATC, rất ít acid nucleic

- Nhân tế bào: là cấu tử bất biến của nấm men, thành phần c bản của nhân

là ADN mang thông tin di truyền Thành phần nucleotit trong ADN phụ thuộc từng loài, những loài nấm men gần nhau có thành phần nucleotit như nhau

- Không bào, các thể vùi và các chất dự trữ trong tế bào[15]

* Phân loại nấm men

Có rất nhiều cách phân loại, nấm men chủ yếu gồm hai lớp là nấm men

thật (Ascomyces) và nấm men giả (Fungiimporfecti) [4], [47]

+ Lớp nấm men thật (Ascomyces): phần lớn nấm men dùng trong công nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces; giống

Schizosaccharomyces giống Endomyces

+ Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti) gồm: Crrytococus (toscula,

tornlopsis); Mycoderma; Candida; Rhodotorula

* Các quá trình sinh lí của tế bào nấm men

Tế bào nấm men có thể sống độc lập.Quá trình sống của chúng gồm các quá trình dinh dưỡng, quá trình sinh trưởng và đặc điểm di truyền

Dinh dưỡng

+ inh dưỡng carbon: các hợp chất hữu c khác nhau như các loại đường và dẫn xuất, rượu, acid hữu c , acid amin… có thể là nguồn dinh dưỡng carbon của nấm men, trong đó nguồn đường là chủ yếu Nấm men có thể sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau như sucrose, maltose, lactose, glucose…

+ Dinh dưỡng nit : đa số nấm men không đồng hóa được nitrat mà chỉ

có khả năng sử dụng các muối amon ở dạng hòa tan, có thể là đạm hữu c hoặc vô c Nguồn nit hữu c thường dùng là acid amin, pepton, amid, urê, nucleotit… Đạm vô c là các muối amon khử nitrat, sulfat, acetat…

+ inh dưỡng các chất sinh trưởng: các vitamin, các purin và prymidin là nhân tố sinh trưởng c bản của nấm men Nhóm nấm men không sinh sắc tố thường sử dụng các vitamin nhóm B, nhóm sinh sắc tố đỏ cần tiamin, acid paraaminobenzoic Ngoài ra nấm men cần các chất khoáng: P, S, Mg, Fe, Mn

- Cơ chế vận chuyển các chất dinh dưỡng qua màng tế bào

Các chất dinh dưỡng khi được nấm men sử dụng sẽ phục vụ cho quá trình sinh trưởng hoặc là cung cấp năng lượng cần thiết cho đời sống của tế bào Các chất dinh dưỡng được vận chuyển qua thành tế bào theo hai con đường c bản

Vận chuyển bị động: là dạng vận chuyển không tiêu tốn năng lượng, vật

chất được qua màng ở dạng chất hòa tan và đi qua màng nhờ tính bán thấm của màng

Vận chuyển chủ động: tiêu tốn năng lượng của quá trình hô hấp (thường

là TP) Đa số vật chất được chuyển qua màng vào nội bào lại trở lại ở dạng không hòa tan trong tế bào chất nhờ hệ enzym permeaza hoạt hóa (chất mang), đây là kiểu vận chuyển hóa lập thể [15]

Qu trình sinh trưởng

- Sinh sản của nấm men

Nấm men có 2 hình thức sinh sản: vô tính (bằng nảy chồi hoặc phân cắt

tế bào) và hữu tính (bằng bào tử) tùy vào điều kiện nuôi cấy Trong vòng đời của nấm men có sự luân phiên sinh sản vô tính và hữu tính với các giai đoạn đ n bội

và nhị bội khác nhau Khi gặp điều kiện thuận lợi nấm men sẽ sinh sản vô tính, còn khi quá trình trao đổi chất trong tế bào xảy ra chậm thì chúng tạo thành bào tử.Sự tạo thành bào tử được xem là một giai đoạn phát triển cá biệt nhằm bảo tồn loài của nấm men [15]

- inh trưởng của nấm men

Khi cấy nấm men vào môi trường dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấm men tăng nhanhvề kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều cho đến khi c chất của môi trường giảm đến mức thấp nhất thì quá trình sinh trưởng phát triển của chúng chậm và ngừng hẳn Lúc này ta có quần thể tế bào trong không gian sống có giới hạn được gọi là “hệ kín” Các nấm men sinh sản bằng phư ng pháp nhân đôi thường cho lượng sinh khối rất lớn sau một thời gian ngắn Tế bào sẽ già đi khi môi trường thiếu chất dinh dưỡng và tế bào không còn khả năng sinh sản nữa Tuy nhiên đa số nấm men sinh sản bằng phư ng pháp nảy chồi nên hiện tượng phát hiện tế bào già rất rõ Khi chồi non tách khỏi tế bào mẹ để sống độc lập thì n i tách đó trên tế bào mẹ tạo thành một

vết sẹo.Vết sẹo này sẽ không có khả năng tạo ra chồi mới Cứ như vậy tế bào

mẹ sẽ chuyển thành tế bào già theo thời gian [4], [15], [47]

Để xác định số lượng tế bào nấm men phát triển theo thời gian hiện nay người ta dùng nhiều phư ng pháp khác nhau như: xác định số lượng tế bào bằng phư ng pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi hay trên mặ tthạch Đo độ đục của tế bào trong dung dịch nuôi cấy trên c sở xây dựng một đồ thị chuẩn của mật độ tế bào [4]

Quá trình sinh trưởng của nấm men được nhiều tác giả chia làm 4 pha: Pha lag (pha tiềm phát hay pha làm quen): nấm men mới được cấy vào môi trường,chưa sinh sản

Pha log (pha lũy thừa): các tế bào phát triển ào ạt với tốc độ lớn nhất

và không đổi, số lượng tế bào trong quần thể tăng lên rất nhanh

Pha ổn định (pha cân bằng): trong pha này số tế bào sống ổn định và mật độ quần thể đạt tối đa

Pha suy vong: số tế bào trong quần thể giảm dần do tế bào trong quần thể bị phân hủy ngày càng nhiều, chất dinh dưỡng cạn kiệt [15]

Đặc tính di truyền của nấm men

Hoạt động sống sinh lí của nấm men chịu nhiều ảnh hưởng của các yếu

tố ngoại cảnh của môi trường nuôi cấy Tuy vậy, yếu tố quyết định và quan trọng nhất vẫn là các đặc tính di truyền của tế bào, đặc tính này thể hiện rõ nét

ở các chủng khác nhau

Năm 1953, nhà bác học arlsberg người Đan Mạch đã xác định được chu

kì sống đ n bội – đa bội của nấm men Ông cũng khẳng định tế bào nấm men có hai giới tính là α và a ác tế bào đ n bội sinh α và a bằng cách nảy chồi, chúng kết hợp với nhau thành bào tử lưỡng bội α/a Khi gặp điều kiện dinh dưỡng kém chúng giảm phân tạo nang chứa 4 bào tử trong đó hai bào tử mang giới tính α và hai mang giới tính a Sau đó tế bào sinh sản theo phư ng pháp vô tính hoặc hữu tính, cũng có thể xen kẽ giữa hai phư ng pháp sinh sản trên[4],[15], [47]

1.2.3 Cơ chế của quá trình lên men kombucha

Trà kombucha là sản phẩm của 2 quá trình lên men đồng thời đó là lên men ethanol (lên men rượu) và lên men acetic.Vi sinh vật sử dụng cho hai quá trình lên men này chủ yếu là nấm men và vi khuẩn acetic

* Lên men ethanol (lên men rượu) nhờ nấm men

Hình 1.5 C chế phân giải đường trong tế bào nấm men

Quá trình lên men rượu được thực hiện nhờ quá trình lên men kị khí của nấm men, chúng sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol.Quá trình lên men rượu được bắt đầu từ hoạt động của nấm men trong trà kombucha tiết

ra một loại enzyme bẻ gãy đường sucrose thành glucose và fructose Từ đây

trong dung dịch dinh dưỡng mới có glucose Nguồn glucose lúc này bị cạnh tranh bởi cả vi khuẩn và nấm men (trong dung dịch chưa có ethanol), hoạt động lên men rượu được chia làm hai thời kì chính:

Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối

Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu: giai đoạn này nấm men chuyển sang hô hấp kỵ khí Giai đoạn đường phân được tăng cường và trở thành nguồn cung cấp năng lượng cho tế bào, sự chuyển hướng trao đổi chất của nấm men sẽ cho sản phẩm là ethanol Trong quá trình lên men rượu, nấm men sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu.Nấm men không có khả năng chịu được môi trường có độ acid cao cho nên acid pyruvic sẽ được chuyển hoá thành CO2 và acetaldehyde rồi thành ethanol Trong lên men rượu, các đường đ n như glucose và fructose được phân giải theo con đường EMP và chu trình ATC ở giai đoạn đầu, sau đó giải phóng ATP Khi nấm men chuyển sang hô hấp kị khí, quá trình lên men cho các sản phẩm chính là

CO2, ethanol và các sản phẩm phụ trong đó có glyxerol

Phư ng trình tổng quát của quá trình lên men rượu có thể viết như sau:

C6H12O6+2ADP+2Pi→2C2H5OH+2CO2+2ATP Quá trình chuyển hóa đường thành ethanol và khí CO2 diễn ra trong tế bào chất của nấm men Ngoài việc tạo ra Ethanol và CO2, tế bào nấm men còn tổng hợp và thải vào dịch lên men nhiều sản phẩm phụ và sản phẩm lên men khác với hàm lượng rất nhỏ, chúng được chia thành 4 nhóm: glyxerol cùng rượu bậc cao, aldehyde, acid hữu c và este Trong quá trình này nhiều acid hữu c được tạo thành, một số acid hữu c được sinh tổng hợp từ chu trình Krebs Nếu quá trình lên men trong điều kiện kỵ khí không nghiêm ngặt, các acid hữu c chiếm hàm lượng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric, malic, acetic, lactic [15], [47]

* Lên men acetic

Lên men acid acetic là quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic dưới tác dụng của vi khuẩn

C2H5OH+O2→CH3CHO(Acetaldehyd)+H2O

CH3CHO+H2O→CH3CH(OH)2(Hydratacetaldehyd)

CH3CH(OH)2+ O2→CH3COOH+H2O

* Lên men lactic

Lên men lactic là một quá trình trao chuyển hóa sinh học kỵ khí làm biến đổi các hợp chất đường thành acid lactic (chủ yếu) và một số sản phẩm khác Các sản phẩm như acid lactic, ethanol, O2 được vi khuẩn thải vào môi trường lên men còn các phân tử TP được giữ lại trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trưởng của vi sinh vật Kết quả là hàm lượng acid lactic tích lũy trong môi trường lên men ngày càng tăng, làm giảm pH môi trường và kéo theo những biến đổi hóa lý khác Có hai kiểu lên men lactic: Lên men lactic đồng hình hầu như chỉ cho ra sản phẩm là acid lactic

Lên men lactic dị hình là quá trình lên men lactic ngoài sản phẩm acid lactic còn có các sản phẩm khác như acid acetic, ethanol, CO2…

Ngoài ra, trong dịch lên men còn xuất hiện nhiều hợp chất hóa học mới

là sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm phụ của quá trình lên men Một số hợp chất dễ bay h i có vai trò quan trọng góp phần hình thành nên mùi vị đặc trưng cho các sản phẩm lên men lactic Lượng sản phẩm phụ thu được hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh [4]

1.2.4 Đa dạng nấm men trong kombucha

Thuật ngữ “đa dạng sinh học” được đưa ra lần đầu tiên bởi hai nhà khoa học Norse và McManus vào năm 1980 Định nghĩa này bao gồm hai khái niệm có liên quan với nhau là: đa dạng di truyền (tính đa dạng về mặt di

truyền trong một loài) và đa dạng sinh thái (số lượng các loài trong một quần

xã sinh vật) ho đến nay đã có trên 25 định nghĩa nữa cho thuật ngữ “đa dạng sinh học” này Trong đó, định nghĩa của tổ chức FAO (Tổ chức Lư ng nông Liên hiệp quốc) cho rằng: “đa dạng sinh học là tính đa dạng của sự sống dưới mọi hình thức, mức độ và mọi tổ hợp, bao gồm đa dạng gen, đa dạng loài và đa dạng hệ sinh thái”

Đa dạng vi sinh vật bao gồm đa dạng về loài vi sinh vật và đa dạng khả năng trao đổi chất của vi sinh vật Đa dạng loài bao gồm độ phong phú loài, tổng số loài, độ đồng dạng loài và sự phân bố loài [9]

Nấm men là một nhóm vi sinh vật đ n bào, nhân chuẩn thuộc về giới nấm, được phân bố ở khá nhiều môi trường khác nhau trong tự nhiên Nấm men có thể được tìm thấy trong đất, nước, không khí, ruột của một số sinh vật, hồ mặn hay các sông băng, thậm chí có ở cả vùng nước acid và môi trường biển sâu Nấm men có nhiều trên bề mặt các loài thực vật như lá, hoa

và trái cây do trên bề mặt thực vật có chứa một số hợp chất có ý nghĩa thích nghi góp phần hình thành các quần thể nấm men Nấm men còn có thể phân lập được từ ruột của một số bọ cánh cứng, một số côn trùng còn sử dụng nấm men như một nguồn thực phẩm (ruồi giấm Drosophila thuộc giống ăn nấm men nhưng khi đi qua bào tử ruột thì nấm men vẫn còn sống nguyên vẹn) Để xác định và phân loại đa dạng nấm men trong tự nhiên là cần thiết để điều tra

về đa dạng sinh thái nấm men Độ đa dạng của nấm men được thể hiện ở khả năng sử dụng các nguồn dinh dưỡng khác nhau trong quá trình sống

Trong lịch sử tiến hóa và phát triển con người đã nghiên cứu và sử dụng nấm men cho nhiều mục đích khác nhau Có thể sử dụng nấm men trong các thực phẩm lên men như: làm bánh, sản xuất gia vị, đặc biệt là trong

lĩnh vực đồ uống lên men mà khởi đầu là sản xuất rượu [42]

Kombucha là một loại đồ uống lên men do đó nấm men là thành phần quan trọng không thể thiếu Việc xác định đa dạng nấm men trong lên men kombucha cho đến nay vẫn còn mới mẻ, các công trình nghiên cứu chủ yếu

về ảnh hưởng của các yếu tố trong quá trình lên men Để nghiên cứu đa dạng nấm men trong kombucha vẫn cần sử dụng các phư ng pháp truyền thống:

- Tính đa dạng của vi sinh vật dựa trên khả năng sử dụng nguồn carbon

- Tính đa dạng của vi sinh vật dựa trên khả năng sử dụng nguồn nit

- Tính đa dạng của vi sinh vật dựa trên điều kiện nuôi cấy

1.3 Tình hình nghiên cứu kombucha hiện nay

1.3.1 Trên thế giới

ho đến nay đã có nhiều tác giả nghiên cứu về trà kombucha Đi tiên phong là các bài báo, các nghiên cứu về tác dụng của kombucha: Bacinskaja (1914) và cộng sự cho rằng kombucha tốt cho hệ tiêu hóa, điều chỉnh các hoạt động đường ruột, đặc biệt là chống táo bón S azarewski (1915) đã có báo cáo gửi “Hiệp hội các nhà nghiên cứu ở Riga Nature”, trong báo cáo này ông cho rằng kombucha có khả năng làm giảm chứng đau đầu Năm 1927, H.Waldeck khẳng định ngoài tác dụng chống táo bón, kombucha còn chứa các acid amin tự nhiên có khả năng chống lão hóa và kéo dài tuổi thọ.Năm

1928, Br.Lakowitz một lần nữa khẳng định các tuyên bố của H.Waldeck về tác dụng của nấm trà [45] ho đến hàng loạt các nghiên cứu gần đây được thử nghiệm trên chuột cho thấy: Gharib OA và Fahim TH (2007) có nghiên cứu về tác dụng bảo vệ của trà kombucha trên các tổn thư ng gan ở chuột bị chiếu xạ [30] Năm 2010, anerjee.D và cộng sự đã có nghiên cứu so sánh khả năng chống loét dạ dày ở chuột của trà kombucha và trà đen [25] Abshenas.J và cộng sự có một nghiên cứu sinh hóa và mô bệnh học về tác dụng của trà kombucha chống nhiễm độc gan acetaminophen gây ra ở chuột vào năm 2012 [23] ũng trong năm 2012, Goh, W.N và cộng sự đã có công

trình nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ sucrose và thời gian lên men đến sản lượng của cellulose vi khuẩn [31] Tới năm 2014, lan J Marsh và cộng

sự đã nghiên cứu phân tích trình tự và định danh quần thể vi sinh vật có trong trà kombucha [24]

Mô tả đầu tiên của trà nấm xuất hiện dưới dạng sách vào năm 1954 có tên là “The Mushroom Tea and its therapeutic properties” của tác giả

GF arbancik, trong đó tác giả đã chứng minh tác dụng kháng khuẩn và khả năng làm hạ huyết áp của trà nấm [45] Cuốn “Kombucha Miracle Fungus” của Harald W.Tietze xuất bản năm 1996 cho thấy kombucha có tác dụng k o dài tuổi thọ, làm giảm sự hình thành nếp nhăn, giảm b o phì, ngăn tiêu chảy, phục hồi thị lực [32] Mới đây nhất là cuốn sách “Kombucha Revolution” của tác giả Stephen Lee và Ken koopman xuất bản tháng 6 năm 2014 bằng tiếng

nh đưa ra 75 bí quyết nấu ăn trong đó có 12 công thức chế biến kombucha thủ công và nhiều cách trộn cocktail có liên quan đến kombucha [39]

1.3.2 Các nghiên cứu kombucha ở Việt Nam

Hiện nay, ở Việt Nam sản phẩm kombucha hầu như chỉ được truyền miệng nhau làm thủ công, chưa có nhiều công trình nghiên cứu đầy đủ về trà kombucha Tuy nhiên đã có một số công trình nghiên cứu bước đầu tìm hiểu

về kombucha Năm 2008, Hà Thị Mỹ Trinh thuộc trường Đại học Kỹ thuật công nghệ thành phố Hồ hí Minh đã có công trình nghiên cứu “Thử nghiệm

chế biến nước trà xanh lên men từ vi khuẩn A xylinum và nấm men

S.cereviciae” Hay Đinh Văn Nam – Viện Đại học Mở Hà Nội đã “Nghiên

cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men nước giải khát kombucha

từ chè phế liệu” vào năm 2011 Năm 2012, Lê Nguyễn Thị Hồng Ngọc của Trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh và cộng sự đã có công trình nghiên cứu “Nghiên cứu hệ vi sinh vật của trà kombucha và hiệu quả tác dụng trên một số chỉ tiêu sinh lý chuột” Tới năm 2013, Nguyễn Thị Thanh Xuân

và cộng sự thuộc khoa Công nghệ Sinh học của trường Đại học Mở thành phố

Hồ hí Minh đã nghiên cứu trong lĩnh vực y dược “Khảo sát khả năng giải độc và hạ men gan của trà Kombucha trên mô hình in vivo” ũng trong năm

2013 Tôn Nữ Liên Hư ng thuộc khoa Khoa học Tự nhiên, Đại học Cần Th

đã có nghiên cứu “ nh hưởng của thời gian chế biến tới một số tính chất và hoạt tính sinh học của trà giấm kombucha” Nghiên cứu chỉ ra: tính chất vật

lý, hóa học, hàm lượng của các hợp chất hữu c có hoạt tính trong Trà giấm kombucha được chế biến từ Trà đóng gói hiệu Lipton và từ Trà đóng gói hiệu Trà Xanh Trà giấm kombucha có hoạt tính sinh học: tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa, độc tính trên tế bào ung thư, theo thời gian lưu mẫu, trên từng loại trà giấm[46].Gần đây nhất là các đề tài “Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà Shan Tuyết Hà Giang” của Lâm Thị Hồng Liên trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 năm 2013 và đề tài “Nghiên cứu một số chủng vi khuẩn lên men kombucha từ trà Thái Nguyên” của Lê Thị Huệ trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 [7], [11]

CHƯ NG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯ NG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nguồn carbon: glucose, fructose, maltose, acid acetic

Nguồn nit : cao nấm men, pepton, (NH4)2SO4, dd NH3,

Nguồn muối khoáng: MgSO4.7H2O, KH2PO4,

Thuốc nhuộm: Fucshin, Lugol, …

H2SO4 , CaCO3, thạch agar…

2.1.2.2 Dụng cụ thí nghiệm

Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức), nồi hấp Tommy (Nhật), Box cấy vô trùng (Haraeus), máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh), máy li tâm Sorvall (Mỹ), micropipet Jinson (Pháp), máy đo pH, cân (Precisa XT320M–ThụySĩ), máy cất nước 2 lần (Hamilton – Anh), kính hiển vi quang học, tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, lamen, đèn cồn và nhiều dụng cụ hoá sinh thông dụng khác

2.1.3 Các loại môi trường

* Môi trường Hanxen (môi trường phân lập)

Glucose: 50g Pepton: 10g

KH2PO4: 3g MgSO4.7H2O: 2g

(NH4)2SO4: 2g ThạchAgar:15-20g

Nước:1000ml

* Môi trường nhân giống

Glucose:50g

KH2PO4:3g

(NH4)2SO4:2g MgSO4.7H2O: 2g

Pepton: 10g Nước:1000ml

* Môi trường lên men

Dịch trà Thái Nguyên: 200ml (Tỉ lệ Nước/trà: 200ml/4g)

Cách làm: môi trường phân lập được khử trùng và được phân bố vào các hộp vô trùng petri để nguội theo phư ng pháp Pasteur Dịch trà được pha loãng từ 10-1 - 10-10 bằng nước cất Dùng pipet đã vô trùng nhỏ 1 giọt huyền phù với độ pha loãng từ 10-6 - 10-9 lên bề mặt thạch rồi dùng bàn trang vô trùng dàn đều Gói kín lại và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 28 - 300C trong

ba ngày Sau ba ngày trên bề mặt thạch sẽ xuất hiện các khuẩn lạc với đặc điểm: to, tròn, lồi, màu trắng, nhẵn, bóng đặc trưng cho nấm men

Phư ng pháp nghiên cứu đặc điểm tế bào nấm men

Nhuộm Gram là nhuộm sử dụng hai hay nhiều loại thuốc nhuộm trên một tiêu bản nhằm quan sát và định loại tế nấm men dựa trên khả năng hình thành trong tế bào hợp chất bền vững của protit đặc biệt với thuốc nhuộm kiềm và iốt

Tiến hành: Lấy các khuẩn lạc trong các ống thạch nghiêng có khả năng

lên men kombucha làm vết bôi trên lam kính nhuộm tế bào theo phư ng pháp nhuộm Gram Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu và kính hiển vi quang học Olympus CH-2 (độ phóng đại 1000 lần) [6], [8]

2.2.1.2 hương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật

Phư ng ph p đếm khuẩn lạc

Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa nấm men, pha loãng theo phư ng pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1ml pha loãng rồi trang đều trên môi trường thạch đĩa Nuôi ở 300

C sau 3 ngày đếm số khuẩn lạc (CFU) trong môi trường đĩa petri, từ đó xác định số lượng tế bào nấm men trong 1ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức [19]

N- Tổng số CFU trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu

A- ố CFU trung bình đếm được trên mỗi đĩa petri

10 -n - Độ pha loãng dịch nuôi cấy

Phư ng ph p đếm số lượng tế bào bằng buồng đếmGoriaev

Đây là phư ng pháp đếm trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật có trong mẫu phân tích Pha loãng dịch huyền phú VSV đến 10-n, nhỏ một giọt dịch huyền phù ở độ pha loãng (n) vào giữa buồng đếm và đậy lá kính, di chuyển nhẹ buồng đếm cho dịch chiếm đầy khoang Đếm số lượng tế bào theo các ô theo đường ch o hoặc theo các góc ở trung tâm buồng đếm Thường đếm 4 ô lớn ở 4 góc và 1 ô lớn ở trung tâm của buồng đếm để tính số lượng tế bào trung bình của ô lớn Sau đó dùng công thức sau để tính số tế bào trong 1ml lúc đầu [6]